SO3- Métodos de identificação de biomoléculas e análise de

SO3- Métodos de identificação de biomoléculas e análise de proteínas
Objectivos:
1. Discutir a identificação das principais biomoléculas (lípidos, proteínas, hidratos de carbono e nucleótidos)
2. Discutir diferentes métodos de análise de proteínas, desde a sua identificação até à avaliação funcional
3. Explicar exemplos do estudo de proteínas para o diagnóstico em Medicina.
Biomoléculas
As biomoléculas são moléculas orgânicas constituintes das células que desempenham diversas funções vitais no
organismo, daí a importância do seu estudo. Para entender os métodos usados para a sua análise é indispensável
conhecer algumas das suas características.
Hidratos de carbono
 Grupos funcionais: C=O/CHO e –OH
 Os grupos hidroxilo (OH) permitem:
- Forte interacção com H2O
- Interacções com grupos funcionais
- Fortes interacções intra- e inter-moleculares por ligações H
 Os HC são classificados de acordo com:
- Tamanho da cadeia carbonada
- Número de unidades de açucar (ose)
- Localização de C=O/CHO (estereoisomeria)
 Classificação:
- monossacarídeos ou oses (glícidos mais simples compostos por 3 a 9 átomos de carbono. Os mais comuns são as
pentoses, como a ribose, e as hexoses, como a glicose e a pentose.)
- oligossacarídeos (conjuntos de 2 a 10 monossacarídeos unidos através de ligações glicosídicas. A maltose e a
sacarose são dissacarídeos)
- polissacarídeos (conjunto com mais de 10 monossacarídeos, como a celulose e o glicogénio)
 Funções
- Metabolismo energético (ex.: glucose)
- Reservas de carbono e energia (ex.: glicogénio e amido)
- Estrutura dos ácidos nucleicos (ex.: ribose e desoxirribose)
- Estruturas de suporte (ex.: celulose e quitina)
- Reconhecimento celular (ex.: glicoproteínas)
 Identificação
Os monossacáridos cíclicos, em solução aquosa, podem ser oxidados, reduzindo iões metálicos como o ião cobre em
solução, formando um precipitado.
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Lípidos
 Insolúveis em água e solúveis em solventes apolares (ex.: acetona)
 Ésteres de ácidos gordos ou amidas de ácidos gordos (os ácidos gordos são cadeias lineares de átomos de
carbono, com um grupo terminal carboxilo –COOH))
 Funções:
- função estrutural (ex.: os fosfolípidos são constituintes das membranas celulares)
- função energética (ex.: triglicerídeos)
- função reguladora (ex.: hormonas sexuais – testosterona e progesterona)
Nucleótidos
 Constituição
- pentose (monossacarídeo com 5 átomos de carbono. O DNA contém desoxirribose e o RNA contém ribose)
- grupo fosfato (confere características ácidas)
- base azotada (bases púricas ou de anel duplo: adenina e guanina; bases pirimídicas ou de anel simples: citosina,
timina e uracilo)
 Funções
- armazenamento e transmissão da informação genética (os ácidos nucleicos são polímeros de nucleóticos)
- transporte de energia (ATP)
- constituição de coenzimas (a adenina entra na constituição de muitas coenzimas)
- mensageiros químicos (actuam na resposta das células a hormonas ou outros estímulos extracelulares)
 Detecção de ácidos nucleicos
- coloração com brometo de etídio
- coloração com nitrato de prata
Proteínas
 Polímeros de aminoácidos ligados por ligações peptídicas (existem 20 aminoácidos diferentes, constituídos por
um grupo amina NH2, um grupo carboxilo COOH, um átomo de hidrogénio e um radical, que varia de aminoácido
para aminoácido, ligados ao mesmo átomo de carbono. As ligações peptídicas estabelecem-se entre o grupo
carboxilo de um aminoácido e o grupo amina de outro. As proteínas apresentam uma estrutura tridimensional
bem definida)
 Grupos funcionais (as proteínas podem conter uma porção não proteica, ligando-se a alcoóis, ácidos
carboxílicos…)
 Organização estrutural:
- estrutura primária (sequência de aminoácidos unidos por ligações peptídicas)
- estrutura secundária (na estrutura em folha pregueada, as cadeias da estrutura primária dispõem-se paralelamente
e ligam-se por pontes de hidrogénio. Na estrutura em hélice, as cadeias peptídicas enrolam-se devido ao
estabelecimento de pontes de hidrogénio entre grupos amina e grupos carboxilo de aminoácidos diferentes)
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- estrutura terciária (a estrutura secundária pode dobrar-se sobre si, ficando com uma forma globular)
- estrutura quaternária (as várias cadeias globulares podem estabelecer ligações entre si)
 Funções
- estrutura (ex.: colagénio)
- enzimas (ex.: pepsina, no suco gástrico)
- hormonas (ex.: insulina)
- defesa (ex.: anticorpos)
- Transporte (ex.: hemoglobina)
- Canais (na membrana plasmática)
 Detecção
Todos os compostos que possuem ligações peptídicas reagem com o sulfato de cobre (II) em meio alcalino,
originando um produto solúvel de cor violeta
Propriedades que permitem a distinção e a separação das biomoléculas
A distinção e a separação das várias biomoléculas apenas são possíveis devido a várias propriedades que
apresentam.
