Análise do perfil de expressão gênica da resposta

INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Luana Tatiana Albuquerque Guerreiro
Análise do perfil de expressão gênica da resposta imunoinflamatória na infecção por Mycobacterium bovis BCG
e Mycobacterium leprae
Rio de Janeiro
Maio 2012
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Luana Tatiana Albuquerque Guerreiro
Análise do perfil de expressão gênica da resposta imunoinflamatória na infecção por Mycobacterium bovis BCG
e Mycobacterium leprae
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte
dos requisitos para obtenção do título de Doutor
em Biologia Celular e Molecular.
Orientador: Dr. Milton Ozório Moraes
Rio de Janeiro
Maio 2012
II
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Luana Tatiana Albuquerque Guerreiro
Análise do perfil de expressão gênica da resposta imuno-inflamatória
na infecção por Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium leprae
ORIENTADOR: Dr. Dr. Milton Ozório Moraes
Aprovada em: ___03__/__05___/__2012___
EXAMINADORES:
Prof. Dra. Cristina Maria Vidal Pessolani - Presidente
Prof. Dr. Patrícia Torres Bozza
Prof. Dr. Jose Roberto Lapa e Silva
SUPLENTES:
Prof. Dra. Leila de Mendonça Lima
Prof. Dra. Danuza de Almeida Esquenazi
Rio de Janeiro, 03 de Maio de 2012
III
Aos meus pais, alicerces da minha vida,
por todo apoio e dedicação.
IV
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a Deus por sua presença constante em minha vida e pelas oportunidades
que tive até hoje.
Ao Dr. Milton Moraes, além de um querido orientador, se tornou um amigo, me incentivando
sempre, mas também puxando a minha orelha em todos os momentos necessários.
A meus pais, Itamar e Regina, por todo embasamento que me deram para chegar aonde
cheguei e por estarem sempre ao meu lado.
Ao meu marido Leonardo, pelo seu amor e por ter sempre se mostrado orgulhoso pelo meu
trabalho, mesmo sem saber ao certo o que faço até hoje.
A meu irmão Cláudio e minha cunhada Carolina que ficaram sempre na torcida, e estão
esperando ansiosos eu defender a tese para voltarmos a fazer os nossos passeios dos finais de
semana.
Aos meus colegas de laboratório, Anna “Xuxu” Beatriz e Alexandre Almeida (além de tudo,
pela ajuda nos experimentos de microarranjo), Carlos Diego, Carolinne Marques e Suelen
(grandes parceiras de congressos), Caroline Xavier e Lucia Elena (que estão dividindo comigo
esse momento de aflição pré-defesa), Cintia, Ohanna, Paula, Sandro, Tiana e Valcemir, pela
ajuda e companheirismo, além de tornarem o nosso laboratório um ótimo ambiente de
trabalho.
Ao Thiago em especial, meu ex-aluno de iniciação, hoje aluno de mestrado, cuja ajuda foi
essencial para o bom andamento da tese, e pela cumplicidade no sucesso e derrota dos
experimentos que dividimos até hoje.
Aos que seguiram outro rumo, mas tive o prazer de conviver no laboratório, Alejandra,
Alexandre Freire, Alice, Cláudia, Cynthia, Diogo, Flávia, Guilherme, Karina, Matilde,
Patrícia e Viviane. Saudades de vocês!
Ao Dr. Marcelo Ribeiro-Alves, por estar sempre disposto ajudar e tirar dúvidas, e
principalmente pelas análises dos dados da minha tese.
À Dra. Cristina Pessolani e aos colegas da “sala 27”, que sempre me receberam muito bem e
me ajudaram no que eu precisei para realização dos meus experimentos. Em particular
V
agradeço a Dra. Luciana Rodrigues pela ajuda nos trabalhos com fagocitose e ao André pela
ajuda com os experimentos de ELISA.
À Dra. Euzenir Sarno e ao pessoal da “sala 6/21”, por todos os empréstimos de pipetas,
reagentes etc....que precisei fazer durante a minha tese.
À Dra. Leila Mendonça pela criteriosa revisão da tese, além das sugestões que ajudaram a
aperfeiçoar o texto para o melhor entendimento e finalização da mesma.
A todos do Pavilhão de Hanseníase, que embora não nomeados, me proporcionaram um
agradável convívio.
A minha amiga Priscila, ex-colega de faculdade e de mestrado, que mesmo de longe, sempre
esteve na torcida pelo sucesso da minha tese.
Às agências de fomento CNPq, IOC, FAPERJ pelo suporte financeiro que possibilitaram o
andamento e finalização da tese.
VI
“Evolução é ter sempre em mente que não nos
pertencemos, mas sim à humanidade. E é em
nome dela que nos aperfeiçoamos.”
Itamar Guerreiro
VII
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Análise do perfil de expressão gênica da resposta imuno-inflamatória
na infecção por Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium leprae
RESUMO
Luana Tatiana Albuquerque Guerreiro
A cepa vacinal Mycobacterium bovis BCG confere proteção parcial ao desenvolvimento da
tuberculose e hanseníase, doenças infecciosas causadas pelas micobactérias intracelulares
Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, respectivamente. Esse efeito protetor
pode variar entre 0 e 80% em diferentes populações, sendo as diferenças genômicas entre
cepas de BCG e a variabilidade genética do hospedeiro dois dos principais fatores que levam
a diferenças na eficácia protetora da vacina. No Brasil, a cepa utilizada na vacinação é a BCG
Moreau, considerada uma das mais antigas em relação às outras cepas, e uma das mais
imunogênicas. Entretanto, a cepa brasileira é pouco utilizada em outros países e, portanto,
ainda é difícil atribuir uma maior importância às diferenças da genética desta cepa na eficácia
vacinal. Neste contexto, diferenças no perfil de expressão gênica de células THP-1 induzidas
pelas cepas de BCG (Danish, Moreau e Pasteur), em comparação com M. leprae, avaliadas
por qRT-PCR e microarranjos poderiam revelar novas vias que indiquem proteção às
infecções micobacterianas. Para tal, células THP-1 foram infectadas com micobactérias por
até 48h, com diferentes concentrações de bacilo (MOI 2:1 e 10:1), sendo avaliados o índice de
fagocitose, expressão de mRNA e secreção de citocinas. Foi determinado o tempo de 24h de
infecção como o mais adequado, com taxas de fagocitose em torno de 80%, e observado que a
infecção pelas cepas de BCG parece não acarretar diferenças no perfil de expressão gênica de
células THP-1. Entretanto, a infecção por M. leprae leva a repressão de vários genes,
incluindo CCL2, CCL3, CCL4, IL-1 e SOD2. Estes genes também foram pouco induzidos em
amostras de validação de biopsias de nervo de pacientes com a forma neural pura da
hanseníase quando comparados à pacientes não hansenianos. Experimentos de microarranjo
de DNA demonstraram que a expressão de outros genes também foi reprimida pela infecção
com M. leprae, quando comparada ao BCG Moreau, como: LGALS1, GPI e RNEP. Com a
ausência de diferenças no perfil de secreção de citocinas em THP-1 infectadas pelas diferentes
cepas de BCG, utilizou-se PBMC para avaliar a influência da variabilidade do hospedeiro.
Com isso, foi identificado um aumento na secreção de TNF apenas na infecção com BCG
Moreau, indicando uma resposta diferencial do hospedeiro à cepa brasileira. Ainda, a
influência de polimorfismos em TNF, IL-10 e TLR1 na produção de TNF, IL-10 e no
log(TNF/IL-10) foi investigada e observada a influência do SNP TLR1 743G com uma
diminuição significativa no log(TNF/IL-10) apenas na infecção por BCG Moreau, sugerindo
um padrão de ativação da resposta imune dependente do genótipo do hospedeiro. A
diminuição da expressão de vários genes relacionados à resposta imune após infecção por M.
leprae sugere um possível efeito supressor desta micobactéria em macrófagos in vitro que
pode estar associado a regulação negativa da resposta imune e, consequentemente, ao sucesso
da infecção. Já que a interação patógeno-hospedeiro é complexa e a emergência da resposta
imune protetora é dependente de genótipos de ambos, essas características devem ser levadas
em consideração no desenvolvimento de melhores vacinas.
VIII
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Gene expression profile analysis of immune-inflammatory response during Mycobacterium
bovis BCG and Mycobacterium leprae infection
ABSTRACT
Luana Tatiana Albuquerque Guerreiro
The bacterial vaccine strain Mycobacterium bovis BCG confers partial protection to the
development of tuberculosis (TB) and leprosy, which are infectious diseases, caused by
intracellular micobactéria, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae,
respectively. This protective effect ranged from 0 to 80% in different populations conducted
in several countries, in which the genomic differences between BCG strains and host genetic
variability are two of main factors leading to variability in vaccine protective efficacy. In
Brazil, the strain used is BCG Moreau that is considered an old strain when compared to other
strains and it is also considered one of the most immunogenic strains currently in use. The
Brazilian strain, however, is rarely used in other countries and therefore, it is still difficult to
assign a greater importance to the genetics of this strain in vaccine efficacy. In this context,
differences in the gene expression profile of THP-1 cells induced by BCG strains (Danish,
Moreau e Pasteur) in comparison to M. leprae could unravel novel pathways suggesting
protection. To do so, THP-1 cells were infected with mycobacteria for up to 48 hours, using
different bacilli concentration (MOI 2:1 and 10:1) and evaluated phagocytosis rate, mRNA
expression and cytokine secretion. It was determined that twenty-four hours of infection was
considered suitable, with phagocytosis rates of approximately 80%, and observed that
infection by BCG strains did not seem to lead to differences in THP-1 immune response
profile. However, M. leprae infection leads to repression of several genes, including CCL2,
CCL3, CCL4, IL-1 and SOD2. The same genes were also less induced in a validation sample
using nerve biopsies of pure neural leprosy patients when compared to non-leprosy cases.
DNA microarray experiments were conducted and others genes such as LGALS1, GPI and
RNEP were also found to be repressed by M. leprae infection. Due to the lack of differences
in cytokine secretion profile in THP-1 infected with BCG strains, PBMC was used to assess
the influence of host variability. It was identified an increase in TNF secretion induced solely
by the infection with BCG Moreau was identified, indicating a differential response of the
host to the Brazilian strain. Furthermore, the influence of TNF, IL-10 and TLR1 gene
polymorphisms in production of TNF, IL-10 and log(TNF/IL-10) was investigated. SNP
TLR1 743G was associated with a significant decrease in log(TNF/IL-10) in BCG Moreau
infection only, suggesting an activation pattern of the immune response that is also dependent
on the genotype of the host. The repression of several genes expression related to immune
response following infection with M. leprae suggest a possible suppressive effect of these
mycobacteria in macrophages in vitro, that may be associated with negative regulation of the
immune response and therefore, with the success of the infection. Since, the host-pathogen
interaction is complex and the emergence of protective immune response is dependent on the
genotypes of both, these features should be taken into consideration for the development of
better vaccines.
IX
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
°C
3’UTR
5’UTR
ADC
Ag 85B
AIDS
ANOVA
aRNA
ASA
ATCC
ATP
aRNA
BAAR
Bad
Bak
Bax
BCG
BCL2
BB
BL
BLAST
BSA
BT
C
C21orf126
CACNA2D3
CAMP
cDNA
CEP
CCL
CD
CFP-10
CO2
Cp
Cq
CYP
Graus Celsius
Região 3´ não traduzida de um gene
Região 5’ não traduzida de um gene.
albumina bovina, dextrose, catalase
Antígeno 85B
Síndrome da imunodeficiência adquirida
Análise de variância
Ácido ribonucleico amplificado
Ambulatório Souza Araújo
American type culture collection
Adenosina trifosfato
Ácido ribonucleico amplificado
Bacilo álcool-ácido resistente.
Bcl-2 antagonist of cell death
Bcl-2 homologous antagonist/killer
Bcl-2-associated X protein
Bacilo de Calmette e Guérin
B-cell CLL/lymphoma 2
Borderline-bordeline
Borderline-lepromatosa
Basic local alignment search tool
Bovine serum albumin
Borderline-tuberculóide
Complemento
Chromosome 21 open reading frame 126
Calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 3
Catelicidina
Ácido nucleico complementar
Comitê de ética em pesquisa
Chemokine ligands
Cluster of differentiation
Culture filtrate protein 10
Deoxido de carbono
Ponto característico (crossing point)
Ciclo de quantificação
Citocromo P450
X
DATASUS
dATP
DAVID
DC-SiGN
dCTP
DEPC
DEFB4A
dGTP
DMEM
DNA
dNTP
D.O.
DOL
DTT
DU
EDTA
EHW
ELISA
ENH
ESAT-6
et al
EUA
FC
g
G
GAD2
GAPDH
G-CSF
GM-CSF
GPI
h
HCl
HIV
HPRT1
IDO
IFN-g
IgM
IL
Departamento de Informatica do SUS
Desoxi-adenosina trifosfatado
Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery
Receptor de células dendríticas
Desoxi-citosina trifosfatado
Dietilpirocarbonato
Defensina beta 4A
Desoxi-guanina trifosfatado
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
Ácido Desoxirribonucléico
Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
Densidade óptica
Degree of labelling
Ditiotreitol
Duplicação
Ácido etilenodiamino tetra-acético
Equilibrio de Hardy & Weinberg
Enzyme Linked Immunosorbent Assays
Eritema nodoso hansênico
Early secretory antigenic 6-kDa
E outros
Estados Unidos da América
Fold change
força-G
Green
Glutamate decarboxylase 2
Desidrogenase glyceraldeído 3-fosfato
Fator estimulador de colônia de granulócitos
Fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos
Glucose-6-phosphate isomerase
Horas
Ácido clorídrico
Vírus da imunodeficiência humana
Hipoxantina fosforibosiltransferase 1
Indoleamine 2,3-dioxygenase
Interferon-gama
Imunoglobulina M
Interleucina
XI
IMF
IS6110
IL-1b
KCl
LDLR
LGALS1
LL
LPL
LRRK2
LTA
LTA4H
LTB4
LXA4
M
M.
M. tb.
MB
MB
MDR
MDM
MESP2
mg
MG
MIF
Mirna
mL
µM
mM
MOI
MOPS
MRC
mRNA
Mt_ATP6
Mt_COX2
Mt_CYTb
Mt_ND1
Mt_ND2
Mt_ND3
Intensidade média de fluorescência
IS-like element
Interleucina 1 beta
Cloreto de potássio
Receptor de proteína de baixa intensidade
Lectin, galactoside-binding, soluble-1
Lepromatosa
Lipoprotein lipase
Leucine-rich repeat kinase 2
Linfotoxina alfa
Leucotrieno A4 hidrolase
Leucotrieno B4
Lipoxina A4
Molar
Mycobacterium
Mycobacterium tuberculosis
Mega pares de base
Multibacilar
Multi-droga resistente
Macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico
Mesoderm posterior protein 2
Micrograma
Miligrama
Macrophage migration inhibitory factor
microRNA
Mililitro
Micromolar
Milimolar
Multiplicidade de infecção
Ácido 3-(N-morfolino) propanesulfonico
Receptor de manose
Acido ribonucléico mensageiro
Mitochondrially encoded ATPsintetase subunit 6
Mitochondrially cytochrome c oxidase subunit 2
Mitochondrially encoded cytochrome b
Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 1
Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 2
Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 3
XII
Mt_ND4L
Mt_ND5
mRNA
NaCl
NAD
NCBI
NF-kB
ng
NK
NL
nM
nm
NOD
NOX3
O-2
OASL
OligoDT
OMS
ORF
oxLDL
PACRG
PAMP
PAS
PARK
PB
PBMC
PBS
PCR
pg
PGL-1
PGN
PH
PINK1
PMA
PNL
PPARg
PPD
PQT
Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 4L
Mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 5
Ácido ribonucléico mensageiro
Cloreto de sódio
Dinucleótido de nicotinamida e adenina
National Center for Biotechnology Information
Fator nuclear kappa B
Nanograma
Natural killer
Paciente não hanseniano
Nanomolar
Nanômetros
Nucleotide-binding oligomerization domain
NADPH oxidase 3
Superóxido
Oligoadenylate synthetase-like
Oligonucleotídeo iniciador de timidinas
Organização Mundial da Saúde
Janela aberta de leitura (open reading frame)
Proteína de baixa densidade oxidada
Parkin co-regulated gene
Pathogen-Associated Molecular Pattern
p-aminossalicílico ácido
Gene que codifica a proteína parkina.
Paucibacilar
Peripheral Blood Mononuclear Cells
Tampão Salina Fosfato
Reação em cadeia da polimerase
Picograma
glicolipídeo fenólico I
Peptideoglicano
Potencial hidrogeniônico
PTEN induced putative kinase 1
Acetato de forbol-miristila
Forma neural pura
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma
Derivado de proteína purificada
Poliquimioterapia
XIII
PRR
qRT-PCR
R
RD
RLEP
RPL13a
RPS13
RNA
RNPEP
ROS
RPM
RPMI
RR
rRNA
RT
SECII
SET1DB
SDS
SFB
SNP
SOD
sRNA
SSC
TB
TE
TCEAL5
TGFb
Th
TLR
TME101
TNF
TNFSF15
TNFR
Treg
tRNA
TT
U
UK
Pattern recognition receptor
RT-PCR em tempo real
Red
Região de diferença
M. leprae-specific repetitive element
Proteína Ribossomal 60S L13a
Proteína Ribossomal 40S S13
Ácido ribonucléico
Arginyl aminopeptidase (aminopeptidase B)
Espécies reativas de oxigênio
Rotações por minuto
Royal Park Memorial Institute
Reação reversa
Ácido ribonucleíco ribossomal
Transcrição reversa
Secretogranina 2
Histona-lisina metiltransferase
Dodecil sulfato de sódio
Soro fetal bovino
Polimorfismo de base única (Single Nucleotide Polymorphism)
Superoxide dismutase 2
Small RNA
Solução salina de citrato
Tuberculose
Tampão Tris EDTA
Transcription elongation factor A protein-like 5
Fator de Crescimento Tumoral Beta
Linfócitos T auxiliares (T helper)
Receptores do tipo Toll (Toll-like receptors)
Transmembrane protein 101
Fator de necrose tumoral
Tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 15
Receptor de fator de necrose tumoral
Células T reguladoras
RNA transportador
Tuberculóide
Unidade
Reino Unido
XIV
URE-B1
UCSC
V
VDR
VNTR
v/v
WHO
ZDHHC22
ZNF79
ZNRF1
E3-Ubiquitina ligase
University of California Santa Cruz
Volts
Receptor de vitamina D
Variable-number tandem repeats
Volume por volume
World Health Organization
Zinc finger, DHHC-type containing 22
Proteína de dedo de zinco 79
ZNRF1 zinc and ring finger 1
XV
Lista de Figuras
Figura 1.1. Cepas vacinais de BCG utilizadas em todo o mundo entre 2003 e 2007....................................3
Figura 1.2. Mapa apresentando a política de vacinação adotada em diferentes países.................................7
Figura 1.3. Genealogia das cepas de BCG...................................................................................................11
Figura 1.4. Genes e vias mais importantes identificados em estudos genéticos de associação
à hanseníase.................................................................................................................................................19
Figura 1.5. Taxas de prevalência de hanseníase no mundo.........................................................................21
Figura 1.6. Taxas de incidência de hanseníase no mundo...........................................................................23
Figura 1.7. Formas clínicas da hanseníase...................................................................................................25
Figura 1.8. Taxas de incidência de tuberculose no mundo..........................................................................33
Figura 4.1. Desenho experimental do estudo...............................................................................................45
Figura 4.2. Desenho experimental de microarranjos de DNA.....................................................................58
Figura 5.1. Avaliação da taxa de fagocitose de BCG Moreau marcado com PKH2 por células
THP-1 em 1, 4, 24 ou 48 horas....................................................................................................................68
Figura 5.2. Citometria de fluxo para avaliar a taxa de fagocitose das cepas de BCG Danish,
Moreau e Pasteur, e M. leprae marcados com PKH2 pelas células THP-1 após 24 horas..........................68
Figura 5.3. Valores normalizados de expressão gênica por multiplex PCR em tempo real, de
células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 2...........73
Figura 5.4. Níveis de CCL2, IL-1, TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1
controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur......................................................74
Figura 5.5. Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas
com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1................................................................................................75
Figura 5.6. Níveis de CCL2, IL-1 , TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1
controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae (MOI 2:1).................................................................78
Figura 5.7. Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas
com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1................................................................79
Figura 5.8. Níveis de CCL2, TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle e
infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur (MOI 10:1)...................................................82
Figura 5.9. Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e infectadas
com BCG Moreau e M. leprae, em MOI 10:1.............................................................................................83
Figura 5.10. Níveis de CCL2, IL-8 e TNF (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle
e infectadas com as cepas de BCG Moreau e M. leprae (MOI 10:1)..........................................................85
Figura 5.11. Níveis de IL-8, TNF e IL-10 (pg/ml) em sobrenadante de células PBMC infectadas
com BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1...................................................................................87
Figura 5.12. Avaliação do logaritmo da razão TNF/IL-10 em PBMC controle e infectadas com
as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur................................................................................................88
XVI
Figura 5.13. Investigação da influência do polimorfismo genético TNF -308 G>A nos níveis
de secreção de (A) TNF, (B) IL-10 e (C) log(TNF/IL10)...........................................................................89
Figura 5.14. Investigação da influência do polimorfismo genético IL10 -819 C>T nos níveis
de secreção de (A) IL-10, (B) TNF e (C) log(TNF/IL-10)..........................................................................90
Figura 5.15. Investigação da influência do polimorfismo genético TLR1 743 A>G nos níveis
de secreção de (A) IL-10, (B) TNF e (C) log(TNF/IL-10)..........................................................................91
Figura 5.16. Valores normalizados de expressão gênica de biopsias de nervo de pacientes
hansenianos (L) e não hansenianos (NL).....................................................................................................95
XVII
Lista de Tabelas
Tabela 1.1. Comparação das características do genoma das cepas de BCG Pasteur, Japan,
Moreau, Danish, Russia e Tice......................................................................................................................9
Tabela 1.2. Comparação das características do genoma de M. bovis, M. tuberculosis e
M. leprae......................................................................................................................................................18
Tabela 4.1. Condições das reações de PCR em tempo real para amplificação de regiões
polimórficas dos genes IL-10 -819 C>T, TNF -308 G>A e TLR1 743 A>G.............................................63
Tabela 4.2. Sequências dos oligonucleotídeos-iniciadores e sondas empregadas para tipificação
dos SNPs nos genes IL-10 -819 C>T, TNF -308 G>A e TLR1 743 A>G pela técnica de PCR
tempo real....................................................................................................................................................64
Tabela 5.1. Genes diferencialmente expressos (p-valor
0,005) entre células THP-1
em três condições.......................................................................................................................................92
XVIII
Sumário
Resumo..........................................................................................................................................................VIII
Abstract............................................................................................................................................................IX
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos............................................................................................................X
Lista de figuras..............................................................................................................................................XVI
Lista de tabelas...........................................................................................................................................XVIII
Sumário.........................................................................................................................................................XIX
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................................................1
1.1. Mycobacterium bovis BCG.............................................................................................................2
1.1.1. Histórico....................................................................................................................................2
1.1.2. Eficácia da vacina BCG......................................................................................................................4
1.1.3. Genoma do BCG.................................................................................................................................7
1.1.4. Diferenças entre as cepas de BCG......................................................................................................9
1.1.5. Relação BCG-hospedeiro..................................................................................................................11
1.1.6. Novas estratégias vacinais para a proteção contra TB e hanseníase.................................................13
1.2. Micobactérias patogênicas: agentes etiológicos da hanseníase e tuberculose..........................................14
1.2.1. Mycobacterium leprae.......................................................................................................................15
1.2.2. Mycobacterium tuberculosis.............................................................................................................17
1.2.3. Interação das micobactérias patogênicas com o hospedeiro.............................................................18
1.3. Principais micobacterioses em humanos...................................................................................................20
1.3.1. Hanseníase........................................................................................................................................20
1.3.2. Resposta imune em hanseníase.........................................................................................................27
1.3.3. Genes e imunidade em hanseníase....................................................................................................31
1.4. Tuberculose...............................................................................................................................................33
1.5. Expressão gênica global em infecções micobacterianas...........................................................................36
1.6. Células THP-1...........................................................................................................................................38
2. JUSTIFICATIVA.........................................................................................................................................40
3. OBJETIVOS.................................................................................................................................................42
3.1. Objetivo geral............................................................................................................................................43
3.2. Objetivos específicos.................................................................................................................................43
4. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................................................44
4.1. Desenho de estudo.....................................................................................................................................45
4.2. Cultivo de micobactérias...........................................................................................................................46
4.2.1. BCG........................................................................................................................................................46
4.2.2. Mycobacterium leprae............................................................................................................................46
4.2.3. Pureza e viabilidade das culturas de micobactérias................................................................................47
XIX
4.3. Cultivo de células e infecção.................................................................................................................48
4.3.1. Células THP-1.......................................................................................................................................48
4.3.2. Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) humanas.........................................................48
4.4. Biopsias de nervos humanos....................................................................................................................49
4.5. Extração de Ácidos Nucléicos..................................................................................................................50
4.5.1. Extração de RNA de células THP-1...................................................................................................50
4.5.2. Extração de DNA das amostras de sangue total.................................................................................51
4.5.3. Extração de RNA e DNA de biopsias de nervos humanos................................................................52
4.6. Ensaios de associação de micobactérias com células THP-1...................................................................52
4.6.1. Marcação das micobactérias..................................................................................................................52
4.6.2. Avaliação da associação de micobactérias com células THP-1............................................................53
4.7. PCR em tempo real..................................................................................................................................53
4.7.1. Síntese de cDNA................................................................................................................................53
4.7.2. Reação de RT-PCR em Tempo Real (qRT-PCR)..............................................................................54
4.7.3. Análise dos dados de qRT-PCR.........................................................................................................55
4.8. Multiplex PCR em Tempo Real...............................................................................................................56
4.8.1. Reação de PCR multiplex em Tempo Real........................................................................................56
4.8.2. Análise dos dados de PCR multiplex em tempo real.........................................................................57
4.9. Microarranjos de DNA............................................................................................................................57
4.9.1. Desenho experimental........................................................................................................................57
4.9.2. Amplificação do RNA........................................................................................................................59
4.9.3. Marcação fluorescente da segunda fita de cDNA...............................................................................59
4.9.4. Hibridação e lavagem das lâminas de microarranjo...........................................................................60
4.9.5. Aquisição e análise das imagens do microarranjo..............................................................................60
4.9.6. Análise de dados.................................................................................................................................61
4.10. Genotipagem de polimorfismos de base única por PCR em tempo real................................................62
4.10.1. Genotipagem de SNPs dos genes IL-10, TNF e TLR1...................................................................62
4.11. Dosagem de citocinas.............................................................................................................................64
4.11.1. Desenho experimental......................................................................................................................64
4.11.2. Dosagem das citocinas TNF, IL-8, IL-1, IL-10 e CCL2................................................................65
5. RESULTADOS...........................................................................................................................................66
5.1. Células THP-1 fagocitam BCG e M. leprae eficientemente....................................................................67
5.2. Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1.............................................69
5.2.1. Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
infectadas pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 2:1...................................................70
5.2.2 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1................................................................................74
5.2.3 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
XX
infectadas pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1..................................................78
5.2.4 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1...............................................................................82
5.3. Influência da variabilidade do hospedeiro na secreção de citocinas.........................................................86
5.4. O logaritmo da razão TNF/IL-10 (log(TNF/IL-10)) foi ligeiramente
aumentado em PBMC infectado com BCG Moreau...............................................................................87
5.5. Influência dos SNPs TNF -308 G>A, IL-10 -819 C>T e TLR1 743 A>G
na secreção de TNF e IL-10, e no log(TNF/IL-10).................................................................................88
5.6. Estudos de expressão diferencial de genes por microarranjo de DNA em células THP-1
infectadas por M. leprae e BCG..............................................................................................................92
5.7. Diferenças no perfil de expressão gênica de amostras de biopsias de nervo humano..............................94
6. DISCUSSÃO...............................................................................................................................................98
6.1. Análise do perfil de expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1 e PBMC
frente à infecção com BCG e M. leprae........................................................................................................102
6.2. Análise do perfil de expressão gênica em biopsia de nervos de pacientes hansenianos
e não hansenianos.........................................................................................................................................115
6.3. Considerações finais..............................................................................................................................118
7. CONCLUSÕES........................................................................................................................................121
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................................124
9. ANEXOS..................................................................................................................................................155
Anexo I. Oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de qRT-PCR (1)e PCR multiplex em
tempo real (2)...............................................................................................................................................156
Anexo II. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real,
de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau
e Pasteur em MOI 2:1.................................................................................................................................162
Anexo III. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real,
de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1.................................164
Anexo IV. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real,
de células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau
e Pasteur em MOI 10:1................................................................................................................................165
Anexo V. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real,
de células THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1..............................168
XXI
1. INTRODUÇÃO
1
1.1. Mycobacterium bovis BCG
1.1.1. Histórico
Em 1908, no Instituto Pasteur de Lille, na França, Albert Calmette e Camille Guérin
deram início ao trabalho de atenuação de uma cepa virulenta de Mycobacterium bovis, obtida
de uma vaca com mastite tuberculosa (revisado por Liu et al., 2009). Após 13 anos de estudos
onde realizaram 231 passagens sucessivas em meio contendo batata, glicerina e bile bovina,
esses pesquisadores observaram uma mudança morfológica na cultura. A partir daí,
começaram a testar a virulência dessa cepa em diversos modelos animais. Em 1921, a cepa
atenuada de M. bovis foi administrada oralmente a uma criança em Paris, cuja mãe tinha
morrido de tuberculose (TB) e observou-se que a criança não desenvolveu a doença. A partir
disso, a vacina foi administrada oralmente em mais de 300 crianças em um período de um ano
(revisado por Brewer & Colditz 1995). Durante este período vários testes demonstraram que
essa cepa havia perdido a virulência, mas ainda mantinha suas propriedades imunogênicas.
Esta cepa passou a ser chamada de Bacilo de Calmette e Guérin (BCG) § e utilizada na
prevenção contra o desenvolvimento da TB, sendo posteriormente utilizada também contra o
desenvolvimento da hanseníase (Prevention Trial Group 1996; Fine et al., 1999; Scollard et al,
2006; revisado por Zodpey et al., 2007; Merle et al., 2010).
Desde 1924, a vacina BCG passou a ser distribuída pelo Instituto Pasteur e
subcultivada em diferentes países (Behr, 2002). No decorrer de algumas décadas, cada
laboratório para onde a vacina foi ditribuída, desenvolveu sua própria cepa de BCG, sendo
posteriormente denominada pela cidade, país ou laboratório aonde foi propagada.
Aproximadamente 14 cepas de BCG subcultivadas foram utilizadas como vacina em
diferentes partes do mundo. Porém, mais recentemente foi observada que existem cerca de
sete cepas sendo utilizadas mundialmente como vacina (Ritz & Curtis, 2009) (figura 1.1).
Apesar dos esforços para padronização do crescimento e produção das vacinas, diferentes
§
O BCG é uma bactéria aeróbica de crescimento lento, ligeiramente curva, sem mobilidade e não esporulada.
Possui uma parede celular rica em lipídeos, composta principalmente de peptideoglicano (PGN), arabinogalactano e ácido
micolico (ácido graxo saturado de elevado peso molecular) (Begum et al., 2002). O PGN do BCG é estruturalmente único e
com isso é facilmente distinguível do PGN das bactérias gram-negativas (Seya et al., 2002). As bactérias coram-se de
vermelho pelo método Ziehl-Nielsen, sendo considerados bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR).
2
condições de passagens foram utilizadas pelos diferentes laboratórios contribuindo para as
mudanças genéticas observadas nas cepas de BCG.
Figura 1.1 – Cepas vacinais de BCG utilizadas em todo o mundo entre 2003 e 2007. Na
legenda, as cepas de BCG foram separadas em caixas de acordo com suas similaridades
genéticas. Adaptado de Ritz & Curtis, 2009.
Em 1930, ocorreu o acidente de Lubeck, onde 250 crianças receberam a vacinação por
BCG, e após 4 a 6 semanas, 72 crianças morreram, 135 crianças desenvolveram TB, mas se
recuperaram, e o restante não manifestou a doença, pelo menos durante o tempo de
acompanhamento médico que foi de 12 anos (revisado por Brewer & Colditz 1995). Isto
levou uma ampla reação contra a vacinação por BCG. Mais tarde descobriram que a vacina
tinha sido contaminada com uma cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (M. tb.),
agente etiológico da tuberculose, porém a ampla vacinação de crianças só foi restabelecida em
1932, depois de novas técnicas levarem a uma produção mais segura. Este acidente mostrou a
grande variação da resposta imune nos indivíduos expostos a bactéria, e começou-se a
suspeitar que diferenças genéticas também do hospedeiro poderiam ser fundamentais na
determinação de quais crianças resistiram à doença, as que foram suscetíveis e as que
mantiveram um equilíbrio com o patógeno (revisado por Mitsos et al., 2003).
3
No Brasil, a vacina chegou em 1925 trazida pelo médico Uruguaio Julio Elvio Moreau
e entregue ao pesquisador Arlindo de Assis, que passou a cultivá-la no Instituto Vital Brasil,
onde a cepa passou a adquirir características próprias (Benévolo-de-Andrade et al., 2005).
Essa cepa foi denominada BCG Moreau e posteriormente passou a ser cultivada pela
Fundação Ataulpho de Paiva, que hoje em dia é responsável por 5% da produção de BCG do
mundo todo. Após o acidente de Lubeck, a vacinação por via oral foi substituída por uma
vacinação intradérmica em praticamente todos os países. Porém, no Brasil a vacina continuou
sendo administrada por via oral até 1973, e desde então foi substituída exclusivamente pela
vacinação intradérmica (Monteiro-Maia et al., 2006). Desde 1976, a BCG Moreau passou a
fazer parte do calendário de vacinação obrigatória no Brasil.
1.1.2. Eficácia da vacina BCG
A vacina BCG confere proteção contra TB e hanseníase, sendo indicada
principalmente para prevenir as formas graves de TB (miliar e meníngea) em crianças
menores de cinco anos de idade, mais frequentemente nos menores de um ano de idade
(Colditz et al, 1995). Essa proteção oferecida pelo BCG é parcial e varia amplamente em
diferentes países e populações. O efeito protetor para TB pulmonar varia de 0% a 80% em
ensaios clínicos realizados em diversos países, enquanto que para a hanseníase o efeito
protetor varia de 20 a 80% (Prevention Trial Group, 1996; Fine et al., 1999; Zodpey et al.,
2005; Scollard et al, 2006; Merle et al., 2010). Com isso, grandes esforços têm sido realizados
na tentativa de buscar um novo candidato à vacina contra TB e hanseníase que tenha uma
melhor eficácia.
A variabilidade na proteção da vacina de BCG é atribuída à: (i) diferenças genotípicas
e fenotípicas das cepas vacinais BCG, que teriam ocorrido em função das mutações
acumuladas ao longo do tempo; (ii) exposição prévia à micobactérias ambientais, que podem
modular a resposta imune do hospedeiro, interferindo na proteção conferida pela vacina; (iii)
via de infecção, onde diferenças na infecção (infecção primária ou re-infecção) poderiam
interferir no efeito protetor; (iv) outros fatores relacionados a condições de utilização da
vacina, como sua viabilidade, dose utilizada e via de administração, e ainda, (v) a fatores
relacionados ao hospedeiro, como o estado nutricional, co-infecções e aspectos genéticos
(Starke & Conelly, 1998; Fine & Vynnycky, 1998; Fine et al., 1999; Behr 2002; Brandt et al.,
2002; Barreto et al., 2006; Fernando & Britton, 2006). Outra fonte observada que estaria
4
contribuindo para variabilidade na eficácia das diferentes cepas vacinais, seria o meio de
crescimento utilizado para a preparação das vacinas, que poderia influenciar nas propriedades
das cepas de BCG (Petricevich et al., 2001; Venkataswamy et al., 2012).
Horwitz e colaboradores (2009) utilizaram um modelo animal para investigar se as
diferentes cepas de BCG possuem eficácia protetora distinta na proteção contra TB pulmonar.
Neste estudo, porquinhos-da-índia foram vacinados com seis cepas de BCG diferentes,
posteriormente desafiados com aerossol contendo M. tb., e então, investigados quanto ao
desenvolvimento de TB pulmonar. Das cepas utilizadas, incluiu-se uma cepa considerada
antiga (cujo critério para classificação será detalhado posteriormente), BCG Japan, e cinco
cepas consideradas recentes, Connaught, Danish, Glaxo, Pasteur e Tice. Estes autores
observaram que com exceção de BCG Glaxo, que se mostrou relativamente menos eficaz,
todas as outras cepas apresentaram uma eficácia protetora comparável, não existindo
diferença entre a cepa antiga e as cepas recentes. Já foi sugerido por Broch e colaboradores
(2007) que as cepas antigas conferem uma melhor proteção contra TB quando comparadas às
cepas recentes; entretanto no estudo de Horwitz e colaboradores, só foi incluída uma cepa das
consideradas antigas (BCG Japan), e, embora não tenha se mostrado mais eficaz do que as
cepas mais recentes utilizadas no estudo (Horwitz et al., 2009), não deve ser descartada a
possibilidade de que outras cepas consideradas antigas, como BCG Russia e BCG Moreau
possam apresentar uma maior eficácia na proteção contra TB.
Recentemente, a cepa BCG Moreau foi comparada com a cepa BCG Danish, onde foi
avaliada não só sua eficácia protetora, como também a influência da via de administração da
vacina (Clark et al., 2010). Neste trabalho, foi observado que a vacina BCG Moreau
administrada oralmente proporcionou uma proteção equivalente a BCG Danish injetável
contra TB pulmonar em modelo animal. A cepa de BCG Moreau quando era administrada por
forma oral apresentava um bom índice de segurança e até menos efeitos colaterais em
comparação com outras cepas de BCG. Deste modo, Clark e colaboradores sugerem que a
volta da administração da vacina por via oral poderia ser uma boa opção, pois teria as
vantagens de não precisar utilizar nenhum objeto perfurocortante, diminuindo possível
contaminação por infecções transmitidas pelo sangue. Além disso, não teria necessidade de
profissionais treinados para realizar a vacinação e seria uma estratégia considerada ideal para
as populações que vivem em países com uma infra-estrutura sanitária deficiente.
Devido a variabilidade na eficácia protetora da vacina de BCG, vários países têm
adotado diferentes programas de vacinação. Alguns países adotam ou já adotaram o programa
universal de vacinação, outros recomendam a vacinação só para grupos de alto risco, como é
5
o caso de contato de pacientes com hanseníase, incluindo Canadá e Estados Unidos. E há
ainda os que não possuem nenhum programa de vacinação (Zwerling et al, 2011) (figura 1.2).
A política de vacinação varia em relação ao número de doses utilizadas, a idade recomendada
para a primeira vacinação e ainda a via de administração da vacina. Devido a essas diferenças
de política de vacinação entre os vários países, foi criado um banco de dados com
informações sobre a vacina BCG em mais de 180 países (http://www.bcgatlas.org/).
A maioria dos países adota a vacinação com BCG em dose única ao nascer,
principalmente os países com alta incidência de TB (como é o caso do Brasil) de acordo com
recomendação da Organização Mundial de Saúde (OMS) (1995). Outros países adotam mais
de uma dose, como é o caso da Rússia, pois acreditam que a proteção conferida pelo BCG vai
diminuindo ao longo do tempo. Há países que revacinam crianças em idade escolar que não
apresentam a cicatriz vacinal, como é o caso de Japão ou Tailândia, ou revacinam
independente da presença da cicatriz ou do resultado do teste cutâneo com PPD (derivado de
proteína purificada de M. tb.), como a Turquia. Há ainda os que revacinam os indivíduos que
apresentam resultado negativo com PPD negativo, como a Bulgária e Polônia (Pereira et al.,
2007). O Brasil é um dos países que até pouco tempo adotava a revacinação, porém estudos
realizados com crianças em idade escolar mostraram ausência de proteção da segunda dose de
BCG contra TB pulmonar (Barreto et al., 2002; Rodrigues et al., 2005) e hanseníase (Cunha
et al., 2008), e como consequência, foi recomendado que a prática de revacinação fosse
suspensa.
Por outro lado, foi estabelecida pelo Ministério da Saúde, a vacinação de todos os
contatos intradomiciliares de pacientes com hanseníase e que estejam sem presença de sinais e
sintomas da doença no momento da avaliação, independentemente de serem contatos de casos
PB ou MB (Brasil, 2009). Foi demonstrado que a administração da vacina BCG subsequente
ao diagnóstico de um caso de hanseníase multibacilar foi eficaz na redução do risco de doença
entre os familiares e outros contatos próximos a esses pacientes com hanseníase (Duppre et al.,
2008).
6
Figura 1.2 – Mapa apresentando a política de vacinação adotada em diferentes países. A,
representa países que atualmente possuem o programa universal de vacinação, por exemplo,
recomendam a vacinação com BCG para todos ao nascimento. B, representa países que
costumavam recomendar a vacinação com BCG para todos, mas atualmente não. C,
representa países onde nunca foi recomendado a vacinação para todos, ou é dado apenas para
grupos de alto risco, como os contatos de pacientes. Adaptado de Zwerling et al., 2011.
1.1.3. Genoma do BCG
O genoma de M. bovis BCG Pasteur 1173P2 possui aproximadamente 4,4 Mb
contendo 3.954 genes e 34 pseudogenes (Brosch et al., 2007). Possui 99,95 % de identidade
com o genoma do M. tb. e, quando comparado a este genoma que também possui
aproximadamente 4,4 Mb, pode-se observar aproximadamente 2.400 polimorfismos de base
única (SNPs). As duplicações em tandem, DU1 e DU2, são os polimorfismos genômicos mais
proeminentes encontrados no genoma de BCG Pasteur. As duas cópias de DU1 são idênticas,
sendo esta duplicação observada apenas na cepa de BCG Pasteur. Enquanto DU2 possue uma
diferença não-sinônima em uma base dentro do gene BCG3258, e ocorre em uma das quatro
diferentes formas (DU2-I à DU2-IV) em todas as cepas de BCG (Brosch et al., 2007). Além
do sequenciamento do BCG Pasteur, também foi sequenciado o genoma do BCG Japan 1172,
a fim de comparar o genoma de uma cepa antiga com uma cepa recente (Seki et al., 2009).
Assim como o genoma do BCG Pasteur, o genoma do BCG Japan (Tokyo), possui
7
aproximadamente 4,4 Mb, e contém 4.033 genes, incluindo 3.950 gene que codificam para
proteínas, 3 genes codificam para rRNA, 45 genes para tRNA e 30 pseudodegenes. Na
comparação com o genoma de BCG Pasteur, foi identificado um total de 18 regiões de
diferença (RDs), apresentando diferenças de mais de 20 pb, incluindo RD14, RD2 e nRD18,
já previamente relatadas; incluindo, também, sete RDs encontradas no locus VNTR (do inglês,
variable-number
tandem
repeats).
Além
disso,
também
foram
identificados
inserções/deleções de menos de 20 pb e 68 SNPs entre as cepas.
Outras três cepas de BCG, Danish 1331, Russia e Tice, também tiveram seu genoma
sequenciado (Pan et al., 2011), e mesmo ainda sendo um rascunho, foi observado que
possuem um tamanho similar de aproximadamente 4,27 Mb, contendo 4.030 genes, incluindo
três genes que codificam para rRNA (5S, 16S e 23S) e 45 genes que codificam para tRNA.
Comparando com seu progenitor, M. bovis, foram identificados mais de 350 SNPs, onde
aproximadamente 170 SNPs foram específicos destas cepas de BCG. E cada cepa de BCG
possui 12 SNPs específicos, que não eram compartilhados com as outras cepas. As
duplicações em tandem foram confirmadas neste trabalho, onde foi observada a presença da
DU2-I na BCG Russia, DU2-III na BCG Danish e DU2-IV na BCG Tice.
Recentemente a cepa brasileira teve seu genoma seqüenciado (Gomes et al., 2011) e
possui aproximadamente 4,4 Mb, assim como o genoma das outras cepas sequenciadas
(Pasteur e Japan). Esse genoma contém 3.945 genes, incluindo 3 genes que codificam rRNA e
45 genes que codificam para tRNA, e possui um alto conteúdo G+C (65,64%) assim como o
genoma de M. tb., com o qual compartilha mais de 99% de identidade. Neste trabalho, foi
confirmada a presença da DU2-I, assim como a deleção RD16 específica da cepa Moreau.
Um resumo comparando as principais características do genoma destas cepas de BCG
encontra-se na tabela 1.1.
Ao comparar o genoma de BCG com M. tb. e M. leprae, além das regiões de diferença
(algumas já previamente mencionadas), foram descritas outras diferenças, como
inserções/deleções. Uma das diferenças observadas é o número de membros da família PE
que varia muito entre as micobactérias. BCG e M. tb. possuem aproximadamente 80-140
genes, enquanto M. leprae possui menos de 10 genes, que por sua vez, parecem ser
pseudogenes (Cosma et al., 2003).
8
Tabela 1.1. – Comparação das características do genoma das cepas de BCG Pasteur, Japan,
Moreau, Danish, Russia e Tice.
Cepas de BCG
Pasteur
Japan
Moreau
Danish/Russia/Tice
Tamanho (Kb)
4. 374
4.371
4.340
4.270
3.954
3.950
3.945
4.030
rRNA
3
3
3
3
tRNA
47
45
45
45
Pseudogenes
34
30
ND
ND
Conteúdo G+C (%)
65
65.64
65.64
65
736* / 2.400†
68
ND
350*
Genes que codificam:
Proteínas
SNPs*
* em
†

relação a M. bovis, em relação a M. tb., em relação a BCG Pasteur.
ND=Não determinado.
1.1.4. Diferenças entre as cepas de BCG
A cepa original BCG apresenta uma série de deleções que restringem a virulência e a
taxa de proliferação do microorganismo, como é o caso da RD1, que difere o BCG do M.
bovis, M. tb. e M. leprae, e supostamente foi perdida durante o processo de atenuação entre
1908-1921 (Behr et al., 1999). Essa região possui genes que codificam as proteínas CFP-10
(do inglês, culture filtrate protein 10) e ESAT-6 (do ingês, early secretory antigenic 6-kDa), e
sabe-se que essas proteínas possuem um papel importante na virulência das micobactérias
(Liu et al., 2009). Outra região que não foi observada em nenhuma cepa de BCG, foi a RD3.
Já a RD2, que contém o gene mpt64, foi deletada apenas nas cepas derivadas após 1926,
indicando que não foi uma deleção ocorrida na cepa BCG original (Mahairas et al., 1996).
BCG Moreau é uma das cepas que mantém essa região. Também foi observado que a região
nRD18 está ausente nas cepas obtidas após 1933 (Mostowy et al., 2003; Lui et al., 2009).
Além disso, as cepas de BCG apresentam outras diferenças entre si (figura 1.3), como
algumas deleções e inserções que estão presentes em um número restrito de cepas, por
exemplo, BCG Japan, Russia e Moreau possuem um elemento dentro da região promotora do
gene phoP, o que deve eliminar a auto-repressão de phoP, enquanto BCG Pasteur não possui
9
esta inserção, resultando em um baixa expressão do gene, podendo ter implicações em sua
virulência (Brosch et al., 2007). Outras regiões faltam em apenas uma das cepas, como é o
caso da Rv3698 (RD Russia) que está ausente na cepa BCG Russia, RD14 na cepa BCG
Pasteur, RD8 na cepa BCG Montreal (BCG Frappier) (Behr et al., 1999; Mostowy et al.,
2003), RD Denmark/Glaxo que está ausente na cepa BCG Danish e também na cepa derivada
dela, BCG Glaxo (BCG Copenhagen 1077) (Mostowy et al., 2003), e ainda BCG Moreau que
possui uma deleção específica chamada RD16 (Behr et al., 1999; Behr et al., 2002 Benévolode-Andrade et al., 2005; Cogrove et al., 2006).
As cepas de BCG foram classificadas em 2 grandes grupos: Grupo I, que consiste nas
cepas de BCG que possuem a região RD2, que contém o gene que expressa a proteína MPT64.
Estas cepas são consideradas como cepas antigas, mais próximas da cepa original e, incluem
BCG Japan, Russia e Moreau, distribuídas antes de 1925 (Behr et al., 1999; Behr et al., 2002;
Brosch et al., 2007). Estas três cepas possuem 2 cópias de uma sequência de inserção
(IS6110), sendo que as cepas consideradas antigas obtidas entre 1925 e 1927 (BCG Sweden e
Birkhaug) já perderam um elemento IS6110. O Grupo II consiste nas cepas que não possuem
a RD2, e são as consideradas recentes. Essas diferenças genômicas contribuem para as
propriedades variáveis das diferentes cepas de BCG (Behr et al., 2002; Brosch et al., 2007).
As diferenças genéticas entre as cepas de BCG são fatores importantes que contribuem
para a grande variabilidade observada na imunidade protetora adquirida após a vacinação.
Apesar das modificações genéticas que diferem a cepa BCG Moreau de várias outras cepas,
como por exemplo, a BCG Danish e Pasteur, não foi observada redução da capacidade
protetora descrita originalmente, onde a cepa brasileira é considerada uma das mais
imunogênicas dentre as várias cepas utilizadas na vacinação (Brewer & Colditz, 1995). Além
disso, Bêrredo-Pinho e colaboradores (2011), ao comparar o perfil proteômico de BCG
Moreau e Pasteur, mostraram a expressão aumentada de proteínas imunogênicas em BCG
Moreau, muitas das quais têm sido implicadas na resposta imune protetora.
10
Figura 1.3 – Genealogia das cepas de BCG. No esquema são mostradas algumas diferenças
genéticas entre as cepas, como as deleções ocorridas ao longo do tempo (quadrados azuis),
desde a atenuação da cepa de BCG original. Os quadrados rosa escuro em destaque
representam as cepas utilizadas em nosso estudo. Esquema adaptado de Hayashi et al., 2009.
1.1.5. Relação BCG-hospedeiro
O padrão de especificidade entre a micobactéria e o hospedeiro já foi investigado tanto
em populações humanas, quanto em modelo animal. Wu e colaboradores (2007), utilizando
células de recém-nascidos vacinados com diferentes cepas de BCG (Japan, Moreau ou
Danish), desafiadas com proteínas de M. tb., identificaram diferenças na resposta imune.
Neste trabalho, observou-se que a vacinação com BCG Moreau ou Danish induziu
preferencialmente a expressão de citocinas envolvidas na imunidade adaptativa, como
interleucina (IL)-12 e interferon (IFN)-γ, enquanto a vacinação com BCG Japan induziu
preferencialmente citocinas associadas com resposta pró-inflamatória, como IL-1β e IL-6.
Este estudo, somado a outros, confirmam que a resposta do hospedeiro desencadeada por
diferentes cepas de BCG tem mostrado não ser homogênea.
11
O perfil de citocinas induzido após a vacinação por BCG também foi observado por
Lalor e colaboradores (2010), que identificaram citocinas pró-inflamatórias, como IFN-γ,
fator de necrose tumoral (TNF), IL-2, IL-1β, IL-6 e IL-17, além da indução de citocinas T
helper (Th)2, como IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, bem como das quimiocinas, IL-8, proteína
induzível por interferon (IP)-10 e proteína inflamatória de macrófago (MIP)-1α, e dos fatores
de crescimento, G-CSF (fator estimulador de colônia de granulócitos) e GM-CSF (fator
estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos). Posteriormente, foi investigado pelo
mesmo grupo (Lalor et al., 2011), diferenças no perfil de citocinas de crianças pertencentes a
duas populações diferentes, Malawi e Reino Unido, após vacinação com BCG Danish 1331.
Das 42 citocinas analisadas, foram identificadas 27 citocinas e quimiocinas diferencialmente
expressas nessas duas populações. Das sete induzidas em indivíduos do Reino Unido, todas
estavam relacionadas com uma resposta Th1, incluindo IL-2, IL-6, IL-12p40, LT- e IFNγ, e quimiocinas, como CCL3, as quais já são conhecidas estarem involvidas na imunidade
contra TB. Enquanto das 20 citocinas/quimiocinas induzidas em indivíduos de Malawi,
estavam incluídas citocinas pró-inflamatórias, como IL-1α, citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e
IL-13, bem como a citocina regulatória IL-10, sugerindo uma maior imunoregulação nessa
população. Além disso, foi observada a indução de IL-17, quimiocinas e fatores de
crescimento, sugerindo um maior desenvolvimento e diferenciação de novos tipos celulares.
Porém, apesar desse aumento dos fatores de crescimento, foi observada uma resposta Th1
diminuída na população de Malawi, com um perfil imune preferencialmente Th2, sendo
assim, os autores sugerem que essa estratégia de vacinação em crianças de Malawi pode não
ser a ideal. Com isso, foram observadas diferenças no perfil e dimensão da resposta imune em
diferentes populações após a vacinação, confirmando que a vacinação por BCG não protege
de forma igual nos diferentes conjuntos populacionais.
Por um lado, uma mesma cepa de BCG dada a indivíduos com diferentes background
genéticos pode variar muito em relação a sua imunogenicidade (Black et al., 2002; Lalor et al.,
2009), onde já foi observado que apesar de BCG induzir uma robusta resposta Th1, em
muitos indivíduos esta resposta por si só, não é suficiente para ocasionar resistência do
hospedeiro contra infecção por M. tb. e M. leprae. Somado ao fato de que em uma mesma
população, cepas de BCG podem levar a diferentes reações adversas (Liu et al., 2009),
poderia refletir interações específicas cepa de BCG-hospedeiro. Recentemente, foi mostrado
que cepa BCG Danish 1331 ativa a resposta imune celular dependente também do genótipo
do hospedeiro (Randhawa et al., 2011). Neste trabalho, foi demonstrado que SNPs em TLR1
12
e TLR6 estão associados com a resposta imune induzida por BCG, 10 semanas após a
vacinação de recém-nascidos, sugerindo que fatores genéticos do hospedeiro estão associados
com a resposta à vacina de BCG.
Recentemente, Di Pietrantonio e colaboradores (2011) investigaram os efeitos do
background genético tanto do hospedeiro quanto da micobactéria,
empregando duas
linhagens de camundongo, conhecidas por possuírem distintas respostas à infecção por
micobactérias; com isso, foram observadas diferenças na expressão de citocinas e quimiocinas
após infecção por cada uma das três cepas de BCG empregada (BCG Russia, Japan e Pasteur).
Além disso, foram mostradas diferenças na capacidade de crescimento das cepas de BCG no
pulmão do hospedeiro dependente da linhagem de camundongo utilizada. Os resultados
observados demonstraram que a variabilidade genética tanto do hospedeiro quanto da bactéria
contribue fortemente em diferentes aspectos da suscetibilidade do hospedeiro à infecções
micobacterianas, mostrando a importância de considerar esses efeitos em conjunto (Di
Pietrantonio et al., 2010; Di Pietrantonio et al., 2011). Com isso, acredita-se que o principal
efeito sobre a resposta do hospedeiro seria devido ao tipo de micobactéria utilizada, enquanto
que o background genético do hospedeiro seria o modulador dessa resposta.
1.1.6. Novas estratégias vacinais para a proteção contra TB e hanseníase
Levando-se em consideração que BCG é a única vacina disponível contra TB,
conferindo proteção em recém-nascidos e crianças contra o desenvolvimento das formas mais
graves de tuberculose disseminada, seria recomendada a continuidade da vacinação em países
endêmicos para a doença. No entanto, a eficácia variável da vacina BCG e o aumento dos
casos de TB multi-droga resistentes em todo o mundo sugerem a necessidade de uma vacina
melhor contra a TB. Algumas abordagens experimentais já prevêem o desenvolvimento de
uma vacina BCG melhorada, incluindo a utilização de micobactérias atenuadas, vacinas de
subunidades e vacinas de DNA (Andersen & Doherty, 2005).
Alguns trabalhos já estudaram o impacto da utilização de BCGs recombinantes, em
sua maioria, em sistema murino (Horwitz et al., 2000; Goonetilleke et al., 2003; Pym et al.,
2003; Chatterjee et al., 2011; Lin et al., 2011). Recentemente, Chatterjee e colaboradores
(2011) mostraram que BCG (Danish) recombinante contendo a região RD1, que contém um
gene codificante para a proteína ESAT-6 (um dos antígenos mais importantes expressos por
M. tb., ausentes em BCG), induziu uma maior eficácia protetora da vacina em modelo murino
13
quando comparado com a cepa BCG Danish não recombinante. Este grupo observou que
enquanto a cepa selvagem induziu apenas uma resposta Th1, a cepa recombinante induziu
uma resposta Th1 e Th17. Foi observado ainda que estas células Th17 desempenham um
papel importante no estabelecimento de resposta imune protetora contra a TB (Khader et al.,
2007; Wozniak et al., 2010; Chatterjee et al., 2011).
Os adjuvantes também têm sido utilizados para estimularar a resposta imune, sendo
parte da sua função, a estimulação e liberação de mediadores, como as citocinas (Lindblad et
al.,1997). No caso das vacinas de subunidade, que se mostram pouco imunogênicas ao serem
utilizadas sozinhas, é essencial administrá-las junto com um adjuvante (Ottenhoff et al., 2010).
A inclusão de adjuvantes pode melhorar a proteção induzida pela vacina por fornecer uma
resposta imune forte e de longo prazo. Neste caso, um dos principais problemas no
desenvolvimento de vacinas antimicobacterianas é a falta de adjuvantes que efetivamente
estimulem a imunidade mediada por células, na mesma medida que torne a vacina segura o
suficiente para ser utilizada no homem.
1.2. Micobactérias patogênicas: agentes etiológicos da hanseníase e tuberculose
Micobactérias que causam doenças são conhecidas há muito tempo e os relatos sobre a
hanseníase podem ser encontradas desde tempos bíblicos. Também já foram identificadas
múmias egípcias de mais de 5.000 anos, apresentando anormalidades e deformidades
caracterísda TB em sua forma óssea (Ducati et al., 2006).
O M. tb. e M. leprae se adaptaram por nichos específicos preferenciais no hospedeiro
humano, sendo o M. leprae altamente adaptado a um ambiente intracelular, o que levou a uma
evolução redutiva do genoma e a impossibilidade de crescimento in vitro (como será melhor
detalhado a seguir). O M. tb. é capaz de crescer em meios de cultura convencionais in vitro e
se adapta a diferentes tecidos, tendo um padrão de crescimento mais rápido que o M. leprae,
bem como maior diversidade genética com inúmeras cepas circulantes no mundo.
14
1.2.1. Mycobacterium leprae
O agente etiológico da hanseníase, o M. leprae**, também conhecido como bacilo de
Hansen, foi identificado pelo médico norueguês Gerhard Henrik Armauer Hansen em 1873
como o agente causador da doença (Foss, 1999; Gomes, 2000). É um parasito intracelular
obrigatório com alta afinidade pelas células de Schwann nos nervos periféricos e macrófagos
da pele, o que explica as lesões observadas nos pacientes (Kaplan & Cohn, 1986). Essa
predileção pode causar danos neurais e deformações, como perda de sensibilidade, atrofias e
paralisias musculares, que se não tratadas adequadamente, podem evoluir para incapacidades
físicas permanentes (Brasil, 2001).
Até hoje, o M. leprae tem resistido a todas as tentativas de cultivo em meios de cultura
in vitro, o que tem dificultado o estudo de sua biologia e dos mecanismos de patogênese
causado por este microrganismo. A obtenção de massa bacilar é possível a partir da infecção
de animais, como o tatu de nove bandas (Dasypus novemcinctus), que é um hospedeiro
natural, ou em camundongos normais da linhagem C57/Black6, camundongos atímicos (nude)
ou nocautes de genes como TNF, linfotoxina-α (LTA) ou receptor de TNF (TNFR) (Hagge et
al., 2009, Cardoso et al., 2011b). O crescimento do M. leprae no coxim plantar de
camundongos atímicos, por exemplo, fornece quantidades suficientes de bacilos viáveis para
fins experimentais. Esses camundongos são extremamente suscetíveis à infecção pelo M.
leprae por apresentar um alto grau de imunodeficiência. Cerca de 2 x 107 bacilos inoculados
no coxim plantar de camundongos nude permitem a obtenção de aproximadamente 1010
bacilos num período de 6 meses (Truman & Krahenbuhl, 2001).
O genoma completo do M. leprae, publicado em 2001, apresenta características
interessantes (Cole et al., 2001), onde apenas metade do seu genoma contém genes que
codificam proteínas e o restante consiste em pseudogenes e regiões não codificantes. Estudos
comparativos mostraram existir um caso de redução evolutiva no genoma dessa bactéria.
Utilizando M. tb. e M. bovis BCG, como critério de comparação, observa-se que ambas as
**
O M. leprae é uma bactéria de crescimento lento, que se apresenta sob a forma de bacilo reto ou levemente
encurvado, imóvel, que pode ser encontrado formando aglomerados, dispostos paralelamente em feixes, também
chamados de globias. Coram-se de vermelho pelo método Ziehl-Nielsen, sendo considerados bacilos álcoolácido resistentes (BAAR), método comumente utilizado para diagnóstico em laboratório (Britton & Lockwood,
2004; Scollard et al., 2006; Hussain, 2007). O patógeno possui um envelope celular complexo, contendo uma
estrutura única, rica em lipídeos. Esse envelope compreende uma membrana celular, uma parede celular formada
principalmente por peptideoglicanos e ácidos micólicos, e uma cápsula rica em glicolipídeos, com destaque para
o mais abundante, o glicolipídeo fenólico I (PGL-I), presente exclusivamente no M. leprae (Daffé & Draper,
1998). Muitas moléculas do envelope celular são essenciais para a patogênese do M. leprae, tais como as
adesinas que mediam a interação do bacilo tanto com células de Schwann, quanto com células epiteliais e
endoteliais do hospedeiro (Pessolani et al., 2003).
15
micobactérias apresentam um genoma de aproximadamente 4,4 Mb, contendo em média
3.973 genes e uma quantidade de pseudogenes que varia de 6 para M. tb. e 34 para BCG,
enquanto o M. leprae possui apenas 1.614 genes e um surpreendente número de 1.133
pseudogenes (Scollard et al., 2006). O número de pseudogenes e sua proporção no genoma do
M. leprae é consideravelmente maior do que em outras micobactérias (Akama et al., 2010).
Recentemente, foi analisado o perfil de expressão global de genes, pseudogenes e
regiões não codificantes em M. leprae, e foi observado, por exemplo, que os pseudogenes
podem ser abundantemente transcritos. Muitas vezes, se observa níveis de transcrição em
taxas similares aos genes (Akama et al., 2009), porém ainda não se sabe o porquê da
transcrição destas sequências, que a princípio se pensava serem não-funcionais. De fato,
análises proteômicas (Wiker et al., 2011) e análises in silico (Williams et al., 2009) sugerem
que esses RNAs de pseudogenes não são traduzidos. Eventos como rearranjos e deleções no
genoma, perda de fatores sigma e a presença de seqüências Shine-Dalgarno alteradas ou
degeneradas seriam responsáveis pelo acúmulo de pseudogenes que se mantêm transcritos
(Williams et al., 2009). Mesmo assim, é curioso observar que esta micobactéria mantém um
gasto energético relevante para gerar produtos que não são funcionais (assumindo a visão
clássica um gene- uma proteína). Entretanto, é interessante a hipótese de que os pseudogenes
transcritos possam participar em vias de regulação gênica do hospedeiro em mecanismos de
controle do tipo microRNA (miRNA) já descritos em E. coli como sRNA (do inglês, small
RNA), o que poderia explicar a capacidade de sobrevivência do M. leprae mediante o número
tão limitado de seqüências codificantes (Akama et al., 2009).
Ainda é importante ressaltar que a “degeneração” do genoma do M. leprae resultou na
eliminação de diversas vias fundamentais, o que implica em respostas limitadas perante o
estresse do ambiente. O acúmulo de pseudogenes, com a consequente perda de função gênica,
deve ser uma das causas do crescimento lento do bacilo e seu inviável cultivo in vitro,
podendo ter resultado em uma evolução adaptativa que possivelmente avançou de um modo
de vida livre a um nicho extremamente especializado dos macrófagos e das células de
Schwann dos nervos periféricos (Monot et al., 2009). Este grupo ao comparar o genoma de
quatro cepas de M. leprae observou a baixa diversidade genômica da micobactéria, o que se
mostrou de acordo com a hipótese de que a hanseníase surgiu da infecção por um único clone,
e que este então, passou por um processo evolutivo. Esta cepa progenitora teria se originado
no leste da África e se espalhado pela Ásia e Europa, e posteriormente para as Américas
(Monot et al., 2005; Monot et al., 2009), reforçando a teoria de que a doença teria surgido no
continente africano.
16
Recentemente, foi demonstrado por comparações genômicas que o M. leprae isolado
de pacientes hansenianos naturais do Sul dos Estados Unidos e o que ocorrem naturalmente
em tatus desta região possuem sequências genômicas idênticas, sendo considerada uma única
cepa responsável pelas infecções nos dois hospedeiros. Os resultados deste trabalho implicam
fortemente os tatus como fonte de infecção, sugerindo que a hanseníase seria uma zoonose
nesta região (Truman et al., 2011).
1.2.2. Mycobacterium tuberculosis
O agente etiológico da tuberculose, o M. tb.†, também conhecido como bacilo de Koch,
foi identificado por Robert Koch em 1882, como causador da doença (Hussain, 2007). É um
patógeno de crescimento preferencialmente intracelular, e embora possa afetar outras células,
possui um tropismo por macrófagos alveolares.
O M. tb. é uma bactéria que faz parte do complexo Mycobacterium tuberculosis que
inclui outras quatro espécies que também podem causar tuberculose, que são M. bovis, M.
africanum, M. microti e M. canetti (Tsukamura et al., 1985; van Soolingen et al., 1997).
Apesar de estreitamente relacionadas, estas micobactérias diferem em relação à morfologia,
bioquímica, variedade de hospedeiros e patogenicidade (Brosch et al., 2002)
O genoma do M. tb., como mencionado anteriormente possui 4,4 Mb, contendo 3.993
genes, onde inclui-se cerca de 2.441 genes com funções atribuídas, 912 genes com funções
hipotéticas conservadas, 606 genes com funções desconhecidas e 6 pseudogenes. Além disso,
possui um alto conteúdo G+C (65%) (Cole et al., 1998) (tabela 1.2). O genoma de M. tb.
difere radicalmente de outras bactérias, já que uma parcela muito grande de sua capacidade de
codificação é dedicada à produção de enzimas envolvidas na lipogênese e lipólise; codifica
também duas novas famílias de proteínas ricas em glicina com uma estrutura repetitiva que
pode representar uma fonte de variação antigênica.
†
O M. tb. é uma bactéria que apresenta crescimento lento e a faixa ideal de temperatura para seu crescimento é
de 37° C. Estes bacilos costumam se agrupar em forma de ramos alongados e tortuosos, conhecidos como
cordas. Seu tempo de geração é longo, podendo variar de 14 a 20 horas dependendo do meio de cultura utilizado
para seu crescimento (Hussain, 2007). O M. tb. possui uma complexa parede celular que é um dos principais
determinantes de virulência da bactéria. Essa parede celular possui um alto teor lipídico (mais de 60%), contendo
peptidoglicano, arabinogalactana, que faz a ligação do peptideoglicano aos lipídeos frouxamente ligados (tais
como, fator corda e cera) e ácidos micólicos; e proteínas (extrato que é utilizado para fabricação da tuberculina)
(Hussain, 2007). A bactéria não é classificada nem como gram-positiva, nem como gram-negativa, pois sua
parede celular não apresenta características químicas de nehum dos dois. Porém, se o bacilo for submetido a
coloração de Gram, poderá ser fracamente corado como gram-positivo (referido como bacilo fantasma). Assim
como outras micobactérias, são consideradas bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR).
17
Vários genótipos para M. tb. já foram descritos, como por exemplo, RD Rio (Lazzarini
et al., 2007) e Beijing (Gynn et al., 2002). A compreensão das variações genéticas entre os
diferentes genótipos de M. tb. poderia ajudar a esclarecer sua contribuição para as diferenças
fenotípicas, e entender o impacto da variabilidade destas cepas de M. tb. na progressão da
doença seria importante para a implementação de medidas de controle da tuberculose
(Hanekom et al., 2011). Um número crescente de evidências sugere que diferentes cepas de
M. tb. apresentam diferenças substanciais em seu potencial patogênico (Gagneux & Small,
2007; Nicol & Wilkinson, 2008) Observações recentes de associações preferenciais de
linhagens de M. tb. com grupos étnicos podem refletir uma co-adaptação da micobactéria e
seu hospedeiro humano (Gagneux et al., 2006).
Tabela 1.2 - Comparação das características dos genomas de M. bovis, M. tb e M. leprae.
Características
M. bovis
M. tb.
M. leprae
Tamanho (Mb)
4.345
4.411
3.268
3.951
3.959
1.614
rRNA
3
3
tRNA
45
45
47
27
6
1.113
Genes que codificam:
Proteínas
Pseudogenes
*
65.6
65.6
57.8
Conteúdo G+C (%)
*
Compreende tanto os genes que codificam para rRNA quanto para tRNA
1.2.3. Interação das micobactérias patogênicas com o hospedeiro
A interação do M. leprae e M. tb. com o hospedeiro determina o desenvolvimento ou
não da doença, bem como de suas complicações. A maioria dos indivíduos infectados não
desenvolve hanseníase ou TB, sugerindo a existência de variações genéticas, biológicas e
ambientais que influenciam na resistência dos indivíduos às estas doenças.
Existem similaridades entre a hanseníase e a tuberculose relacionadas à interação
patógeno-hospedeiro e a ativação da resposta imune celular, onde M. leprae e M. tb. induzem
uma resposta imune celular específica no hospedeiro para controlar a infecção.
Resumidamente, após contato com o hospedeiro, através das vias aéreas superiores, o bacilo
18
pode penetrar no corpo e se espalhar, instalando-se preferencialmente em macrófagos de pele
e em células de Schwann nos nervos periféricos, no caso do M. leprae, e em macrófagos
alveolares no caso do M. tb. Após ser reconhecido pelo macrófago, o bacilo será fagocitado e
em seguida serão ativadas vias que tentarão impedir o sucesso da infecção, tais como a
produção de óxido nítrico, de radicais superóxido, e de peptídeos antimicrobianos como
catelicidina e β-defensinas (Liu et al., 2006). Essa interação micobactéria:hospedeiro pode
ocorrer através da interação com os receptores de fagocitose como C3 (complemento 3) ou
MRC1 (receptor de manose) ou DC-SIGN (receptor de células dendríticas, do inglês,
dendritic cell-specific intercellular adhesion ) e ativação se dá por receptores que reconhecem
padrões ou PRR (do inglês, pattern recognition receptors) como os receptores do tipo Toll
(TLR do inglês, Toll-like receptor) e NOD2 (do inglês, Nucleotide- binding oligomerization).
No final, o isolamento das bactérias em granulomas no pulmão, no caso de M. tb., ou na pele
ou nervo, no caso do M. leprae, é a forma de impedir a progressão da doença (Cardoso et al.,
2011a). Os genes e as vias mais importantes identificados em estudos de associação à
hanseníase estão resumidos na figura 1.4.
Figura 1.4 - Genes e vias mais importantes identificados em estudos genéticos de associação à
hanseníase; mostrando desde o primeiro nível de interação da bactéria com a célula do
hospedeiro através de PRRs, até a produção de proteínas envolvidas diretamente na atividade
microbicida. As setas azuis pontilhadas correspondem às vias de ativação, enquanto as setas
sólidas identificam interações ou translocações de cada proteína. Adaptado de Cardoso et al.,
2011a.
19
1.3. Principais micobacterioses em humanos
As duas micobacterioses mais importantes como problemas de saúde pública são a
tuberculose e hanseníase. Outra micobacteriose de interesse é a úlcera de Buruli, caracterizada
por ulcerações típicas na pele devido ao desenvolvimento de necrose da derme. Esta doença é
a terceira mais comum causada por micobactérias em humanos, e possui o Mycobacterium
ulcerans como agente etiológico, porém é de pouco interesse clínico e epidemiológico nas
Américas. Já foi observado que a vacinação com BCG também fornece uma significante
proteção contra a úlcera de Buruli em crianças e adultos (Portaels et al., 2002; Portaels et al.,
2004).
Nas últimas décadas, tem sido observado o aumento de micobacterioses causadas por
micobactérias oportunistas. Destas, destaca-se o Mycobacterium abscessus, a mais perigosa
micobactéria, responsável por um amplo espectro de infecções em humanos, como doenças
pulmonares (em condições de predisposição, como fibrose cística), cutâneas e ósseas
(associadas aos cuidados de saúde, como feridas após mamoplastia), e doença disseminada
(casos de cirurgia ocular) (revisado por Medjahed et al., 2009).
Além disso, existem as micobacterioses em animais, sendo a tuberculose bovina a
mais importante. É uma doença infecto-contagiosa, crônica, que apresenta como agente
etiológico o M. bovis. A TB bovina pode causar grandes prejuízos, pois é capaz de levar a
uma redução do tempo de vida produtiva do rebanho, crescimento mais lento ou mesmo perda de
peso e diminuição na produção de leite, sendo importante causa de perdas econômicas (OIE,
2009). Um dos pontos mais críticos desta doença com relação à saúde pública é a transmissão
da TB bovina ao homem por meio do leite de vacas infectadas. Porém, após a implantação da
pasteurização, esta forma de transmissão foi minimizada. Entretanto, esta doença vem se
destacando entre indivíduos que trabalham diretamente com animais contaminados, como
veterinários, tratadores, laboratoristas, entre outros (Michel et al., 2010). E apesar da eficácia
protetora variável, também foi mostrado que a vacinação com BCG leva a uma proteção
contra infecções por M. bovis (OIE, 2009).
1.3.1. Hanseníase
A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa de evolução crônica, sistêmica,
considerada uma das mais antigas doenças que afligem o homem. A doença é amplamente
20
conhecida pelo nome de lepra, porém no Brasil, a substituição do termo lepra por hanseníase
foi em homenagem ao médico que identificou a bactéria M. leprae, como já mencionado,
Gerhard Henrik Armauer Hansen. Esta mudança foi realizada justamente para minimizar o
forte estigma social que se faz presente até hoje.
A hanseníase ainda é considerada um problema de saúde pública em alguns países,
dentre os quais se destacam a Índia e o Brasil. Este último apresenta um dos maiores números
absolutos de casos e prevalência acima da meta estabelecida pela OMS (figura 1.5).
Figura 1.5 - Taxas de prevalência de hanseníase no mundo. Os dados são reportados pela
OMS e correspondem ao início de 2011. As taxas referem-se a cada 100.000 habitantes da
população (WHO, 2011).
De acordo com relatórios enviados de 130 países e territórios à OMS, a detecção de
novos casos registradas em 2010 foi de 228.474, e a prevalência global registrada no começo
de 2010 foi de 192.246 casos (WHO, 2011). Na América Latina, o Brasil se destaca,
apresentando aproximadamente 80% dos casos do continente, com 34.894 novos casos
registrados em 2010, dos quais 7,1% são detectados em menores de 15 anos, indicando a
21
existência de transmissão ativa do bacilo. Embora, a Índia seja responsável pelo maior
número de novos casos de hanseníase no mundo segundo a OMS (134.184 novos casos em
2008), foi observado um declínio nesses números ao longo dos últimos anos, que contribuiu
para a redução na prevalência mundial. Porém, acredita-se que a redução na prevalência
venha sendo influenciada muito mais pela diminuição no tempo de tratamento e pela remoção
dos registros de pacientes curados, do que pela redução nos níveis de transmissão do M.
leprae. Entretanto, em muitos países a redução na prevalência não foi acompanhada pela
redução no número de novos casos o que ocorre, por exemplo, no Brasil (figura 1.6). O
diagnóstico tardio e o longo período de incubação da doença são fatores que contribuem para
a transmissão ativa da hanseníase, dificultando a redução significativa no número de novos
casos.
A hanseníase possui uma distribuição desigual no Brasil, que acompanha a
desigualdade sócio-econômica regional. Em 2009, a região Nordeste foi responsável por
40,8% do número de novos casos no país, seguida da região Norte que possuiu 21,1%
(DATASUS, 2010). Nesse mesmo ano, a região Sudeste possuía 17% do número de novos
casos da doença, enquanto que o Sul, região onde os índices de prevalência já são menores do
que 10 a cada 100.000 habitantes, contribuiu com apenas 4,1% (DATASUS, 2010). Os dados
no país em relação à doença demonstram a necessidade de reforçar a vigilância
epidemiológica nas áreas mais endêmicas, dando continuidade ao cumprimento de atividades
que controlem a transmissão da hanseníase.
22
Figura 1.6 - Taxas de incidência de hanseníase no mundo. Os dados são reportados pela OMS
e correspondem ao início de 2011. As taxas referem-se a cada 100.000 habitantes da
população (WHO, 2011).
As vias aéreas superiores constituem a principal porta de entrada e via de eliminação
do bacilo, constituindo a forma mais provável de transmissão da hanseníase entre seres
humanos. Desta forma, a proximidade com pacientes é um importante determinante da
transmissão da doença (Noordeen, 1994). Os indivíduos com maior probabilidade de contrair
a doença são aqueles que residem na mesma casa, que vivem no peridomicílio ou que tenham
contato íntimo e frequente com o paciente. Um estudo realizado em uma população endêmica
na Indonésia demonstrou que o risco estimado para a hanseníase foi cerca de nove vezes
maior em famílias de pacientes e quatro vezes maior em pessoas com relações diretas com
pacientes em comparação às famílias que não tinham qualquer contato com os doentes (Van
Beers et al., 1999). Outro estudo realizado recentemente por Sales e colaboradores (2011),
confirmou que o principal fator de risco entre os contatos de casos de hanseníase foi a
proximidade com os doentes, onde os contatos intradomiciliares apresentam um risco
praticamente duas vezes maior de adoecer quando comparados àqueles extradomiciliares,
apesar da força desta associação ser diferente para casos incidentes (entendidos como os que
adoecem no acompanhamento após o início do tratamento do caso índice) e co-prevalentes
23
(caso secundário diagnosticado no momento do exame de todos os familiares reportados pelo
paciente índice). Entretanto, além da proximidade, a carga bacilar também mostrou
associação importante na determinação da doença entre os contatos e doentes hansenianos,
onde contatos de casos multibacilares tem uma chance quatro vezes maior de desenvolverem
hanseníase do que contatos de casos paucibacilares. Quando a taxa de adoecimento foi
avaliada, segundo status vacinal, observou-se que o risco de adoecer foi três vezes maior no
grupo sem cicatriz vacinal (não vacinado), do que no grupo com cicatriz vacinal (vacinado).
Apesar de ter sido demonstrado que indivíduos que vivem nas mesmas habitações que
pacientes de hanseníase possuem um risco aumentado de desenvolver a doença, a maioria dos
contatos não a manifesta e a prevalência entre os contatos é baixa. Entretanto, o risco de
adoecimento é também aumentado pelo parentesco, onde a relação de consangüinidade de
primeiro grau é um fator muito importante, indicando um papel fundamental de fatores
genéticos no estabelecimento da infecção por M. leprae, que por sua vez é modulada por
fatores ambientais (Almeida et al., 2004; Moet et al., 2006; Lázaro et al., 2010). Sendo assim,
a hanseníase apresenta um caráter multifatorial, onde o elevado risco de desenvolver
hanseníase possui uma contribuição tanto genética quanto de fatores ambientais (Moraes et
al., 2006), e embora a infecção pelo M. leprae seja a necessária, ela não é suficiente para o
estabelecimento da doença.
A infecção causada pelo M. leprae apresenta um longo período de latência, onde o
tempo médio de incubação nos pacientes pode variar de quatro até trinta anos (Noordeen,
1994). Acredita-se que este longo período de incubação contribua para a transmissão da
hanseníase, pois o indivíduo já poderia estar transmitindo a doença antes mesmo de apresentar
manifestações clínicas. Após o contato do M. leprae com o hospedeiro, o bacilo pode penetrar
no corpo através das vias aéreas superiores, e posteriormente, espalhar-se preferencialmente
em áreas de baixas temperaturas como as extremidades do corpo, como os pés, mãos e face.
As principais manifestações clínicas da hanseníase dependem da resposta imune do
hospedeiro, que influencia não só na suscetibilidade, mas também no curso da infecção
(Ridley & Jopling, 1966). Elas incluem lesões de pele, mucosas e nervos. Desta forma, os
pacientes são classificados em cinco formas clínicas baseadas na carga bacilar e resposta
imune (figura 1.7). A forma mais grave, ou lepromatosa (LL) é caracterizada por uma alta
carga bacilar, numerosas lesões na pele e baixa atividade de resposta imune celular. Já a
forma mais branda, ou tuberculóide (TT), apresenta uma resposta imune celular parcialmente
eficiente que controla a proliferação e a dispersão do bacilo, poucas lesões na pele e baixo
número de bactérias. Existem ainda três formas intermediárias chamadas de borderline
24
tuberculóide (BT), borderline borderline (BB) e borderline lepromatosa (BL), em ordem
crescente de severidade (Ridley & Jopling, 1966).
Além desta classificação espectral, a OMS propõe uma subdivisão simplificada dos
pacientes para fins de tratamento. Neste caso, os pacientes são classificados em multibacilares,
caracterizados pela presença de carga bacilar positiva na biopsia, seis ou mais lesões cutâneas
e esfregaço positivo para a presença da bactéria, e incluem as formas LL, BB e BL. Enquanto
os paucibacilares são caracterizados pelo aparecimento de raros bacilos, apresentando cinco
ou menos lesões cutâneas e esfregaço negativo, e incluem as formas TT e BT. Ao longo do
curso natural da doença, os pacientes podem desenvolver reações, que representam episódios
inflamatórios que se intercalam no curso crônico da hanseníase. As reações são divididas em
reação reversa (RR) ou reação do tipo I, que ocorre nas formas BL, BB e BT,
preferencialmente; e eritema nodoso hansênico (ENH) ou reação do tipo II que ocorre mais
freqüentemente, nas formas BL e LL. Ambas as reações são caracterizadas por uma
reativação do processo inflamatório que pode culminar em lesões na pele e neurite aguda no
caso da reação do tipo I e até mesmo complicações sistêmicas no caso da reação do tipo II
(Scollard et al., 2006; Nery et al., 1998).
Figura 1.7 - Formas clínicas da hanseníase. Esquema demonstra o perfil espectral da doença.
Representação baseada na classificação de Ridley e Jopling: TT (tuberculóide), BT
(borderline tuberculóide), BB (borderline), BL (borderline lepromatosa), LL (lepromatosa).
Estão incluídos aspectos da resposta imune do paciente e os episódios reacionais RR (reação
reversa) e ENH (eritema nodoso hansênico). Adaptado de Ridley & Joplin, 1966.
25
A hanseníase é a neuropatia não traumática mais importante em saúde pública onde a
lesão neural leva a morbidade cerca de 30% dos pacientes. Existe ainda, a forma neural pura
(PNL) que é uma das formas clínicas da doença causada por M. leprae. A PNL apresenta uma
neuropatia periférica isolada, sem evidências de lesões na pele, caracterizada por disfunção
motora, sensorial ou por ambas. A incidência de pacientes hansenianos com PNL varia de
acordo com a população, onde, por exemplo, na Índia varia de 5,5 a 17,7% de todos os casos
de hanseníase. No Brasil, a proporção de PNL ainda não foi determinada (Jardim et al., 2003).
A PNL é uma das formas mais mutiladoras da hanseníase, já que não há lesões visíveis
na pele que possam indicar um diagnóstico de hanseníase. Além disso, os bacilos podem não
ser demonstrado em esfregaços de pele para confirmar a doença, com isso, os danos
nos nervos prosseguem até se tornarem irreversíveis (Suneetha et al., 2005). O diagnóstico de
PNL exige a realização de biopsias de nervo periférico devido à ausência de lesões cutâneas
(Jardim et al., 2003; Jardim et al., 2005).
Os danos nos nervos periféricos estão presentes em todas as formas de manifestação
da doença. Nas formas iniciais, os nervos sensoriais e motores da pele são afetados, levando a
perda da sensibilidade a estímulos externos, enquanto os danos em nervos cutâneos mais
profundos podem levar a perda da função muscular e a paralisia. A perda das pontas dos
dedos, uma característica da desfiguração dos pacientes com hanseníase, ocorre devido à
osteoporose resultante da inflamação, traumas e à infecções bacterianas secundárias (WilderSmith & Brakel, 2008).
O sistema de classificação clínica e patológica permanece o diagnóstico padrão da
hanseníase, com importantes implicações para o tratamento e prognóstico (Hussain, 2007). O
diagnóstico é comumente baseado em sintomas e sinais clínicos. Os sinais são lesões
cutâneas, nervos espessados e sensibilidade alterada em 70% dos casos. A lesão de pele pode
ser única ou múltipla e geralmente fica menos pigmentada que a pele normal ao redor.
Geralmente, um nervo espessado é muitas vezes acompanhado por outros sinais como
resultado de danos ao nervo. Porém, na ausência de sinais, espessamento dos nervos por si só,
sem perda sensorial e/ou fraqueza muscular muitas vezes não é uma sinal confiável da
hanseníase. Em alguns casos, a confirmação do diagnóstico requer o uso de exames
laboratoriais complementares, como a baciloscopia e a histopatologia. É observada
microscopicamente a presença do M. leprae em amostras obtidas diretamente da pele ou de
lesões, bem como a integridade dos nervos cutâneos.
Ainda não está disponível nenhum teste sorológico que pudesse ser implementado
rotineiramente no diagnóstico da hanseníase. Imunoensaios tem sido desenvolvidos para
26
detectar anticorpos contra o antígeno PGL-1 do M. leprae (Moura et al., 2008), no qual os
níveis de produção do IgM anti PGL-1 indicam exposição ao M. leprae e mostram correlação
positiva com a baciloscopia. Entretanto, esses ensaios ainda não possuem satisfatório grau de
sensibilidade e especificidade para a aplicação de diagnóstico.
Já o diagnóstico laboratorial teve grandes avanços nos últimos anos e foram
desenvolvidos métodos para a extração, amplificação e identificação de DNA do M. leprae
em amostras clínicas utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e outras
técnicas moleculares. Muitos genes foram utilizados no desenvolvimento do ensaio de PCR
para a detecção do bacilo em amostras clínicas, tais como o elemento repetitivo RLEP, fbpB
(Ag 85B), SodA e o rrs (16S rRNA), têm sido utilizados e comparados (Martinez et al., 2006;
Martinez et al., 2009; Martinez et al., 2011), onde RLEP mostrou ser o mais sensível. Esses
ensaios têm sido muito úteis em casos de difícil diagnóstico da doença, devido a sua alta
especificidade e sensibilidade, possibilitando a sua utilização em quase todos os tipos de
amostras clínicas, incluindo linfa, sangue, secreção nasal e biopsias de tecido. Embora a
técnica ainda seja cara e não esteja disponível como um teste de rotina, a PCR pode fornecer
um complemento excelente para diagnóstico clínico e histopatológico da hanseníase
(Martinez et al., 2011).
Desde 1981, a OMS introduziu a poliquimioterapia (PQT) para tratamento da doença
(Scollard et al., 2006). A PQT é uma associação dos antibióticos rifampicina, dapsona e
clofazimina, que dificulta o desenvolvimento de resistência medicamentosa. Essa combinação
elimina os bacilos, impedindo o paciente de transmitir a doença logo no início do tratamento,
e garante a cura da doença caso o esquema terapêutico seja administrado de forma correta.
(Brasil, 2009). Para o tratamento da reação reversa, o único tratamento realmente eficaz é
realizado através da introdução de corticóides, que têm como principal objetivo reduzir a
reação inflamatória. No tratamento do ENH, a droga de escolha é a talidomida, que apresenta
grande efeito imunomodulatório (Sheskin, 1965).
1.3.2. Resposta imune em hanseníase
Uma resposta imune inata efetiva em combinação com a moderada virulência do M.
leprae pode ser a base da resistência do indivíduo ao desenvolvimento da doença clínica
(Scollard et al., 2006). Essa resposta imune inata constitui o primeiro nível de interação do M.
leprae com o hospedeiro e pode ser suficiente para reconhecer e restringir a infecção,
27
podendo ser relevante no estágio inicial onde se define o estabelecimento ou não da doença.
Além disso, é importante ressaltar que a interação do patógeno com o hospedeiro é complexa
e multifatorial.
Células fagocitárias, como as células dendríticas e os macrófagos, são as primeiras
células do hospedeiro a responder a infecção por micobactérias. As células dendríticas são
potentes indutores de uma resposta imunológica celular contra micobactérias e são ativadas
durante o primeiro contato com patógeno, passando a ser eficientes em fagocitar, processar e
apresentar antígenos aos linfócitos T e B distantes do sítio da infecção. Além disso, a célula
dendrítica ativada participa na modulação do curso da resposta imune adaptativa, produzindo
moléculas co-estimulatórias e citocinas como IL-12, TNF, IL-10 e IL-6 (Demangel & Britton,
2000). A produção de IL-12 potencializa o desenvolvimento de células Th1, que por sua vez
produzem IFN-γ e TNF. Já a geração de IL-1, IL-6 e TNF contribui para o desenvolvimento
do processo inflamatório, através do recrutamento de leucócitos levando à formação de
granuloma e impede a disseminação das micobactérias.
Os macrófagos participam da interação inicial com o M. leprae, e possuem uma ação
diretamente efetora na restrição do crescimento e proliferação da micobactéria. Foi observado
que após essa interação, os macrófagos passam a apresentar fenótipos distintos relacionados à
resposta imunológica do hospedeiro. Eles diferem em relação a expressão de receptores,
função efetora e produção de citocinas e quimiocinas (Montovani et al., 2002). Macrófagos
no polo tuberculóide da hanseníase são bem diferenciados e raramente contêm bactérias,
enquanto no pólo lepromatoso, esses macrófagos são caracterizados por bacilos intracelulares
abundantes e formação de células espumosas (Cruz et al., 2008). Enquanto no polo
tuberculóide as citocinas expressas são IFN- TNF e IL-15, no pólo lepromatoso as citocinas
majoritariamente expressas são IL-4 e IL-10. Destas citocinas, IL-15 e IL-10 são produzidas
pela ativação do sistema imune inato e são conhecidas por regular a função dos macrófagos
diferenciando-os em macrófagos do tipo 1 ou tipo 2. Estas citocinas seriam capazes de
desencadear distintos programas funcionais em macrófagos, com relevância para a defesa do
hospedeiro na infecção humana (Montoya et al., 2009). Os dois tipos de macrófagos diferem
quanto ao seu papel principal, podendo ser microbicida (tipo 1) ou fagocítico (tipo 2). A
atividade antimicrobiana dos macrófagos induzida por IL-15 seria compatível com as lesões
de pacientes do polo tuberculóide, enquanto IL-10 desencaderia a atividade fagocítica
observada em pacientes com lesões do pólo lepromatoso. Foi observada ainda a conversão
desta atividade fagocítica para a antimicrobiana em pacientes que tiveram reação reversa,
sugerindo um padrão de reativação de uma respota imune celular (Montoya et al., 2009).
28
De fato, a progressão à doença induz modificações celulares onde o M. leprae nos
macrófagos e células de Schwann (e também M. tb. nos macrófagos) após serem fagocitados
levam ao acúmulo de grandes quantidades de lipídios, e foram descritos como células
espumosas (Virchow, 1863). Estas células foram observadas na forma lepromatosa da
hanseníase (e também nas formas pulmonares da TB), porém não na forma tuberculóide (Kim
et al., 2010). Os mecanismos que regulam esse acúmulo de lipídios ainda não estão claros, e
pensava-se que esses lipídios, incluindo fosfolipídeos e ácido graxos, eram derivados de M.
leprae (Sakurai & Skinsnes, 1970). Porém, mais recentemente, foi realizada uma análise mais
detalhada do metabolismo lipídico em lesões LL, indicando o acúmulo de lipídios derivados
do hospedeiro nas células, tais como fosfolipídios oxidados e éster de colesterol (Cruz et al.,
2008; Mattos et al., 2010). Cruz e colaboradores ainda mostrou que esses lipídios,
denominados corpúsculos lipídicos, são capazes de diminuir a regulação da resposta imune
inata, sugerindo que essa acumulação em células infectadas pode favorecer o crescimento
bacteriano e persistência no hospedeiro. Além do efeito inbitório sobre a imunidade inata,
esse acúmulo de lipídios interfere nas funções das células dendríticas e na atividade
antimicrobiana mediada pelos TLRs (Montoya et al., 2009).
Ensaios in vitro utilizando cultura de macrófagos mostraram que micobactérias
patogênicas podem utilizar uma variedade de receptores para sua internalização.
Possivelmente esses diferentes receptores são expressos em várias fases da infecção, de modo
que a capacidade de usar vários receptores do hospedeiro representaria uma série de
adaptações para completar um ciclo de infecção de sucesso (Ernst, 1998). O M. leprae é
reconhecido pelas células do hospedeiro através dos PRRs, receptores que reconhecem os
padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs, do inglês Pathogen-Associated
Molecular Patterns), que variam dependendo da natureza do PAMP e da sua localização na
célula. Os macrófagos possuem uma linha completa de TLR, que são uma família altamente
conservada de proteínas responsáveis pelo reconhecimento de várias vias de padrões PAMPs.
No caso da hanseníase, demonstrou-se que os receptores TLR1 e TLR2 reconhecem
lipopeptídeos da parede bacteriana do M. leprae (Walker & Lockwood, 2006). Esses TLR1 e
TLR2 foram mais expressos em amostras de lesões de pacientes do pólo tuberculóide do que
em lesões de pacientes do pólo lepromatoso, sugerindo que a ativação dos TLR no sítio da
doença contribui para conter a infecção (Krutzik et al., 2003). Depois de ativados pelos seus
ligantes, os TLRs iniciam uma cascata de sinalização que levam à ativação de fatores de
transcrição, tais como o fator nuclear kappa B (NF-kB), levando a indução da resposta
inflamatória e modulação da imunidade inata (Liu et al., 2006).
29
Outra classe de PRRs são os receptores do tipo NOD que são receptores citosólicos,
que reconhecem patógenos intracelulares. Dentre eles, os recpetores NOD1 e NOD2 quando
estimulados, resultam na ativação de NF-kB e proteínas quinases ativadas por mitógenos
(MAPks, do inglês mitogen-activated protein kinases (Hayden et al., 2004), os quais dirigem
a transcrição de numerosos genes envolvidos na resposta imune inata e adaptativa. Apesar do
M. leprae se replicar preferencialmente em vesículas, acredita-se que a bactéria seja
reconhecida pelos receptores NOD através de componentes do bacilo, que podem ser
secretados para o citoplasma (Berrington et al., 2010).
O controle efetivo da infecção pelo M. leprae se dá através do desenvolvimento
preferencial de uma resposta imune do tipo celular, que é altamente complexa e envolve a
geração de vários subconjuntos de linfócitos T com várias funções e liberação de citocinas.
(Hussain, 2007). Estas citocinas, tais como IL-12 e IL-23 ativam uma cascata de sinalização
celular que culmina na liberação de IFN- e, conseqüente, ativação dos mecanismos
oxidativos do macrófago, essenciais para a destruição do bacilo. Dessa forma, o eixo IL12/IL-23/IFN-γ é uma das vias principais de ativação celular no combate ao patógeno
intracelular (revisado por Goulart et al., 2002).
O perfil da resposta imune adaptativa potencializa os efeitos da imunidade inata e
esses eventos juntos, atuam de maneira altamente dinâmica para controlar a infecção. A
importância da imunidade adaptativa na resposta imune ao M. leprae acontece principalmente
pelo direcionamento do curso da infecção, assim como das diversas formas clínicas da
hanseníase (revisado por Goulart et al., 2002).
O tipo de resposta desencadeada pelos linfócitos Th, através da produção de citocinas
específicas, pode explicar os diferentes perfis de resposta imune entre pacientes tuberculóides
e lepromatosos (Yamamura et al., 1991). De uma forma geral, os pacientes paucibacilares
com a forma tuberculóide da hanseníase são relativamente resistentes ao patógeno, possuem
uma infecção localizada com granulomas bem formados e as lesões caracterizadas por um
perfil de células Th1 com expressão de citocinas, como IFN-, TNF e IL-2, características de
uma resposta imune celular intensa. IFN- ativa macrófagos infectados, enquanto a IL-2 pode
induzir a expansão de células T ativadas e aumentar a produção de IFN- (Sieling & Modlin,
1994). Em contraste, no pólo oposto, pacientes com a forma lepromatosa são relativamente
suscetíveis ao patógeno, possuem uma infecção sistemicamente disseminada, pois possuem
granulomas mal formados ricos em macrófagos espumosos contendo abundantes bacilos. As
lesões são caracterizadas por um perfil de células Th2, com liberação das citocinas IL-4, IL-5
e IL-10, indicando uma resposta imune celular ineficaz, com falha na ativação de macrófagos,
30
característica das respostas humoral com alta produção de anticorpos, que por sua vez não são
protetores, estando assim, associada com a progressão da doença. (Krutzik et al., 2005).
Em resumo, sugere-se que os pacientes do pólo tuberculóide tenham um padrão de
resposta imune protetora mediada pelas células T parcialmente eficientes, com produção de
citocinas que contribuem na maturação e ativação dos macrófagos, culminando no controle da
multiplicação dos bacilos e a sua subsequente eliminação. Por outro lado, os pacientes do pólo
lepromatoso, parecem possuir um perfil de citocinas que induz a redução da resposta
inflamatória, com inibição de macrófagos e perfil característico da resposta humoral, que
somados a outros fatores, seriam insuficientes para conter o M. leprae. No entanto, muitos
pacientes podem exibir um perfil de resposta mista, produzindo citocinas do perfil Th1 e Th2.
Isso mostra que o predomínio de uma resposta não implica na anulação da outra, e pode
sugerir ainda que em alguns pacientes, a resposta imune ao M. leprae possa não satisfazer
completamente o modelo Th1/Th2. Sendo assim, vale destacar que novos subgrupos de
células T auxiliares já foram descritos, como as células T reguladoras (Treg) e as células T
produtoras de IL-17 (Th17), indicando que a resposta celular não é tão dicotômica como se
pensava (Hall, 2011).
A resposta imune de contatos de pacientes com hanseníase também vem sendo
investigada. No trabalho de Lima e colaboradores (2000) foi comparada a resposta imune à
infecção com M. leprae entre contatos de casos novos de pacientes com hanseníase
multibacilar e os contatos previamente expostos (considerados resistentes) após vacinação
com BCG, e observado uma baixa frequência de indivíduos produtores de INF-γ entre os
contatos de casos novos, bem como uma razão de TNF/IL-10 aumentada, sugerindo que essa
razão aumentada teria um papel na restrição da invasão e replicação micobacteriana no início
da infecção. Por outro lado, foi observado nos contatos previamente expostos, um aumento na
produção de INF-γ, condizente com sua função na resposta protetora, uma produção de IL-5 e
uma razão TNF/IL-10 diminuída.
1.3.3. Genes e imunidade em hanseníase
As características clínicas da hanseníase sugerem fortemente a participação de
diversos genes na regulação da resposta imune, na proteção e na suscetibilidade à doença.
Dentre os genes que participam, os que codificam citocinas são críticos no controle da
natureza, celular ou humoral, gravidade e duração da resposta contra o agente infeccioso.
31
Desta forma, variações pontuais, também conhecidas como polimorfismos de base única
(SNP), nas regiões promotoras ou outras regiões codificantes e não codificantes de citocinas
poderiam influenciar os níveis de expressão gênica ou a atividade de uma enzima, o que
poderia explicar os diferentes padrões de resposta observados entre pacientes tuberculóides e
lepromatosos (Moraes et al., 2004; Santos et al., 2002). Na hanseníase, o TNF apresenta um
papel relevante tanto na resistência quanto na inflamação. Portanto, freqüências de SNPs no
promotor do gene do TNF foram investigadas na população do Rio de janeiro. Esses estudos
sugeriram que o SNP -308A tem uma freqüência aumentada em controles quando comparados
à pacientes, indicando uma associação deste alelo com resistência à hanseníase. Assim, a
produção aumentada de TNF restringiria a proliferação do M. leprae (Santos et al., 2000;
Moraes et al., 2001; Santos et al., 2002).
IL-10 é outra citocina que mostrou estar associada à hanseníase, onde foram
observados níveis aumentados nas formas multibacilares da doença (Yamamura et al., 1991;
Misra et al., 1995; Moubasher et al., 1998). O alelo T do polimorfismo -C819T em IL-10 foi
associado à suscetibilidade à hanseníase na população brasileira em dois estudos diferentes,
sendo confirmado na população indiana (Santos et al., 2002; Malhotra et al., 2005; Pereira et
al., 2009). No estudo de Pereira e colaboradores foram observados níveis menores de IL-10
nos carreadores do alelo -819T comparado com os não carreadores, indicando que este SNP
regula a secreção de IL-10 in vitro e sugerindo que baixos níveis desta citocina durante o
início da hanseníase, podem conduzir a uma resposta do paciente não protetora, levando a
disseminação da doença.
Recentemente foi observado que SNPs no gene LTA4H (leucotrieno A4 hidrolase)
estão associados com proteção tanto da forma multibacilar da hanseníase, quanto da
tuberculose (Tobin et al., 2010). Esse controle genético regula uma produção diferencial do
eicosanóide pró-inflamatório LTB4 (leucotrieno B4) e anti-inflamatório lipoxina A4 (LXA4),
que funcionam de maneira antagônica na regulação dos níveis de TNF (Tobin et al., 2012).
Foi mostrado que genótipos associados a uma baixa produção de LTB4 e altos níveis de
LXA4 levam a baixos níveis de TNF, podendo resultar em tuberculose clínica ou na forma
multibacilar da hanseníase (Tobin et al., 2012). Por outro lado, o excesso de TNF, causado
por genótipos associados a alta produção de LTA4H (e consequentemente excesso de LTB4),
podem levar a uma resposta imune exacerbada e o adoecimento do indivíduo. Assim,
variações genéticas em genes que regulam a resposta imune inata podem afetar a resposta
adaptativa e consequentemente a proteção à M. leprae/M. tb.
32
1.4. Tuberculose
A TB é uma doença infecciosa predominantemente urbana, associada a moradias
superlotadas e pouco ventiladas, e está intimamente ligada a pobreza e má distribuição de
renda. Com o surgimento da epidemia da síndrome da imuno deficiência adquirida (AIDS, do
inglês, acquired immune deficiency syndrome), o problema da tuberculose se agravou ainda
mais. O termo tuberculose diz respeito à "tubérculos", que foram as primeiras características
clínicas associadas à doença no século XVII (Hussain, 2007).
A TB continua sendo um sério problema de saúde pública no Brasil. Em 2010, foi
estimado 85 mil novos casos, com uma prevalência de 92 mil e mortalidade em torno de 5 mil
casos. No país, a tuberculose é a terceira causa de óbitos por doenças infecciosas e a primeira
entre pacientes com AIDS (WHO, 2011). No mundo, houve uma estimativa de 8,8 milhões de
casos incidentes. A figura 1.8 apresenta o número estimado de casos novos de TB a cada
100.000 habitantes no mundo. A maior parte destes casos ocorreu na Ásia (59%) e África
(26%), onde a Índia foi responsável por cerca de 30% destes pacientes de tuberculose (WHO,
2011).
Figura 1.8 - Taxas de incidência de tuberculose no mundo. Os dados são reportados pela
OMS e correspondem a 2010. As taxas referem-se a cada 100.000 habitantes (adaptado de
WHO, 2011).
33
A progressão da TB vai depender de alguns fatores como: as cepas de M. tb.,
exposição prévia, vacinação, a dose infecciosa e o estado imune do hospedeiro. Existem
várias formas da doença, sendo as formas pulmonares as mais freqüentes em adultos. Existem
também, as extra-pulmonares que incluem as formas mais graves de tuberculose, meníngea e
miliar (ou disseminada), e são mais frequentes em crianças, devido a propagação da
micobactéria através do sangue, após uma infecção pulmonar primária. Em adultos, a infecção
está freqüentemente limitada aos pulmões, e reflete a reativação da tuberculose latente,
proveniente de uma infecção primária silenciosa (Alcais et al., 2005). Nos últimos anos, foi
observado o surgimento de cepas multidroga resistente do M. tb. (MDR-TB), devido
predominantemente ao abandono do tratamento. Essa resistência ocorre com maior freqüência
aos quimioterápicos mais comumente empregados no tratamento da TB, a isoniazida e
rifampicina, e estão associados a uma alta taxa de mortalidade, sendo um grande problema em
várias regiões do mundo (Delogu & Fadda, 2009). Com o aumento da infecção pelo vírus da
imunodeficiência humana (HIV) e o risco elevado de indivíduos infectados de desenvolver
TB, a prevalência de MDR-TB deve certamente aumentar em vários países do mundo.
A transmissão da tuberculose se dá através de aerosóis produzidos por indivíduos
contaminados. Os bacilos contidos em gotículas são expulsos por atos respiratórios, fala, tosse
e espirros. Raramente, o M. tb. é transmitido por ingestão ou infecção da pele (Hussain, 2007).
A probabilidade de transmissão de uma pessoa para outra depende do número de bacilos
expelidos por um transportador, a eficácia da ventilação, a duração da exposição e a
virulência da cepa micobacteriana.
Após a inalação do aerosol contendo os bacilos, as bactérias podem atingir os alvéolos
pulmonares e se espalhar para os nódulos linfáticos e então, através da corrente sanguínea,
alcançar tecidos mais distantes onde a doença pode se desenvolver. Porém, na maioria dos
casos, a resposta imune do hospedeiro é capaz de conter a multiplicação do bacilo, impedindo
sua disseminação. Uma vez que os bacilos são fagocitados pelos macrófagos alveolares, se
não forem detidos, haverá uma intensa multiplicação dos bacilos, onde acontecerá o
rompimento dos macrófagos e disseminação da bactéria. Então, a exposição do homem ao M.
tb. pode levar a alguns resultados potenciais, que incluem uma eliminação precoce da
infecção (provavelmente por mecanismos da imunidade inata), desenvolvimento da doença
logo após a infecção (tuberculose primária ou pós-primária), ou o desenvolvimento de uma
infecção subclínica ou assintomática (tuberculose latente) com potencial de transição para a
doença ativa ao longo da vida do indivíduo infectado (Hussain, 2007).
34
O M. tb. apresenta mecanismos de escape do sistema imune pela inibição da maturação
do fagossoma, que permite sua sobrevivência e multiplicação dentro de macrófagos. Após
serem fagocitados, os bacilos podem inibir a fusão fagossomo-lisossomo. A bactéria pode
permanecer ou escapar do fagossomo, porém em ambos os casos ela encontra um ambiente
protegido para o crescimento no macrófago (revisado por Houben et al., 2006; revisado por
Hussain, 2007). A formação do granuloma através da agregação de macrófagos ativados e
linfócitos impedem a disseminação da bactéria, que no interior do granuloma pode ficar em
estado de dormência, catacterizando uma infecção latente (revisado por Houben et al., 2006).
Mesmo com sua atividade metabólica deprimida, o bacilo pode proliferar dentro do
granuloma, podendo reativar a infecção posteriormente.
O controle da infecção por M. tb. depende do reconhecimento do patógeno e ativação de
ambas as respostas imune inata e adaptativa (Quesniaux et al., 2004). A detecção de M. tb.
por macrófagos e células dendríticas via PRRs, como a família de TLRs, desencadeia cascatas
de sinalização, que iniciam secreção de citocinas, sugerindo um papel na proteção contra M.
tb.. Por exemplo, foi observado que a ativação do heterodímero TLR2/1 reduziu a viabilidade
de M. tb. intracelular em monócitos humanos e macrófagos, porém não em células dendríticas
derivadas de monócitos (Liu et al., 2006). A regulação de genes induzidos por TLR2/1
influenciando na viabilidade de M. tb. e M. leprae, foi mostrada recentemente por Liu e
colaboradores (2012), como sendo realizada por microRNAs (miRNAs). Neste trabalho, os
autores identificaram um miRNA, hsa-mir-21, que se mostrou mais expresso tanto em lesões
de pacientes com a forma lepromatosa, quanto em monócitos in vitro infectados com M.
lepare. Esse hsa-mir-21 diretamente diminuiu a expressão CYP27B1 (citocromo P450, família
27, subfamília B, polipeptídeo 1) e IL1B que são induzidos por TLR2/1, e indiretamente
induziu IL-10, levando a inibição da expressão de genes que codificam dois peptídeos
antimicrobianos dependentes de vitamina-D, CAMP (catelicidina) e DEFB4A (defensina beta
4A). Além disso, foi observado que o bloqueio deste miRNA levou a restauração da atividade
antimicrobiana mediada por TLR2/1.
A infecção de macrófagos por M. tb. induz tanto citocinas pró-inflamatórias, tais como
TNF, IL-2 e IL-6, bem como citocinas imunoreguladoras, como IL-10 (Giacomini et al.,
2001). Já foi demonstrado que a liberação de TNF nestes macrófagos infectados pode ter um
efeito no aumento da atividade antimicobacteriana, ativando macrófagos e induzindo
formação de granuloma, enquanto TNF em excesso na célula hospedeira resulta em necrose e
disseminação de micobactérias (Mootoo et al., 2009). Enquanto IL-10 está associada com
doença progressiva (Jamil, et al., 2007), a ausência dele resulta em falta de imuninade contra
35
a micobactéria.
O diagnóstico da tuberculose é baseado principalmente nas características clínicas,
histopatologia e isolamento da bactéria a partir de tecido. A radiografia de tórax mostra a
cavitação, a calcificação no caso de doença curada, e nódulos nos lobos superiores, porém não
confirma o diagnóstico. Já granulomas com caseificação obtido de biopsias podem indicar o
diagnóstico, mas se não houver caseificação, podem ter outros possíveis diagnósticos. Os
esfregaços de escarro e culturas também são úteis no diagnóstico da tuberculose pulmonar.
Porém o diagnóstico definitivo requer crescimento da bactéria e confirmação do M. tb. com
testes bioquímicos ou sondas de DNA, o que pode levar várias semanas (Hussain, 2007).
O tratamento da tuberculose é prolongado e a associação de drogas é necessária
devido ao freqüente aparecimento de sub-populações resistentes. As drogas mais comumente
utilizadas são a isoniazida, rifampicina, pirazinamida, estreptomicina e etambutol,
consideradas drogas de primeira linha, geralmente utilizadas em casos novos. Já a etionamida,
cicloserina, ácido p-aminossalicílico (PAS), tiacetozona, canamicina, capreomicina,
amicacina e fluoroquinolonas são consideradas drogas de segunda linha e utilizadas no
retratamento ou como alternativa para o tratamento de TB, quando os bacilos são resistentes
às drogas de primeira linha (WHO, 2010). O aparecimento da resistência do M. tb. às drogas
acontece quando o paciente é submetido a um esquema terapêutico inadequado ou quando
ocorre o abandono do tratamento.
1.5. Expressão gênica global em infecções micobacterianas
Estudos de expressão gênica global apresentam-se como ferramentas valiosas na
compreensão da interação micobactéria-hospedeiro. Entretanto, existem poucos estudos de
expressão gênica utilizando modelos animais vacinados ou infectados com BCG. Um destes
estudos, utilizando a tecnologia de microarranjo identificou diferenças na expressão gênica
em camundongos vacinados com BCG (Danish 1331) e infectados com M. tb. (Mollenkopf et
al., 2006), onde foram observados genes induzidos por M. tb, incluindo INF-γ e CCL8.
Também utilizando a tecnologia de microarranjo, Tree e colaboradores (2006) conseguiram
examinar a expressão de múltiplas citocinas, quimiocinas e genes relacionados à resposta
imune no modelo de porquinho da índia, definindo um perfil imunológico da vacinação de
BCG neste modelo de cobaia. Neste mesmo contexto, há poucos relatos do perfil de expressão
gênica global induzido por micobactérias em células humanas, onde em um dos estudos, por
36
exemplo, foi analisado através da utilização da tecnologia de microarranjo, diferenças na
expressão gênica de células THP-1 infectadas com M. tb. em diferentes tempos de infecção
(Ragno et al., 2001). Recentemente, foram analisadas diferenças no perfil de expressão gênica
entre pacientes com TB, indivíduos infectados sem manifestações clínicas (TB latente) e
indivíduos saudáveis, onde não foram observadas importantes diferenças entre os grupos de
indivíduos saudáveis e os com TB latente, entretanto foram observados genes
diferencialmente expressos entre os pacientes com TB e o grupo com TB latente, mostrando
um enriquecimento de genes envolvidos na regulação da resposta imune, transdução de sinais
e ativação de leucócitos (Maertzdorf et al., 2011).
O microarranjo é uma poderosa ferramenta que permite obter informações sobre a
expressão de muitos genes avaliados simultaneamente em diferentes condições biológicas,
podendo ser utilizado para estudar a resposta do hospedeiro à diversos microorganismos
patogênicos. Apesar das novas tecnologias desenvolvidas, como os sequenciadores de nova
geração, o microarranjo é uma ferramenta empregada até hoje e é umas das tecnologias
empregadas neste estudo, onde utilizamos arranjos de genes envolvidos direta e indiretamente
na resposta imune ao BCG e M. leprae viável.
Também foi observada a existência de poucos estudos de comparação do perfil de
expressão gênica global induzido pelas diferentes cepas vacinais de BCG. Um dos trabalhos
foi o de Di Pietrantonio e colaboradores (2011), mencionado anteriormente, onde foi realizada
uma investigação simultânea dos efeitos do background genético do hospedeiro e da
micobactéria na magnitude e variância de fenótipos da resposta do hospedeiro. Ao empregar
duas linhagens diferentes de camundongo, com três cepas diferentes de BCG e uma cepa de
M. tb., os autores confirmaram que camundongos distintos geneticamente diferem
significantemente na sua suscetibilidade a infecções micobacterianas. No trabalho de Irwin e
colaboradores (2008), ao utilizar populações geneticamente homogêneas de linhagens puras
de camundongos, foram observadas diferenças na resposta imune às cepas de BCG
(Connaught, Pasteur e Sweden). Neste trabalho, ainda que não tenha sido investigado o perfil
de expressão gênica, os autores mostraram que apesar das cepas de BCG induzirem uma
resposta imune qualita- e quantitativamente diferente, elas induziram uma redução semelhante
da carga bacilar após desafio com uma cepa virulenta de M. tb. Embora os dados obtidos com
sistema murino contribuam no entendimento da influência genética do hospedeiro, bem como
das interações hospedeiro-patógeno, resultados observados utilizando modelos animais nem
sempre traduzem o ocorrido em sistema humano, principalmente devido a diferenças na
suscetibilidade à TB (e hanseníase) e os padrões de doença. Com isso, se faz necessária a
37
confirmação dos resultados em hospedeiro humano.
1.6. Células THP-1
Monócitos e linhagens de células monocíticas geralmente apresentam número
reduzido de receptores e são menos eficientes em fagocitar patógenos (Schwende, 1996).
Entretanto, macrófagos diferenciados apresentam um grande número de receptores e tem
capacidade fagocítica aumentada. Estudos de interações entre micobactérias e macrófagos
humanos têm empregado muitos sistemas, como células primárias e diferenciadas in vitro,
para mimetizar a situação in vivo. A linhagem celular de leucemia monocítica aguda humana,
THP-1, obtida através da purificação de monócitos do sangue periférico de uma criança com
leucemia monocítica aguda, desenvolve função de macrófagos mediante a adição de
estimuladores. Um dos estimuladores é o acetato de forbol-miristila (PMA) que ativa proteína
quinase C e induz um grande grau de diferenciação em células THP-1. As células após serem
diferenciadas passam a ter uma diminuição na síntese de DNA, a aderir em plásticos e
assemelham-se a macrófagos primários em sua morfologia e, além disso, passam a expressar
marcadores de superfície associados a diferenciação dos macrófagos (Schwende, 1996).
Essa linhagem é um sistema bem estabelecido para o estudo do crescimento e
persistência de micobactérias (Paul et al., 1996; Oliveira et al., 2001; Theus et al, 2004). Por
exemplo, esse sistema foi utilizado para examinar a taxa de crescimento de cepas de M. tb. de
isolados clínicos, para determinar se esta se correlacionava com a virulência previamente
definida em modelos animais (Paul et al., 1996). Neste estudo, as cepas H37Rv e sua variante
avirulenta H37Ra de M. tb. apresentaram taxas de crescimento similares em THP-1, o que não
era observado em macrófagos de camundongos in vitro, onde o crescimento da cepa H37Rv
foi mais rápido, indicando que a virulência da micobactéria em sistema murino não
necessariamente traduz o ocorrido em sistema humano. Recentemente (Singhal et al., 2012),
as células THP-1 foram utilizadas para analisar e comparar perfil de expressão proteica após
infecção por isolados clínicos de M. tb., onde foi observado que a maioria das proteínas
comumente expressas tanto após infecção por M. tb. sensível quanto por M. tb.-MDR,
pertenciam a categoria de metabolismo celular e respiração, representando alguns
mecanismos em comum adotados por estas micobactérias (sensível e resistente) para sua
sobrevivência.
Esse sistema foi também empregado na comparação da apoptose induzida pela
38
infecção por M. leprae e BCG, onde observou-se que havia uma inibição da apoptose em
células THP-1 infectadas pelo M. leprae e aumento desta quando infectadas pelo BCG
(Montreal) (Hasan et al., 2006a). Recentemente, células THP-1 foram utilizadas para avaliar a
influência de espécies reativas de oxigênio (ROS) na secreção de CCL2 após infecção por
BCG (Méndez-Samperio et al.., 2010), e foi demonstrado que esse ROS tem um papel
essencial na regulação da secreção desta quimiocina por estas células infectadas com BCG.
CCL2 tem um papel importante na infecção micobacteriana por induzir recrutamento e
ativação de leucócitos. A utilização deste modelo pode ajudar a esclarecer eventos
moleculares envolvidos no início de interações entre macrófagos e micobactérias.
39
2. JUSTIFICATIVA
40
Ainda hoje a incidência de hanseníase e tuberculose permanece alta e, por esta razão,
ambas as doenças são consideradas problemas de saúde pública no Brasil. A única vacina
empregada na prevenção destas doenças ainda possui um efeito protetor muito variável na
população, sendo pouco eficiente especialmente na população adulta, independente da cepa
vacinal ou do país onde se emprega a vacina. Algumas hipóteses sugerem que a resposta
imune induzida durante a vacinação não é duradoura e, portanto, se perde na idade adulta.
Mesmo assim, a BCG é uma vacina segura e protege crianças contra tuberculose meníngea,
embora com taxas variáveis de proteção nos diversos países onde é utilizada. De fato, o
entendimento aprofundado que indique o porquê de tantas diferenças na eficácia da BCG nos
países em que é utilizada, pode fornecer pistas sobre a melhor abordagem para melhorar a
vacina ou os esquemas de vacinação (via de administração, número de doses, uso de
adjuvantes, etc). As diferenças genéticas entre as cepas BCG são consideradas como fatores
importantes na variabilidade observada na imunidade protetora adquirida após a vacinação.
Identificar mecanismos de ativação da resposta imune do hospedeiro por diferentes
cepas de BCG é importante para entender o processo de interação micobactéria-hospedeiro.
Entretanto, até o momento, foi observado apenas um estudo de análise de padrões de
expressão gênica em humanos utilizando a cepa BCG Moreau (Schreiber et al., 2010),
importante pela sua imunogenicidade. Além disso, também só foi observado um estudo
comparando o perfil de expressão gênica de BCG Moreau com outras cepas de BCG (Wu et
al., 2007), realizado em condições diferentes do presente estudo. Realizamos ainda a inédita
comparação entre BCG Moreau e M. leprae viável. Essas comparações realizadas com uma
lógica de testar concentrações diferentes de bactéria por célula (2:1 e 10:1), bem como
identificar um perfil de expressão gênica específico, podem ajudar a entender as vias
principais de ativação, que pode culminar no desenvolvimento de melhores vacinas. Nesse
trabalho, pretende-se determinar o perfil de expressão gênica relacionada à resposta imune
empregando o sistema de células humanas diferenciadas in vitro e diferentes cepas de
micobactérias.
Os genes utilizados para análise da expressão gênica pelos métodos de RT-PCR em
tempo real (qRT-PCR) e PCR multiplex em tempo real (Biomark, Fluidigm) foram incluídos
no presente estudo após terem sido observados em estudos da literatura, bem como em outros
trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório, e que foram surgindo ao longo do nosso estudo.
Porém, por limitação de tempo e principalmente de material, a expressão de alguns genes só
foi analisada em algumas condições, como observado na tabela que se encontra no anexo I.
41
3. OBJETIVOS
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3.1. Objetivo geral
Analisar a resposta imuno-inflamatória através do perfil de expressão gênica frente à infecção
pelas cepas vacinais de BCG Danish, Moreau e Pasteur, e compará-la a resposta imunoinflamatória à infecção por M. leprae.
3.2. Objetivos específicos:
3.2.1. Estabelecer padrões de expressão gênica e secreção de citocinas em células THP-1
diferenciadas, infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, e M. leprae
vivo por 24 horas, em diferentes MOI (multiplicidade de infecção);
3.2.2. Avaliar os níveis de secreção de citocinas, incluindo TNF, IL-10, CCL2 e IL-8 a
partir das dosagens em sobrenadantes de cultura de células mononucleares de sangue
periférico (PBMC) in vitro nas infecções pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur;
3.2.3. Avaliar a influência de polimorfismos genéticos na secreção de citocinas, TNF e IL10 em culturas de PBMC infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur;
3.2.4. Comparar a expressão gênica de células THP-1 infectadas com M. leprae e BCG
Moreau, através de microarranjo de DNA, para identificar genes diferencialmente
expressos entre esses dois modelos de infecção;
3.2.5. Estabelecer padrões de expressão gênica em biópsias de nervo de pacientes
hansenianos, na tentativa de correlacionar com os resultados obtidos de células após
infecção por M. leprae;
43
4. MATERIAIS E MÉTODOS
44
4.1. Desenho de estudo
O desenho do estudo adotado na presente tese encontra-se resumido na figura 4.1.
Figura 4.1 – Desenho experimental do estudo. A partir de uma hipótese a priori, genes
identificados em trabalhos anteriores foram incluídos no presente estudo e analisadas a
expressão gênica e secreção de proteínas de células THP-1 infectadas com cepas de BCG
(Danish, Moreau e Pasteur) e M. leprae em diferentes concentrações de bactérias, MOI 2:1 e
10:1. Também foram dosados níveis de proteínas em sobrenadantes de PBMCs infectadas
com as cepas de BCG para investigação de diferenças não observadas em THP-1.
Paralelamente, a partir de um estudo sem hipótese a priori, foi analisado o perfil de expressão
gênica por microarranjo de células THP-1 infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI
10:1. Genes identificados como diferencialmente expressos nos ensaios de microarranjos não
foram validados no presente estudo, entretanto os genes identificados serão incluídos em
ensaios de PCR em tempo real para confirmação. Além disso, foram utilizadas biopsias de
nervos de pacientes hansenianos e não hansenianos para confirmação in vivo da expressão
gênica diferencial observada em experimentos com THP-1.
45
4.2. Cultivo de micobactérias
4.2.1. BCG
As cepas vacinais BCG Danish, doada pela Dra. Leila Mendonça Lima (Laboratório
de Genômica Funcional e Bioinformática, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz), BCG Moreau,
doado por Carolina Zavareze (Fundação Ataulfo de Paiva, RJ) e BCG Pasteur 1173P2 (OMS)
foram cultivadas em meio de cultura Middlebrook 7H9 (DIFCO Laboratories, EUA) contendo
0,02% glicerol, 0,05% Tween-80 (DIFCO laboratories, EUA) e enriquecido com 10%
Middlebrook ADC (albumina bovina, dextrose, catalase) por cerca de duas semanas, em
constante agitação, em uma temperatura de 37º C. Após esse período, a densidade óptica
(D.O.) foi medida e ao atingir uma D.O. de aproximadamente 1, as bactérias foram utilizadas
para contagem.
Antes das infecções, uma alíquota de cada cultura em suspensão foi centrifugada a 500
rpm por 2 min para evitar grumos de micobactérias. Os sobrenadantes foram utilizados para a
quantificação das bactérias na câmara de contagem de bactéria Petroff-Hausser. Depois de
contadas, as suspensões foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante
descartado, e o sedimento ressuspenso em RPMI 1640. Este sedimento foi posteriormente
utilizado nos ensaios de infecção. As suspensões contendo bacilos que não foram utilizadas
imediatamente foram aliquotadas em 20% de glicerol (LGC Biotecnologia, Brasil) estéril e
estocadas a -70º C até o momento da utilização em ensaios de infecção posteriores ou para um
novo cultivo.
4.2.2. Mycobacterium leprae
Foi utilizado M. leprae Thai-53 vivo, tanto cedido pela Dra. Patrícia Sammarco Rosa
(Instituto Lauro de Souza Lima, Bauru, SP) quanto pelo Dr James Krahenbuhl (Department of
Health and Human Services, Baton Rouge, Louisiana, EUA). Em ambas as fontes de M.
leprae, a micobactéria foi proveniente de modelo de infecção de coxim plantar de
camundongos atímicos nude (nu/nu) infectados. Após ser colhida das patas dos camundongos,
a suspensão de bacilos foi tratada com hidróxido de sódio 0,1 M, e, posteriormente
ressuspensa em meio de cultura 7H12 Middlebrook (DIFCO Laboratories, EUA)
46
suplementado com 50 µg/mL de ampicilina (Sigma-Aldrich, EUA) e 50 µg/mL de
anfotericina B (Sigma-Aldrich, EUA). Os bacilos foram incubados por três horas em estufa a
33° C. As bactérias foram centrifugadas a 10.000 x g por 5 minutos e ressuspendidas em meio
de cultura D-10 contendo DMEM (Gibco, Life Technologies EUA), 10% soro fetal bovino
(SFB) inativado (HyClone Laboratories, Canadá) e 50 µg/mL de gentamicina (Sigma-Aldrich,
Brasil). Posteriormente os bacilos foram quantificados por contagem direta em microscópio
óptico através de lâmina corada pelo método de Kinyoun (Barlelt, 2000), descrito no item
4.2.3. Todas as infecções realizadas com M. leprae vivo, foram incubadas em estufa a 33ºC e
5% CO2.
4.2.3. Pureza e viabilidade das culturas de micobactérias
A pureza das culturas de micobactérias foi determinada através da técnica de Kinyoun.
Para isso, foram utilizados 10 L da cultura para fazer um esfregaço em lâmina de vidro.
Depois de seco, o esfregaço foi fixado na lâmina por calor. Posterior à fixação, a lâmina foi
coberta com fucsina fenicada, deixando agir por cerca de 5 minutos. A lâmina foi lavada
delicadamente em água corrente para a retirada da fucsina e, em seguida, foi lavada com a
solução de álcool-ácido para a descoloração. Novamente, a lâmina foi lavada em água
corrente para a retirada do álcool-ácido. Posteriormente, a lâmina foi coberta com solução de
azul de metileno durante 30 segundos. Mais uma vez, a lâmina foi lavada em água corrente e,
depois de seca, foi observada ao microscópio óptico com lente de imersão (Nikon Eclipse
E400) em um aumento de 100 x. A cultura foi determinada livre de contaminação, quando
foram observados apenas bacilos corados com fucsina (em rosa).
A viabilidade das culturas de micobactérias foi observada por coloração fluorescente
através do ensaio BacLight® Live/Dead (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Para isso, as
micobactérias foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 minutos, o sedimento ressuspendido
em 300 L PBS 1x, e então adicionado 6 M de SYTO 9 (componente A) e 30 M de iodeto
de propídio (componente B) por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a coloração, foi
realizado um esfregaço em lâmina de vidro. Através da microscopia de fluorescência,
bactérias vivas e mortas foram quantificadas por contagem dos bacilos verdes e vermelhos,
respectivamente. Essa discriminação ocorre pela capacidade dos corantes usados de
penetrarem nas bactérias em questão. O corante SYTO 9 marca todas as bactérias,
independente de sua viabilidade. Entretanto, o iodeto de propídio penetra somente nas
47
bactérias com danos na membrana, reduzindo assim a fluorescência do corante SYTO 9.
Assim, bactérias viáveis, com a membrana intacta, irão fluorescer em verde, enquanto
bactérias com danos na membrana irão fluorescer em vermelho. A taxa de viabilidade
considerada para a utilização das micobactérias nos ensaios de infecção foi de >80%.
4.3. Cultivo de células e infecção
4.3.1. Células THP-1
Células THP-1 adquiridas do American Type Culture Collection (ATCC, Rockville,
EUA) foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo (LGC Biotecnologia, Brasil) contendo
2 mM L-Glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 g/mL estreptomicina, e suplementado
com 10% de SFB (HyClone Laboratories, Canadá). As células foram mantidas em frascos de
cultura na estufa a 37ºC com 5% CO2. A quantificação de células viáveis foi realizada através
do método de exclusão por meio de coloração pelo azul Tripan (Sigma-Aldrich, EUA). Após
duas semanas de expansão, as células foram contadas através da câmara de Neubauer e
diferenciadas em macrófagos, mediante estímulo com 80 nM (50ng/mL) de acetato de forbolmiristila (PMA, Sigma-Aldrich EUA). Após 24 horas de diferenciação, o meio foi trocado
para retirada do PMA e adicionado meio RPMI fresco sem adição de antibiótico. Os
macrófagos derivados de THP-1 foram então, infectados com as cepas vacinais de BCG em
diferentes multiplicidade de infecção (MOI) 2:1 e 10:1, ou com M. leprae em MOI 2:1 e 10:1,
por 24 horas.
4.3.2. Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) humanas
Apenas para os estudos funcionais, foram coletadas amostras de sangue periférico de
22 voluntários sadios com média de idade de 33 anos. Neste grupo estavam incluídos 17
indivíduos do sexo masculino, e 5 indivíduos do sexo feminino.
As amostras de sangue periférico foram coletadas em tubos com heparina e diluído
numa proporção 1:1 em meio RPMI-1640 completo (LGC Biotecnologia, Brasil) contendo
2mM L-Glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 g/mL estreptomicina. O sangue diluído
foi cuidadosamente depositado sobre um gradiente de Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich, EUA)
48
na proporção 1:2 e centrifugado a 1.200 x g por 20 minutos, sem freio, à temperatura
ambiente. Ao final da centrifugação, o anel contendo PBMC, que se encontra na interface
Ficoll-Hypaque/plasma foi coletado. As células obtidas foram lavadas com meio RPMI na
proporção 1:1 e centrifugadas a 670 x g por 10 minutos a 4º C. O sobrenadante foi descartado
e o sedimento foi ressuspenso com RPMI, na mesma proporção, ocorrendo então, uma nova
centrifugação a 670 x g por 10 minutos a 4º C. Esse processo foi repetido e o sedimento foi
ressuspenso em 5 mL de meio RPMI contendo 10% de SFB. A quantificação de células
viáveis foi realizada através do método de exclusão, por meio de coloração pelo azul de
Tripan (Sigma-Aldrich, EUA), em câmara de Neubauer, observada em microscópio óptico,
com aumento de 40x. Em seguida, 3 x 106 células foram cultivadas em placas de cultura de 24
poços de fundo chato (BD Biosciences FALCON™) com meio RPMI completo acrescido de
10% de soro AB RH+ humano inativado (Sigma-Aldrich), e foram infectadas com cada uma
das cepas de BCG em MOI 10:1. Estas células foram mantidas na estufa a 37º C com 5% CO2
por 24 e 72 horas.
A retirada do sangue periférico dos indivíduos aconteceu depois da obtenção do termo
de consentimento livre e esclarecido por escrito, como aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa em seres humanos da Fiocruz (Protocolo CEP 206/03). O processamento do sangue
dos indivíduos incluídos neste estudo foi realizado em câmara de fluxo laminar respeitando as
normas de precauções para manipulação de material biológico.
4.4. Biópsias de nervos humanos
A coleta de rotina de biopsias de nervo foi realizada no Ambulatório Souza Araújo
(ASA, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, RJ) em pacientes de difícil diagnóstico, como é o
caso da forma neural pura da hanseníase, onde a patologia é restrita ao nervo e o paciente não
apresenta lesões de pele (Jardim et al., 2003). Foram coletadas 96 biopsias de nervos de
pacientes atendidos no ASA com intuito de se fazer diagnóstico. Todos os indivíduos
apresentavam neuropatia periférica com exame de eletroneuromiografia alterado (Jardim et
al., 2003) e tinham suspeita de hanseníase. O protocolo de extração de RNA e DNA destas
biópsias foi estabelecido para realização de estudos de expressão gênica a partir de nervos
colhidos para o diagnóstico molecular e histopatológico (Martinez et al., 2009). Também, foi
coletado sangue total destes mesmos pacientes a partir do qual, foi extraído DNA para
genotipagem de polimorfismos em alguns genes previamente associados à hanseníase.
