Técnicas de análise de proteínas

Biologia Celular e Molecular
Técnicas de Análise de Proteínas
Trabalho elaborado por: Cátia Monteiro
Cláudia Rosado
Cristiana Pinho
Sara Martins
Turma 5
Técnicas de Análise de Proteínas
1
Introdução
O nosso trabalho baseia-se nas técnicas de análise de proteínas e, como tal, temos
como objectivo principal referenciar algumas delas (nomeadamente a Cromatografia, a
Electroforese, o Western Blotting, etc).
Contudo, também fizemos uma breve abordagem à estrutura e função das proteínas
e ao estudo proteómico.
Proteínas
As proteínas são biopolímeros compostos por resíduos de aminoácidos ligados
entre si por ligações peptídicas. Este tipo de ligação estabelece-se entre os resíduos de
aminoácidos com consequente perda de uma molécula de água. Cada alfa-aminoácido é
constituído por um grupo amino, um grupo carboxílico, um átomo de hidrogénio e uma
cadeia lateral (que difere de aminoácido para aminoácido), ligados a um carbono
(carbono alfa). São vinte os aminoácidos que combinados em número e sequência
diferentes dão origem a todas as proteínas existentes, conferindo-lhes a estrutura e
capacidade funcional.
A extremidade amino (grupo -amino) é considerada como sendo o início da
cadeia e a extremidade carboxílica (grupo -carboxílico) o fim. Uma cadeia peptídica é
constituída por uma parte que se repete regularmente (cadeia principal) e uma parte
variável (cadeias laterais), possuindo também polaridade.
O corpo humano produz milhares de proteínas diferentes que no organismo
possuem funções também diferentes, como por exemplo, estruturais, catalíticas,
contrácteis, transportadoras, de defesa imunológica, etc, estando o formato de cada
proteína directamente relacionado com a sua função.
Existem quatro níveis de organização nas proteínas: estruturas primárias,
secundária, terciária e quaternária.
A estrutura primária é caracterizada pela sequência de aminoácidos e ligações
peptídicas da molécula; é o nível estrutural mais simples e mais importante já que dele
deriva todo o arranjo espacial da molécula.
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A estrutura secundária é caracterizada pelo estabelecimento de ligações de
hidrogénio entre aminoácidos de uma cadeia proteica; os elementos deste tipo de
estrutura mais comuns em proteínas são a hélice- e a folha- ou pregueada.
A estrutura terciária é a organização “global” de uma única cadeia polipeptídica; o
principal factor que determina a estrutura terciária numa proteína globular é o efeito
hidrofóbico, ou seja, as cadeias laterais dos aminoácidos não polares ficam como que
“escondidas” dentro da estrutura e as cadeias laterais dos resíduos polares ficam
expostos à superfície. As ligações de hidrogénio são fundamentais na estabilização da
estrutura terciária.
A estrutura quaternária é caracterizada pela associação de duas ou mais cadeias
polipeptídicas numa estrutura com várias subunidades, resultando numa unidade activa.
Este tipo de estrutura é estabilizada por ligações de hidrogénio, forças de Van der Walls
ou ligações iónicas.
Técnicas de análise de proteínas
Cromatografia
A coluna de Cromatografia é um
dos
métodos
mais
comuns
de
purificação de proteínas.
Esta
técnica
consiste
na
passagem da proteína através de uma
coluna (fase estacionária) que é
desenhada para reter ou diminuir a
velocidade da passagem da fase
móvel onde estão as macromoléculas
(proteínas) e a técnica baseia-se numa propriedade particular, como o tamanho, carga ou
afinidade química. A solução a analisar deve conter a proteína concentrada e o método
deve ser rápido para evitar a degradação da mesma, devendo no entanto, utilizar-se
inibidores de proteases.
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Dependendo da escolha da coluna, as proteínas podem ser separadas de acordo com
a sua carga (IEX – cromatografia de troca iónica), sua hidrofobicidade (HIC –
cromatografia de interacção hidrofóbica), seu tamanho (GF – filtração em gel) ou pela
sua capacidade de se ligar a grupos químicos particulares.
IEX – Cromatografia de troca Iónica
Baseia-se na carga da proteína que estamos a tentar
isolar. Se esta possuir carga positiva, a solução deve
passar por uma coluna com carga negativa (impedindo a
passagem das proteínas com carga positiva).
Depois de fazer passar a solução pela coluna
recorre-se ao procedimento “salting out” para separar a
proteína, com carga positiva, da coluna com carga
negativa (este tipo de coluna é denominado “coluna de
troca de catiões” e possui iões de sulfato, imobilizados
na fase estacionário).
