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western blotting

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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA
RIO GRANDE DO NORTE
PROF.: MS. RAQUEL MAIA
BIOLOGIA II
DISCENTES:
WESTERN BLOTTING
ALMIR SILVA TEODORO JÚNIOR;
JOAILSON MIRANDA DA SILVA JÚNIOR;
JOÃO ROGER MACÊDO DA SILVA;
LARA
GABRIELLY
CARVALHO
ARAÚJO
NARA LUANA DANTAS SALDANHA;
SILLAS VINICIUS FÉLIX MEDEIROS;
MACILÉIA DA SILVA DAVI;
DE
CURRAIS NOVOS/RN
2019
HISTÓRICO
• Criação;
• Termo “blot”
• Em que consiste a técnica;
• Resumida em 5 etapas;
• Imunodetecção;
EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
• Realização dos experimentos de Western blotting;
• O mais utilizado para quantificar as proteínas em uma
solução é o ensaio de Bradford;
• Baseia-se na mudança de cor do corante blue G-250;
• Interações hidrofóbicas e iónicas;
FRACIONAMENTO DAS PROTEÍNAS
Dodecil Sulfato de Sódio
Gel de Poliacrilamida para Eletroforese
• Eletroforese → SDS-PAGE "técnica que envolve a migração
de partículas em um determinado gel" (PAGAND, 1999);
• Polimerização de monômeros;
• Agente redutor → beta-mercaptoetanol;
• Separação de todos os tipos de proteína;
FRACIONAMENTO DAS PROTEÍNAS
TRANFERÊNCIA DE PROTEÍNAS
• MÉTODOS:
Por difusão;
Por capilaridade;
Por vácuo;
• MAIS USADO:
 Eletroblotting;
• Em que consiste;
• Fatores de eficiência;
• Corante panceau S
TRANFERÊNCIA DE PROTEÍNAS
INCUBAÇÃO
• FASES:
1º Anticorpo primário;
2º Proteína de interesse;
3º Anticorpo secundário;
4º Anti-IgG;
• Modificação
que
permite a visualização
da
proteína
de
interesse;
REVELAÇÃO PARA ANÁLISE DE DADOS
• Conjugação do anticorpo com uma enzima;
• Associação do anticorpo com um fluoróforo;
Detecção por
Quimioluminescência
Detecção por fluorescência
WESTERN BLOTTING
• Uso;
 EETs; LVA;
• Vantagens e desvantagens;
• Técnica ELISA;
COMO INTERPRETAR OS RESULTADOS
COMO INTERPRETAR OS RESULTADOS
COMO INTERPRETAR OS RESULTADOS
• 1) A metodologia de “Western Blot" é considerada como teste
confirmatório para a infecção pelo HIV de acordo com o Manual Técnico
para Diagnóstico da Infecção pelo HIV (Ministério da Saúde). O resultado é
considerado positivo pela presença de proteínas virais representadas por
bandas reveladas no teste.
Assinale a opção que indica um teste positivo.
a) p 24.
b) p24 e gp 120.
c) gp 41 e p 66.
d) p 17 e p 55.
e) gp 60.
COMO INTERPRETAR OS RESULTADOS
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