49
Os ensaios que se valeram da utilização de amostras humanas foram realizados depois
da obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido por escrito, de acordo com as
normas do Comitê de Ética em Pesquisa da Fiocruz (protocolo CEP/Fiocruz 151/01).
4.5. Extração de Ácidos Nucléicos
4.5.1. Extração de RNA de células THP-1
As células THP-1 tiveram seu RNA extraído pelo método descrito pelo fabricante do
reagente Trizol (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Após 24 horas de infecção, o
sobrenadante das células foi retirado e armazenado -20° C. Nas células aderentes foi
adicionado 1 mL de Trizol para rompimento das células e estas foram destacadas utilizando a
ajuda de um raspador plástico estéril (“rodinho”) e transferidas para tubos eppendorf de 1,5
mL. Em seguida, adicionou-se 200 L de clorofórmio (Merck, Alemanha) a cada tubo
seguido de homogeneização por inversão. Os homogeneizados foram centrifugados a 14.000
x g por 15 minutos a 4° C. A fase aquosa superior contendo o RNA foi transferida para novos
tubos eppendorf de 1,5 mL, foi adicionado 500 L isopropanol (Sigma-Aldrich, EUA),
misturado por inversão e incubado a -70° C, por uma noite ou mais. Após a incubação, os
tubos foram centrifugados a 14.000 x g por 20 minutos a 4° C. O sobrenadante foi descartado
e os sedimentos lavados com 500 L de etanol (Merk, Alemanha) 70% por centrifugação a
10.000 x g por 10 minutos a 4° C. O sobrenadante foi aspirado e os sedimentos foram
ressupensos em 30 L de água tratada com dietilpirocarbonato 0,01% (v/v) (DEPC,
Invitrogen, Life Technologies, EUA).
Posteriormente, foi realizada uma quantificação do RNA através da leitura em
espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, EUA), onde 1 µl da
amostra foi lido contra um “branco” contendo água DEPC. Para avaliar a pureza das
amostras, utilizou-se a razão da absorbância em dois comprimentos de onda, onde a razão
A260/280 indica o grau de contaminação por proteínas e a razão A260/230 indica a contaminação
por compostos orgânicos. Amostras com razões de A260/280 e A260/230 inferiores à 1,8 foram
consideradas inadequadas e foram repurificadas até atingirem a razão de A260/280 e A260/230
iguais ou superiores à 1,8. A análise da integridade do RNA foi observada através da
eletroforese em gel de agarose (Invitrogen, Life Technologies, EUA) a 1,2% em tampão
MOPS 1X (Sigma-Aldrich, EUA), no qual 200 ng de RNA foi previamente desnaturado com
50
35% formamida, MOPS 1X e corado com 0,125% azul de bromofenol e 1 L de SYBR Green
II 100X (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA). O RNA foi incubado em banho seco
a 65° C por 10 minutos e, em seguida, aplicado ao gel. O gel foi submetido a uma corrente
elétrica de 100 V por 40 minutos. Após a corrida eletroforética, o gel foi analisado por um
sistema de fotodocumentação (l-Pix Touch, Loccus Biotecnologia, Brasil).
4.5.2. Extração de DNA das amostras de sangue total
O DNA foi extraído a partir de amostras de sangue total dos indivíduos saudáveis
utilizando o método salting out (Miller et al., 1988), com algumas modificações.
Primeiramente, foram adicionados 10 mL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM) a
um tubo cônico Falcon de 15 mL contendo 2 mL de sangue total. O conteúdo do tubo foi
misturado por inversão e centrifugado a 1.200 x g durante 20 minutos. Após o sobrenadante
ter sido descartado, tampão TE foi adicionado ao precipitado até completar o volume de 10
mL. Posteriormente, o material foi homogeneizado no vórtex até que o precipitado estivesse
completamente dissolvido e, em seguida, o tubo foi centrifugado a 1.200 x g durante 20
minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi novamente ressuspenso em 10 mL
de tampão TE, homogeneizado e centrifugado. Depois de descartar o sobrenadante, foi
adicionado ao precipitado 600 µL de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 400 mM
e EDTA 2 mM), 80 µL de uma solução de SDS a 10% e 9 µL de solução de proteinase K a 25
mg/mL. O material foi homogeneizado no vórtex por 2 segundos e incubado a 37º C durante a
noite. Posteriormente, foram acrescentados 200 µL de uma solução de acetato de sódio
saturado a 6,83 M e o material foi centrifugado a 1.200 x g por 20 minutos. O sobrenadante
foi coletado e transferido para um novo tubo de 15 mL, ao qual foi adicionado etanol absoluto
(2 vezes o volume recuperado). A solução foi então misturada por inversão até que o DNA
precipitasse. O precipitado de DNA foi coletado e transferido para um microtubo eppendorf
de 1,5 mL, adicionando-se 200 µL de etanol 70%. Em seguida, o material foi centrifugado a
12.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. O microtubo foi cuidadosamente
mantido invertido por 30 minutos para que o etanol evaporasse completamente. Finalmente,
foram adicionados 100-200 µL de tampão TE (Tris-HCl 5 mM pH8.0, EDTA 0,1 mM) ao
sedimento de DNA, e o material foi incubado a 56º C até que o sedimento estivesse dissolvido.
Posteriormente, o DNA foi quantificado através da leitura em espectrofotômetro NanoDrop
ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, EUA), observando-se os mesmo parâmetros descritos
51
no item 4.4.1, e em seguida estocado a -20ºC.
4.5.3. Extração de RNA e DNA de biopsias de nervos humanos
A extração de RNA de biópsias de nervo foi realizada pelo método descrito pelo
fabricante do reagente Trizol (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Para isso, as biopsias,
pesando em torno de 10 mg, foram maceradas utilizando pistilo e almofariz de inox mantidos
congelados em gelo seco. O macerado foi colocado em microtubos eppendorf de 1,5 mL e
adicionado 1 mL de Trizol. Em seguida, foi adicionado 200 L de clorofórmio:álcool
isoamílico (Sigma-Aldrich, EUA) 24:1 a cada tubo seguido de homogeneização por inversão.
Os passos seguintes de extração de RNA foram realizados como descrito no item 4.4.1. As
fases intermediária e inferior orgânica foram armazenadas a -20° C para posterior extração de
DNA.
Posteriormente, foi realizada a extração de DNA presente na interfase e na fase
orgânica inferior. Para isso, foi adicionado aos tubos contendo as fases de interesse, 100 L
de tampão TE (Tris-HCl 5 mM pH8.0, EDTA 0,1 mM) e 150 L de clorofórmio:alcool
isoamílico (24:1). A mistura foi homogeneizada no instrumento FastPrep 120 (MP
Biomedicals, Solon, OH, EUA) na velocidade de 6,5 metros/segundo (m/s) por 45 segundos.
Logo após, os tubos foram incubados em gelo por 5 minutos e então centrifugados a 12.000 x
g por 10 minutos à temperatura ambiente. A fase aquosa superior foi transferida para um novo
tubo eppendorf de 1,5 mL, onde foram adicionados 2 vezes o volume de isopropanol e 2 L
de GlycoBlue (Invitrogen, Life Technologies, EUA) e, então foi homogeneizada por inversão.
A mistura foi incubada por no mínimo 4 horas a -20° C seguido de centrifugação a 12.000 x g
por 30 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado
com 500 L de etanol 70% por centrifugação a 12.000 x g por 15 minutos a 4° C. O
sobrenadante foi descartado e o sedimento foi seco à temperatura ambiente por
aproximadamente 15 minutos. O DNA foi ressuspenso em 20-30 L de água tratada com
DEPC.
4.6. Ensaios de associação de micobactérias com células THP-1
4.6.1. Marcação das micobactérias
As cepas de BCG e M. leprae foram marcados com o PKH2 Green Fluorescent Cell
52
Linker Kit (Sigma-Aldrich, EUA), de acordo com instruções do fabricante. Para isso,
aproximadamente 107 bacilos foram centrifugados a 14.000 rpm por 10 minutos à temperatura
ambiente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 1 mL do diluente
A. Posteriormente, foi adicionado 1 mL do corante PKH2 diluído no diluente A e
homogeneizado. A mistura foi incubada por 5 minutos à temperatura ambiente, protegido da
luz. Em seguida, foi adicionado igual volume de SFB e incubados por 1 minuto, para a
neutralização. A suspensão de bacilos foi, então, diluída em igual volume de meio RPMI1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14.000 rpm. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi descartado e as bactérias foram lavadas por três vezes com meio RPMI-1640
para a retirada do excesso de fluorocromo. Ao final, as bactérias foram ressuspendidas no
volume inicial de meio de cultura e a eficiência da marcação monitorada em microscópio de
fluorescência com lente de imersão (Nikon Eclipse E400) em aumento de 1000X.
4.6.2. Avaliação da associação de micobactérias com células THP-1
Para avaliar a eficiência da infecção das culturas, células THP-1 foram infectadas com
as diferentes cepas de BCG (Danish, Moreau e Pasteur) e M. leprae por períodos de até 48 h.
Para isso, 3 x 105 células diferenciadas foram infectadas com micobactérias marcadas, em
MOI 10:1, e incubadas a 37º C, por até 48 horas. Posteriormente, as células foram lavadas
com PBS e depois destacadas com ajuda de um raspador plástico estéril (“rodinho”) e
mantidas em PBS com 2% SFB. Aproximadamente 10.000 células foram adquiridas em
citometria de fluxo Accuri C6 (Accuri Cytometers, Inc.) e a fluorescência detectada pelo
canal FL1-A. As amostras foram adquiridas com e sem corante vital Azul de Tripan (0,4%)
com o objetivo de distinguir células contendo bactérias aderidas e/ou internalizadas. Neste
ensaio, denominado ensaio de “quenching”, o corante é adicionado para “apagar” a
fluorescência das bactérias extracelulares (Lamprou et al., 2007). O percentual de células
associadas à bactérias (adesão + internalização), bem como o percentual de células contendo
apenas bactérias internalizadas (fagocitose) foi determinado a partir de culturas não infectadas.
A análise quantitativa dos dados foi realizada utilizando programa cflow Plus.
4.7. PCR em tempo real
4.7.1. Síntese de cDNA
53
O cDNA foi transcrito reversamente a partir do RNA total utilizando superscript III
seguindo instruções do fabricante (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Inicialmente, 1 µg
RNA em solução aquosa, foi misturado a 0,5 µg de iniciador oligo(dT) e 0,125 mM de dNTP,
e incubado no banho seco (modelo DB- Heat & Cool, Loccus Biotechnologia, Brasil) por 5
minutos a 65° C. Posteriormente, a essa mistura foi adicionado o tampão da enzima em
concentração final 1x, DTT a 10 mM, 40U de Inibidor de RNAse e 200U da enzima
Superscript III, em um volume final de 20 µL. Em seguida, esta reação foi incubada em banho
seco por 60 minutos a 50° C para realização da transcrição, seguidos de 15 minutos a 70° C
para a inativação da enzima. Ao final da reação, adicionamos 180 µL de água milli-q. O
cDNA foi armazenado a -20° C.
4.7.2. Reação de RT-PCR em Tempo Real (qRT-PCR)
A reação de PCR em tempo real foi realizada utilizando o sistema SYBR Green I
(Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) seguindo instruções do fabricante. Para isso,
foi utilizado 5 µM de cada cDNA e, a estes, adicionados Sybr Green PCR Master Mix 1X
(Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) e 0,25 µM de cada oligonucleotídeo, em um
volume final de 20 µL. Para cada amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse
além dos genes constitutivos RPL13, RPS13 e HPRT1. As reações foram incubadas no
sistema de PCR em tempo real ABI 7000 (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA),
seguindo as condições da reação: 95° C por 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95° C por 15
segundos e 60° C por 1 minuto. Ao final da reação de amplificação, as amostras foram
submetidas a uma nova incubação para geração da curva de dissociação, onde se determina o
ponto correspondente à temperatura de dissociação dos oligonucleotídeos de suas sequências
alvo.
Todos os oligonucleotídeos utilizados na reação de qRT-PCR (tabela em anexo I)
foram desenhados a partir de sequências de referência de cada gene obtidas no UCSC
Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu/), utilizando o software Primer3 v.0.4.0
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3), para tal, alguns fatores foram controlados: (i) tamanho do
iniciador; (ii) tamanho do produto; (iii) temperatura de anelamento dos iniciadores; (iv)
conteúdo GC do iniciador; (v) chance de pareamento entre o par de iniciadores e dentro do
mesmo iniciador; e (vi) força de anelamento na extremidade 3’ do iniciador. Após serem
desenhadas,
as
sequências
foram
validadas
54
pela
ferramenta
Primer-BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) utilizando o banco de genes humanos do
NCBI (National Center for Biotechnology Information).
4.7.3. Análise dos dados de qRT-PCR
Primeiramente, foi realizada no próprio equipamento, uma análise da curva de
dissociação (curva de “melting”), para confirmar a amplificação específica através da
temperatura de dissociação do produto de amplificação, que produz um único pico. Caso
tenha sido observada a presença de produtos inespecíficos na reação ou formação de dímeros
de oligonucleotídeos, era realizada uma de eletroforese em gel de agarose para confirmação
dos produtos indesejáveis, e caso fosse confirmado, essa quantificação era descartada e
repetida.
A partir dos dados de acúmulo de fluorescência das triplicatas da reação de qRT-PCR
de cada amostra (Rn), utilizou-se o ajuste de função logística, ou curva sigmóide, de quatro
parâmetros para representar cada curva de amplificação, usando a biblioteca de funções qpcR
(Ritz & Spiess, 2008), para a linguagem estatística R (R Development Core Team, 2009)
versão 2.922. O ciclo de quantificação, ou Cq, foi determinado como o ciclo relativo ao ponto
de máxima da segunda derivada da curva sigmóide ajustada (ponto característico, ou crossing
point [Cp]). O uso desse ponto de máxima característico é conveniente uma vez que ele se
encontra numa região de eficiência constante na fase exponencial da curva de amplificação,
além de ser invariante do poço e placa aonde ocorre a reação de qRT-PCR (Rebrikov et al.,
2006). A eficiência de cada reação de amplificação foi calculada como a razão entre a
fluorescência do ciclo de quantificação e a florescência do ciclo anterior a esse. A eficiência
estimada de cada gene foi obtida pela eficiência média das eficiências calculadas para cada
reação de amplificação daquele gene. Os genes empregados na normalização entre as
diferentes amostras amplificadas foram selecionados pelos métodos geNorm (Vandesompele
et al., 2003) e NormFinder (Andersen et al., 2004). O algoritmo do geNorm parte do
pressuposto de que os genes com expressão mais estável em relação aos outros genes
analisados são os mais adequados para normalização interna. Enquanto, o algoritmo
NormFinder parte do pressuposto de que a expressão média entre todos genes testados possua
uma pequena variação entre grupos, próxima de zero.
Para a comparaco de dias dos valores de o normalizados entre os grupos
foi utilizado one-way ANOVA o trica via permutaço irrestrita (n=1000), seguido
da comparaco de dias par-a-par por teste t o trico via permutaco (n=1000) com
55
correco de Bonferoni (Basso et al., 2009). Os dados são apresentados pela média ± erro
padrão da média. Níveis de significância bi-caudais menores ou iguais a 0,01, 0,05 e 0,1
foram considerados como altamente significantes, significantes e sugestivos, respectivamente.
4.8. Multiplex PCR em Tempo Real
Outra metodologia utilizada em nosso estudo para a análise da expressão gênica foi a
tecnologia de qRT-PCR multiplex em sistema microfluídica da Fluidigm, no qual foi utilizado
um painel de 48 genes (tabela no anexo I) para uma análise simultânea de 96 amostras.
Em um primeiro experimento foram utilizadas células THP-1 infectadas com as cepas
de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 2:1 e 10:1; e infectadas com M. leprae em MOI
2:1 e 10:1. Em um segundo experimento, foi utilizado o cDNA de biopsias de nervos
humanos.
4.8.1. Reação de PCR multiplex em Tempo Real
Inicialmente, 100 ng de cDNA foi pré-amplificado em um termociclador convencional
(Gene Amp PCR System 9700, Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) com uma
mistura de 48 oligonucleotídeos (tabela no anexo I) para cada uma das 96 amostras
simultaneamente. Para isso, foi utilizado 2,5 µL do TaqMan preAmp Master mix (Applied
Biosystems, Life Technologies, EUA) na presença de 200 nM de cada oligonucleotídeo e 1,25
µL de cada cDNA em 5 µL finais, nas seguintes condições da reação: 95° C por 10 minutos,
seguido de 14 ciclos de 95° C por 15 segundos e 60° C por 4 minutos. Posteriormente, o
cDNA pré-amplificado é carregado no controlador de fluídos e depois amplificado no sistema
Biomark (Fluidigm, EUA), que com um sistema de microfluidica, define 9216 pontos com
poços de 8nl possibilitando a amplificação simultânea de 96 amostras por 96
oligonucleotídeos, ou como foi utilizado em nosso estudo, 48 oligonucleotídeos em duplicata.
Para a amplificação em tempo real no sistema Biomark (Fluidigm, EUA), 2 µL de
cada cDNA pré-amplificado foi misturado a 2,5 µL de 2x Taqman Gene Expression Master
mix (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) e 0,25 µL de 20x EvaGreen DNA
binding dye (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) em 5 µL finais. Paralelamente,
20 µM de cada um dos 48 oligonucleotídeos foi misturado a 2,5 µL de 2x Assay Loading
Reagent (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA) em 5 µL finais. Então, ambos cDNA
56
pré-amplificado e as sondas, foram adicionados no chip (96.96 Dynamic Array IFC, Fluidigm,
EUA), em seus respectivos poços, e esse chip foi colocado no IFC Controller MX (Fluidigm,
EUA) para que fosse carregado. Em seguida, o chip carregado foi adicionado ao
termociclador Biomark (Fluidigm, EUA) para a amplificação simultânea das 96 amostras
onde cada oligonucleotídeo foi analisado em cada uma das amostras.
4.8.2. Análise dos dados de PCR multiplex em tempo real
A partir dos dados de acúmulo de fluorescência das duplicatas da reação de PCR
multiplex em tempo real de cada amostra (Rn), utilizou-se o ajuste de função logística, ou
curva sigmóide, de quatro parâmetros para representar cada curva de amplificação, utilizando
a biblioteca de funções qpcR, para a linguagem estatística R (R Development Core Team,
2009) versão 2.922. O ciclo de quantificação, ou Cq, foi determinado pelo ciclo
correspondente ao ponto de máxima da primeira derivada da curva sigmóide ajustada (Cp). A
eficiência de cada reação de amplificação foi calculada como a razão entre a fluorescência do
ciclo de quantificação e a florescência do ciclo anterior a esse. A eficiência estimada de cada
gene foi obtida pela eficiência média das eficiências calculadas para cada reação de
amplificação daquele gene. Os genes empregados na normalização entre as diferentes
amostras amplificadas foram selecionados pelos métodos geNorm e NormFinder.
Para a comparaço de dias dos valores de o normalizados entre os grupos
foi utilizado one-way ANOVA o trica via permutaco irrestrita (n=1000), seguido
da comparaco de dias par-a-par por teste t o trico via permutaco (n=1000) com
correco de Bonferoni (Basso et al., 2009). Os dados são apresentados pela média ± erro
padrão da média. Níveis de significância bi-caudais menores ou iguais a 0,01, 0,05 e 0,1
foram considerados como altamente significantes, significantes e sugestivos, respectivamente.
4.9. Microarranjos de DNA
4.9.1. Desenho experimental
Para avaliar o efeito da cepa de BCG Moreau e M. leprae na expressão gênica global
57
de células THP-1 e observar possíveis diferenças na resposta destas células, foi utilizada a
técnica de microarranjo de DNA. Para isso, foram utilizadas três condições experimentais:
células THP-1 não infectada, células THP-1 infectadas com BCG Moreau e células THP-1
infectadas com M. leprae, por 24 horas. As comparações foram realizadas entre: as células
infectadas com BCG Moreau e infectadas com M. leprae; e células não infectadas e infectadas
com M. leprae (figura 4.2). As hibridações foram realizadas em triplicata biológica, com troca
dos fluoróforos entre as amostras, resultando em um total de 12 lâminas.
As lâminas utilizadas nesse estudo foram adquiridas da Stanford Genomics Facility e
continham 44.544 sondas de oligonucleotídeos de 70 bases. Desses, 30.718 sondas
reconheciam transcritos de genes, 8.441 reconheciam exons de alguns genes com splicing
alternativo conhecido, 196 reconheciam RNA não codificante e 372 sondas reconheciam
transcritos de genes que sofrem rearranjo somático. Além dessas sondas, também estava
incluída na lâmina um conjunto grande de controles de hibridação incluindo 398 controles
negativos, 864 positivos e 1384 controles que reconhecem sequências não-humanas de
amostras controle acrescentadas ao RNA antes da marcação. Também foi adquirido da
Stanford o pool de RNAs controle spike-in contendo 51 RNAs não-humanos que são
reconhecidos pelas sondas controle. O desenho experimental das hibridizações foi do tipo
competitivo, no qual duas amostras foram hibridadas por lâmina, sendo cada amostra marcada
com fluoróforos distintos (Alexa 555, cor verde, ou Alexa 647, cor vermelha). Duas lâminas
foram hibridadas para cada conjunto de amostras, e em cada uma dessas hibridações foi
efetuada a troca dos fluoróforos entre as amostras (do inglês, dye swap).
Células THP-1 infectadas com M.lep
Células THP-1 não infectadas (controle)
Células THP-1 infectadas com BCG Moreau
Figura 4.2 - Desenho experimental de microarranjos de DNA. Foi analisada a diferença na
expressão gênica de células THP-1 após 24 horas de infecção por BCG Moreau ou M. leprae.
Desenho com replicação em dye swap. As setas correspondem a hibridações entre as duas
amostras. Por convenção, representamos a amostra corada em verde na ponta e a amostra
58
corada em vermelho na cauda da seta.
4.9.2. Amplificação do RNA
O RNA extraído das células THP-1 foi amplificado utilizando o kit Message AmpTM
II aRNA (Ambion, Life Tecnologies), seguindo as recomendações do fabricante. Para isso, 2
µg de RNA total foram submetidos a uma transcrição reversa para a síntese de uma primeira
fita de cDNA numa reação contendo T7 oligo (dT), 1 X First Strand Buffer, 4 µL dNTP, 1 µL
de inhibidor de RNases e 1 µL de enzima ArrayScript, em 20 µL finais. A reação foi incubada
por 2 horas a 42º C. Posteriormente, foi realizada a síntese da segunda fita de cDNA através
de uma reação contendo, além do conteúdo da primeira reação, 1 X Second Strand Buffer, 4
µL dNTP, 2 µL de DNA polimerase e 1 µL de RNase H, em 100 µL finais. Essa reação foi
incubada por 2 horas a 16º C. O cDNA de dupla fita foi purificado através de colunas do
próprio kit e em seguida submetida a uma transcrição in vitro para síntese de aRNA numa
reação contendo tampão da transcrição, dNTP e enzima que foi incubado por 14 horas a 37º
C. O aRNA foi purificado através de colunas do kit e quantificado no espectrofotômetro
NanoDrop ND-1000.
4.9.3. Marcação fluorescente da segunda fita de cDNA
As amostras de aRNA foram submetidas a marcação direta para a incorporação de
nucleotídeos acoplados aos fluoróforos Alexa 555 ou 647 através de uma adaptação do
Bioprime DNA labeling kit (Invitrogen, Life Technologies, EUA). Para isso, 2 µg de aRNA
foram submetidos a uma reação de transcrição reversa contendo 2 µL de random primer, 2 µL
dNTP, 1 µL RNA controle (spike-in), 1 X First Strand Buffer, 1 µL DTT, 1 µL inibidor de
RNase e 2 µL enzima Superscript III, no volume de 20 µL. Essa reação foi incubada a 50º C
por 2 horas em termociclador. Posteriormente, o RNA foi digerido adicionando-se ao tubo 1
X Tampão RNase One, 2 µL de enzima RNase One e 68 µL de água livre de nucleases (água
DEPC). Esta reação foi incubada por 10 minutos a 37º C. O restante do cDNA foi purificado
por centrifugação a 13.000 x g por 10 minutos em colunas Microcon 30 (Millipore). Em
seguida o cDNA foi marcado numa reação contendo 20 µL da solução de random primer, 1
µL do fragmento Klenow da DNA polimerase, 120 µM de dATP, dTTP e dGTP, 60 µM de
59
dCTP não marcado, e 40 µM de dCTP-Alexa 555 ou 647, em um volume final de 50 µL.
Após incubar a 37º C por 3 horas, o cDNA marcado foi purificado por 4 centrifugações a
13.000 x g em colunas Microcon 30, com 400 µL de água DEPC cada vez. Ao final da
purificação, as amostras foram quantificadas no espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 para
cálculo do grau de incorporação dos fluoróforos (DoL, do inglês, Degree of Labelling). O
DoL é expresso em porcentagem e representa o número de bases marcadas incorporadas a
cada 100 bases. Valores de DoL entre 1,0 e 3% indica boa incorporação e foram utilizados
como controle de qualidade das marcações.
4.9.4. Hibridação e lavagem das lâminas de microarranjo
Antes da hibridação, as lâminas de microarranjo foram lavadas para retirada de sujeira
e bloqueadas para evitar sinal inespecífico seguindo as recomendações do fabricante. Para
isso, as lâminas foram lavadas nas seguintes condições: 5 minutos em Triton X-100 0,1%
(v/v); 2 minutos em 1 mM HCl por 2 vezes; 10 minutos em 100 mM KCl; 1 minuto em água
Milli-Q; 15 minutos a 50º C em 50 mM etanolamina, 0,1% SDS e 0,1 M Tris-HCl, pH 9.0; 1
minuto em água Milli-Q. As amostras marcadas e purificadas foram hibridadas com as
lâminas de microarranjo em solução contendo 5 X SSC (NaCl/citrato de sódio) e 0,1% SDS
(dodecil sulfato de sódio). A hibridação foi realizada em câmaras mantidas em banho-maria a
60º C sob agitação por 18 horas. Após a hibridação, as lâminas foram lavadas em vidro
béquer sob agitação contendo 500 mL das seguintes soluções: 2 X SSC, 0,2% SDS por 10
minutos; 0,5 X SSC, 0,02% SDS por 10 minutos; 0,1 X SSC por 5 minutos; 0,1 X SSC por 5
minutos. As lâminas foram secas por centrifugação em suporte apropriado por 10 minutos a
500 x g.
4.9.5. Aquisição e análise das imagens do microarranjo
As lâminas foram analisadas em um leitor óptico (Vers Array Chip ReaderTM,
BioRad), que quantifica a emissão de fótons após a excitação dos fluoróforos por um laser,
em leituras independentes ao comprimento de onda de 532 nm (para quantificação do Alexa
555, denominado canal “verde”) ou de 635 nm (para quantificação do Alexa 647, denominado
canal “vermelho”). Nesse estudo, cada lâmina foi analisada com 9 µm de resolução dos pixels
60
e intensidade do laser de 100%, porém variando a voltagem do tubo fotomultiplicador de
forma a balancear a razão da emissão entre os canais.
A análise das imagens foi realizada através do programa GenePix Pro v.6.0 (Axon), e
incluiu três etapas: (i) gradeamento, que é o alinhamento de uma grade sobre os pontos de
impressão das sondas para marcar as coordenadas de cada ponto; (ii) segmentação, na qual
uma máscara circular é posicionada sobre o ponto, e os pixels que localizam-se sob a máscara
são classificados como sinal, enquanto que os pixels fora da máscara são classificados como
ruído; e (iii) quantificação, na qual são calculadas estatísticas correspondentes às áreas de
sinal e ruído segmentadas (média, mediana, desvio-padrão, distância interquatílica). O método
de segmentação utilizado por este programa é o de círculos adaptativos, que permitem
variações no diâmetro de cada ponto (Yang et al., 2001).
4.9.6. Análise de dados
Todas as análises foram realizadas utilizando o pacote Limma (Smyth, 2004)
desenvolvido para a linguagem de programação R (R Development Core Team, 2010),
utilizando as medianas do sinal e do ruído em cada canal como dados brutos de entrada, uma
vez que médias são mais influenciadas por valores extremos. A correção pelo ruído é utilizada
para remover os possíveis efeitos de hibridação não-específica da heterogeneidade espacial no
microarranjo. Entretanto, a correção de ruído padrão, estimada pela subtração sinal - ruído
para cada ponto em cada canal introduz uma grande variabilidade nos pontos de baixa
intensidade e gera problemas como valores negativos de intensidade. O método de correção
pelo ruído empregou o modelo de misturas normo-exponencial (Bolstad, 2004), que é mais
adequado por evitar valores negativos. Os pontos foram filtrados por três critérios: razão sinal
ruído (SNR, do inglês, signal to noise ratio) > 3, flag do software Genepix  -49, Hthreshold
< 0,2. O software Genepix identifica pontos não detectados durante o gradeamento com flag
no valor de -50. O Hthreshold é um critério que elimina pontos com grande diferença entre a
média e a mediana da intensidade dos pixels (normalizados pela média de intensidade do
canal), que podem representar pontos com artefatos.
Em seguida, foram feitos gráficos MA (MA plots) para visualização do perfil das
intensidades dos pontos de cada lâmina. Esses gráficos foram propostos por Dudoit e
colaboradores (2002) e tem se tornando o método padrão para visualização de dados de
microarranjos por hibridação competitiva pelo fato dos mesmos revelarem mais
61
características e artefatos dos dados que os RG plots utilizados anteriormente. O gráfico MA é
feito plotando no eixo x o valor da intensidade média de todos os pixels em escala log2 [índice
A; A = 1/2 (log2R + log2G); onde R e G são os valores de intensidade do ponto nos canais
vermelho e verde, respectivamente (do inglês, Red e Green)] e no eixo y a razão da expressão
entre os canais, que é estimada pela diferença na quantidade de pixels em escala log2 [índice
M; M = log2R - log2G = log2 (R/G)]. Após análise visual dos gráficos MA, optou-se pela
normalização lowess global (Yang et al., 2002) e pelo escalonamento pelos quantis da
distribuição dos valores médios de intensidade A, método conhecido por A-quantile (Irizarry
et al., 2003). Aos dados normalizados e escalonados, assim como para o experimento anterior
de microarranjo, optou-se pelo ajuste de um modelo linear com um fator principal (infecção) e
apenas dois níveis, infectado ou não-infectado. Esse modelo de one-way ANOVA pode ser
representado por: Yij = µi +Iij+ εij, onde, Yij é a expressão log-transformada do gene i, i
={1,...,n}, dada a presença ou ausência de infecção Ij, j={1,2}. A média global é representada
por µ, enquanto ε corresponde ao componente aleatório do modelo. Em seguida, dois testes de
hipótese foram utilizados na comparação de médias do contraste de interesse: (i) frequentista
moderado e; (ii) Bayesiano. Os mesmos critérios de seleção de genes diferencialmente
expressos (GDEs) foram considerados, ou seja: (i) p-valor ajustado < 0,05, para controle do
erro family-wise do tipo I ou false discovery rate (Benjamini e Hochberg, 1995); (ii) valor
absoluto de log fold change  1 (fold change  0,5 ou fold change  2); e (iii) odds
Probability  0,95. Foi realizada uma anotação funcional dos genes através do software
Database
for
Annotation,
Visualization
and
Integrated
Discovery
(DAVID;
http://david.abcc.ncifcrf.gov).
4.10. Genotipagem de polimorfismos de base única por PCR em tempo real
4.10.1. Genotipagem de SNPs dos genes IL-10, TNF e TLR1
Para identificar se polimorfismos em genes de citocinas envolvidas na resposta imune,
que exercem alguma influência na suscetibilidade ou resistência à hanseníase, influenciam a
secreção de citocinas por PBMC infectadas com diferentes cepas de BCG, fizemos a
genotipagem dos SNPs IL10 -819 C>T (rs1800871), TNF -308 G>A (rs1800629) e TLR1 743
A>G (N248S) (rs5433095), através da técnica de discriminação alélica utilizando PCR em
tempo real. Nesta técnica, são utilizadas sondas fluorescentes específicas para cada alelo, e a
62
inferência dos genótipos são baseadas na intensidade de fluorescência.
Tabela 4.1 - Condições das reações de PCR em tempo real para amplificação de
regiões polimórficas dos genes IL-10 -819 C>T, TNF -308 G>A, TLR1 743 A>G e
TNFSF15 A>G.
SNPs
IL-10 -819C>T
TNF -308G>A
TLR1 743A>G
Ciclagens
(1 ciclo)
(1 ciclo)
(1 ciclo)
Para desnaturação
Para desnaturação
Para desnaturação
94°C-3min
94°C-5min
95°C-10min
(35 ciclos)
(35 ciclos)
(40 ciclos)
94°C-40seg
94°C-1min
95°C-15seg
56°C-45 seg
57°C-1min
60°C-1 min
72°C-40seg
72°C-1min
60°C-30seg
(1 ciclo)
(1 ciclo)
-
Para extensão final
Para extensão final
72°C-10min
72°C-5min
-
As reações de PCR foram realizadas utilizando o sistema TaqMan Assay (Applied
Biosystems, Life Technologies, EUA), de acordo com recomendações do fabricante,
utilizando o aparelho StepOne Real Time PCR Systems (Applied Biosystems, Life
Technologies, EUA). Este sistema é baseado no uso de duas sondas, cada uma carregando um
fluoróforos, VIC e FAM, específicas para cada alelo estudado. Para isso, foram utilizados 2050µg/mL de DNA, misturados a TaqMan Universal Master Mix (40X) e a sonda. As
condições das reações de PCR em tempo real foram diferentes para cada sonda, e estão
descritas na tabela 4.1. Os oligonucleotídeos e as sondas utilizadas nos ensaios também se
encontram na tabela 4.2. A determinação dos genótipos foi realizada através do programa
Step One 2.1 software (Applied Biosystems, Life Technologies, EUA), obtendo-se uma razão
entre a fluorescência dos dois fluoróforos (R).