 Propriedades químicas que permitem distinguir as principais classes de biomoléculas (solubilidade aquosa;
propriedades redutoras; presença de azoto)
 Propriedades físicas que permitem separar biomoléculas (massa, volume, densidade, propriedades redox - carga);
 Propriedades químicas que permitem separar biomoléculas (grupos funcionais);
 Propriedades fisíco-químicas (solubilidade, afinidade da ligação)
Métodos de separação e purificação de biomoléculas
O estudo da função de uma biomolécula requer que seja previamente isolada no seu estado puro. Existem vários
métodos para separar as biomoléculas, mas é necessária uma combinação dos vários processos para conseguir a sua
purificação.
 Cromatografia
 Electroforese
 Diálise
 Ultracentrifugação
 Salt fractionation
Embora o salt fractionation seja o único processo utilizado apenas para a separação das proteínas, iremo-nos referir
somente à purificação destas biomoléculas em especial, já que um dos principais objectivos deste trabalho é
conhecer os seus métodos de análise.
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Cromatografia
A coluna de cromatografia é um dos métodos mais utilizados para separar biomoléculas. Aplica-se uma mistura de
biomoléculas, consoante o grupo destas que se quer separar, no topo de uma coluna cilíndrica preenchida com uma
resina sólida e permeável, imersa num solvente. Uma grande quantidade de solvente é bombeada através da coluna.
Uma vez que a passagem das diferentes biomoléculas será retardada conforme os seus diferentes graus de
interacção com a resina, essas biomoléculas poderão ser recolhidas separadamente quando fluírem para fora da
coluna. De acordo com o tipo de resina, as biomoléculas podem ser separadas consoante as suas cargas, as suas
hidrofobidades, o seu tamanho ou pela sua habilidade de se ligarem a um grupo químico particular)
Cromatografia de filtração em gel
Esta técnica faz a separação das proteínas com base no seu tamanho. Neste procedimento, a amostra de proteínas é
colocada no cimo de uma coluna cheia de grãos porosos (as moléculas pequenas podem entrar nestes grãos, mas as
grandes não). Assim, as proteínas mais pequenas são retardadas pois demoram a atravessar os grãos, ocupando um
maior volume, enquanto as maiores, não podendo entrar nos grãos, ocupam apenas o volume exterior a estes,
atravessando-o mais rapidamente.
Este processo também permite uma estimativa do tamanho das proteínas.
Cromatografia de troca iónica
Este tipo de cromatografia separa proteínas de acordo com a sua carga.
Se a proteína que se pretende isolar tiver carga positiva, a solução deve passar por uma coluna com moléculas de
carga negativa. Assim, as proteínas com carga positiva ligam-se a grãos de carga negativa enquanto as de carga
negativa ou nula atravessam a coluna, separando-se.
As proteínas de carga positiva podem ser então libertadas por adição de NaCl, pois o catião Na+ compete com a
proteína pela ligação à coluna.
A associação entre a proteína e a coluna depende do pH e da força iónica da solução que por ela passa.
Cromatografia de afinidade
Esta técnica baseia-se nas funções biológicas da proteína.
A coluna contém moléculas que interagem especificamente com a proteína de interesse. Assim, a amostra passa
através da coluna, ficando a proteína pretendida ligada a ela (por afinidade com à referida molécula), enquanto
outras proteínas são libertadas.
A proteína com afinidade pelas moléculas pode ser libertada por uma mudança de pH do solvente, ou passando
através da coluna uma solução que contenha uma elevada concentração de ligando livre.
