ESPINDOLA, F. S. . Uso de proteína recombinante e

1
USO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE E PRODUÇÃO DE ANTICORPO PARA
MIOSINA-V E DLC NO ESTUDO DE CÉREBRO DA ABELHA Apis mellifera
ANDRÉA ANDRADE VILELA1, LUCIANA KAREN CALÁBRIA1, MILTON VIEIRA
COELHO1, FOUED SALMEN ESPINDOLA1
RESUMO
Em estudos que envolvem a miosina-V e suas proteínas associadas, em cérebro de
vertebrados e invertebrados, o anticorpo é utilizado como ferramenta essencial. Dessa forma,
esse trabalho tem como objetivo produzir anticorpos anti-DLC1 a partir de proteínas
recombinantes e testar a especificidade de anticorpos anti-cabeça de miosina-V purificados
por imunoafinidade, em homogeneizados de cérebro de abelha rainha e operárias Apis
mellifera.
Palavras chave: miosina-V, DLC, abelha, anticorpo, imunoafinidade.
ABSTRACT
Antibodies are the most important tool to study myosin V and its associated proteins in both
invertebrate and vertebrate brains. This work aims to produce antibodies through recombinant
proteins against DLC1 and to test the specificity of immunoaffinity-purified anti-miosina-V
in Apis mellifera brain homogenates.
Key words: myosin V, DLC, honeybee, antibody, immunoaffinity.
1
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Bloco 2E, sala
39, Av.. Pará s/ número, CEP. 38400-920, Uberlândia-MG, [email protected].
2
conseqüente
INTRODUÇÃO
transcrição
do
gene
(SAMBROOK et al., 1989).
Tecnologia do DNA Recombinante
As proteínas de fusão são geralmente mais
Até a década de 70, o DNA era o
estáveis que a correspondente proteína de
componente celular mais difícil de ser
eucarioto
analisado. Sua seqüência de nucleotídeos
portanto, podem ser obtidas em grande
de enorme tamanho e monotonia química
quantidade. Com isso, a expressão de
era
proteínas
geralmente
analisada
por
meios
produzida
clonadas
em
bactérias
tornou-se
e,
uma
indiretos como a seqüência de proteínas e
abordagem essencial para a produção de
análise genética. Novas técnicas foram
anticorpos
desenvolvidas permitindo o isolamento e o
afinidade, a fim de se realizar estudos
uso de genes específicos num processo
funcionais/estruturais da proteína expressa
chamado de clonagem gênica, que faz
(BUGG et al., 1994).
parte da tecnologia do DNA recombinante
King e Patel King (1995) descreverem a
(BUGG et al., 1994).
clonagem molecular de seqüências de genes
A partir do uso dessa tecnologia e de novas
que correspondem as cadeias leves de
descobertas sobre promotores e repressores
dineína (DLCs) de Clamydomonas de 8 e 11
do genoma de Escherichia coli é possível a
kDa. A região que codifica a DLC foi
clonagem de genes e a manipulação de
clonada em fusão com uma proteína ligante
expressão protéica. O primeiro, e mais
de maltose (PLM). A construção foi inserida
comumente usado, sistema de expressão de
em Escherichia coli XL-1 e a expressão da
proteínas heterólogas em Escherichia. coli é
proteína foi induzida pela adição do IPTG.
baseado no operon lac. Nesse sistema, o
Cerca de 50% da proteína expressa foi
DNA de interesse é clonado em fago ou
purificada através de cromatografia de
plasmídeo contendo o lacI (repressor), lacP
afinidade, e a partir do anticorpo obtido foi
(promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito
possível
para mRNA da β-galactosidase). A indução
homólogas as DLCs de 8 e 11 kDa de
da transcrição é obtida pela adição de um
Clamydomonas em Caenorhabditis elegans.
análogo
não
Um outro estudo, realizado por Espindola e
(isopropiltio-β-D-galactosídeo,
colaboradores (2000), demonstrou através
IPTG), o qual se associa ao repressor e o
de anticorpos anti-DLC Clamydomonas
inibi, deixando o promotor livre para a
(KING
interação
homologia entre a DLC presente no flagelo
de
degradável
lactose
com
a
sintético
RNA
e
polimerase
e
e
a
&
purificação
identificação
PATEL
desses
de
KING,
por
proteínas
1995)
a
de Clamydomonas (KING & PATEL,
3
KING, 1995, KING et al., 1996) com a
cultura primária de hipocampo de rato,
cadeia leve de 10 kDa associada ao domínio
quando analisadas com anticorpos anti-
cauda da miosina-V de cérebro de Gallus
miosina-V produzidos a partir de proteínas
gallus. No mesmo trabalho, o uso de
recombinantes, porém purificados tanto
técnicas
por cromatografia de afinidade quanto por
de
proteínas
recombinantes
possibilitou a síntese de um anticorpo anti-
imunoafinidade
cabeça de miosina-V, usado para confirmar
nitrocelulose.
em
membrana
de
a localização da DLC nesta classe de
miosina.
Material
Anticorpos anti-miosina-V também foram
Moleculares e abelha Apis mellifera
sintetizados em um estudo desenvolvido
As células animais possuem um grande
por Costa e colaboradores (1999) com a
repertório
de
subclonagem de fragmentos dos genes que
associados
ao
codificam os domínios cabeça, pescoço e
denominados de mecanoenzimas, capazes
cauda total da miosina-V de cérebro em
de hidrolisar o ATP e acoplar a energia
fusão com a PLM no vetor pIH902, e
química dessa hidrólise à produção de
subdomínios
cauda
força e movimento necessários a vários
proteína
eventos celulares (RECK-PETERSON et
globular
cauda
associadas
medial
com
e
a
de
Estudo:
motores
Motores
moleculares
citoesqueleto,
também
glutationa transferase (GST) no vetor
al., 2000).
pGEX,
bactéria
Existem três principais proteínas motoras,
Escherichia.coli. O estudo proporcionou
cada uma pertencendo a uma superfamília
evidências bioquímicas que sugeriram que
gênica com muitas classes distintas. Dentre
a miosina-V de cérebro é fosforilada por
essas, as proteínas da família das miosinas,
uma proteína quinase dependente de cálcio
que interagem com filamentos de actina, e
e calmodulina, denominada CaMKII. Além
dineínas e cinesinas que atuam associadas
disso,
utilizando
a
de
miosina-V
MOOSEKER, 1992; LANGFORD, 1995).
a
localização
A classe V de miosinas é composta por 11
subcelular da miosina-V em células B16 de
membros, sendo a miosina–V de cérebro a
melanomas (NASCIMENTO et al., 1997).
primeira
Um trabalho apresentado por Esperafico e
Inicialmente
colaboradores (1998) mostrou diferenças
fosfoproteína de cérebro de coelho de 190
de marcação na região perinuclear de
kDa, ligante de calmodulina e enriquecida
células em cultura de mamíferos e em uma
em sistema nervoso, apresenta atividade
todos
a
anticorpos
também
expressos
imunodetecção
anti-cauda
confirmou
na
microtúbulos
identificada
(CHENEY
&
bioquimicamente.
caracterizada
como
uma
4
MgATPásica
e
A dineína foi inicialmente identificada em
estimulada por Ca2+/calmodulina, mas não
axonema de eucariotos, como uma proteína
atividade
ATPásica,
ATPásica requerida para o batimento de
característica de miosinas (ESPINDOLA et
cílios e flagelos. Posteriormente, foi
al., 1992).
isolada uma forma enzimática de dineína
Considerando a presença da miosina-V em
citoplasmática,
domínios ricos em microtúbulos, como
complexo protéico com multi-subunidades
centrossomos de células em interfase,
envolvidas no transporte axonal retrógrado
pólos
mitótico
de organelas e em alguns aspectos da
(ESPREAFICO et al., 1998), acredita-se
mitose (HUGHES et al., 1995; DICK et al.,
que este motor molecular possa, além de
1996 a, b).
transportar organelas, interagir diretamente
A DLC1 como uma cadeia do complexo da
com
filamentos
dineína, está relaciona a diversas funções,
intermediários, participando de funções
incluindo manutenção da polaridade e
distintas durante o processo de divisão
controle do ciclo celular (FAN et al.,
celular (RAO et al., 2002).
2002), além de funcionar como um
Outras funções atribuídas a miosina têm
regulador de apoptose por seqüestro da
partido de várias linhas de pesquisa,
proteína
incluindo a identificação de organelas e
microtúbulos (PUTHALAKATH et al.,
proteínas que interagem com a miosina-V
1999).
(RECK-PETERSON et al., 2000). Dentre
também como um inibidor neuronal da
essas proteínas, reconhece-se a sintaxina,
PIN (JAFFREY & SNYDER, 1996), como
uma proteína de membrana sináptica que
uma proteína ligante do RNAm do 3 -UTR
co-imunoprecipita
miosina-V
do hormônio da paratireóide (EPSTEIN et
(COSTA et al., 1999), a cadeia pesada da
al., 2000), além de realizar interações com
cinesina, que interage com a cauda
a proteína de controle transcricional 1
globular da miosina-V (HUANG et al.,
kappaB alpha (CREPIEUX et al., 1997).
1999) e uma cadeia leve de massa
Além disso, Espindola e colaboradores
molecular relativa de (Mr) 10 kDa,
(1996) verificaram a presença de uma
associada ao domínio cauda, homóloga a
cadeia leve homóloga a DLC1, com uma
uma cadeia leve de dineína (DLC) e a um
identidade de 85 a 100%, em associação
inibidor da óxido nítrico sintase (PIN)
com a miosina-V. Essa proteína adicional
(ESPINDOLA et al., 1996).
associada a miosina-V pode desempenhar
e
ativada
por
K-EDTA
fibras
do
microtúbulos
fuso
e
com
actina
que
representa
pró-apoptótica
Esta
proteína
foi
Bim
um
dos
identificada
funções que incluem a estabilização da
5
interação entre as duas cadeias pesadas de
Para
miosina-V e papel na ligação dessa com as
informações, conseqüente aprendizado e
cargas transportadas (RECK-PETERSON
armazenamento sob forma de memória é
et al., 2000).
necessário
A partir de um screen em duplo híbrido de
neuronal. As proteínas motoras possuem
levedura tratadas com GKAP (proteína
sua abundância comprovada em tecidos
com domínio associado a guanilato)
nervosos, bem como seu relacionamento
ligadas a proteínas pós-sinápticas (PSD-
com transporte de organelas, vesículas e
95), realizado por Naisbitt e colaboradores
biomoléculas, no intrincado mecanismo de
(2000), foi possível isolar uma nova
transmissão sináptica (MANI et al., 1994).
proteína de mamífero (DLC2) que é
Na abelha Apis mellifera, dados de
idêntica
imunolocalização
em
tamanho
e
altamente
que
haja
que
o
processamento
ocorra
de
comunicação
demonstraram
a
semelhante em seqüência de aminoácidos
presença das proteínas motoras cinesina,
(93%) com a DLC1 humana, mas é
dineína e miosinas na superfície da
claramente derivada de um gene distinto.
membrana do Golgi de fotorreceptores
Um estudo mais recente mostrou que a
(BAUMANN, 1998). Devido a este dado e
proteína DLC2 interage com a Bmf, um
a presença de uma arquitetura cerebral
membro pró-apoptótico da família Bcl-2, e
especializada
co-imunoprecipita
miosina-V,
comunicação bem desenvolvido, as abelhas
enquanto que DLC1 co-imunoprecipita
podem ser consideradas um organismo
com a dineína (PUTHLAKATH et al.,
modelo
1999).
propriedades de proteínas motoras, como a
As abelhas Apis mellifera são insetos
miosina–V, DLC1 e a DLC2.
sociais altamente adaptados, capazes de
Em nosso trabalho utilizamos as técnicas
promover
específicos
do DNA recombinante para a produção de
cujo objetivo é a manutenção da colônia. A
anticorpos anti-DLC1, além de promover a
base molecular de seu comportamento
purificação por afinidade do soro imune
social tem sido amplamente investigada
(ESPINDOLA et al., 2000) para verificar a
devido
com
a
comportamentos
ao
exclusivas,
para
com
a
um
sistema
investigação
de
de
paradoxo
de
possuírem
imunoreatividade e a especificidade do
intrigantes
e
complexas
anticorpo
anti-cabeça
de
miosina-V,
respostas a estímulos baseados em uma
mantido sob refrigeração a -20°C durante
simples e eficiente plasticidade neuronal
10 anos, em homogeneizados de cérebro da
(GIURFA, 2003).
abelha Apis mellifera.
6
terminal, se a sequência não contiver um
METODOLOGIA
códon de terminação e se estiver em fase
Subclonagem em vetor de expressão
com lacZa.
plH902
Fragmentos de cDNA codificantes do
domínio cabeça de miosina –V isolados de
uma biblioteca de cérebro de galinha
(ESPREAFICO
et
aI.,
1992)
foram
subclonados no vetor de expressão plH902
(New England Biolabs, Beverly, M.A.).
Este vetor, representado esquematicamente
na figura 1, contém a origem de replicação,
o forte promotor indutível Ptac, o gene
malE, que codifica a proteína ligante de
maltose (PLM, 42 kDa) e o gene lacZa,
que
codifica
o
fragmento
da
f3-
galactosidase. Entre os genes malE e
lacZa,
encontra-se
uma
sequência
codificadora do sítio de reconhecimento da
protease fator Xa da coagulação e o
"polylinker"
do
vetor,
ou
seja,
um
Subclonagem em vetor de expessão
fragmento de DNA contendo vários sítios
pGEX
para endonucleases de restrição. Também
O
estão presentes o gene lacl codificante do
esquematizado na figura 2, contém o forte
repressor Lac, que mantém o nível de
promotor indutível tac e a sequência
expressão baixo até que seja adicionado o
codificadora
indutor, e o gene da f3-lactamase, que
transferase (GST, 26 kDa) do parasito
confere
Schistosoma japonicum, no qual o códon
resistência
à
ampicilina.
A
vetor
de
da
expressão
enzima
pGEX,
glutationa
clonagem de fragmentos de cDNA em fase
de
com o gene malE resulta na expressão de
"polylinker" contendo sítios únicos de
proteínas de fusão contendo em seu amino-
restrição para BamHI, Smal e EcoRI,
terminal a PLM, seguida do peptídeo ou
seguido de códons de terminação TGA nas
proteína de interesse e de um pequeno
três fases abertas de leitura. O vetor
fragmento da f3-galactosidase no carboxi-
contém também um gene que confere
terminação foi substituído por um
7
resistência à ampicilina, a origem de
contendo Bacto-tryptone 1%, NaCl 1%,
replicação e o gene lacl, codificante do
Bacto-Yest Extrato 0.5%. Os clones foram
repressor Lac, que se liga ao promotor
inoculados diretamente em meio LB estéril
inibindo
com
a
expressão
até
que
seja
adicionado o indutor.
glicose
0.2%
e
antibióticos
Ampicilina (100 µg/mL) e Tetraciclina
(12.5 µg/mL), e
crescidos overnigth à
32°C no shaker a 20 rpm. Adicionou-se a
cultura de bactérias em um novo meio LB
estéril com glicose 0.2% e os antibióticos
Ampicilina (100 µg/mL) e Tetraciclina
(12.5 µg/mL). A cultura foi mantida sob
agitação
a
20
rpm
até
atingir
a
densitometria óptica de 600 nm. Neste
momento, foi coletado uma amostra de
cada cultura para centrifugação a 10.000
xg por 1 min à 4°C para análise em SDSPAGE, sendo consideradas “células não
induzidas”. À cultura remanescente foi
adicionado
o
indutor
IPTG
na
concentração final de 0.3 mM, e a
Expressão da proteína de fusão em
incubação foi mantida por mais 2 horas.
cultura de bactéria Escherichia coli
Ao final deste intervalo, novamente foi
Inicialmente foram expressos três clones
retirado amostra para análise em SDS-
contendo a DLC acoplada a glutationa
PAGE,
transferase (GST) e a proteína ligante de
induzidas”. A cultura foi centrifugada a
maltose (PLM).
4.000 xg por 15 minutos e o precipitado foi
As construções foram
realizadas com DLC1, DLC2 e DLC
sendo
consideradas
“células-
congelado a -70°C.
Clamydomonas inseridas em diferentes
linhagens de bactérias. Com isso, foram
Extração e purificação da proteína de
utilizados os clones: DLC1 GST Bl21
fusão
Códon Plus, DLC2 GST Bl21 Códon Plus
A extração foi realizada apenas com o
e DLC Clamydomonas PIH XLI Blue. A
sedimento da cultura de DLC1 GST Bl21
expressão dos clones transformantes foi
Códon
realizada
ressuspendido, na câmara fria, em 20 mL
utilizando
meio
LB
estéril
Plus.
O
sedimento
foi
8
de tampão de lise (10 mM Tris-HCl, 100
o valor de zero, foi iniciada a eluição da
mM, NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1
proteína. A eluição consistiu da adição de
mM EGTA, azida sódica 0.2 mM),
50 mM Tris-HCl pH 8.0, contendo 5 mM
contendo os inibidores de proteases: 1 mM
de
benzamidina, aprotinina 2 µg/mL, 1 mM
dosadas que apresentaram as maiores
perfabloc.
A
foi
leituras (OD) foram unidas e colocadas em
realizada,
inicialmente,
um
diálise contra 2 litros de PBS pH 7.4 para a
em
saída da glutationa reduzida, à 4°C, sob
homogeneizador
homogeneização
tipo
em
Dounce
e
glutationa reduzida. As amostras
seguida, procedeu-se a lise bacteriana na
agitação
French
amostras do dialisado para análise em
Press,
por
alta
pressão
overnight.
Foram
retiradas
(1800PSIG), quando então o lisado foi
SDS-PAGE
coletado. Após a lise, foi feita uma
centrifugação a 30.000 xg a 4°C durante 15
centrifugação a 16500 xg por 10 minutos a
minutos. O precipitado foi armazenado a -
4°C. Foram retiradas amostras para análise
80°C para posterior dosagem protéica.
e
foi
realizada
uma
em SDS PAGE do precipitado (P1) e do
sobrenadante (S1). Com o sobrenadante
Imunização de coelho com proteína de
contendo as proteínas solúveis procedeu-se
fusão DLC-GST
a purificação.
As proteínas de fusão de DLC-GST, já
A purificação da proteína DLC1 acoplada
extraídas e purificadas foram injetadas em
GST foi realizada por cromatografia de
coelhos de dois meses de idade, mantidos
afinidade
pelo
liofilizada
em
de
resina
glutationa
(Amersham/Pharmacia).
