Aminoácidos, peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Características químicas dos aminoácidos Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Os aminoácidos • Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L – A biologia é canhota • Glicina não tem isomeria óptica Carbono alfa Grupo R apolar e alifáticos • Aminoácidos apolares e hidrofóbicos • Ligações de Van der Waals • Ala, Val, Leu, Iso – Interações hidrofóbicas • Gly; menor aminoácido • Met – Possui átomo de enxofre • Pro – Iminoácido, menor flexibilidade estrutural Grupo R aromáticos • Aminoácidos hidrofóbicos • Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água • Modificações póstraducionais – Fosforilação do OH da tirosina • Fenilalanina – Mais apolar Grupos R polares, não carregados • Solubilidade intermediária em água • Serina e treonina – Grupos hidroxil • Asparagina e glutamina – Grupo amida • Cisteína – Grupo sulfidril – Ligações dissulfeto Grupos R carregados • Aminoácidos básicos – – – – Carga positiva Lisina, segundo grupo amino Arginina, grupo guanidina Histidina, grupo aromático imidazol • Aminoácidos ácidos – Carga negativa – Possuem segundo grupo ácido carboxílico Aminoácidos incomuns • Modificações pós-traducionais – – – – – 4-hidroxiprolina 5-hidroxilisina 6-N-metil-lisina Gama-carboxiglutamato Fosforilação de resíduos • Selenocisteína – Selênio ao invés de enxofre na Cys – É adicionado durante a tradução por mecanismo específico e regulado pH e pKa • Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas • Ionização • < pH; > [H]+ estado não-ionizado Aminoácidos são ionizáveis • Substâncias anfóteras: possuem natureza dual • Podem funcionar assim como ácidos ou bases – Doam ou recebem prótons Titulação de um aminoácidos • pKa: tendência de um grupo fornecer um próton ao meio • Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio • Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos • Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral Peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Polipeptídeo >Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA LEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENY CN Peptídeos tbm são ionizáveis • Ou seja, possuem curva de titulação característica • Funcionam em faixas de pH ótimas Número de resíduos por proteína Uso de aminoácidos • Varia bastante entre as proteínas • Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula Proteínas com outros grupos químicos • Adicionados pós-traducionalmente Trabalhando com proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Proteínas podem ser separadas e purificadas • Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas? – Basta selecionar por propriedade • Tamanho, carga e propriedades de ligação • Obter o extrato bruto – “correr” em cromatografia de coluna • Fase estável (matriz) • Fase móvel (solução com tampão) – Coluna maior permite maior resolução na separação Cromatografia por troca iônica • Polímero carregado negativamente – Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna • Afinidade da proteína é definido também pelo pH Cromatografia por exclusão de tamanho • Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores • Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro Cromatografia de afinidade • Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse • Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz • Elui-se com solução de ATP Eletroforese -- Histórico • 1952, Markham and Smith – • 1955, Smithies – • Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA 1980, Schwartz and Cantor – • Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano 1967, Loening – • Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante... Vou ali correr um gelzinho e já volto Tenho que ir senão vou perder meu gel Eletroforese • Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme • DNA, carga negativa – Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico • Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) • Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular Eletroforese, etapas 1.Preparação do gel 2.Aplicação das amostras 3.Eletroforese 4.Coloração 5. Análise dos resultados Preparação do gel Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida Aplicação das amostras Definição do mapa das amostras por canaleta Corrida do gel • Aplicação do campo elétrico • Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão • Terminais positivo e negativo • Tempo adequado, senão o DNA sai do gel Coloração das moléculas • Prata – Gel SDS-PAGE • PoliAcrilamide Gel Electrophoresis – Melhor resolução • Coomassie blue, etc • Brometo de etídio – Agente intercalante do DNA • Cancerígeno! – Composto fluorescente à luz UV – Gel de agarose Eletroforese de um resultado de cromatografia O marcador de peso molecular • Comprado de uma empresa – Possui proteínas de peso molecular bem conhecido • Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra Geis bidimensionais • Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois virase-o e corre-se em outra dimensão • Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra – Maiores géis dão maiores resolução Proteínas não separadas podem ser quantificadas • Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa • Deve-se poder medir o produto da ação enzimática • Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC Estrutura primária das proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Níveis estruturais das proteínas As estruturas primárias das proteínas são conhecidas • Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo • As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas – E principalmente dentro da mesma Sequenciamento de peptídeos • Degradação de Edman – Marca e remove apenas o resíduo N-terminal • Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas • Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina Produção de peptídeos • Purificação a partir de tecidos • Engenharia genética • Síntese química direta Alinhamento de sequências • Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas) – Derivam do ancestral comum entre os organismos • O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína Evolução molecular • Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente Árvore molecular da vida Conclusões • Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas • Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas ou milhares para formar peptídeos e proteínas • As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente • As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese • As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida) • As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra