metodologia

CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO
MESTRADO ACADÊMICO EM NANOCIÊNCIAS
DISCIPLINA: NANOTECNOLOGIA
Ana Paula Tasquetto da Silva, Benonio Villalba e Iuri Jauris
Profª Drª Marta Palma Alves
Profª Drª Renata Raffin
Profª Drª Solange Fagan
ARTIGO

Fator de impacto: 7.365
INTRODUÇÃO
•
Câncer de próstata
potencialmente letal
•
6° tipo de câncer mais comum no mundo, e
3° mais comum em homens
Tratamento  Quimioterapia Paclitaxel
(PTX) - nome comercial Taxol®, Bristol-Myers
Squibb.
•
INTRODUÇÃ
O
Problema

Alta toxicidade, especialmente hematológica.

Diversos casos de interrupção do tratamento!
Solução
Nanopartículas magnéticas funcionalizadas e
revestidas por “casca” ou polímero hidrofílico

INTRODUÇÃ
O
Potencialidades
Melhora o
magnética;


contraste
em
ressonância
Entrega vetorizada do fármaco;
Maior capacidade de armazenamento de
fármaco;


Boa dispersão em solução aquosa;

Biocompatibilidade com células e tecidos.
INTRODUÇÃ
O
Como revestir as nanopartículas magnéticas com
PTX?
(PAn)  biocompatível em aplicações
in vivo e in vitro  aplicados na engenharia
biomédica e em biosensores.
 Polianilina
Porém!  fracas propriedades hidrofílicas  limita
sua aplicação biomédica.
Solução: Modificar PAn estruturalmente  PAn +
anidrido succínico  poly[aniline-cosodium N-(1one-butyric acid) aniline] (SPAnNa)

INTRODUÇÃ
O
METODOLOGIA
Preparação das SPAnH/MNPs
• MNPs de Fe3O4
Co-precipitação
• FeCl3 e FeCl2 – 4H2O
dissolvidos em 400 mL de
água e agitados por 5 min.
• MNPs foram dispersas por sonicação e separadas da
solução através de um ímã
e dopados com HCl 0,2 M.
• Formação de SPAnH/MNP
infravermelho.
misturadas com SPAn
espectroscopia no
METODOLOGIA
Caracterização das SPAnH/MNPs
• Tamanho e morfologia
microscopia eletrônica de
transmissão.
• Tamanho hidrodinâmico
espalhamento de luz
dinâmico (Zetasizer).
• Magnetização MNPs
dispositivo supercondutor
de interferência quântica (SQUID).
• Concentração do grupo carboxila na superfície da
amostra
método TBO.
METODOLOGIA
Ensaio de estabilidade e atividade do PTX
conjugado
• Atividade do PTX conjugado
ensaio da proteína
tubulina
medida através do monitoramento do
aumento da Abs (380 nm por 1h).
• Densidade óptica
ELISA.
• Estabilidade PTX livre e conjugado
variações de
sua atividade utilizando o teste da proteína tubulina,
após armazenamento a 25 e 37 ºC, por 21 dias.
METODOLOGIA
Análise de Western blot
• Células CWR22R foram tratadas com PTX livre e
conjugado.
• Proteínas foram quantificadas pela análise de
Bradford.
• Lisados
celulares
membrana
nitrocelulose
bloqueadas com tampão TBS e imunocarregadas com
anticorpos primários contra tubulina e β-actina.
• Incubadas com anticorpos secundários conjugados
com peroxidase.
METODOLOGIA
Ensaios de citotoxicidade in vitro
• Células PC3 e CWR22R
cultivadas em meio
RPMI + soro fetal bovino + gentamicina + penicilina +
estreptomicina.
• 50 µL de SPAnH/MNPs com PTX livre e PTX
conjugado foram adicionados ao meio de cultura.
• Medição por densidade óptica
490 nm
leitor
de ELISA.
• Culturas celulares realizadas na presença de campo
magnético de 800 Gauss.
METODOLOGIA
Estudos de captação celular
• Células PC3 e CWR22R foram incubadas com
SPAnH/MNPs por 2h a 37 ºC.
• Fixadas por glutaraldeído 3%.
• Células colocadas em moldes
coradas com
acetato de uranila 4% e citrato de chumbo.
• Imagens
TEM com uma tensão de aceleração de
100 kV e microscopia confocal.
RESULTADOS
Caracterização SPAnNa e SPAnH/MNPs
Espectroscopia
de fotoelétrons excitados por
raios X (XPS)
Picos
centrados em
398,2 eV (-N=), 399,3 eV (-N-)
H
399,8 eV (-N-)
R
RESULTADOS
Imagens de MET  MNPs e SPAnH/MNPs
possuem 8 e 11 nm de diâmetro, respectivamente.
•
A espessura da “casca” foi de aproximadamente
1,5 nm.
•
•
O tamanho hidrodinâmico das MNPs e
SPAnH/MNPs foi cerca de 80,6 e 73,7 nm,
respectivamente.
RESULTADOS
O potencial zeta do SPAnH/MNPs em água
deionizada foi de 43,5 ± 1,07 mV e diminui para
-30,5 ± 0,45 mV quando o PTX foi incorporado
ao SPAnH/MNPs.

SQUID

Tanto
as
MNPs
como
SPAnH/MNPs apresentam características de
superparamagnetismo.