Para impedir a passagem de uma proteína com carga negativa utiliza-se uma coluna
de carga positiva designada por “coluna de troca de aniões” que, geralmente, possui iões
de amónio.
“Salting out”
Esta técnica usa uma solução de elevada concentração de sal que compete com a
proteína na ligação à coluna. Como esta tem maior afinidade para a carga dos sais do
que para a das proteínas, estas acabam por ser libertadas, mantendo-se os sais ligados à
coluna. As proteínas com fracas interacções iónicas serão libertadas com uma
concentração baixa de sal. A adição de sal deverá ser feita de uma forma gradual e, no
final, para ter a certeza que todas as proteínas foram libertadas da coluna, deve ser
colocado nesta uma solução de concentração de sal de 2-3mol/L.
Para remover os sais da solução de proteínas deve ser feita uma diálise contra
tampão.
As mudanças no pH alteram a carga das proteínas, por isso é necessário conhecer o
seu ponto isoelétrico (pH a que a carga da proteína é 0) e certificar-se de que o pH do
sistema está convenientemente ajustado e tamponado.
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HIC – Cromatografia de Interacção hidrofóbica
O HIC baseia-se nas propriedades hidrofóbicas de algumas proteínas.
As proteínas devem ser colocadas na presença de elevada concentração de sulfato
de amónio, o qual aumenta a entropia da água, aumentando, assim, as interacções
hidrofóbicas. Este também estabiliza as proteínas.
As porções hidrofóbicas da coluna são colocadas com uma matriz de agarose de
fenil. Na presença de elevadas concentrações de sal, os grupos de fenil da matriz
impedem a passagem de porções das proteínas hidrofóbicas. Pode-se controlar a
separação de diferentes ligações à coluna das proteínas, reduzindo a concentração do sal
ou adicionando solventes.
GF – Cromatografia de filtração em gel
A cromatografia de filtração em gel separa as
proteínas com base no seu tamanho. A coluna é
constituída por uma matriz de pequenas esferas porosas
empacotadas.
Ao fazer passar a solução de proteínas pela matriz da
coluna, as moléculas pequenas entram nos poros das
esferas demorando a atravessá-los, enquanto que as
grandes passam entre as esferas sendo separadas
primeiro.
Outro tipo de coluna é o AC (Cromatografia de Afinidade), que é um procedimento
mais eficiente que os outros, acima citados.
AC – Cromatografia de Afinidade
A cromatografia de afinidade baseia-se nas funções
biológicas da proteína que se liga à coluna.
O tipo mais comum envolve um ligando (pequena
biomolécula específica por exemplo anticorpo), que é
imobilizado e ligado a uma matriz da coluna, como a
celulose ou poliacrilamida.
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A proteína a analisar passa depois através da coluna e liga-se a ela pelo seu ligando,
enquanto que outras proteínas serão libertadas. A separação da proteína alvo é
normalmente feita, passando através da coluna uma solução que contenha uma elevada
concentração de ligando livre.
Isto é um método muito eficiente de purificação, uma vez que se baseia numa
especificidade biológica da proteína que se pretende analisar, tal como a afinidade de
uma enzima a um substrato ou a ligação entre antigénio e anticorpo.
Contudo, apesar das inúmeras vantagens que a cromatografia convencional oferece,
esta está limitada pela não homogeneidade nas matrizes (como celulose), que causa uma
desigual fluidez do solvente através da coluna. Com o objectivo de colmatar esta falha
foi desenvolvida uma nova cromatografia, o HPLC (High Performance Liquid
Cromatography). Para além disso também permite que as proteínas sejam separadas
mais rapidamente do que pelos métodos convencionais e separar moléculas com
estruturas e tamanhos muito semelhantes.
Electroforese
A electroforese é uma técnica de separação
de moléculas que consiste na migração de
moléculas com carga, numa solução, em função
da aplicação de um campo eléctrico.
A velocidade da migração depende da força
do campo aplicado, da carga, do tamanho e da
forma das moléculas e também da força iónica,
viscosidade e temperatura do meio, onde estas se movem. De um modo geral, no
transporte electroforético, à força do campo opõe-se a resistência do meio, produzindo,
quando se igualam, uma velocidade constante das partículas.
É uma técnica que pode ser usada para análise de proteínas. As proteínas são
moléculas anfotéricas, cuja carga é determinada pelo pH do meio onde estão suspensas.
Numa solução com pH acima do ponto isoeléctrico, a proteína negativamente carregada
migra para o ânodo do campo eléctrico. Abaixo do ponto isoeléctrico, a proteína é
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positivamente carregada e migra para o cátodo. Há diversos tipos de electroforese
como:
 Electroforese livre (frente móvel)
 Electroforese de zona
 Electroforese em papel
 Electroforese em acetato de celulose
 Electroforese em gel (SDS-PAGE)
 Focagem isoeléctrica
 Electroforese bidimensional
Dentro desta variedade centraremos a nossa atenção no SDS-PAGE.
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polycrylamide Gel Electrophoresis Laemmli,
1970)
O objectivo do SDS é desnaturar a proteína, isto é, converter a proteína numa
estrutura linear (a sua forma nativa é, geralmente, globular) e conferir-lhe densidade de
carga uniforme, de forma a poderem ser separadas por electroforese, somente, em
função do tamanho (massa molecular). O SDS tem uma alta carga negativa e pH 7 e tem
uma cauda hidrofóbica que interactua com as cadeias das proteínas (polipeptídeos). O
número de moléculas de SDS que se ligam às proteínas é proporcional ao número de
aminoácidos que constituem as mesmas, pois liga-se na razão de uma molécula por
ligação peptídica.
Se as proteínas desnaturadas são postas num campo eléctrico, todas elas se moverão
para o pólo positivo, na mesma proporção, sem possibilidade de avaliar a distância
migrada. Então, é necessário colocá-las num ambiente que permita que proteínas de
variados tamanhos se desloquem a velocidades diferentes, sendo o meio adequado o gel
de poliacrilamida (polímero de monómeros de acrilamida).
De seguida, aplica-se uma corrente eléctrica e, como tal, as moléculas movem-se
ao longo do gel de poliacrilamida (a todo este processo chama-se Electroforese em Gel
de Poliacrilamida), migrando mais rapidamente as de menores dimensões.
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Após as proteínas terem “corrido” o gel, é preciso fixá-las, para evitar que
difundam quando se procede à coloração do mesmo. O ácido acético a 25% em H2O é
um bom fixador, além de que mantém as proteínas desnaturadas.
O gel é, tipicamente, corado com azul de Coomasie (a fixação e coloração podem
ser preparadas na mesma solução, usando como solvente o metanol ou sais de prata) e
depois descorado.
Focagem isoeléctrica
Esta técnica baseia-se nas diferenças dos pontos isoeléctricos das proteínas para as
separar.
As proteínas possuem uma carga nativa que pode ser positiva, negativa ou nula
dependendo do pH do meio e para cada proteína existe um valor de pH do meio para o
qual a carga da mesma é 0 (pI, ponto isoeléctrico), que geralmente se situa entre 3 – 12.
Quando uma proteína é colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual
o gradiente de pH é estabelecido pela mistura de soluções tampão especiais e sujeita a
um campo eléctrico irá inicialmente mover-se em direcção ao eléctrodo com carga
oposta. Durante a migração através do gradiente de pH, a proteína irá captar ou perder
protões. Enquanto a proteína migra a sua velocidade vai diminuindo até chegar ao ponto
em que o valor de pH será igual ao seu pI. Neste ponto a proteína terá carga total neutra
e como consequência deixa de migrar. Se a proteína se difundir para uma região fora do
seu pI, irá adquirir carga e consequentemente move-se novamente para a posição onde é
globalmente neutra. Pode ter grupos ionizados, mas globalmente é neutra.
 Electroforese Bidimensional
Como as bandas proteicas tendem a sobrepor-se, os métodos unidimensionais de
separação, como a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS), podem apenas separar
um número relativamente pequeno de proteínas (geralmente menos de 50), a
electroforese de um gel bidimensional, ao combinar dois processos de separação
distintos, pode ser usado para separar mais de 1000 proteínas.
Numa primeira etapa as proteínas são separadas em função da sua carga nativa. As
cadeias polipeptídicas são, então, separadas por um processo de focagem isoeléctrica.
Numa etapa posterior o gel de poliacrilamida com forma de cilindro que contém as
proteínas separadas por focagem isoeléctrica é sujeito, novamente, a electroforese mas
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numa direcção em ângulo recto àquela usada na primeira etapa. O gel original é
mergulhado em SDS e depois colocado numa extremidade de um “slab” de gel de
poliacrilamida SDS, através do qual cada cadeia polipeptídica migra em função do seu
tamanho observando-se no resultado final como um ponto “sptot”.
As únicas proteínas que não são separadas serão aquelas que terão idêntico tamanho
e ponto isoeléctrico, uma situação relativamente rara. Até quantidades vestigiais de cada
cadeia polipeptídica pode ser detectada no gel por vários processos de coloração – ou
por autorradiografia se a amostra da proteína tiver sido previamente marcada por um
radioisótopo.
O poder de separação é tão grande que duas proteínas que diferem em apenas um
aminoácido carregado podem ser prontamente distinguidas.
Western blotting
O western blotting permite detectar uma proteína numa mistura de proteínas dando
também informação acerca do seu tamanho.
Inicialmente as proteínas são separadas por SDS-PAGE e, posteriormente, são
transferidas para uma membrana de nitrocelulose (do mesmo modo que foram separadas
no SDS-PAGE). O polo negativo – cátodo, fica do lado do gel e o positivo - ânodo no
lado da membrana de nitrocelulose para conduzir as proteínas carregadas negativamente
em direcção à membrana (carregada positivamente). A razão para a transferência das
bandas de proteínas para uma membrana de nitrocelulose é permitir a chegada dos
anticorpos às bandas com maior facilidade e eficácia, já que o gel de poliacrilamida não
permite a difusão de grandes moléculas.
A membrana de nitrocelulose é incubada com o anticorpo primário que se liga à
proteína que se pretende detectar, formando um complexo anticorpo-proteína.
Seguidamente é-lhe adicionado o anticorpo secundário conjugado, anticorpo-enzima,
que se vai ligar ao anticorpo primário. A enzima (ex. fosfatáse alcalina ou peroxidase)
funciona como um sinalizador molecular que permite a visualização do local da proteína
detectada. No entanto, para que a enzima seja visualizada é necessário colocá-la na
presença de uma mistura reactiva específica. É adicionado um substrato cromogénico,
que ao ser degradado pela enzima conjugada com o anticorpo dará origem a um
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precipitado insolúvel colocalizado com o anticorpo primário que por sua vez se ligou à
proteína.
Podem também ser utilizados outros tipos de marcadores como os fluorescentes ou
os radioisótopos (que podem ser detectados por técnicas de autorradiografia).
Apesar do proteoma não ser objectivo directo do trabalho, achamos importante e
pertinente falar sobre este assunto que, de certa forma, está directa ou indirectamente
relacionado com as técnicas de análise de proteínas1.É integrativo dos estudos de análise
de proteínas
Proteoma
O proteoma reflecte o estado actual de funcionamento do sistema em condições
fisiológicas específicas, ou seja, a expressão do genoma funcional. Esta característica
faz com que o estudo do proteoma se torne um grande desafio.
O proteoma da célula é bastante dinâmico dependendo do seu estado de
desenvolvimento, da presença de activadores ou inibidores e também das condições
específicas do meio ambiente.
Embora a identificação de todas as proteínas codificadas no genoma de um
organismo pareça uma tarefa bastante difícil de concretizar, mesmo em organismos
muito simples, são cada vez mais as informações completas, através de estudos
proteómicos, sobre vias de sinalização celular, conjuntos de proteínas reguladoras,
modificações pós-tradução, bem como outras informações cruciais sobre os estados
fisiológicos e fisiopatológicos de células e organismos.
O estudo em questão pode levar a três vertentes básicas com implicações directas
em vários campos da biologia e da biotecnologia.
Primeiro, o estudo do proteoma permite a descoberta de vias metabólicas nas
diversas etapas celulares, gerando um conhecimento sem precedentes na biologia
1
Os métodos experimentais utilizados no estudo do proteoma dividem-se, fundamentalmente, em duas
etapas: isolamento e separação das proteínas a partir do material biológico (fraccionamento
cromatográfico - filtração em gel, afinidade, imunoafinidade, etc - métodos electroforéticos - SDSPAGE, focagem isoeléctrica, etc); e sequenciação dos aminoácidos de cada proteína.
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celular e na bioquímica. Tal conhecimento torna possível a identificação de novos alvos
farmacológicos específicos.
Segundo, esse mesmo estudo permite viabilizar a identificação de novas moléculas
bioactivas em extractos biológicos naturais, levando ao desenvolvimento de novos
medicamentos.
Terceiro, permite também a identificação e caracterização de marcadores
biológicos, ou seja, moléculas endógenas ou exógenas específicas de um determinado
estado patológico. A capacidade de identificar essas moléculas é extremamente útil no
diagnóstico precoce de doenças e no acompanhamento da evolução do tratamento.
O estudo do proteoma também tem largas aplicações na medicina, principalmente
na caracterização de cancros e em doenças neurológicas (como a doença de Alzheimer),
infecciosas ou cardíacas.
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Bibliografia
 ALBERTS, Bruce; JOHNSON, Alexander; LEWIS, Julian; RAFF, Martin;
ROBERTS; Keith; WALTER, Peter, Molecular biology of the cell, 4ª edição Garland
Science, New York 2002
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 http://www.biology.arizona.edu/immunolo/activities/western_blot/west3html
 http://ntri.tamuk.edu/if/if.html
 http://.accessexcellence.org/LC/SS/chromatography_background.html
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