nosso
Laboratório
no
Hospital
A
Veterinário da Universidade Federal de
coluna foi previamente recuperada e
Uberlândia–MG. As injeções foram feitas
equilibrada com tampão de lise. Após a
via cutânea e intramuscular, com a proteína
adição do sobrenadante à coluna, essa foi
emulsificada com 1 volume de adjuvante
lavada com 3 volumes de tampão de
de Freund completo na primeira injeção e
renaturação (TR) pH 8.2 (100 mM Tris-
incompleto nas subseqüentes. O seguinte
HCl, 500 mM NaCl, 1 mM EGTA)
esquema de imunização foi seguido: 1ª
acrescido de Tween 0.25% (9 mL de TR
injeção contendo 200 a 250 µg de proteína,
em 25 µL de Tween ), e em seguida lavada
1o reforço 15 dias depois e 2o reforço 21
com 5 volumes de TR sem Tween para a
dias após o primeiro, cada um com 100 a
coleta e dosagem no espectrofotômetro de
150 µg do antígeno. No 7ª dia após o 2o
cada 1 mL do fluido, a uma absorbância de
reforço
280 nm. Quando a densidade óptica atingiu
quantidade de sangue pela orelha, e a partir
foi
coletado
uma
pequena
9
da centrifugação a 2.500 xg por 10 minutos
homogeneização (40 mM Hepes, 10 mM
a 4°C obteve-se os soros. Após o uso, foi
EDTA, 2 mM EGTA, 5 mM ATP, 2 M
adicionado 0.2 mM de azida sódica ao
DTT,
soros imune e esses foram mantidos a
Aprotinina, 0.15 M PMSF) em 5 séries de
–20°C.
30 segundos, com intervalos de 1 minuto
1
M
Benzamidina,
1
mM
entre as séries. O homogeneizado foi
Purificação de anticorpos anti-cabeça de
centrifugado a 10.000 xg por 10 min a 4°C
miosina-V por imunoafinidade
e o sobrenadante foi utilizado para a
Uma fração enriquecida de miosina-V de
dosagem de proteína, segundo o método de
cérebro de galinha (S5) imobilizada em
Bradford (1976).
membrana de nitrocelulose foi gentilmente
cedida pelo Prof.Dr. Roy Larson (FMRP-
Eletroforese em gel de poliacrilamida na
USP) para a purificação por afinidade do
presença de SDS (SDS-PAGE)
soro imune (ESPINDOLA et al., 2000)
Na eletroforese foi utilizado o sistema de
armazenado a -20°C durante 10 anos. O
tampão descontínuo descrito por Laemmili
soro foi pré-clareado com centrifugação de
e Favre (1973). As amostras foram tratadas
10.000 xg por 20 min à 4°C e incubado
com tampão desnaturante e adicionadas a
com a fita de nitrocelulose por 2 horas à
géis com gradiente de acrilamida de 5 a
temperatura ambiente. Após remover o
22%.
soro pré-adsorvido, a fita foi lavada com
TBS-Tween. O anticorpo purificado foi
Dot blot
eluído com 1.4% de trietilamina, incubada
Amostras de homogeneizado de cérebro de
por 5 minutos com agitação à temperatura
pintainho
ambiente e a reação foi neutralizada com
aplicados em membranas de nitrocelulose a
100 µL de TBS-Tween [10X] pH 8.0. Para
uma concentração de 20 µg de proteína. As
realizar a diálise foi utilizado tampão TBS-
membranas foram bloqueadas com tampão
Tween [1X] pH 7.6 a 4°C. Os anticorpos
bloqueio (leite desnatado 5% em TBS-
foram armazenados com 0.2 mM azida, em
Twenn 0.5%) por 1 hora à temperatura
refrigeração.
ambiente com agitação. Em seguida, foram
lavadas
e
em
abelha
tampão
campeira
foram
TBS-Tween
e
Homogeneização de cérebro
incubadas overnigth com os anticorpos
Cérebros de abelhas rainha, operárias
primários
campeiras e nutridoras e pintainho foram
purificados, diluídos 1:1.000. Seguiu-se a
homogeneizados
incubação com anticorpo secundário anti-
em
tampão
de
anti-cabeça
de
miosina-V
10
coelho conjugado com peroxidase e a
revelação com NBT-BCIP diluído em
tampão fosfato.
Western blot (TOWBIN et al., 1979)
Amostras
de
transferidas
homogeneizado
para
foram
membrana
de
nitrocelulose e coradas com Ponceau 0.5%.
Logo em seguida, as membranas foram
bloqueadas com solução bloqueio por 4
horas, à temperatura ambiente, lavadas em
PBS-Tween e incubadas com um anticorpo
anti-cabeça de miosina-V purificado e
anticorpo
secundário
conjugado
com
peroxidase. A especificidade do anticorpo
foi detectada por quimiluminescência,
seguindo o protocolo do fabricante (ECL).