63
Tabela 4.2 - Seqüências dos oligonucleotídeos-iniciadores e sondas empregadas para tipificação
dos SNPs nos genes IL-10 -819 C>T e TNF -308 G>A pela técnica de PCR tempo real.
Gene
IL-10
TNF
SNP
-819 C>T
-308 G>A
Seqüências 5’3’ dos
Seqüências 5’3’ dos
oligonucleotídeos iniciadores
oligonucleotídeos sondas
F 5’-GGCACTGGTGTACCCTTGTA 3’
VIC: 5’CACAGAGATGTTACATCAC 3’
R 5’-CATGACCCCTACCGTCTCTATTTT 3’
FAM: 5’CACAGAGATATTACATCAC3’
F 5’-CCAAAAGAAATGGAGGCAATAGGTT 3’
VIC: 5’CCCGTCCCCATGCC 3’
R 5’-GGACCCTGGAGGAGGCTGAAC 3’
FAM: 5’CCCGTCCTCATGCC3’
VIC: 5’ TAAGGTAAGACTTGATAACTTTG
TLR1
743 A>G
C__44103606_10 (Código do Ensaio Applied)
FAM: 5’ TAAGGTAAGATTTGATAACTTTG
F (forward) = oligonucleotídeo senso; R (reverse) = oligonucleotídeo antisenso. Obs: em negrito e vermelho são
demonstrados os SNPs identificados pelos oligonucleotídeos-sondas
4.11. Dosagem de citocinas
4.11.1. Desenho experimental
Foi utilizado sobrenadante de células THP-1 infectadas com as cepas de BCG Danish,
Moreau e Pasteur, e M. leprae em MOI 2:1 e 10:1 por 24 horas, para a dosagem de TNF, IL1, IL-8, IL-10 e CCL2. Ainda, foi utilizado o sobrenadante de PBMC infectadas com as
cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur após 24 horas, para a dosagem de TNF e IL8; e após
72 horas, para a dosagem de IL-10.
4.11.2. Dosagem das citocinas TNF, IL-8, IL-1, IL-10 e CCL2
As citocinas TNF, IL-1, IL-8, IL-10 e CCL2 foram quantificadas separadamente por
Ensaio Imunoenzimático (ELISA, do inglês Enzyme-linked immunosorbent assay) utilizando
kit DuoSet (R&D Systems, EUA) específico para cada citocina, de acordo com as
recomendações fornecidas pelo fabricante. Inicialmente, placas de 96 poços de fundo chato
64
(NUNC) foram sensibilizadas com 50 L do anticorpo de captura específico para cada
citocina, diluído em PBS, por 16 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, os poços
foram lavados 3 vezes com tampão de lavagem (0,05% Tween 20 em PBS) e bloqueados com
reagente diluente (1% de BSA diluído em PBS) por 1 hora a temperatura ambiente. Os poços
foram novamente lavados 3 vezes. Em seguida, as placas foram incubadas à temperatura
ambiente, durante 12 horas, com 50 L das amostras a serem testadas em duplicata e com 50
L da citocina padrão (anticorpo recombinante), utilizada para a geração da curva padrão. Os
poços foram lavados novamente por 3 vezes, e logo após, foi adicionado 50 L do anticorpo
de detecção específico para cada citocina, conjugado a biotina e diluído em reagente diluente.
Então, a placa foi incubada por mais 2 horas a temperatura ambiente. Após a lavagem dos
poços, foi adicionado 50 L de estreptavidina conjugada a peroxidase, diluída em reagente
diluente na proporção de 1:200 por 20 minutos à temperatura ambiente. Após mais 3
lavagens, a atividade da peroxidase foi revelada com peróxido de hidrogênio e
tetrametilbenzidina (TMB; LGC Biotecnologia, Brasil) em um volume final de 100 L. A
reação colorimétrica foi interrompida com 50 L de ácido sulfúrico a 2,5 N e a leitura da
densidade óptica foi determinada em espectrofotômetro usando o programa SOFTmax®PRO
4.0 (Life Sciences Edition, Molecular Devices Corporation, EUA) a uma absorbância de 450
nm. Após a leitura, os resultados foram analisados com base na confecção da curva padrão.
As concentrações de cada anticorpo, os pontos da proteína padrão e os componentes do
reagente diluente variavam de acordo com a citocina quantificada. As dosagens foram feitas
em duplicatas. Os resultados foram expressos em pg/mL.
A comparação das médias dos valores normalizados de expressão da proteína entre os
grupos foi realizada por uma ANOVA one-way não paramétrico com 1000 permutações
irrestritas, seguido de comparações de pares com o ajustamento de Bonferroni (Bickel et al.,
2009). Os resultados foram representados em gráficos mostrando os níveis de expressão
média ± erro padrão da média de cada grupo em relação ao grupo controle. Níveis bicaudais
de significância menor ou igual a 0,01, 0,05 e 0,1 foram considerados como altamente
significativo, significativo e sugestivo, respectivamente.
65
5. RESULTADOS
66
5.1. Células THP-1 fagocitam BCG e M. leprae eficientemente
Para avaliar a taxa de fagocitose das micobactérias, primeiramente foi realizada uma
curva temporal, onde células THP-1 foram infectadas com BCG Moreau (MOI 10:1) por 1, 4,
24 e 48 horas. Os resultados foram observados de duas formas diferentes: a partir da
associação, que significa que as bactérias estão aderidas a membrana da célula, e fagocitadas
que significa que estão no citoplasma celular. Na figura 5.1 observa-se que há aumento da
fagocitose de BCG dependente do tempo de infecção. Após 1 hora de infecção, 54% das
bactérias apresentaram-se associadas às células, sendo observado 44% de células contendo
BCG fagocitado (figura 5.1A e B); e após 4 horas, a taxa de associação aumentou para
aproximadamente 81%, sendo 67,5% de células com BCG fagocitado. Em 24 e 48 horas de
infecção, a taxa de associação e de fagocitose, se manteve praticamente a mesma entre os dois
tempos, em torno de 90% e 80% respectivamente, entretanto, a quantidade de BCG por célula
foi maior em 48 do que em 24 horas de infecção, medidos pela intensidade média de
fluorescência (figura 5.1C).
A)








67


B)
C)
Figura 5.1 - Avaliação da taxa de fagocitose de BCG Moreau (MOI 10:1) previamente corado
com PKH2 por células THP-1 em 1, 4, 24 ou 48 horas (n=1). Através da citometria de fluxo
foi medido em (A) o percentual de associação das células, em (B) a diferença entre fagocitose
e adesão, que foi determinada pela adição de azul de Tripan no ensaio de “quenching”, e em
(C), a quantidade de BCG por células foi avaliada através da intensidade média de
fluorescência (IMF).
Com isso, adotou-se o tempo de 24 horas de infecção. A partir daí, foi avaliada a
capacidade das células THP-1 de fagocitarem as diferentes cepas de BCG Danish, Moreau,
Pasteur, e M. leprae viável (MOI 10:1). Na figura 5.2, foi mostrado que acima de 80% das
células fagocitaram tanto BCG, independentemente da cepa, quanto M. leprae, sendo
considerada uma boa taxa de infecção pelas micobactérias, sendo utilizada para experimentos
posteriores de análise de expressão gênica e secreção de citocinas.
68
% fagocitose
100
75
50
25
.l
M
Pa
B
C
G
ep
ra
e
st
eu
r
u
or
ea
M
C
G
B
G
B
C
C
on
tr
ol
e
D
an
is
h
0
Figura 5.2 – Citometria de fluxo para avaliar a taxa de fagocitose de BCG Danish, Moreau e
Pasteur, e M. leprae (MOI 10:1) marcados com PKH2 pelas células THP-1 após 24 horas.
Células não infectadas foram utilizadas como controle. As barras representam média ± desvio
padrão das amostras biológicas (n=3) pertencentes a cada grupo.
5.2. Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
A estratégia inicial do presente estudo foi desenvolvida para avaliar a expressão
gênica diferencial em células THP-1. Assim, experimentos com uma baixa concentração de
bactérias (MOI 2:1) foram realizados, para posteriormente comparar os padrões de expressão
gênica utilizando uma concentração mais alta (MOI 10:1), e observar se haveria maiores
diferenças decorrente de diferentes concentrações bacterianas.
Nesta etapa, foram utilizadas duas técnicas para análise da expressão gênica de células
THP-1 baseadas na amplificação por qRT-PCR (em tempo real), como já mencionada na
justificativa. A diferença entre os métodos é que a primeira técnica realiza o qRT-PCR para
cada gene separadamente em um termociclador (SDS7000 ou Step One, Applied Biosystems,
Life Technologies) com detecção de amplificação em tempo real, enquanto a outra técnica
realiza a amplificação simultânea em sistema multiplex (Biomark, Fluidigm). A metodologia
para qRT-PCR multiplex foi implementada recentemente em nosso laboratório, e foi utilizada
em nosso estudo de expressão gênica utilizando um painel de 48 genes para uma análise
simultânea de 96 amostras. Foram utilizados genes identificados como relacionados à resposta
às doenças micobacterianas, bem como identificados em trabalhos do nosso grupo (Ferreira,
69
2011), e a tabela com os genes utilizados no presente estudo encontra-se em anexo (anexo I),
onde a grande parte dos genes empregados na qRT-PCR estava presente no sistema multiplex
da fluidigm, e a maioria dos resultados obtidos foi semelhante. Com isso, optou-se por
apresentar aqui, apenas os resultados do fluidigm para evitar a redundância.
Antes das análises, foi realizada a seleção dos normalizadores, com base nos dois
métodos utilizados para esta seleção, geNorm e NormFinder. Com isso, foram escolhidos
como genes normalizadores, os três genes constitutivos incluídos no estudo, HPRT1, RPS13 e
RPL13, e esses normalizadores foram utilizados para todas as análises de expressão gênica de
células THP-1.
5.2.1. Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
infectadas pelas cepas de BCG, Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 2:1
Depois de normalizados, os dados foram analisados. Com isso, observamos na figura
5.3, que não houve diferenças significativas na expressão gênica das células THP-1 tanto
controle, quanto infectadas pelas diferentes cepas de BCG, quando utilizada uma baixa
multiplicidade de infecção.
70
71
72
Figura 5.3 – Valores normalizados de expressão gênica por multiplex PCR em tempo real, de
células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI
2:1 por 24 horas. As barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=10)
pertencentes a cada grupo.
Mesmo observando que não houve diferenças na expressão de todos os 48 genes
estudados, algumas citocinas foram dosadas no sobrenadante das culturas das células THP-1.
As citocinas/quimiocinas CCL2, IL-1β, IL-8, TNF e IL-10 foram escolhidas como candidatas
(devido a importância descrita em diferentes modelos de infecção micobacteriana)
(Yamamura et al., 1991; Suzuki et al., 1993; Ragno et al., 2001; Kirkaldy et al., 2003;
Murray et al., 2007), para medir seus níveis de produção em sobrenadantes, na tentativa de
correlacionar esses resultados com os níveis de expressão gênica.
Após 24 horas de infecção com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, com MOI
2:1, os níveis de CCL2, IL-1, IL-8, TNF e IL-10 foram dosados nos sobrenadantes das
células THP-1. Foi realizado um ensaio para cada citocina e os resultados foram apresentados
como média ± erro padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo.
Não foram observadas diferenças significativas na secreção de CCL2, IL-1, IL-8 e
TNF pelas células THP-1 tanto controle quanto infectadas com qualquer uma das cepas de
BCG (figura 5.4), podendo ser correlacionados com os resultados de expressão gênica destas
citocinas. Já os níveis de IL-10, não foram detectáveis nestas células.
73
Figura 5.4 – Níveis de CCL2, IL-1, TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1
controle e infectadas com BCG Danish, Moreau e Pasteur (MOI 2:1) por 24 horas. As barras
representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=5) pertencente a cada grupo. Os
níveis de IL-10 não foram detectáveis.
5.2.2 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1
Por não terem sido observadas diferenças significativas na expressão gênica de células
THP-1 infectadas com diferentes cepas de BCG, foram realizadas infecções, agora utilizando
apenas o BCG Moreau, que é a cepa utilizada na vacinação no Brasil, e M. leprae em um
MOI 2:1.
Depois de normalizados, os dados foram analisados e foi observado que alguns dos
genes foram diferencialmente expressos (figura 5.5). As quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4,
CCL7 e IL-8 foram reguladas negativamente em células THP-1 infectadas com M. leprae em
relação as célula infectadas com BCG Moreau e controle. Também foi observado uma
diminuição da expressão das citocinas IL-1β e IL-6, bem como de SOD2 e TNFSF15 em
células infectadas com M. leprae.
74
75
76
Figura 5.5 – Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e
infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1 por 24 horas. As barras representam
média ± erro padrão das amostras biológicas (n=6) pertencente a cada grupo. Níveis de
significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados
como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.
Após 24 horas de infecção com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1, foram dosados
os níveis de CCL2, IL-1, IL-8, TNF e IL-10 em sobrenadantes das células THP-1. Foi
realizado um ensaio para cada citocina e os resultados foram apresentados como média ± erro
padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo
Não foram observadas diferenças significantes na secreção de CCL2, IL-1, IL-8 e
77
TNF pelas células THP-1 (figura 5.6). Embora não tenha sido significante, foi observada uma
redução na produção de CCL2 nas células infectadas com M. leprae, podendo ser
correlacionado com o resultado observado na expressão gênica para esta citocina, enquanto a
secreção das outras citocinas não foi correlacionada com os resultados da expressão destes
genes. Os níveis de IL-10 não foram detectáveis nestas células.
Figura 5.6 – Níveis de CCL2, IL-1, TNF e IL-8 (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1
controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae (MOI 2:1) por 24 horas. As barras
representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=4) pertencente a cada grupo. Os
níveis de IL-10 não foram detectáveis.
5.2.3 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
infectadas pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1
Já que não foram observadas diferenças significantes na expressão gênica de células
THP-1 infectadas com qualquer uma das cepas utilizando uma MOI baixa (2:1), a
multiplicidade de infecção foi aumentada para 10:1.
Após a normalização, os dados foram analisados. Mesmo utilizando uma MOI maior
(10:1), não foram observadas diferenças significantes na expressão dos genes estudados nas
células THP-1, tanto controle quanto infectadas pelas diferentes cepas de BCG (figura 5.7).
78
79
80
Figuras 5.7 – Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e
infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1 por 24 horas. As
barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=5) pertencente a cada
grupo
Foram dosados os níveis de CCL2, IL-8, TNF e IL-10 em sobrenadantes de células
THP-1 após 24 horas de infecção com BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1. Foi
realizado um ensaio para cada citocina e os resultados foram apresentados como média ± erro
padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo.
Foi observado um aumento significativo na secreção de TNF nas células THP-1
81
infectadas com BCG Moreau em relação ao controle, porém não foi observada nenhuma
diferença na secreção destas citocinas entre as células infectadas (figura 5.8). Já os níveis de
IL-10, mesmo utilizando uma MOI mais alta, continuaram não sendo detectáveis nestas
células.
Figura 5.8 – Níveis de CCL2, IL-8 e TNF (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1 controle
e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur (MOI 10:1) por 24 horas. As
barras representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=6) pertencente a cada
grupo. Os níveis de IL-10 não foram detectáveis. Níveis de significância bi-caudais inferiores
ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante,
significante e sugestivo, respectivamente.
5.2.4 Diferenças na expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1
Mesmo utilizando uma MOI maior (10:1), não foram observadas diferenças
significantes na expressão de células THP-1 infectadas com as diferentes cepas de BCG. Com
isso, foram realizadas infecções das células utilizando apenas a BCG Moreau e M. leprae em
uma MOI 10:1.
Depois de normalizados, os dados foram analisados e foi observado que não houve
diferenças significantes na expressão gênica das células THP-1, tanto controle quanto
infectadas pelo BCG Moreau e M. leprae, utilizando uma MOI 10:1 (figura 5.9). Acredita-se
que a grande variabilidade observada na expressão gênica ao utilizar uma MOI 10:1, tenha
82
sido devido ao baixo número de replicatas biológicas.
83
84
Figura 5.9 – Valores normalizados de expressão gênica de células THP-1 controle e
infectadas com a cepa de BCG Moreau e M. leprae, em MOI 10:1 por 24 horas. As barras
representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=3) pertencente a cada grupo
Após 24 horas de infecção com BCG Moreau e M. leprae com MOI 10:1, foram
dosados os níveis de CCL2, IL-8, TNF e IL-10 em sobrenadantes das células THP-1. Foi
realizado um ensaio para cada citocina e os resultados foram apresentados como média ± erro
padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo.
Não foram observadas diferenças nos níveis de IL-8 em sobrenadantes de células
THP-1 infectadas com BCG e M. leprae (figura 5.10), já os níveis de CCL2 parecem ter tido
85
uma diminuição nas células infectadas com M. leprae, o que não foi correlacionado com os
resultados de expressão de CCL2 em MOI 10:1, porém correlacionou com os resultados
obtidos em MOI 2:1. Entretanto, foi observado um aumento significativo na secreção de TNF
em células infectadas com BCG Moreau em relação às células controle ou infectadas com M.
leprae, o qual não foi correlacionado com os resultados de expressão gênica. Já os níveis de
IL-10, mesmo utilizando um MOI mais alto, continuaram não sendo detectáveis nestas células.
Figura 5.10 - Níveis de CCL2, IL-8 e TNF (pg/ml) em sobrenadante de células THP-1
controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1 por 24 horas. As barras
representam média ± erro padrão das amostras biológicas (n=3) pertencente a cada grupo. Os
níveis de IL-10 não foram detectáveis neste experimento. Níveis de significância bi-caudais
inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente
significante, significante e sugestivo, respectivamente.
5.3. Influência da variabilidade do hospedeiro na secreção de citocinas
Como não foram observadas grandes diferenças na secreção das citocinas estudadas
pelas células THP-1 infectadas com as diferentes cepas de BCG, foram dosados níveis de
citocinas em sobrenadante de PBMC de indivíduos saudáveis para investigar se a
variabilidade do hospedeiro poderia influenciar na secreção destas citocinas. Foram dosados
níveis de IL-8 e TNF após 24 horas, e IL-10 após 72 horas de infecção pelas diferentes cepas
de BCG (MOI 10:1) em PBMC. Foi realizado um ensaio para cada citocina e os resultados
foram apresentados como média ± erro padrão das amostras biológicas pertencente a cada
grupo (figura 5.11). Apesar do aumento da secreção das citocinas nas células infectadas, não
86
foram observadas diferenças significativas na secreção de IL-8 e IL-10 entre PBMC
infectadas com as diferentes cepas de BCG. No entanto, foi observado um aumento
significativo nos níveis de TNF em PBMC infectada com BCG Moreau em comparação com
as células infectadas com BCG Danish e BCG Pasteur, sugerindo uma interação especieespecifica, que leva a uma resposta diferencial do hospedeiro frente a cepa de BCG Moreau.
Figura 5.11 – Níveis de IL-8, TNF e IL-10 (pg/ml) em sobrenadante de células PBMC
infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur, em MOI 10:1 por 24 (para IL-8 e
TNF) e 72 (para IL-10) horas. Com BCG Danish foi utilizado um n=18, 15 e 16; com BCG
Moreau, um n=19, 16 e 16; com BCG Pasteur, um n=16, 15 e 15; para IL-8, TNF e IL-10,
respectivamente. O box - e strip-plot representa a distância interquartílica e mediana das
amostras biológicas pertencente a cada grupo. A expressão de TNF foi significativamente
aumentada (p<0,01) em PBMC infectada com BCG Moreau.
5.4. O logaritmo da razão TNF/IL-10 (log(TNF/IL-10)) foi ligeiramente aumentado em
PBMC infectada com BCG Moreau
Já foi mostrado que uma razão TNF/IL-10 alta está relacionado com a proteção à
hanseníase (Lima et al., 2000). Com isso, foi avaliado o logarítmo da razão TNF/IL-10 em
PBMC infectadas com as diferentes cepas de BCG. Apesar de não ter sido significante, foi
observado um aumento do log(TNF/IL-10) em células infectadas com BCG Moreau em
relação às células infectadas com BCG Danish ou BCG Pasteur, que por sua vez,
87
apresentaram uma diminuição significativa em relação às células controle (figura 5.12).
2.5
*
*
log (TNF/IL-10)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
Controle
Danish
Moreau
Pasteur
Figura 5.12 – Avaliação do logaritmo da razão TNF/IL-10 em PBMC controle e infectadas
com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 10:1 por 24 (para TNF) e 72 (para
IL-10) horas. O strip-plot representa a mediana das amostras biológicas pertencente a cada
grupo. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x)
foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.
5.5. Influência dos SNPs TNF -308 G>A, IL-10 -819 C>T e TLR1 743 A>G na secreção
de TNF e IL-10, e no log(TNF/IL-10)
DNA dos indivíduos doadores do sangue utilizado nos ensaios de secreção de
citocinas foi utilizado para genotipagem. Assim, 22 indivíduos saudáveis foram genotipados
para os polimorfismos TNF -308 G>A (rs1800629), IL-10 -819 C>T (rs1800871) e TLR1 743
A>G (rs4833095). Primeiramente foi investigada a influência do SNP rs1800629 na secreção
de TNF e IL-10 em sobrenadante de PBMC dos indivíduos saudáveis infectados com as
diferentes cepas de BCG, bem como no log(TNF/IL-10). Para isso, os indivíduos foram
agrupados pela presença ou ausência do alelo A. Apesar de ter sido observado um aumento
significante nos níveis de TNF em PBMC infectada com BCG Moreau (figura 5.12), não foi
observada nenhuma diferença significante na secreção de TNF em relação ao genótipo
estudado (figura 5.13A). Ou seja, o SNP rs1800629 não influenciou na secreção desta citocina,
assim como, também não influenciou na secreção de IL-10 (figura 5.13B). O log(TNF/IL-10)
88
também não foi afetado por esse polimorfismo (figura 5.13C).
A)
12500
TNF (pg/mL)
10000
7500
5000
2500
B)
G
le
tr
o
C
on
C
on
tr
o
le
G
G
A
/A
D
A
an
D
an ish
G
is
G
h
G
M A/A
or
M
ea A
or
u
ea
G
G
u
G
A
Pa
/A
Pa ste A
u
st
eu r G
rG G
A
/A
A
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A
-5
Figura 5.13 – Investigação da influência do polimorfismo genético TNF -308 G>A nos níveis
de secreção de (A) TNF, (B) IL-10 e (C) log(TNF/IL-10). Os indivíduos foram estratificados
pelo genótipo do SNP rs1800629 como sendo homozigotos GG ou carreadores do alelo A
(GA/AA). O strip-plot representa a mediana das amostras biológicas pertencente a cada grupo.
89
Parelelamente, foi investigada a influência do SNP rs1800871 na secreção de TNF e
IL-10 em sobrenadante de PBMC dos indivíduos saudáveis infectados com as diferentes
cepas de BCG, bem como no log(TNF/IL-10). Para isso, os indivíduos foram agrupados pela
presença ou ausência do alelo T. Apesar de não ter sido observada diferença significante na
secreção de IL-10 entre as células infectadas com as cepas de BCG (figura 5.12), notou-se um
agrupamento de baixos, intermediários e altos produtores de IL-10. Entretanto ao investigar a
influência do polimorfismo genético rs1800871 na secreção de IL-10 em PBMC, não foi
observada nenhuma diferença significante na secreção desta citocina, independente da cepa
utilizada e do genótipo estudado (figura 5.14A). Esse polimorfismo também não influenciou
na secreção de TNF (figura 5.14B), bem como não afetou o log(TNF/IL-10) (figura 5.14C).
A)
IL-10 (pg/mL)
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-5
Figura 5.14 – Investigação da influência do polimorfismo genético IL10 -819 C>T nos níveis
de secreção de (A) IL-10, (B) TNF e (C) log(TNF/IL-10). Os indivíduos foram estratificados
pelo genótipo do SNP rs1800871 como sendo homozigotos CC ou carreadores do alelo T
(CT/TT). O strip-plot representa a mediana das amostras biológicas pertencente a cada grupo.
Posteriormente, foi investigada a influência do SNP rs4833095 presente no gene de
TLR1 na secreção de TNF e IL-10 em sobrenadante de PBMC infectados com as diferentes
cepas de BCG, bem como no log(TNF/IL-10). Para isso, os indivíduos foram agrupados pela
presença ou ausência do alelo G, e não foi observada nenhuma diferença significante na
secreção de TNF e IL-10 em PBMC, independente da cepa utilizada e do genótipo estudado
(figura 5.15A e B). Entretanto, esse polimorfismo afetou o log(TNF/IL-10) (figura 5.15C),
sendo que os indivíduos carreadores do alelo G tiveram uma diminuição significante no
log(TNF/IL-10) quando as células foram infectadas com BCG Moreau, sugerindo um padrão
de ativação da resposta imune dependente do genótipo do hospedeiro.
A)
12500
7500
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2500
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-5
Figura 5.15 – Investigação da influência do polimorfismo genético TLR1 743 A>G nos níveis
de secreção de (A) IL-10, (B) TNF e (C) log(TNF/IL-10). Os indivíduos foram estratificados
pelo genótipo do SNP rs433095 como sendo homozigotos AA ou carreadores do alelo G
(AG/GG). Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x)
foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente. O
strip-plot representa a mediana das amostras biológicas pertencente a cada grupo.
5.6. Estudos de expressão diferencial de genes por microarranjo de DNA em células
THP-1 infectadas por M. leprae e BCG
Nesta etapa, foram utilizadas amostras de células THP-1 controle, de células
infectadas com BCG Moreau e de células infectadas com M. leprae, em um total de três
92
replicatas biológicas. Após as hibridações e estabelecimento de critérios de qualidade, os
dados filtrados e normalizados foram utilizados na inferência estatística, utilizando como
critério de seleção p-valor (não ajustado)  0,005, onde foi encontrado um número restrito de
genes (n=12) como diferencialmente expressos (tabela 5.1).
Tabela 5.1: Genes diferencialmente expressos (p-valor  0,005) entre células THP-1 em três
condições. Primeira condição: células infectadas com BCG Moreau x células controle;
segunda condição: células infectadas com M. leprae x células controle; e terceira condição:
células infectadas com M. leprae x células infectadas com BCG Moreau; por 24 horas.
Condição de infecção Símbolo do gene
Primeira condição
Descrição do gene
logFC
p-valor
TMEM101
Transmembrane protein 101
-1,871
0,00165
C21orf126
Chromosome 21 open reading frame 126
1,697
0,00482
Segunda condição
TMEM101
Transmembrane protein 101
-1,201
0,00334
Terceira condição
LGALS1
Lectin, galactoside-binding, soluble-1
-1,591
0,00041
Calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 3
-1,380
0,00245
Glucose-6-phosphate isomerase
-1,373
0,00331
Arginyl aminopeptidase (aminopeptidase B)
-1,370
0,00162
Sem anotação até o momento
-1,224
0,00431
Transcription elongation factor A protein-like 5
-1,202
0,00361
Zinc finger, DHHC-type containing 22
-1,107
0,00287
Random|corinne|150275298|662356677|709
-1,035
0,00168
SFT2 domain containing 2
-0,939
0,00450
Mesoderm posterior protein 2
-0,907
0,00314
CACNA2D3
GPI
RNPEP
suid=1417524
TCEAL5
ZDHHC22
Random_709
SFT2D2
MESP2
logFC: log fold change
Nesta lista de genes, foi observado que a expressão de uma proteína transmembranar,
TMEM101, se encontrava reprimida nas células infectadas com as micobactérias (tanto por M.
leprae quanto BCG Moreau) em relação às células THP-1 controle (tabela 5). Este gene está
relacionado com a regulação positiva da cascata I-kappaB quinase/NF-kappaB. Em células
infectadas com BCG Moreau foi observado que a expressão do gene C21orf126, localizado
no braço longo do cromossomo 21, estava induzida em relação às células controle.
Na comparação entre as cepas infectadas com as micobactérias, encontrou-se 9 genes
diferencialmente expressos (tabela 5). Dessa lista, destacou-se a LGALS1, reprimida em
93
células infectadas com M. leprae, e está associada na modulação de interações célula-célula e
célula-matriz (Paclik et al., 2011). Outro gene reprimido foi o GPI, pertencente à família GPI,
(Malaisse et al., 1990). Também foi observado repressão na expressão de RNPEP, uma
exopeptidase que selectivamente remove resíduos de arginina e/ou lisina a partir do Nterminal de vários substratos de peptídeos (Foulon et al., 1999).
5.7. Diferenças no perfil de expressão gênica de amostras de biopsias de nervo humano
Após a identificação de genes regulados em estudos de infecção de células THP-1 por
M. leprae, decidiu-se investigar, in vivo, a expressão gênica em amostras de biópsias de
nervos de pacientes com suspeita de hanseníase. Portanto, nesta amostra de validação temos
35 pacientes que tiveram a confirmação diagnóstica de hanseníase (que envolve resultados de
PCR para DNA de M. leprae, análise sorológica, histopatologia e clínica) e 50 pacientes que
apresentam outra neuropatia periférica, com exclusão de hanseníase (além destes, onze
pacientes ainda não tinham sido diagnosticados e não foram incluídos na análise). Assim,
foram denominados hansenianos e não hansenianos, respectivamente. Com isso, poderíamos
validar os genes observados como diferencialmente expressos no modelo de infecção in vitro.
Portanto como explicado acima, nesta etapa, foram utilizadas amostras de cDNA
provenientes de biópsias de nervo de pacientes hansenianos (L) e não hansenianos (NL). Os
normalizadores utilizados neste ensaio foram GAPDH, RPS13 e RPL13. Depois de
normalizados, os dados foram analisados.
Foram observados vários genes significativamente regulados (figura 5.16). Os genes
BAD, CCL2, CCL3, CCL4, IL-1β, IL-10, IL-12, SOD2, e os mitocondriais mt_ATP6,
mt_COX, mt_CYB, mt_ND1, mt_ND3 e mt_ND5 foram regulados negativamente em
amostras de biópsias de pacientes hansenianos. Enquanto, E3-Ub-ligase e LDLR foram
regulados positivamente nestas amostras.
Além disso, apesar de não ter sido significante, foi observada uma leve diminuição na
expressão da maioria dos outros genes nas amostras de biopsias de pacientes hansenianos
(figura 5.16). São estes: CCL5, CCL7, LPLR, LRRK2, MIF, NOD2, OASL, PINK1 PPDRJ,
SET1DB, TNF, ZNF79 e ZNRF1.
94
95
96
Figura 5.16 - Valores normalizados da expressão gênica de biopsias de nervo de pacientes
hansenianos (L) (n=35) e não hansenianos (NL) (n=50). As barras representam média ± erro
padrão das amostras biológicas pertencente a cada grupo. Níveis de significância bi-caudais
inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente
significante, significante e sugestivo, respectivamente.
97
6. DISCUSSÃO
98
Neste trabalho, primeiramente optou-se por utilizar o sistema de células THP-1, pois já
foi demonstrado que estas células são um sistema bem estabelecido para o estudo do
crescimento e persistência de micobactérias (Paul et al., 1996; Oliveira et al., 2001; Theus et
al., 2004), e tem se mostrado um bom modelo para macrófagos derivados de monócitos
diferenciados in vitro. Como o objetivo principal deste estudo era observar possíveis
diferenças na resposta imune após infecção por diferentes cepas de BCG e M. leprae, se fazia
interessante a utilização de THP-1, devido a sua vantagem de ter sido obtida de um único
doador, não apresentando variabilidade do indivíduo na função do macrófago (Schwende et
al., 1996). Entretanto, há a necessidade de uma ativação prévia para que os monócitos se
diferenciem em células tipo macrófago, principalmente quando se avalia a produção de
citocinas como TNF, que foi um dos genes candidatos importantes de nosso estudo. Células
THP-1 indiferenciadas não produzem quantidades detectáveis de TNF, mesmo quando
estimuladas, por exemplo, com LPS (Schwende et al., 1996; Takashiba et al., 1999) ou com
M. leprae (Oliveira et al., 2001). Por outro lado, as células THP-1 diferenciadas por PMA
secretam TNF. O PMA é um dos ativadores químicos mais comumente utilizados para induzir
esse estado de diferenciação, porém o PMA não é produzido endogenamente pelo hospedeiro,
e é considerado tóxico para humanos in vivo (revisado por Estrella et al., 2011). Com isso,
alguns trabalhos utilizaram outros agentes para ativação de THP-1 como, por exemplo, ácido
retinóico e a vitamina D3, que já se mostrou estar associada à resposta imune contra uma
infecção por M. tb. (revisado por Estrella et al., 2011). Em estudos em nosso laboratório, foi
observado que células THP-1 diferenciadas com PMA mantiveram sua viabilidade em torno
de 80% e, por isso, mantivemos como modelo para essa parte do estudo (Toledo-Pinto,
comunicação pessoal).