Este é um modo muito eficiente de purificação.
Ex: Afinidade de uma enzima a um substrato ou de um antigénio a um anticorpo.
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Cromatografia de interacção hidrofóbica:
Este método baseia-se nas propriedades hidrofóbicas dos solutos para os separar.
As áreas hidrofóbicas (apolares) das proteínas ligam-se aos ligandos hidrofóbicos da coluna (ex: grupos fenil).
Quanto mais hidrofóbico for o constituinte, mais forte é a ligação à coluna.
Cromatografia líquida de alta pressão
Esta técnica melhora o poder de resolução de todas as técnicas de cromatografia em coluna. Esta usa materiais da
coluna mais finos, o que cria mais pontos de interacção. Tem de ser aplicada uma pressão à coluna para obter taxas
adequadas de fluxo, obtendo-se uma grande eficiência e uma separação rápida.
Há ainda a cromatografia de fase reversa, que usa solventes orgânicos para a libertação dos solutos ligados à coluna
utilizada. Estes solventes podem causar desnaturação das proteínas e por isso esta técnica não é muito utilizada nas
proteínas.
Electroforese
Tal como foi referido anteriormente, a electroforese consiste na aplicação de um campo eléctrico, que irá induzir a
migração das moléculas consoante a carga que apresentam. Assim sendo, numa solução com pH acima do ponto
isoeléctrico, uma proteína carregada negativamente tende a migrar para o ânodo do campo eléctrico (eléctrodo
positivo de uma fonte eléctrica de alimentação), enquanto que, abaixo do ponto isoeléctrico, uma proteína
carregada positivamente tende a deslocar-se, em sentido contrário, para o cátodo ( eléctrodo negativo).
A mobilidade electroforética/velocidade de migração das diferentes proteínas depende de factores como:
 a intensidade do campo eléctrico;
 o coeficiente de atrito;
 a carga global, o tamanho e a forma da protéina;
 o pH, a temperatura e a viscosidade (oferece resistência resultante do atrito entre as moléculas e o meio) do
meio;
 a adição de electrólitos ou substâncias não ionizáveis.
Existem diferentes tipos de electroforese (electroforese livre/frente móvel, de zona, em papel, em acetato de
celulose, em gel – SDS-PAGE, bidimensional e ainda a focagem isoeléctrica). Contudo decidimos mencionar com mais
pormenor as 3 últimas.
Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A técnica do SDS encontra-se intimamente relacionada com a electroforese em gel, pois permite a desnaturação das
proteínas, antes de estas serem colocadas no gel, onde irão sofrer electroforese.
O SDS, também conhecido por solução de dodecil sulfato de sódio é um detergente aniónico que, através da ruptura
de diversas ligações, consegue desnaturar a proteína, convertendo-a numa estrutura linear, com densidade de carga
uniforme.
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Este gel funciona como uma espécie de “crivo/peneira”, que permite a movimentação, através dos esporos do gel,
de moléculas que sejam mais pequenas que estes. Por outro lado, moléculas muito maiores que os esporos ficam
quase imóveis. Desta forma conseguimos obter uma separação das diferentes proteínas, de acordo com o seu
tamanho e peso molecular, pois cada proteína desloca-se a uma velocidade diferente, em função das suas
propriedades.
Focalização isoeléctrica
Esta técnica tem como ponto de partida os diferentes pontos isoeléctricos (valor de pH ao qual a molécula apresenta
uma carga global nula ou neutra) de cada proteína que, juntamente com a acção do campo eléctrico, o
estabelecimento de um gradiente de pH e a adição de tampões especiais (anfólitos), irão provocar a migração das
proteínas em direcção ao eléctrodo com carga oposta. Assim sendo, cada proteína deslocar-se-á no gel de
poliacrilamida até atingir uma região que apresente pH igual ao seu pI. Como resultado obteremos diferentes faixas
que podem ser cortadas e utilizadas noutras experiências.
Para perceber: O gradiente de pH no gel é formado pela electroforese de uma mistura de polianfólitos (pequenos
polímeros com múltiplas cargas) com diferentes valores de pI.
Electroforese bidimensional em gel
Esta técnica de separação de proteínas apresenta uma maior resolução/poder de separação, pois tem a capacidade
de separar mais de 1000 proteínas, contrabalançando com a capacidade de separação dos outros tipos de
electroforese (menos de 50 proteínas). Esta eficácia deve-se ao facto de a electroforese bidimensional combinar
vários processos distintos.
