Métodos de Identificação de Biomoléculas

Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Seminário de Bioquímica
SO2-T2
Elaborado por:
Joana Abrantes
Joana Couto
João Costa
João Pedro
João Miranda
João Barros
João Gomes
João Bernardes
João Martins
Coimbra, 07 de Outubro de 2009
1º Passo
Identificar:
Indicar;
Reconhecer;
Sinalizar;
Focar.
2º Passo
Isolar a Biomolécula
Estudar a sua
3º Passo
avaliação funcional.
Estudo das
mesmas para o
diagnóstico em
Medicina.
As biomoléculas são identificadas por:
Químicas analíticas (espectroscopia de massa);
Absorção/emissão/refracção da luz;
Propriedades redox;
Propriedades biológicas;
Propriedades químicas;
Propriedades físicas.
Cromatografia;
Absorvência;
Detergentes;
Teste do Biureto;
Centrifugação;
Electroforese.
Um dos métodos mais comuns de identificação de proteínas
Consiste na passagem de proteínas através de uma coluna (fase estacionária),
destinada a reter/diminuir a velocidade de passagem dessas mesmas proteínas na
fase móvel da coluna, de modo a serem devidamente separadas.
A coluna possui uma matriz/gel, que deverá estar embebido num líquido
(tampão), usado para forçar o contacto entre a matriz e as proteínas a separar.
Utilizando este método, as proteínas podem ser separadas segundo:
carga (IEX – cromatografia de troca iónica)
hidrofobicidade (HIC – cromatografia de interacção hidrofóbica)
tamanho (GF – filtração em gel)
afinidade (cromatografia de afinidade)
Cuidados especiais: a solução a analisar deve ter a proteína concentrada e a
execução do método deve ser rápida para evitar a degradação da mesma.
Método utilizado na identificação de biomoléculas
numa solução aquosa, permitindo calcular a sua
concentração em determinada amostra.
Definição:
Aλ= -log10(I/I0)
λ – comprimento de onda da radiação
I – intensidade radiação incidente
I0 – intensidade na radiação transmitida
Com esta técnica podemos identificar parâmetros
como a massa e densidade, aprender algo sobre a
forma da biomolécula e investigar interacções entre
moléculas.
s=m(1-vp)/f
s – coeficiente de sedimentação
m – massa da particula
v – volume parcial específico
p – densidade do meio
f – coeficiente de atrito
1.
2.
3.
4.
Uma particula com maior massa
sedimenta mais rapidamente.
Uma particula mais compacta
sedimenta mais rapidamente.
Uma particula mais densa
sedimenta mais rapidamente.
A velocidade de sedimentação
depende da densidade da solução
Exemplos de métodos para análise de proteínas:
Electroforese em gel;
Cromatografia de afinidade;
Teste do biureto;
Ultra centrifugação;
Salting out;
Diálise;
Anticorpos.
Em função da carga eléctrica líquida das proteínas, em que
a velocidade de migração das proteínas depende da
intensidade do campo, da carga da proteína e do
quoeficiente de atrito
Em função da massa, em que as moléculas de maior peso
ficam quase imóveis enquanto que as menores adquirem
maior velocidade
Em função dos relativos ao ponto isoeléctrico, em que cada
proteína mover-se-á até atingir uma posição no gel no qual
o pH é igual ao pI da proteína
A electroforese desempenha um papel preponderante, por
exemplo, na referenciação imediata de algumas anomalias
proteicas, como por exemplo:
Mieloma múltiplo;
Macroglobulinémia;
Enteropatia exudativa;
Sindroma nefrótico;
Cirrose;
Sarcoidose;
Doenças neoplásicas, metabólicas e infecciosas.
No diagnóstico da cirrose hepática podemos notar uma diminuição da
albumina, por diminuição da catabolização das globulinas no fígado,
cuja função está deficiente (insuficiência hepática).
Para além disto, denota-se um aumento do nº de proteínas na região β
e γ.