Entretanto, vale a pena ressaltar que esta linhagem de células THP-1 pode não induzir
o mesmo padrão de expressão gênica que é observado em macrófagos in vivo, como no caso
de macrófagos alveolares, ou macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico (MDM)
(Monahan et al., 2001), e que diferentes linhagens celulares utilizadas para avaliar a interação
macrófagos-micobactérias também podem influenciar a produção de proteínas, um dos
motivos pelos quais também foi incluído, em um segundo momento, neste trabalho as células
mononucleares de sangue periférico.
Já é conhecido que com a diferenciação de células THP-1, elas passam a expressar
marcadores de superfície associados à diferenciação dos macrófagos, como CD14, e têm sua
capacidade fagocítica aumentada (Schwende et al., 1996). Em experimentos realizados em
nosso laboratório, foi observado um aumento significativo de CD14 em células THP-1
99
diferenciadas quando infectadas com BCG, o que está de acordo com Sendide e colaboradores
(2005), que mostrou que CD14 desempenha um papel importante na fagocitose de BCG por
estas células. Em ensaios de fagocitose realizados no presente estudo, foi observado que
acima de 80% das células THP-1 diferenciadas fagocitaram micobactérias e que o pico de
fagocitose foi em torno de 24 h, não havendo diferenças entre a taxa de fagocitose das três
cepas de BCG utilizadas no estudo, nem de M. leprae. Entretanto, foi observado que em 48 h,
houve uma maior quantidade de BCG por células do que em 24 h, porém esse tempo não foi
utilizado em experimentos posteriores. Deste modo, foram realizados os ensaios de expressão
gênica e dosagem de citocinas utilizando as cepas de BCG e M. leprae escolhendo-se o tempo
de 24 h para as análises, e acredita-se que as diferenças observadas a partir daí, não devem ser
devido a diferenças na fagocitose dessas micobactérias pelas células THP-1. Porém, alguns
trabalhos utilizaram tempos diferentes em estudos da expressão gênica em THP-1, como por
exemplo, Ragno e colaboradores que identificaram mudanças na expressão gênica em tempos
mais precoces de infecção (6 e 12 h) por M. tb. Enquanto, Hasan e colaboradores (2006a)
observaram diferenças na expressão gênica entre células THP-1 tanto em 18 quanto em 48
horas de infecção por M. leprae ou BCG.
As cepas de BCG possuem diferenças genéticas que contribuem para as propriedades
variáveis observadas no que diz respeito a eficácia protetora entre as cepas de BCG quando
utilizadas na vacinação em países distintos. Acredita-se que um dos principais fatores que
contribuem para essa grande variabilidade é a imunidade protetora distinta adquirida após a
vacinação. Entretanto, mais recentemente tem sido sugerido que fatores genéticos do
hospedeiro estão associados com a resposta imune à vacinação por BCG, onde Di
Pietrantonio e colaboradores (2011) empregando duas linhagens distintas de camundongo,
com três cepas diferentes de BCG (Russia, Japan e Pasteur), mostraram que cada cepa
apresentou habilidades específicas para o crescimento nos pulmões do hospedeiro, e que essas
diferenças dependiam também da linhagem de camundongo utilizada. Ainda as diferenças na
expressão de citocinas e quimiocinas observada após infecção por cada cepa de BCG foi mais
proeminente em uma das linhagens de camundongo, sugerindo dependência do background
genético do hospedeiro. Além disso, também já foi mostrado que diferentes cepas de BCG
induzem diferentes níveis de proteção contra TB e hanseníase, além de variar nos efeitos
adversos observados nos indivíduos (Liu et al., 2009).
A cepa de BCG Moreau é considerada uma das mais imunogênicas atualmente em uso.
Entretanto, o Brasil é um dos únicos países do mundo que utilizam esta cepa na vacinação, e
consequentemente, ainda são observados poucos estudos a respeito desta cepa, principalmente
100
se comparado com trabalhos que utilizam a cepa de BCG Pasteur. Só recentemente a cepa de
BCG Moreau teve seu genoma seqüenciado (Gomes et al., 2011). Além do mais, estudos de
análises do perfil de expressão gênica em células hospedeiras utilizando BCG Moreau são
escassos, e ainda, uma comparação do perfil de expressão com M. leprae viável é inédita na
literatura científica mundial.
BCG Moreau difere das cepas Danish e Pasteur, pois é a única das cepas estudadas
aqui que possui a região RD2 (Mahairas et al., 1996) observada também em outras
micobactérias, como M. bovis e M. tb. Essa região é conhecida por conter o gene mpt64 que
codifica uma proteína altamente imunogênica, MPT64. Sua função ainda não é bem
conhecida, porém já se sabe que ela tem um papel na estimulação do sistema imune (revisado
por Kozak & Behr, 2011). Kozak & Behr demonstraram que a perda da RD2 contribuiu para
uma vacina menos imunogênica, porém isso não se refletiu de uma maneira evidente na
eficácia protetora da vacina contra TB em murino. Essa proteína foi recentemente utilizada na
construção de uma cepa de BCG Pasteur recombinante (Sali et al., 2010), onde a expressão da
proteína quimera PE-MPT64 na superfície do BCG, aumentou sua imunogenicidade. Além
disso, este BCG recombinante induziu uma proteção melhor contra TB em relação a cepa
BCG Pasteur e até mesmo em relação a outras cepas de BCG recombinante expressando este
mesmo antígeno, porém localizado em diferentes compartimentos celulares. Com isso
acredita-se que, pelo menos em parte, o aumento da imunogenicidade descrita nas cepas
antigas de BCG, deve-se a presença dessa proteína, que poderia ser utilizada como adjuvante
com outras cepas de BCG utilizadas na vacinação em outros países.
Além disso, cada uma destas cepas não apresenta outras regiões de diferenças
específicas. A cepa de BCG Danish possui uma deleção chamada RD Denmark/Glaxo
(Mostowy et al., 2003), uma região de 726 pb que afeta a Rv1809, que corresponde a uma
proteína da família PPE e a Rv1810, que corresponde a uma proteína hipotética conservada. A
cepa de BCG Pasteur não possui a chamada RD14 (Behr et al., 1999), uma região de 9073 pb
que afeta a Rv1766 à Rv1773c (Mostowy et al., 2003), sendo a Rv1768 correspondente a uma
proteína da família PE-PGRS, a Rv1771 corresponde a uma gulono-lactona desidrogenase
recentemente descrita e, os outros genes que correspondem a ORFs ainda não caracterizadas
(Alexander & Behr, 2007). A Rv1773 truncada explica a regulação positiva da transcrição do
operon Rv1774-Rv1775, observada apenas no BCG Pasteur. E a cepa de BCG Moreau não
possui a RD16 (Behr et al., 1999; Behr et al., 2002), uma região de 7068 pb que afeta a
Rv3400 à Rv3405c (Mostowy et al., 2003), onde essa Rv3405c corresponderia a uma possível
proteína de regulação transcricional. Uma hipótese interessante seria sugerir que esse fator
101
transcricional poderia ter um papel na regulação da expressão de alguns genes que passariam
a ser mais expressos nessa cepa em comparação com BCG Danish e BCG Pasteur, por
exemplo. E isso poderia também ajudar a explicar a maior imunogenicidade da cepa de BCG
Moreau. Mesmo assim, estudos de transcriptomica ou proteômica comparativa das cepas de
BCG (verificando RNAm e proteínas da micobactéria) em células infectadas no mesmo
modelo seriam necessários para confirmar essa hipótese.
De qualquer forma, no presente estudo, os resultados observados utilizando as três
cepas de BCG (Danish, Moreau e Pasteur) conhecidamente diferentes entre si, sugerem uma
interação hospedeiro-patógeno, que estaria sendo modulada pelo genótipo do hospedeiro, e
que seria dependente também da cepa de BCG (BCG Moreau). E ainda, a infecção por M.
leprae parece ter um efeito supressor em macrófagos in vitro maior que a infecção por BCG,
o que se acredita estar associado à regulação negativa da resposta imune do hospedeiro.
Ambos os resultados serão explorados adiante.
6.1. Análise do perfil de expressão gênica e secreção de citocinas de células THP-1
e PBMC frente à infecção com BCG e M. leprae
Foram
investigadas
possíveis
diferenças
na
expressão
e/ou
secreção
de
citocinas/quimiocinas em células infectadas com diferentes cepas de BCG e M. leprae. Para
isso, foi utilizada a linhagem celular THP-1, que representa um único hospedeiro, bem como a
influência de vários hospedeiros (PBMC de indivíduos saudáveis) na secreção destas
citocinas/quimiocinas.
Para a análise do perfil de expressão gênica, além da técnica de microarranjo de DNA,
foram utilizadas duas outras metodologias. Uma delas foi o qRT-PCR, que é a metodologia
mais utilizada para a quantificação da expressão gênica e é um dos métodos utilizados para
validação de experimentos de microarranjo. A outra metodologia foi o multiplex PCR em
tempo real através do sistema Biomark de microfluídica (Fluidigm), que foi colocada em
prática no nosso laboratório recentemente, e possibilitou a amplificação simultânea de 96
amostras utilizando 48 oligonucleotídeos, empregando uma quantidade muito menor de cada
amostra, de reagentes e de tempo, quando comparada a RT-PCR em tempo real. Porém, um
dos problemas do multiplex PCR em tempo real é o grande número de pares de
oligonucleotídeos específicos que são adicionados na mesma reação, possibilitando o
surgimento de produtos inespecíficos, podendo comprometer o rendimento da amplificação
102
(Dahl et al., 2007; Fredriksson et al., 2007). Entretanto, com uma única reação pode-se
analisar simultaneamente várias amostras com vários genes, diminuindo o viés experimental
relativo a eficiências distintas em múltiplas reações de PCR. Essa metodologia foi pela
primeira vez empregada em estudos de expressão gênica de células humanas infectadas com
micobactérias e, com isso, foram observadas algumas diferenças que serão discutidas adiante.
No presente estudo, decidiu-se começar a analisar diferenças na expressão gênica
utilizando cepas de BCG em uma baixa multiplicidade de infeção (MOI 2:1) que deveria se
assemelhar mais com o que acontece durante infecções in vivo. Existem vários outros
trabalhos que também optaram por utilizar uma baixa MOI. Por exemplo, Almeida e
colaboradores (2009) observaram a indução da expressão de PPAR-γ (do inglês, peroxisome
proliferator-activated receptor γ) em macrófagos infectados com BCG em MOI 1:1. Também
utilizando MOI 1:1, Vergara e colaboradores (2009) observaram a viabilidade de macrófagos
infectados por BCG frente a componentes de uma nova droga em desenvolvimento contra M.
tb. E ainda, com um MOI de 3:1, Méndez-Samperio e colaboradores (2010) observaram
aumento na expressão de CCL2 em células THP-1 diferenciadas e infectadas com BCG.
Entretanto, nenhum destes trabalhos exemplificados observou diferenças na expressão gênica
frente à infecção por diferentes cepas de BCG.
Com isso, no presente estudo, ao utilizar uma MOI baixa não observamos diferenças
na expressão gênica entre as células THP-1 infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau
e Pasteur. Como não houve diferenças ao utilizar as três cepas de BCG, apenas a cepa BCG
Moreau foi selecionada para comparar com a expressão gênica de células THP-1 infectadas
com M. leprae. Deste modo, foi observado que a expressão das quimiocinas, CCL2, CCL3,
CCL4, CCL7 e IL-8 foi regulada negativamente nas células infectadas com M. leprae em
relação às célula infectadas com BCG Moreau, o que foi correlacionado com o resultado de
secreção de CCL2 em sobrenadante de células THP-1, que apesar de não significante,
encontraca-se diminuida na infecção com M. leprae. Já foi demonstrado que CCL2, CCL3,
CCL4, CCL7 possuem habilidade de atrair e ativar principalmente monócitos, células T e
outros tipos celulares, como células NK (do inglês, natural killer) e células dendríticas,
enquanto IL-8 pode atrair e ativar principalmente neutrófilos, mas também algumas células T
e células NK (Méndez-Samperio et al., 2003; Luo et al., 2007). Com isso, sugere-se um papel
das quimiocinas na modulação da resposta imune protetora contra infecção por micobactérias,
indicando sua grande importância.
No presente estudo foi identificada uma produção aumentada de IL-8 em PBMC
infectada com BCG (independente da cepa), em acordo com trabalhos de Méndez-Samperio e
103
colaboradores (2001 e 2002). A secreção de IL-8 contribui para o início da resposta do
hospedeiro contra infecções de micobactérias, participando do aumento da inflamação local e
recrutamento de monócitos, linfócitos e neutrófilos. Embora tenha sido observado um
aumento na expressão de IL-8 em biopsia de pele de pacientes hansenianos (Kirkaldy et al.,
2003; Hussan et al., 2004), em nosso estudo não foram observadas diferenças na expressão
desta quimiocina em biopsia de nervo de pacientes com hanseníase, entretanto, foi observada
a diminuição na expressão gênica de IL-8 por M. leprae em células THP-1. Acredita-se que
baixos níveis desta quimiocina em uma situação de infecção in vivo estariam contribuindo
para a diminuição da migração celular durante a infecção pela micobactéria e,
consequentemente, com a diminuição da inflamação, sugerindo um sucesso infectivo nos
eventos mais precoces da interação de M. leprae:célula hospedeira. Mesmo assim, os dados
de expressão gênica não foram corroborados pelos níveis de secreção desta citocina, onde não
foi observada nenhuma diferença na secreção de IL-8 em células infectadas com BCG e M.
leprae, o que pode estar relacionado com a cinética de tempo escolhido para a análise de
expresão de mRNA e secreção de proteína.
Alguns trabalhos já mostraram o aumento da secreção das quimiocinas CCL2 (Luo et
al., 2007), CCL3, CCL4 e CCL5 (Méndez-Samperio et al., 2003) após infecção de PBMC por
BCG. Enquanto, Méndez-Samperio e colaboradores (2010) observaram aumento na
expressão/secreção de CCL2 por células THP-1. Com isso, sugere-se que a habilidade do
BCG em aumentar a produção de quimiocinas em células humanas estaria relacionada a um
aumento da resposta imune contra infecções micobacterianas. Entretanto, em nosso estudo
utilizando células THP-1, não foi observado o aumento da expressão destas quimiocinas, o
que poderia estar relacionado ao tipo celular utilizado e/ou diferenças no tempo de infecção.
Também foi observado um aumento na produção de quimiocinas após infecção de
células tanto por M. tb. (Lin et al., 1998; Kasahara et al., 1998; Ragno et al., 2001), quanto
por M. leprae (Sinsimer et al., 2010) e também em pacientes com hanseníase (Kirkaldy et al.,
2003; Hasan et al., 2006b). Entretanto, ao mesmo tempo em que Hasan e colaboradores
observaram um aumento na produção de CCL2 em soro de pacientes hansenianos, estes
autores observaram uma diminuição dos níveis de CCL2 em monócitos destes mesmos
pacientes em cultura in vitro infectados ou não por M. leprae; com isso, acredita-se que outros
tipos celulares além de monócitos, estariam contribuindo para a elevada produção desta
quimiocina in vivo. Estes dados estariam de acordo com a diminuição da expressão/secreção
de CCL2 que foi apresentada para as infecções por M. leprae em nosso estudo, e que foi
confirmada em biopsias de pacientes hansenianos. A baixa expressão/produção das
104
quimiocinas em células infectadas por M. leprae, poderia ser um indicativo de que células
THP-1 infectadas com esta micobactéria seriam capazes de evitar a ativação da resposta
quimiotática do hospedeiro, e assim, escapar de uma destruição pelo sistema imune do
hospedeiro, contribuindo para o estabelecimento da infecção intracelular e, como
consequência, a disseminação da doença. Infelizmente, não foi possível realizar infecção de
PBMC com M. leprae para uma comprovação definitiva da produção de CCL2 e IL-8, pois o
desenho experimental proposto se utiliza de M. leprae vivo, e, como não há uma farta
disponibilidade da micobactéria e os experimentos com PBMC são individualizados há
dificuldade de realizar ensaios de rotina com células isoladas a partir de sangue fresco.
Já foi mostrado que M. leprae é um pobre ativador de macrófagos e células dendríticas
in vitro, principalmente comparado com M. tb. e BCG (Suzuki et al., 1993; Murray et al.,
2007; Sinsimer et al., 2010), onde foi observado que BCG e M. tb. são melhores indutores de
IL-1 e TNF, e IL-6 (no caso de BCG) nestas células do que M. leprae, o que está de acordo
com nossos resultados de expressão de IL-1 e IL-6 que mostraram diminuição em células
THP-1 diferenciadas infectadas com M. leprae. IL-1 e IL-6 são citocinas pró-inflamatórias
que participam no controle de infecção aguda por micobactérias, e a diminuição destas
citocinas por M. leprae pode sugerir que a micobactéria esteja contribuindo para o
favorecimento da sua infecção, por evitar a reação do hospedeiro.
Estudos têm mostrado que PGL-1, antígeno principal e específico de M. leprae,
purificado da parede celular da micobactéria, possui um efeito modulador na indução de
citocinas por células humanas. Foi observado que PGL-1 purificado adicionado sozinho a
cultura de monócitos levou a uma pobre indução da produção de TNF (Silva et al., 1993;
Charlab et al., 2001; Dhungel et al., 2008; Manca et al., 2012), IL-6 (Silva et al., 1993), IL10 (Manca et al., 2012) e IL-1β (Silva et al., 1993; Manca et al., 2012), porém a produção de
TNF foi aumentada quando as células foram infectadas simultaneamente com PGL-1 e M.
leprae obtido a partir de tatu (acreditando-se que o PGL-1 tenha sido parcialmente perdido
durante o processo de purificação da micobactéria) (Charlab et al., 2001; Dhungel et al.,
2008). Entretanto esse aumento na produção de TNF ainda foi significativamente menor
comparado com a infecção por M. leprae obtido a partir de pata de camundongo, envolvendo
um processo de purificação menos rigoroso, acreditando-se possuir um PGL-1 mais intacto
(Dhungel et al., 2008). Além disso, foi observado que BCG Pasteur recombinante capaz de
sintetizar PGL-1 levou a uma diminuição da secreção de TNF em macrófagos comparado com
BCG Pasteur, apesar do BCG recombinante ter sido fagocitado mais eficientemente (Tabouret
et al., 2010). Ainda, Manca e colaboradores (2012) também utilizando este mesmo BCG
105
recombinante tiveram resultados opostos em monócitos mostrando um aumento na secreção
de TNF, e a possível explicação para essa diferença nos resultados seria atribuída a diferenças
na maturação e diferenciação destas células em cultura (monócitos ou macrófagos). Sendo
assim, acredita-se que PGL-1 possui um papel chave na regulação de citocinas/quimiocinas
em células humanas interferindo na reposta imune à infecção por M. leprae. É possível que o
PGL-1 no M. leprae vivo utilizado em nosso modelo de estudo, mesmo assumindo que uma
parte do PGL-1 tenha se perdido durante a purificação, esteja participando nesse efeito na
diminuição da expressão destas citocinas e quimiocinas contribuindo para evasão da resposta
imune do hospedeiro. Esta controvérsia é interessante, mas no nosso modelo parece que o M.
leprae se assemelha ao BCG recombinante do estudo de Tauboret (2010), pois induz uma
diminuição da expressão de genes associados à ativação da resposta imune protetora.
Além disso, também foi observada uma diminuição na expressão de SOD2 e
TNFSF15 em células THP-1 infectadas com M. leprae. SOD2 (do inglês, superoxide
dismutase 2) é uma enzima metabólica mitocondrial membro da família SOD, que está
envolvida na defesa contra superóxido (O2-) tóxico e outras espécies reativas de oxigênio
(ROS) (Rakkola et al., 2007). Macrófagos ativados produzem O2- tóxico e ROS durante a
fagocitose para destruir patógenos invasores, porém, estes produtos em níveis elevados podem
causar prejuízos ao DNA, proteínas e lipídeos, onde SOD2 atuaria como uma enzima
antioxidante. Rakkola e colaboradores observaram uma expressão elevada desta enzima em
macrófagos após estimulação com ligantes de TLR, sugerindo que SOD2 estaria envolvida na
proteção do macrófago contra estresse oxidativo durante a fagocitose de patógenos. Já foi
observado que a expressão de SOD2 foi estimulada por M. tb. em macrófagos (Thuong et al.,
2008) e por componentes da parede celular de BCG em células dendríticas (Ishii et al., 2005).
Além disso, foi observada a associação deste gene com suscetibilidade à hanseníase (Mira et
al., 2004). No nosso estudo, a diminuição da expressão desse gene observada em células
THP-1 infectadas com M. leprae, e validada in vivo em biópsia de nervo de pacientes
hansenianos confirma a participação do gene na resistência/suscetibilidade ao M. leprae.
Entretanto, a correlação genótipo-fenótipo é difícil de ser realizada com os dados nesse
momento. Estudos com a genotipagem dos pacientes para os SNPs associados à
suscetibilidade à hanseníase deverão ainda ser realizados para verificar os níveis de expressão
de mRNA no nervo. Ainda, devido aos resultados de expressão dos genes mitocondriais,
estudos funcionais para dosagem de produtos de metabolismo oxidativo em células do sangue
periférico de indivíduos genotipados também é uma estratégia interessante.
O gene SOD2 se encontra no cromossomo 6q25, próximo ao gene PARK2, que
106
compartilha um promotor com outro gene, o PARCRG (do inglês, parkin co-regulated gene)
(West et al., 2003), e ambos estão envolvidos no sistema de ubiquitinação. O gene PARK2
codifica uma proteína chamada parkina, uma E3-ubiquitina ligase multifuncional, que além de
participar da via de degradação de proteínas, interage com proteínas do sistema imune como,
TLRs e, ainda interfere na produção de ROS (revisado por Schurr et al., 2006). Também foi
demonstrada uma função anti-apoptótica da parkina, que estaria associada ao controle do
estresse oxidativo causado por ROS, levando à hipótese de que a infecção por M. leprae altere
de alguma maneira a expressão da parkina, o que poderia impedir a apoptose da célula e,
portanto, favorecer a perpetuação do M. leprae no organismo do hospedeiro. Foi observado
que SNPs nos genes PARK2 e PARCRG também estão associados à hanseníase. Dos SNPs
identificados nestes genes, o haplótipo formado apenas pelos polimorfismos das regiões -2599
e rs1040079 (localizados no promotor de PARK2 e PARCRG) mostrou-se bastante
informativo, de modo que a presença do alelo T na região -2599 e do alelo C no SNP
rs1040079 confere uma maior suscetibilidade à doença (Mira et al., 2004). Esses SNPs foram
associados à suscetibilidade à hanseníase em duas populações distintas, vietnamita e brasileira.
O aumento da expressão de outro gene, E3-ubiquitina ligase, foi observado em biópsias de
pacientes hansenianos no presente estudo, e apesar da grande quantidade de enzimas E3ubiquitina ligase identificadas, poderia reforçar a associação da parkina à hanseníase.
Outros genes associados à PARK2 como LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) e
PINK1 (PTEN induced putative kinase 1), também foram incluídos no presente estudo.
LRRK2 é uma proteína citoplasmática que interage diretamente com a parkina e acredita-se
que estaria regulando a atividade ligase de PARK2 (Smith et al., 2005). Já foi identificada
uma associação de LRRK2 com a hanseníase em outros estudos (Zhang et al., 2009; Sun et
al., 2011), onde foi observada que o SNP rs1491938 neste gene mostrou uma forte associação
com a forma multibacilar, mas não com a paucibacilar da doença (Zhang et al., 2009),
entretanto não foi observada nenhuma associação da expressão diferencial de LRRK2 com a
hanseníase no presente estudo. PINK1 é uma proteína mitocondrial com suposta atividade
quinase, e teria um papel na proteção de células contra condições de estresse celular, e
consequentemente contra disfunções mitocondriais e apoptose. A maioria das mutações
identificadas em PINK1 está dentro do domínio quinase, podendo levar a perda da suposta
atividade quinase da proteína, o que afetaria a função das mitocôndrias (Valente et al., 2004).
Além disso, parkina-PINK1 regula o tráfico de mitocôndrias para a região perinuclear para
serem degradadas, indicando a participação destas proteínas na regulação da autofagia de
mitocôndrias danificadas (mitofagia) (Vives-Bauza et al., 2010). Deste modo, semelhanças
107
entre mecanismos de sinalização da autofagia de mitocôndrias e de bactérias intracelulares
(Deretic et al., 2009) reforçam a hipótese de que a parkina, assim como proteínas associadas a
ela, também estariam atuando na autofagia do M. leprae, e mutações nestas proteínas
poderiam proporcionar um ambiente que permita o crescimento da micobactéria. No entanto,
assim como LRRK2, PINK1 não se mostrou diferencialmente expresso em células infectadas
por M. leprae ou em biópsias de nervo de pacientes com hanseníase em nosso estudo.
TNFSF15 (do inglês, tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 15), outro
gene também observado ter sua expressão diminuída em células THP-1 infectadas com M.
leprae, é uma molécula da superfamília do TNF que é expressa em células endoteliais,
macrófagos, células dendríticas, e células T e B (Croft, 2009). Tem sido relatado que o
TNFSF15 tem um papel importante na modulação da resposta imune adaptativa. Este gene,
também conhecido como TL1A, se liga a um receptor pertecente a família de TNF (DR3, do
inglês, death receptor3) e essa interação TNFSF15-DR3 pode resultar em aumento da
proliferação de células T e produção de citocinas (Meylan et al., 2008). A expressão
aumentada de TNFSF15 em lesões de pacientes hansenianos (Sun et al., 2011), e variantes
genéticos nesse gene identificados através de um estudo de associação do genoma completo
(GWAS, do inglês genome-wide association study) (Zhang et al., 2009), mostraram uma
significativa associação à suscetibilidade à hanseníase. Entretanto, esta associação de
TNFSF15 não foi replicada em estudos realizados por Wong e colaboradores (2009), e uma
possibilidade, seria que o efeito de variantes neste gene poderia ser população-específica,
sendo associado à suscetibilidade à hanseníase em chineses, no caso do estudo de Zhang e
colaboradores. Porém, não estaria associado à suscetibilidade à doença em indianos, no caso
do estudo de Wong e colaboradores, e nem em brasileiros (dados não mostrados), indicando a
heterogeneidade da população. Os dados de expressão em nervos de pacientes não
confirmaram os ensaios de infecção de M. leprae in vitro utilizando a linhagem THP-1. A
discrepância dos resultados (que também aparecem nos estudos genéticos da literatura) nos
impede de indicar mais claramente como o TNFSF15 participaria na suscetibilidade à
hanseníase.
TNF é uma citocina pró-inflamatória, produzida principalmente por macrófagos,
linfócitos T e células NK. Esta citocina possui um papel fundamental na defesa do hospedeiro
contra infecções micobacterianas, onde está intimamente envolvida na formação do
granuloma e restrição de micobactérias (Garcia et al., 1997; Kindler et al., 1998). Foi
observado que a administração de drogas anti-TNF para doenças autoimunes, como por
exemplo, a doença de Crohn, levou a ativação de uma infecção latente por M. tb. ou M. leprae,
108
e os pacientes desenvolveram tuberculose pulmonar ou hanseníase (revisado por Moraes et al.,
2006), demonstrando um papel essencial no controle da latência da infecção por
micobactérias, impedindo a progressão da doença. No presente estudo, não foram observadas
diferenças na expressão gênica entre células THP-1 infectadas com as cepas de BCG, nem em
relação ao controle em ambas as MOIs. Entretanto, foi observado um aumento na secreção de
TNF em células infectadas com as cepas de BCG em relação ao controle, apesar de não ter
sido observada diferenças entre as cepas de BCG utilizadas, porém apenas utilizando uma
carga bacteriana maior (10:1). Quando foram comparadas apenas células infectadas com a
cepa de BCG Moreau e M. leprae, foi observado um aumento na secreção de TNF após
infecção por BCG em relação às células infectadas com M. leprae, de acordo com os
trabalhos discutidos acima, onde foi demonstrado que BCG é um melhor indutor de TNF
(além de IL-1 e IL-6) do que M. leprae (Suzuki et al., 1993; Murray et al., 2007; Sinsimer et
al., 2010). Entretanto, apesar desse aumento na secreção de TNF no sobrenadante de células
THP-1, não foi observado o aumento da expressão do mRNA de TNF, sugerindo claramente
uma regulação pós-transcricional deste gene, que pode ter sido alvo da atuação de um miRNA.
Devido a ausência de diferenças na secreção das citocinas entre as células THP-1 após
infecção com as diferentes cepas de BCG, foi investigado, através da utilização de PBMC, se
a variabilidade do hospedeiro poderia influenciar na secreção destas citocinas. Com isso, foi
observado um aumento significante nos níveis de TNF, entretanto, apenas nas células
infectadas com a cepa de BCG Moreau, indicando que a variabilidade do hospedeiro poderia
influenciar na secreção desta citocina; além disso, o resultado sugere uma interação
hospedeiro-cepa específica. Esse resultado levou o nosso grupo a investigar a associação de
SNPs na produção desta citocina.
O gene TNF é um dos alvos mais comuns de estudos de associação em hanseníase,
principalmente o SNP -308G>A. A freqüência deste SNPs no promotor de TNF já foi bem
investigada, e foi mostrado que o SNP -308A tem uma frequência aumentada em controles
quando comparados a pacientes, sugerindo uma associação deste alelo com proteção à
hanseníase (Santos et al.,2000; Moraes et al., 2001; Santos et al.,2002; Cardoso et al., 2011b).
Assim, a produção aumentada de TNF restringiria a proliferação do M. leprae. No presente
estudo, foi avaliada a influência deste SNP, rs1800629, na secreção de TNF em sobrenadante
de PBMCs infectadas com as diferentes cepas de BCG, e não foi observada diferença na
secreção desta citocina nestas células, independente do genótipo e da cepa estudada, nem
mesmo diferenças no log(TNF/IL-10). Além disso, também não foi observada influência do
SNP IL-10 -C819T na produção desta citocina.
109
IL-10 é uma citocina produzida principalmente por macrófagos e monócitos, mas
também podem ser induzidas em células T, B e eosinófilos. É uma citocina pleiotrópica, que
desenvolve atividade anti-inflamatória e imunossupressora sobre a resposta imune Th1 pela
supressão de citocinas pró-inflamatórias, como IFN-, TNF, IL-12 e GM-CSF, e é coestimuladora de citocinas em macrófagos, contribuindo para a persistência do patógeno (Volk
et al., 2001; Grutz, 2005). Já foi observado que a síntese de IL-10 está aumentada em
infecções micobacterianas (Misra et al., 1995; Santos et al., 2002; Jang et al., 2006). Esta
citocina mostrou estar associada à hanseníase, onde foram observados níveis aumentados de
IL-10 nas formas multibacilares da doença (Yamamura et al., 1991; Misra et al., 1995;
Moubasher et al., 1998). O alelo T do polimorfismo -C819T em IL-10 foi associado à
suscetibilidade à hanseníase na população brasileira em dois estudos diferentes (Santos et al.,
2002; Pereira et al., 2009), além de ter sido confirmado na população indiana (Malhotra et al.,
2005). No estudo de Pereira e colaboradores foram observados níveis menores de IL-10 nos
carreadores do alelo -819T comparado com os não carreadores, indicando que este SNP
regula a secreção de IL-10 in vitro. Estes resultados somados a resultados anteriores sugerem
uma participação definitiva do alelo IL-10 -819T na suscetibilidade a hanseníase.
Em nossos estudos, não foram observadas diferenças na expressão de IL-10 em células
THP-1, independente da micobactéria e da MOI utilizada. Além disso, não foram obtidos
níveis detectáveis de IL-10 em sobrenadantes destas células, o que poderia estar relacionado
ao tempo de infecção escolhido. Entretanto, curiosamente foi observada secreção de TNF por
THP-1 após 24 horas de infecção por BCG Pasteur (Sendide et al., 2005), porém foi utilizada
diferentes MOIs (25:1 e 50:1) e concentração de PMA (20 ng/ml). Embora estudos anteriores
do nosso laboratório sugiram que para PBMC o pico de secreção de IL-10 seja entre 18-20h
(Sampaio et al., 1998), para as células THP-1 utilizadas em nosso estudo, o tempo de 24 h
poderia não ser o tempo ideal, já que foi observado secreção de IL-10 por células THP-1 após
72 h de infecção por M. tb. (Lasunskaia et al., 2010; Kanji et al., 2011). Deste modo, optou-se
por utilizar o tempo de 72 h de infecção em PBMC. Com isso, observamos secreção de IL-10,
e apesar de ter sido notado um aumento desta citocina em células infectadas com as cepas de
BCG em relação às células controle, não foi observada nenhuma diferença significante entre
as células infectadas com as diferentes cepas. Entretanto, foi notado um agrupamento, de
baixos, intermediários e altos produtores de IL-10; levando-se em consideração que SNPs no
promotor de IL-10 estão associados à hanseníase, resolveu-se investigar a influência do
polimorfismo genético -819 na produção de IL-10, e sobre o log(TNF/IL-10). Apesar de ter
sido observado que a produção de IL-10 foi influenciada pelos genótipos em infecção de
110
PBMCs com M. leprae (Pereira et al., 2009), aqui, a produção de IL-10 e o log(TNF/IL-10)
não foram influenciados pelos genótipos em cada estímulo de BCG utilizado. Além disso,
também não foi observada influência do SNP TNF -308G>A na produção desta citocina.