Numa primeira etapa, uma amostra de proteínas é sujeita à focalização isoeléctrica, obtendo-se a separação das
mesmas tendo em conta o seu pI. De seguida, o gel resultante da primeira técnica é sujeito a SDS-PAGE, sofrendo
novamente electroforese mas, desta vez, em direcção perpendicular à da separação original. Desta forma
conseguimos obter, no gel, um padrão bidimensional de pontos spot, no qual as proteínas foram primeiramente
separadas de acordo com o seu ponto isoeléctrico na direcção horizontal e de seguida com base na sua massa numa
direcção vertical.
Diálise
A diálise é um processo que separa substâncias e que se baseia na utilização de membranas semipermeáveis. Na
verdade, estas são atravessadas por líquidos e pelas moléculas mais pequenas, ficando as de maiores dimensões
retidas.
Ultracentrifugação
Técnica onde se utiliza uma centrífuga que, através de rotações a elevadíssima velocidade, cria forças centrífugas de
grande intensidade fazendo com que o material mais denso (mais pesado) se deposite no fundo dos tubos. Assim, as
moléculas em solução criam camadas que poderão ser mais facilmente separadas.
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Salt fractionation
Procedimento utilizado para separar proteínas através da precipitação. O sal mais comum utilizado é o sulfato de
amónia ((NH4) 2SO4), pois é extremamente solúvel em água e consegue estabilizar muitas proteínas. O sulfato de
amónia pode competir com as proteínas por água. Por este motivo, a água que hidrata a superfície da proteína pode
ser retirada, permitindo assim a interacção entre grupos hidrofóbicos da superfície da proteína, fazendo com que
elas precipitem. Como normalmente as proteínas têm diferentes grupos hidrofóbicos na sua superfície, estas
precipitam com diferentes concentrações de sais e assim pode ocorrer algum fraccionamento aquando da separação
das proteínas.
Salting in: é o primeiro passo. Mantém-se baixa a concentração de sais e, portanto, aumenta a solubilidade das
proteínas. Assim, as proteínas ligam-se ao sal e separam-se de todo o resto (p. ex. proteínas que não nos interessa
separar).
Salting out: é o segundo passo. Aumenta-se a concentração de sal para que diminua a solubilidade das proteínas
(pois os sais têm maior afinidade entre eles do que com as proteínas). Assim, o sal e as proteínas separam-se e
conseguimos isolar as proteínas desejadas.
Métodos usados para determinar a estrutura das biomoléculas
Após a purificação de uma biomolécula é possível determinar a sua estrutura.
 Análise elementar
 Radiação ultravioleta, vísivel e infravermelha (para estudar a absorção, emissão e refracção de luz)
 Espectroscopia de NMR (ressonância magnética nuclear) (uma solução concentrada de pequenas proteínas é
colocada num campo magnético forte e submetida a radiações de rádio, determinando-se a distância entre os
pares de átomos de hidrogénio que interagem)
 Espectroscopia de massa
 Cristalografia de raio-X (quando um feixe de raios-X é dirigido para um cristal de uma proteína pura, alguns raios
são desviados pelos átomos, surgindo um padrão de manchas num detector de raio-X, que contém informação
sobre a posição dos átomos na proteína)
 Ácidos e de bases (a utilização de ácidos e de bases para degradar uma biomolécula permite o estudo dos seus
constituintes básicos)
 Enzimas (utilização de um conjunto de enzimas que uma determinada biomolécula. Ex.: proteases, nucleases…)
 Sequenciação das cadeias (as técnicas anteriormente referidas não são suficientes para determinar a estrutura
tridimensional das proteínas, também é necessário estudar a sequenciação de aminoácidos)
Avaliação funcional das proteínas
 Clivagem (a clivagem selectiva de uma proteína produz diferentes conjuntos de fragmentos peptídicos, que
podem ser estudados para formar a sequência completa dos aminoácidos na proteína)
 Sequenciação da proteína
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 Estrutura tridimensional (a estrutura tridimensional de uma proteína está directamente relacionada com a sua
função, pelo que o seu estudo é essencial)
As proteínas têm sequências de aminoácidos especiais que são determinadas geneticamente. Estas sequências
indicam a estrutura tridimensional das proteínas que por sua vez condiciona as funções desempenhadas por elas.