Após ressuspender e homogeneizar os
RESULTADOS
sedimentos obtidos com a expressão do
Expressão dos clones DLC1 GST Bl21
clone DLC1 GST foi possível obter as
Códon Plus, DLC2 GST Bl21 Códon
proteínas solúveis em um sobrenadante e
Plus e DLC Clamydomonas PIH XLI
purificá-las através de uma coluna de
Blue
afinidade, contendo glutationa reduzida.
A figura 3 mostra o perfil eletroforético
Os
das proteínas de fusão, induzida com IPTG
absorbância a 280nm foram reunidos para
e
diálise e análise em SDS-PAGE (Figura 4).
não-induzida.
Pode-se
observar,
comparando a amostra de células nãoinduzidas e induzidas, a obtenção de altos
níveis de expressão e uma expressão não
significativa antes da adição do indutor
(IPTG).
As
proteínas
de
fusão
apresentaram massa molecular relativa
(Mr) de, aproximadamente, 36 kDa.
eluidos
que
apresentaram
maior
11
concentrações protéicas 0.483, 0.548 e
0.602 ug/uL, respectivamente.
Especificidade dos anticorpos gerados
A reatividade dos anticorpos 1909, 2809 e
0810 foi testada através de Dot blot, em
amostras de homogeneizado de 30 cérebros
de abelha campeira e 1 cérebro de
pintainho,
utilizado
como
controle
positivo. A marcação para todos os
anticorpos foi positiva (Figura 5).
Purificação de anticorpo anti-cabeça de
miosina-V,
por
método
de
imunoafinidade
Os anticorpos anti-cabeça de miosina-V
foram purificados a partir do soro imune
(ESPINDOLA et al., 2000) armazenado a 20° durante 10 anos, contra uma fração
enriquecida de miosina-V de cérebro de
A fim de determinar a especificidade do
galinha (S5) imobilizada em membrana de
anticorpo M-VRP em abelha, amostras de
nitrocelulose, gentilmente cedida pelo
homogeneizados de cérebro de rainha,
Prof. Dr. Roy Larson (FMRP-USP). O soro
operárias campeiras e nutridoras foram
foi incubado na membrana de nitrocelulose
aplicados em SDS-PAGE e o anticorpo foi
e os anticorpos foram eluídos com
testado por Western blot (Figura 6). Na
trietilamina
de
análise das membranas observou-se o
purificação resultou na produção de 4
reconhecimento de um polipeptídeo de Mr
anticorpos, sendo o primeiro produzido em
190 kDa, em todas as amostras testadas,
Ribeirão Preto e denominado M-VRP com
que possivelmente corresponde a cadeia
uma concentração protéica de 0.750 ug/uL,
pesada da miosina-V.
1.4%.
A
seqüência
e os seguintes denominados 1909, 2809 e
0810, de acordo com a data em que foram
produzidos,
com
as
seguintes
12
mantidos
em
condições
ideais
de
refrigeração, podem ser purificados por
afinidade e conservam sua reatividade.
Na síntese de proteínas recombinantes há a
promoção da expressão da proteína de
interesse em fusão com um tag específico a
partir de um indutor denominado IPTG e
sua
purificação
ocorre
através
de
cromatografia por afinidade em resinas
acopladas com ligantes específicos para o
tag (SASSENFELD, 1990). Nos ensaios de
expressão das proteínas recombinantes,
foram obtidos resultados positivos para
todos os clones testados, confirmada
através do perfil eletroforético diferencial
das amostras que sofreram indução com
IPTG em relação às amostras que não
sofreram indução.
Somente a proteína DLC1 foi purificada
para a produção do anticorpo. De acordo
com o perfil eletroforético das amostras
eluídas da coluna de glutationa sepharose é
possível
observar
um
alto
grau
de
purificação e de conservação da proteína,
DISCUSSÃO
visto os baixos níveis de degradação.