RESULTADOS
Espectroscopia FT-IR: Picos não mudam
quando
comparados
SPAnH
e
MNPs
separadamente com o SPAnH/MNPs;

Para COOH
C=O pico em 1707 cm-1
O-H pico em 3410 cm-1
Fe-O pico em 582 cm-1
RESULTADOS
Atividade e estabilidade térmica PTX +
SPAnH/MNPs
Máximo de 302,75 μg de PTX pode ser associado
a 1mg de SPAnH/MNPs

Decréscimo na atividade relativa  fraca
interação de alguns grupos funcionais do PTX com
a tubulina

RESULTADOS
•
A melhora sensível na estabilidade térmica do
SPAnH/MNPs + PTX prolonga o tempo de duração
no qual o PTX pode circular eficientemente no
organismo.
RESULTADOS
Captação celular
• Co-cultura de células PC3 com Cy5/SPAnH/MNPs por
8 h não tinha efeito sobre o equilíbrio dinâmico entre
tubulina e microtúbulos. No entanto, os conjugados
podem ser guiadas e concentrada para o fundo das
placas de cultura através da aplicação de um campo
magnético, resultando em conjugados mais ser
interiorizados nas células.
• Alguns conjugados (cor vermelha) foram aprisionadas
dentro dos lisossomos (cor verde) em um tempo de
incubação e mostrado em amarelo imagem da
fluorescência, o que implica que não houve aparente
efeito citotóxico.
RESULTADOS
Imagem confocal de células PC3 expostas a Cy5/SPAnH/MNPs conjugadas por 8 h
(A) sem e (B) com a aplicação de campo magnético (800 Gauss).
RESULTADOS
Imagens de MET (A) células PC3 (B) e células CWR22R (ambos 10.000)
• As nanopartículas em negro de células PC3 e CWR22R (fig.
A, B) são Fe3O4. Assim, PTX ligado as SPAnH / MNPS é
transportado para as células de forma rápida e eficaz,
aumentando a eficácia do tratamento e diminuindo a dose.
RESULTADOS
Western blot
• Tratamento de células CWR22R durante 24 h com
diferentes concentrações de PTX livre e conjugado não teve
nenhum efeito perceptível em β-actina.
• No entanto, o tratamento com 10 mM de PTX livre ou
conjugado reduziu os níveis de α-tubulina para 52% e 63%,
respectivamente, em relação aos controles não tratados.
• A redução observada com PTX-limite foi aprimorado para
81% quando um campo magnético foi aplicado durante a
cultura fazendo aumentar significativamente a concentração
do fármaco para a área específica.
RESULTADOS
• Isto sugere que, após o tratamento com PTX livre e
conjugado, as tubulinas reuniriam rapidamente aos
microtúbulos e isto resultou a não formação de mitose,
consequentemente induzindo a apoptose.
Análises de Western blot de α-tubulina e β-actina em células CWR22R tratados por 24 horas
com (A) 0 mM (controle); (B) 2 mM, (C) 5 mM, e (D) 10 mM livre PTX; (E) 2 mm (F) 5 mM,
(G) 10 mM PTX-ligado; células tratadas com (H) 2 mM, (I) 5 mM, e (J) 10 mM PTX conjugado
foram submetidos ao campo magnético (800 Gauss).
RESULTADOS
Citotoxicidade in vitro
• A citotoxicidade sem e com PTX conjugado as células PC3
e CWR22R foram obtidos através do método de ensaio XTT.
• A viabilidade celular após 48 h de incubação com SPAnH /
MNPS em diferentes concentrações, demonstraram que as
células PC3 e CWR22R co-cultivados com SPAnH / MNPS
permaneceram viáveis em comparação com o controle
quando a concentração de SPAnH / MNPS foi de até 500
µg/mL .
RESULTADOS
• No entanto, PTX livre e conjugado foram tóxicos para os dois tipos
de células de modo dose-dependente. No caso da célula PC3, o
IC50 (50% inibição do crescimento celular) de valor-limite
PTX foi 9,7 µg/mL mais baixa do que a de PTX livre (11,1 µg/mL) e
foi significativamente reduzida para apenas 4,6 µg/mL para a
aplicação magnética direcionamento para o PTX-limite.
RESULTADOS
• Da mesma forma, no caso de células CWR22R, o valor de
IC50 do PTX conjugado foi de 4,2 µg/mL mais baixa do que
o PTX livre (7,1 µg/mL) e foi bastante reduzido para apenas
1,7 µg/mL para a aplicação magnética segmentação para o
PTX-limite.
RESULTADOS
Microscopia de Fluorescência
• SPAnH / MNPS sozinho não teve efeito citotóxico em células
PC3 ou CWR22R (fig. a), mesmo quando um campo
magnético foi aplicado (fig. e).
RESULTADOS
• No entanto, o número de células mortas (em vermelho)
aumentou quando a dose de PTX-limite aumentou (fig. b,d).
RESULTADOS
• Além disso, quando PTX estava conjugado poderia ser
concentrada uma área específica por um campo magnético
aplicado (fig. f) (maioria das células mortas na região).
CONCLUSÃO

Em resumo, uma molécula SPAnH/MNPS atóxica,
transportadora de fármaco contendo carboxilas foi
desenvolvida com sucesso e poderá ser utilizada de
forma eficaz para imobilizar o fármaco hidrofóbico
PTX.

Além disso, estudos de estabilidade térmica
mostraram um aumento na meia-vida do composto,
para a temperatura de 37°C, de 19h do fármaco livre
para 57h para o fármaco associado às
nanopartículas.
CONCLUSÃO

O PTX associado às nanopartículas pode ser
concentrado no local do tumor por aplicação de
campo magnéticos, reforçando a sua eficácia
terapêutica.

O fármaco associado às nanopartículas apresentou
ainda uma melhora de 58,6% a 76,1% na inibição do
crescimento das células cancerígenas.

Eficácia do tratamento do tumor, ou seja, com menor
dose terapêutica e potencialmente, menos efeitos
colaterais.