A função das proteínas depende da afinidade entre essas proteínas e outras moléculas, quer sejam aminoácidos,
outras proteínas ou substractos.
É a estrutura terciária da proteína que define a localização dessas superfícies de ligação e as propriedades químicas
das cadeias de aminoácidos que as rodeiam.
Exemplos da especificidade de ligação das proteínas:
 A aminoacil-tRNA sintetase liga-se a diversos aminoácidos, activando-os para que possam constituir uma cadeia
polipeptídica. O aminoácido valina é identificado embora seja similar ao aminoácido isoleucina (síntese proteica)
 ligação enzima-substracto (actividade enzimática).
Importância da análise de proteínas
As proteínas desempenham importantes funções no organismo e resultam da expressão da informação genética,
pelo que o seu estudo é essencial para o diagnóstico em Medicina.
Por exemplo, quando se requer a realização de análises sanguíneas, as proteínas do soro sanguíneo podem ser
analisadas através de electroforese em gel. As proteínas dispersam-se em bandas paralelas, que podem ser fixadas e
coloridas. Utilizando um aparelho óptico, é possível conhecer a densidade de coloração de cada banda, doseando a
concentração das diferentes proteínas. Um valor anormal de uma determinada proteína num fluido corporal
(sangue, urina, líquido céfalo-raquideo…), em conjunto com outros sintomas, poderá permitir o diagnóstico do
paciente.
Por exemplo:
 Hipoproteinémia (défice de proteínas)
Creatininémia (a creatinina é eliminada na urina, por filtração glomerular. A sua retenção revela um índice de
insuficiência glomerular, o que pode ser causado por nefropatias, nefrose po produtos tóxicos como Hg e Ag e
insuficiência cardíaca (pode existir uma retenção discreta ou moderada de creatinina, embora não exista verdadeira
nefropatia)
 Hiperproteinémia (excesso de proteínas)
Antigénio prostático específico (proteína produzida pelas células da glândula prostática que existe em baixos valores
no sangue. Níveis mais elevados desta proteína podem ser provocados pelo cancro das próstata ou por condições
benignas como prostites (inflamação da próstata) e hiperplasia benigna da próstata (aumento da próstata). Níveis
isolados de PSA não dão ao médico informação suficiente para distinguir entre condições benignas da próstata e
cancro. Contudo, o médico tem em conta os resultados do teste do PSA para procurar outros sinais de cancro da
próstata)
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Proteína C reactiva (é uma proteína plasmática produzida pelo fígado que quando existe em elevadas quantidades
pode ser sinónimo de infecção ou de inflamação dos tecidos. Dores abdominais, um hemograma que revele um
elevado número de glóbulos brancos no sangue e o aumento da concentração da PCR no sangue podem diagnosticar
uma apendicite)
Por outro lado, sendo as proteínas o resultado da expressão da informação genética do indivíduo, a alteração de
uma proteína resulta da anomalia na sequência genica, pelo que os métodos de análise de proteínas também podem
ser importantes para o diagnóstico de doenças genéticas. Contudo, normalmente não é necessário recorrer a estas
técnicas para diagnosticar uma doença genética, já que os sintomas do paciente juntamente com a sua história
clínica podem permitir o diagnóstico.
 Anemia falciforme (doença hereditária provocada por uma alteração no gene do cromossoma 11, que implica a
substituição do Ácido Glutâmico pela Valina na 6.ª posição da cadeia polipeptídica. A hemoglobina S torna as
hemácias menos eficentes no transporte de oxigénio. Nesta doença, não é necessário avaliar directamente a
estrutura da proteína para diagnosticar a anemia, uma vez que a hemoglobina se reflecte na forma das hemácias)
 Hipercolesterolemia familiar (mutação num gene do cromossoma 19 que codifica uma proteína receptora da
membrana celular. Estas proteínas (lipoproteínas de baixa densidade) permitem às células capturarem e
absorverem gordura e colesterol que são fabricados no fígado. Esta disfunção provoca níveis anormais de
colesterol no sangue, já que as proteínas receptoras podem estar ausentes ou não funcionar adequadamente)
 Fenilcetonúria (mutação no cromossoma 12 que se traduz no defeito ou na ausência da fenilalanina hiroxilase, a
enzima responsável pela transformação do aminoácido fenilalanina em tirosina. A acumulação da fenilalanina no
sangue e nos órgãos afecta o tecido nervoso e provoca atrasos mentais severos).
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