Considerando
da
Considerando estudos que relatam a
padronização de técnicas sobre a produção
associação da DLC1 com a dineína
e
(PUTHLAKATH
a
a
purificação
importância
de
anticorpos
em
et
al.,
1999)
os
quantidade ideal para ensaios bioquímicos,
anticorpos
histoquímico e estudos de neurobiologia de
utilizados para uma melhor caracterização
invertebrados, nosso trabalho detalhou a
da localização e participação da dineína em
técnica de produção de anticorpos contra
processos celulares que ainda não foram
proteínas
recombinantes,
de
totalmente elucidados. Para a produção de
comprovar
que
se
anticorpos anti DLC2, que se associa a
esses
além
anticorpos,
produzidos
poderão
ser
13
miosina-V,
coelhos
estão
sendo
Nossos
resultados
de
constantemente imunizados com a proteína
imunodetecção, realizado inicialmente em
de fusão purificada. Esses anticorpos anti-
Dot-Blot, confirmaram a reatividade dos
DLC2
a
anticorpos purificados, porém contra o
continuidade dos estudos da participação
homogeneizado total de cérebro de abelha
da miosina-V no mecanismo neural da
e pintainho. Com isso, foi realizada uma
abelha Apis mellifera.
nova imunodetecção por Western-Blot para
Além disso, os resultados apresentados
confirmar a especificidade do anticorpo
confirmam que é possível obter um
contra a miosina-V, que apresentou como
anticorpo funcional a partir de um soro de
marcação uma banda de aproximadamente
coelho
190
serão
importantes
imunizado
para
com
proteína
kDa,
correspondente
a
massa
recombinante e armazenado por um longo
molecular da proteína, o que possibilita
período em refrigeração a -20°C, através
afirmar
de purificação por imunoafinidade contra
especificidade do anticorpo.
uma
Dessa
fração
imobilizada
em
protéica
uma
enriquecida
membrana
de
nitrocelulose.
Seguindo
essa
a
manutenção
forma,
a
da
padronização
alta
dos
mecanismos de produção de anticorpos
anti-miosina-V e anti-DLC que envolvem
metodologia,
foram
técnicas de biologia molecular, ensaios
purificados quatro anticorpos anti-cabeça
bioquímicos e imunológicos são essenciais
de miosina-V a partir de um soro imune de
para
coelho (ESPINDOLA et al., 2000) e sua
ferramenta como meio de estudo, e os
especificidade
em
anticorpos produzidos e purificados nesse
homogeneizados de cérebro de abelhas
trabalho abrem perspectivas para novas
rainha e operárias, e em pintainho, como
descobertas na área da neurobiologia e
controle positivo. Estudos bioquímicos
neurociência comportamental da abelha
anteriores revelaram que a miosina-V está
Apis mellifera.
foi
testada
pesquisas
que
utilizam
essa
bastante enriquecida em tecido nervoso e
em alguns tecidos secretórios. Calábria
(2004)
mostrou
com
detalhe
AGRADECIMENTOS
a
imunolocalização de miosina-V no cérebro
Agradecemos aos professores Dra. Enilza
de operária campeira; e Passos-Lima
Maria Espreafico e Dr. Roy Edward Larson
(2001) imudetectou em cérebro de Apis
do Departamento de Biologia Celular e
mellifera e Melípona scutellaris tanto
Molecular e Bioagentes Patogênicos da
miosinas –V e –VI, como também dineína.
Universidade de São Paulo, em Ribeirão
14
Preto/SP; e aos professores Dra. Ana Maria
CHENEY, R. E.; MOOSEKER, M. S.
Bonetti e Dr. Luis Ricardo Goulart Filho do
Unconventional myosins. Current Opinion
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pela disponibilidade da estrutura laboratorial
e seus reagentes. Ao Apiário Girassol pelas
COSTA, M. C; MANI, F; SANTORO, W;
abelhas. Ao CNPq pelo auxílio financeiro
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