Ainda no estudo de análise de associação realizado por Wong e colaboradores, foram
identificados variantes genéticos em regiões de TLR1 que estariam associados com a
suscetibilidade à hanseníase, onde o efeito do tamanho desta associação observada sugere que
TLR1 é um dos principais genes associados à suscetibilidade à hanseníase (Wong et al., 2009).
Um dos SNPs de TLR1 é o N248S localizado no domínio extracelular, necessário para o
reconhecimento de lipopeptídeos bacterianos (Omueti et al., 2007), e foi observado que o
genótipo homozigoto SS está relacionado com o aumento da suscetibilidade à hanseníase na
população de Bangladesh (Schuring et al., 2009). A associação do polimorfismo N248S à
hanseníase foi confirmada por Salles-Marques e colaboradores (dados ainda não publicados),
onde os autores demonstraram que o alelo 248S está associado à suscetibilidade à doença na
população brasileira. Então, resolveu-se estudar a influência desse polimorfismo na produção
de citocinas por células humanas e se haveria alguma diferença em relação à cepa de BCG
utilizada. Com isso, foi investigada a influência do SNP rs4833095 na secreção de TNF e IL10 em sobrenadante de PBMCs infectadas com as diferentes cepas de BCG, e não foi
observada diferença na secreção destas citocinas nestas células, independente do genótipo e
da cepa estudada. Entretanto, a análise do log(TNF/IL-10), demonstra que indivíduos
carreadores do alelo S tiveram uma diminuição significante no log(TNF/IL-10) quando as
células foram infectadas com a cepa de BCG Moreau, sugerindo um padrão de ativação da
resposta imune dependente não só do genótipo do hospedeiro, mas também da cepa utilizada.
Essa diminuição do log(TNF/IL-10) em carreadores de S foi confirmada por Salles-Marques e
colaboradores (dados ainda não publicados) quando as células foram estimulados por um
antígeno de M. leprae. Como já foi observado que níveis aumentados da razão TNF/IL-10
estão associados à proteção à hanseníase (Lima et al., 2000), uma baixa razão TNF/IL-10
observada nos carreadores do alelo S, sugere uma influência deste SNP na ativação da
resposta imune contra M. leprae, e poderia indicar uma diminuição da ação protetora da cepa
BCG Moreau contra infecção por M. leprae.
Outra metodologia empregada neste estudo para análise da expressão de genes
envolvidos direta e indiretamente na resposta imune de células THP-1 foi o microarranjo de
DNA. A tecnologia do microarranjo é uma poderosa ferramenta pela qual é possível obter
informações sobre a expressão de milhares genes simultaneamente avaliados em diferentes
condições biológicas. Deste modo, através do microarranjo é possível medir a quantidade de
111
mRNA (ligado em cada sítio do arranjo) de milhares de genes paralelamente num mesmo
experimento, e é extremamente útil quando se necessita analisar um grande número de genes
rapidamente. Essa metodologia já vem sendo utilizada há bastante tempo para investigar
diferenças na expressão após infecção por micobactérias, onde no estudo de Ragno e
colaboradores (2001) foram investigadas diferenças na expressão gênica de células THP-1
infectadas com M. tb. em diferentes tempos de infecção. Apesar das novas tecnologias
desenvolvidas, como os sequenciadores de nova geração, o microarranjo é uma ferramenta
empregada até hoje. Recentemente foi utilizada para investigar mudanças transcricionais de M.
tb. em resposta a exposição a uma nova droga, a linezolida (Liang et al., 2012), bem como
utilizada para identificação de M. tb. e M. bovis em gado (Jia et al., 2012).
Através do PCR em tempo real, não foram observadas diferenças na expressão gênica
de células infectadas com as diferentes cepas de BCG. Sendo assim, foi utilizada nesta etapa
para as análises por microarranjo, apenas a cepa de BCG Moreau em comparação com M.
leprae. Devido a algumas limitações de tempo e custo da técnica, em nosso trabalho,
inicialmente foram utilizadas para comparação, apenas células infectadas com micobactérias
em MOI 10:1; entretanto comparações utilizando MOI 2:1 serão realizadas futuramente.
Obviamente, estamos na fase de confirmação da expressão gênica por qRT-PCR tanto em
THP-1 utilizando um número maior de replicatas, bem como nas amostras de biópsias de
nervo. Entretanto, os resultados encontrados são muito interessantes adicionando novos genes
de
vias
importantes
que
podem
desempenhar
um
papel
fundamental
na
resistência/suscetibilidade à hanseníase.
Foram encontrados 12 genes como diferencialmente expressos incluindo as três
condições experimentais. Na primeira condição, onde foram comparadas indiretamente as
células infectadas com BCG Moreau e as células controle, foram observados dois genes como
diferencialmente expressos. O gene C21orf126 localizado no braço longo do cromossomo 21,
que codifica uma proteína ainda não caracterizada, se mostrou induzido em células infectadas
com BCG Moreau em relação às células controle. Enquanto, o gene TMEM101 se encontrava
reprimido nas células infectadas com BCG. Esse gene está localizado no cromossomo 17 e
codifica a proteína transmembranar 101. Tem sido proposto que essa proteína participa da
regulação positiva da cascata I-kappaB quinase/NF-kappaB (informação retirada do NCBI,
AceView: Gene:TEMEM101). Esse TMEM101 também se encontrava reprimido nas células
infectadas com M. leprae em relação às células controle, que foi a segunda condição avaliada,
o que corrobora os resultados.
Também foram observados genes diferencialmente expressos após vacinação de
112
indivíduos com BCG Moreau (Schreiber et al., 2010). Neste trabalho, os autores utilizaram
microarranjo para analisar perfil de expressão gênica de indivíduos saudáveis vacinados
oralmente com BCG Moreau em 3 dias diferentes. Com isso, observaram 6 genes reprimidos
quatro dias após a primeira vacinação e 9 genes reprimidos sete dias após a primeira
vacinação. Nenhum destes genes diferencialmente expressos foi observado em nosso estudo.
A terceira condição analisada foi a comparação entre células infectadas com BCG e M.
leprae, onde foram observados 9 genes diferencialmente expressos. Destes, destaca-se o gene
LGALS1 (do inglês, lectin, galactoside-binding, soluble, 1), reprimido em células infectadas
com M. leprae. Esse gene codifica a galectina-1 (Gal-1), uma subdivisão das galectinas, que
pertencem à família das lectinas, proteínas de ligação de beta-galactósideos implicadas na
modulação de interações célula-célula e célula-matriz, e podem regular proliferação e
diferenciação celular, secreção de citocinas, migração e apoptose (Paclik et al., 2011). Gal-1 é
expressa por muitos tipos celulares, incluindo células do sistema imune, como monócitos e
macrófagos (Stewart et al., 2008), e se mostrou ser quimoatraente de monócitos in vitro
(porém não de macrófagos), assim como CCL2 (Malik et al., 2009). Gal-1 também apareceu
diferencialmente expressa nos experimentos de microarranjo realizados por Galindo e
colaboradores (2009). Nesse estudo, utilizando modelo animal, foi observado que este gene se
encontrava reprimido após infecção por M. bovis. Esse resultado, somado ao nosso, sugere
que a expressão diminuida de Gal-1 em resposta a infecção por micobactérias mais virulentas,
como M. bovis e M. leprae, seria um mecanismo do hospedeiro para evitar a inibição da
replicação destas micobactérias nos macrófagos infectados.
Um dos achados mais interessantes do estudo de microarranjos foi a repressão do gene
RNPEP [do inglês, arginyl aminopeptidase (aminopeptidase B)] parálogo ao LTA4H. RNPEP
codifica aminopeptidase B, uma exopeptidase que selectivamente remove resíduos de arginina
e/ou lisina a partir do N-terminal de vários substratos de peptídeos (Foulon et al., 1999),
podendo hidrolisar leucotrieno A4 (LTA4) em leucotrieno B4 (LTB4), um mediador lipídico
de inflamação. A produção diferencial de LTB4 está associada com infeções micobacterianas,
onde já foi demonstrada a indução de LTB4 em soro de camundongos após infecção por M. tb.
(Bafica et al., 2005). Então, assim como a deficiência de LTA4H causada por um
polimorfismo no locus deste gene, a diminuição de RNPEP levaria a uma baixa produção de
LTB4, que por sua vez, leva a uma baixa produção de TNF, o que pode causar uma
deficiência da proteção à infecções micobacterianas, resultando em tuberculose clínica ou na
forma multibacilar da hanseníase (Tobin et al., 2010). Porém, também foi mostrado que
excesso de LTB4, resultando em uma resposta pró-inflamatória exarcebada, pode levar ao
113
adoecimento do indivíduo, como consequência do aumento da imunopatologia. Com isso,
Tobin e colaboradores (2012) sugerem que uma terapia sob medida para genótipos específicos
de LTA4H que levam a esses estados inflamatórios divergentes (devido a uma resposta imune
inadequada ou exacerbada do hospedeiro) poderia melhorar os resultados dos pacientes ao
tratamento de doenças micobacterianas.
Nesse mesmo contexto, pensar em uma terapia preventiva específica para contatos de
pacientes hansenianos que possuem um genótipo de TLR1 que indique um fenótipo TNF/IL10 baixo, através da utilização de medicamentos que influencie no reestabelecimento da
resposta moderada TNF/IL-10 é uma estratégia interessante. Ainda, a vacinação com uma
cepa de BCG adjuvantada específica para o genótipo do hospedeiro, seria importante contra
infecção por M. leprae, e consequente redução no número de novos casos de hanseníase, o
que sugere claramente o início da era da vacinação personalizada.
Outro gene reprimido foi o GPI (do inglês, Glucose-6-phosphate isomerase),
pertencente à família GPI, cujos membros codificam proteínas multifuncionais fosfoglicose
isomerase (PGI) envolvidas nas vias de glicólise e glicogênese (Malaisse et al., 1990; Jeffery
et al., 2000; Tsutsumi et al., 2009). A PGI tem sido bem estudada no câncer, onde o aumento
desta proteína está associada à progressão da doença (Funakasa et al., 2009; Tsutsumi et al.,
2009). Porém, não foram encontrados relatos na literatura sobre o papel desta proteína em
doenças micobacterianas, assim como da proteína MESP2 (do inglês, mesoderm posterior 2),
codificada pelo gene MESP2, também reprimido pela infecção com M. leprae. MESP2 é um
fator de transcrição tipo bHLH (do inglês, basic helix-loop-helix) (Haraguchi et al., 2001). A
família HLH é um grupo de fatores de transcrição eucariótico que estão envolvidos na
regulação de diversos processos biológicos, dentre eles, a diferenciação e proliferação celular
(Toledo-Ortiz, et al., 2003).
Os experimentos envolvendo microarranjos não têm como objetivo confirmar uma
hipótese a priori. Seu principal objetivo seria funcionar como uma ferramenta geradora de
hipóteses, onde os dados obtidos muitas vezes servem como base para estudos mais precisos
de expressão gênica realizados através de PCR quantitativo e de outros métodos. Neste caso,
após uma análise estatística dos dados de microarranjo, os genes candidatos observados
precisariam passar por comprovação. Infelizmente no presente trabalho, não foi possível
realizar a confirmação dos resultados de microarranjo, e devido à falta de validação, é
possível que os resultados obtidos sejam falso positivos. Entretanto, já foram desenhados
oligonucleotídeos para os principais genes observados no microarranjo e a confirmação dos
resultados através de RT-PCR em tempo real será realizada futuramente. Devido a algumas
114
limitações técnicas em nosso trabalho, as análises de expressão gênica por qRT-PCR foram
realizadas antes das análises de expressão gênica por microarranjo, e com isso, nenhum dos
genes identificados como diferencialmente expressos por qRT-PCR foram confirmados por
experimentos de microarranjo. E apesar desta tecnologia não ter como finalidade a validação
de resultados, acredita-se que essa falta de confirmação, seja em parte, devido ao enorme
volume de dados gerados a partir de uma lâmina de microarranjos, e com isso seria
importante direcionar as análises para os objetivos específicos do experimento, além de levar
em conta a variabilidade técnica e tamanho amostral.
Com base em nossos resultados, onde foi observada a diminuição de várias
citocinas/quimiocinas relacionadas à resposta imune contra infecção por M. leprae, sugere-se
que M. leprae parece ter um efeito mais supressor do que indutor de resposta imune em
macrófagos in vitro. Esse efeito supressor pode ser, em parte, atribuído ao antígeno PGL-1, já
que, como mencionado anteriormente, foi observado um aumento da fagocitose de BCG
Pasteur recombinante produtor de PGL-1 em macrófagos humanos ao mesmo tempo em que
foi associado a uma diminuição na resposta inflamatória, quando comparado com BCG
Pasteur selvagem (Tabouret et al., 2010).
Outra hipótese para a diminuição da expressão de alguns dos genes estudados induzida
por M. leprae, seria a influência de miRNAs. Já foi mostrado que a infecção por M. leprae
regula o perfil de miRNA interferindo com a resposta antimicrobiana do hospedeiro,
contribuindo para o aumento da viabilidade da micobactéria. Foi observado que o miRNA
hsa-mir-21 estava mais expresso em lesões de pacientes LL, confirmado em monócitos in
vitro infectados com M. leprae ou apenas estimulados com PGL-1 (Liu et al., 2012). Esse
hsa-mir-21 diminui a expressão de CYP27B1 e IL-1β, levando a inibição da expressão de
genes da via microbicida dependente de vitamina D, onde ele atuou diretamente. É possível
que este miRNA esteja contribuindo para a diminuição de IL-1β, assim como outros miRNAs
poderiam estar influenciando na repressão de outros genes observados no presente estudo.
6.2. Análise do perfil de expressão gênica em biopsias de nervos de pacientes
hansenianos e não hansenianos
Em um estudo tipo caso/controle foi investigada a expressão gênica entre pacientes
hansenianos (L) e não hansenianos (NL). Com isso, foi observado através de um PCR
multiplex em tempo real, que 16 genes se encontravam diferencialmente expressos entre as
115
duas condições (L e NL).
Assim como foi observado na análise do perfil de expressão gênica em células THP-1
infectadas com M. leprae, houve uma diminuição da expressão das quimiocinas, CCL2,
CCL3 e CCL4, e também de IL-1β e SOD2 em amostras de pacientes hansenianos. Outras
citocinas também se mostraram menos expressas nestes pacientes, como é o caso de IL-10 e
IL-12.
Já foi mostrado que a forma tuberculóide da hanseníase possui um perfil de células
preferencialmente Th1, com produção de citocinas como TNF, IFN-γ, IL-1 e IL-12, onde se
observam macrófagos com atividade antimicrobiana dependente de vitamina D, que é
induzida por IL-15. Enquanto a forma lepromatosa apresenta um perfil preferencialmente Th2,
com produção de IL-4, IL-5 e IL-10 (Yamamura et al., 1991), onde IL-10 desencadearia a
atividade fagocítica dos macrófagos (Montoya et al., 2009). Esta citocina, como mencionado
anteriormente, possui atividade imunoreguladora, e IL-12 é uma das citocinas que sofrem
supressão por ação da IL-10. IL-12 potencializa o desenvolvimento de células T, que passam
a produzir citocinas inflamatórias, IFN-γ, TNF e IL-2 que por sua vez vão mediar a resposta
imune (Demangel & Britton, 2000). Então, uma produção de IL-12 diminuída estaria
associada à suscetibilidade a infecção por micobactérias. Esta citocina é produzida por
monócitos/macrófagos e células dendríticas após contato com a micobactéria, e o equilíbrio
entre a produção de IL-12 e IL-10 é de fundamental importância, onde IL-12 promove o
aumento da resposta Th1, enquanto IL-10 diminui essa resposta (Libraty et al. 1997). Assim,
é esperada uma diminuição da produção de IL-12 em lesões de pacientes hansenianos, em
razão de um aumento da expressão de IL-10. IL-10 promoveria um aumento da fagocitose de
micobactérias e de lipoproteína de baixa densidade oxidada (oxLDL), onde estes lipídeos
podem inibir a resposta imune inata contra as micobactérias através da diminuição da
atividade antimicrobiana induzida por TLR e do desvio do equilíbrio das citocinas para
induzir uma produção maior de IL-10 e menor de IL-12 (Cruz et al., 2008). Entretanto, apesar
de ter sido observado o aumento do receptor de LDL (que será discutido mais adiante), o que
deve levar ao aumento nos níveis de LDL, contribuindo para a repressão de IL-12 observada
no presente estudo, curiosamente, também foi observada a diminuição de IL-10 em pacientes
hansenianos. Uma possível explicação para essa ausência de relação observada entre a
expressão das citocinas seria a falta de uma estratificação dos pacientes hansenianos de
acordo com as formas clínicas da doença, para uma investigação do perfil de citocinas
específicas de acordo com cada programa de diferenciação macrofágica, predominantes em
116
cada pólo da doença.
Outro gene que se mostrou reprimido em pacientes hansenianos foi o Bad (do inglês,
BCL-2 antagonist of cell death), que é um gene pró-apoptótico, membro da família Bcl-2 (do
inglês, B-cell CLL/lymphoma 2), que codificam proteínas que podem promover ou inibir a
apoptose. Bad regula positivamente a apoptose, pois forma heterodímeros com proteínas antiapoptóticas conseguindo reverter a sua atividade repressora de morte celular. As
micobactérias interferem com a apoptose da célula hospedeira através da modificação da
expressão de membros da família Bcl-2, onde já foi observado que M. tb. reprime a apoptose
pela regulação positiva de genes anti-apoptóticos, como Bcl-2 e Mcl-1, e repressão dos genes
pró-apoptóticos, Bad e Bax (do inglês, BCL2-associated X protein) em células epiteliais;
entretanto em linhagens de macrófagos alveolares (U937), foi observado o contrário
(Danelishvili et al., 2003). Esse aumento da expressão de genes pró-apoptóticos, como Bax e
Bak (do inglês, Bcl-2 homologous antagonist/killer) também foi observado ao utilizar PBMC
de pacientes hansenianos infectados por M. leprae morto (Hernadez et al., 2003), porém
acredita-se que macrófagos de pacientes hansenianos estejam mais propensos a morte por
apoptose do que macrófagos de indivíduos saudáveis. No entanto, o gene Bad também se
mostrou reprimido após infecção de células THP-1 por M. leprae nos estudo de Hasan e
colaboradores (2006a). Nesse trabalho, os autores observaram que M. leprae morto inibe a
apoptose pela repressão da expressão de genes pró-apoptóticos Bad e Bak e indução do gene
anti-apoptótico Mcl-1 (do inglês, myeloid cell leukemia sequence 1), enquanto na infecção por
BCG foi observado o oposto, o que implica o papel da apoptose na defesa da células
hospedeiras contra a infecção micobacteriana. Trabalhos recentes mostraram que M. leprae
viável não induz apoptose em macrófagos murinos, apesar de M. leprae morto induzir, (Lahiri
et al., 2010) e em linhagem de células de Schwann, em condições de privação de soro
(Rodrigues et al., 2010). Apesar de ainda ser controverso se M. leprae induz ou não apoptose,
o que pode ser causado pelas diferentes fontes, pureza e viabilidade da micobactéria, estes
resultados somados as nossas observações, (que incluem a repressão de Bad e indução de
URE-B1) ajudam a confirmar a diminuição da apoptose da célula hospedeira pela infecção por
M. leprae, o que seria uma estratégia adequada deste patógeno intracelular que só se
multiplica a cada 14 dias.
Um conjunto de genes que também se mostraram regulados negativamente em
pacientes hansenianos, foram os mitocondriais, mt_ATP6 (do inglês, mitochondrially encoded
ATPsintetase subunit 6), mt_COX-2 (do inglês, mitochondrially cytochrome c oxidase subunit
2), mt_CYB (do inglês, mitochondrially encoded cytochrome b), mt_ND1 (do inglês,
117
mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 1), mt_ND3 (do inglês,
mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 3) e mt_ND5 (do inglês,
mitochondrially encoded NADH dehydrogenase subunit 5); cada um codifica uma subunidade
de um dos complexos protéicos que participam da fosforilação oxidativa, cujo objetivo final é
a geração de trifosfato de adenosina (ATP). Estes complexos protéicos estão localizados na
membrana interna da mitocôndria e são subdivididos em complexo I (NADH-ubiquinona
oxidoredutase ou desidrogenase), complexo II (succinato-ubiquinona oxidoredutase),
complexo III (ubiquinolol-citocromo c oxidoredutase), complexo IV (citocromo c oxidase) e
complexo V (ATP sintase). Os genes mitocondriais foram investigados no presente estudo,
após terem sido identificados em estudos recentes de nosso laboratório (Ferreira, 2011), como
reprimidos em células de Schwann após infecção por M. leprae, sugerindo uma repressão de
etapas do metabolismo energético mitocondrial. As alterações mitocondriais observadas
estariam de acordo no que se refere a processos de apoptose e autofagia que muitas vezes são
iniciados pela mitocôndria. Essas organelas desempenham uma função central como sensor de
estresse dentro da célula, e a repressão de genes mitocondriais, poderia ser uma confirmação
da diminuição da apoptose ocasionada pela infecção por M. leprae.
Ainda nesta análise de expressão gênica, foi identificado um aumento na expressão do
gene E3-Ubiquitina ligase (URE-B1) em pacientes hansenianos. Existe um grande número de
enzimas E3-Ubiquitina ligase, e várias delas já foram identificadas como reguladoras da
resposta imune. Uma das mais conhecidas é a parkina (Schurr et al., 2006), já mencionada
anteriormente, descrita como associada à hanseníase.
Outro gene que também teve sua expressão aumentada foi o LDLR (receptor de
proteína de baixa intensidade). Foi mostrado que as micobactérias além se ligarem a uma
variedade de receptores em macrófagos, como TLR, complemento, manose, também são
capazes de interagir com colesterol da membrana plasmática (Gatfield & Pieters, 2000). A
parede celular micobacterina, já conhecida por ser rica em glicolipídeos, parece conter
componentes que se ligam diretamente ao colesterol, indicando a presença de um sítio de
ligação a colesterol de alta afinidade (Gatfield & Pieters, 2000); com isso, o teor de colesterol
das membranas das células do hospedeiro parece ser fundamental para a entrada das
micobactérias. Sendo assim, sugere-se que o colesterol funcione como um sítio para ligação
direta das micobactérias, estabilizando sua ligação com a membrana das células do hospedeiro.
Sendo assim, é proposto que LDLR esteja aumentado nas infecções micobacterianas, para
aumentar os níveis de LDL, como mecanismo do patógeno de facilitar sua entrada nas células
do hospedeiro.
118
6.3. Considerações finais
Uma limitação das análises realizadas no presente estudo foi o tamanho amostral,
principalmente no que diz a respeito às infecções com M. leprae vivo, que como mencionado
anteriormente, não havia uma farta disponibilidade da micobactéria. A ausência de uma
cinética a fim de ser definido qual o melhor tempo para dosagem de citocinas no sobrenadante
das células pode ter contribuído para a divergência de resultados entre expressão gênica e a
secreção de citocinas.
Curiosamente, os efeitos observados na regulação da expressão gênica em células
THP-1 parecem pronunciados apenas em MOI 2:1. Uma hipótese para não terem sido
observadas diferenças em MOI 10:1, seria o baixo número de replicatas em nosso estudo.
Entretanto, quando dosamos os níveis de citocinas em sobrenadantes de THP-1, observamos
que em baixa MOI (e nos tempos escolhidos) não houve nenhuma diferença nos níveis de
citocinas. Porém, em MOI 10:1 foi observado aumento nos níveis de TNF para as cepas de
BCG, um dos motivos para ter sido escolhido este MOI para dosagem das citocinas em
sobrenadantes de PBMC infectadas pelas cepas de BCG.
Mesmo assim, reunimos aqui uma série de resultados muito relevantes e, em conjunto
com dados recentes na literatura (Di Pietrantonio et al., 2011; Randawa et al., 2011), têm
mostrado que cepas de BCG específicas têm papel protetor dependente também do genótipo
do hospedeiro. Nossos estudos com diferentes cepas vacinais de BCG utilizadas para
prevenção de doenças micobacterianas, sugerem que a interação do patógeno com o
hospedeiro indica padrões de resposta imune específicas para a cepa de BCG Moreau que não
se repetem nas cepas de BCG Pasteur ou Danish. Entretanto, o efeito é observado apenas
quando as diferentes cepas são utilizadas para estímulo em células de sangue periférico de
diferentes indivíduos com genótipos distintos. Além disso, vale a pena ressaltar que são
indivíduos que já foram expostos à micobactérias ambientais e provavelmente todos já foram
vacinados com BCG Moreau (uma ou até duas vezes), o que poderia contribuir para as
diferenças observadas entre os indivíduos, e para o efeito específico observado com BCG
Moreau. Quando as diferentes cepas são utilizadas para infectar uma linhagem celular, que
apresenta apenas um único genótipo, essas diferenças não são observadas.
Acredita-se então, que esses fatores poderiam refletir interações específicas cepa de
BCG-hospedeiro. Com isso, acredita-se que uma vacina de BCG específica para o genótipo
do hospedeiro seria mais eficaz na prevenção contra TB e hanseníase. Entretanto, até agora
119
não há relatos que descrevam a relação genótipo-fenótipo, ou seja, como que indivíduos que
carregam determinadas combinações genotípicas respondem frente à infecção.
120
7. CONCLUSÕES
121
1 – Não houve diferenças na expressão gênica e na secreção de citocinas/quimiocinas de
células THP-1 infectadas pelas cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur independente da
multiplicidade de infecção utilizada (2:1 e 10:1), podendo ser correlacionados estes resultados;
2 – A infecção de células THP-1 por M. leprae levou a uma diminuição da expressão de genes
associados a infecções micobacterianas, porém apenas quando a MOI 2:1 foi utilizada. Os
genes reprimidos foram SOD2 e TNFSF15, e os genes codificantes para as quimiocinas IL-8,
CCL2, CCL3, CCL4 e CCL7, e para as citocinas IL-1β e IL-6;
3 – Não houve diferenças nos níveis de secreção de citocinas e quimiocinas entre as células
THP-1 infectadas por BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1 no tempo estudado. Por outro
lado houve um aumento na expressão de TNF em células THP-1 infectadas por BCG Moreau
em MOI 10:1. Ambos os resultados não puderam ser correlacionados com os dados de
expressão gênica;
4 – A variabilidade do hospedeiro influenciou na secreção de TNF, porém apenas na infecção
com a cepa de BCG Moreau, sugerindo uma interação espécie-específica, levando a uma
resposta diferencial do hospedeiro frente à cepa brasileira;
5 – Não houve influência dos SNPs TNF -308 G>A, IL-10 -819 C>T e TLR1 743 A>G na
secreção de TNF e IL-10. Entretanto, diferente dos outros SNPs, o TLR1 743 A>G afetou o
logaritmo da razão (TNF/IL-10), em células infectadas com BCG Moreau, sugerindo um
padrão de ativação da resposta imune dependente do genótipo do hospedeiro;
6 – A análise de expressão de genes por microarranjo revelou genes diferencialmente
expressos em células THP-1 infectadas por M. leprae, incluindo genes envolvidos em
modulação de interações célula-célula e célula-matriz, em vias de glicólise e glicogênese, e
também envolvidos na biosíntese de leucotrienos;
7 – Em uma amostragem de validação foi confirmado em amostras de biópsias de pacientes
hansenianos a repressão de CCL2, CCL3, CCL4, IL-1β e SOD2 quando comparados a
pacientes não hansenianos indicando uma assinatura molecular específica. Além disso,
122
também foram reprimidos os genes mitocondriais e induzidos os genes E3-Ub-ligase e LDLR;
8 – Sugere-se que o desenvolvimento de uma vacina de BCG específica para o genótipo do
hospedeiro seria mais eficaz na prevenção contra TB e hanseníase, indicando a importância de
uma vacinação personalizada.
123
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. ANEXOS
155
156
Anexo I - Oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de qRT-PCR (1) e PCR multiplex em tempo real (2), com suas respectivas sequências. Também foram
incluídos os trabalhos nos quais estes genes foram identificados, bem como a importância pela qual foram adicionados no presente estudo. Essa tabela mostra
todas as condições de infecção em que as células THP-1 foram submetidas, e quais genes foram utilizados para quais condições específicas. Os genes em negrito
são os constitutivos utilizados para a normalização dos ensaios.
THP-1 +
THP-1 + BCG
THP-1 +
THP-1 + BCG
cepas de
Moreau
cepas de
Moreau
Gene
BCG 2:1
e M. lep 2:1
BCG 10:1
e M. lep 10:1
Fita
GAPDH
x
x
x
x
HPRT1
RPL13a
RPS13a
TGFb1
VDR
Catelicidina
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
(CAMP)
CCL2
x
x
x
x
qPCR (1) ou PCR
Importância em
Seqüência (5' - 3')
multiplex (2)
nosso trabalho
Senso
AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT
1e2
Gene constitutivo
-
Antisenso
CAACAGCCTCAAGATCATCAGCAA
Senso
GTGGAAGATATAATTGACACTGGC
1e2
Gene constitutivo
-
Antisenso
AACACTTCGTGGGGTCCTTT
Senso
GACAAGAAAAAGCGGATGGT
1e2
Gene constitutivo
-
Antisenso
GTACTTCCAGCCAACCTCGT
Senso
CGAAAGCATCTTGAGAGGAACA
1e2
Gene constitutivo
-
Antisenso
TCGAGCCAAACGGTGAATC
Senso
AAGGACCTCGGCTGGAAGT
1
Gene associado à
Yamamura et al., 1991
Antisenso
GACCTTGCTGTACTGCGTGT
Senso
TTGAGCCCCTCATCAAGTTC
Antisenso
GACGATCTGGGGAGACGAT
Senso
ACACAGCAGTCACCAGAGGA
Antisenso
GGGCAAATCTCTTGTTATCCTT
Senso
CCTGCTGTTATAACTTCACCAAT
Antisenso
TTGAAGATCACAGCTTCTTTGG
157
Referências
hanseníase
1
Gene associado à
Liu et al., 2007
TB
1
Gene associado à
Liu et al., 2007
TB
1e2
Gene associado à
hanseníase
Kirkaldy et al., 2003
THP-1 +
THP-1 + BCG
THP-1 +
THP-1 + BCG
cepas de
Moreau
cepas de
Moreau e M.
Gene
BCG 2:1
e M. lep 2:1
BCG 10:1
lep 10:1
Fita
CCL3
x
x
x
x
CCL4
CCL5
CCL7
TNF
IL-6
Il-10
IL-12
IL-1
IL-8
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
qPCR (1) ou PCR
Importância em
Seqüência (5' - 3')
multiplex (2)
nosso trabalho
Senso
TGCTGCTTCAGCTACACCTC
1e2
Gene associado à
Antisenso
GCTTCGCTTGGTTAGGAAGA
Senso
CGCCTGCTGCTTTTCTTACA
Antisenso
TGCTTCTTTTGGTTTGGAAT
Senso
CCTGCTGCTTTGCCTACATT
Antisenso
GGGTGACAAAGACGACTGCT
Senso
CTTCAACTACCTGCTGCTACAGA
Antisenso
CAGTTTGGTCTTGAAGATTACAGC
Senso
GAGGGTTTGCTACAACATGG
Antisenso
CCCCAGGGACCTCTCTCTA
Senso
GCATCTAGATTCTTTGCCTTTTT
Antisenso
GAAAATCATCACTGGTCTTTTGG
Senso
ATCGATGACAGCGCCGTAG
Antisenso
GATGCCCCAAGCTGAGAAC
Senso
TTTCTTTTCTCTCTTGCTCTTGC
Antisenso
GTGGAGGTCAGCTGGGAGTA
Senso
CAAAATACCTGTGGCCTTGG
Antisenso
TTTTTGGGATCTACACTCTCCAG
Senso
CTGCGCCAACACAGAAATTA
Antisenso
TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA
158
Referências
Hasan et al., 2004
hanseníase
1e2
Gene associado à
Lin et al., 1998
TB
2
Gene associado à
Kirkaldy et al., 2003
hanseníase
2
Gene associado à
Ragno et al., 2001
TB
1e2
Gene associado à
Yamamura et al., 1991
hanseníase
1e2
Gene associado à
Yamamura et al., 1991
hanseníase
1e2
Gene associado à
Yamamura et al., 1991
hanseníase
1e2
Gene associado à
Libraty et al., 2012
hanseníase
1e2
Gene associado à
Yamamura et al., 1991
hanseníase
1e2
Gene associado à
hanseníase
Kirkaldy et al., 2003
THP-1 +
THP-1 + BCG
THP-1 +
THP-1 + BCG
cepas de
Moreau
cepas de
Moreau e M.
Gene
BCG 2:1
e M. lep 2:1
BCG 10:1
lep 10:1
Fita
NOX3
x
x
x
x
SOD2
NOD2
OASL
SET1DB
mtND1
mtND2
mtND3
mtND4L
mtND5
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
qPCR (1) ou PCR
Importância em
Seqüência (5' - 3')
multiplex (2)
nosso trabalho
Senso
CTGGGACGAAAATACTGACG
1e2
Gene associado à
Antisenso
AATACTGCTGCTGGGGTGAT
Senso
GGAACGGGGACACTTACAAA
Antisenso
TAAGCGTGCTCCCACACAT
Senso
CACTGATGCTGGCAAAGAAC
Antisenso
GGTAGGTGATGCAGTTATTGGA
Senso
AAATTTCTGCCCATCCTTCAG
Antisenso
TGGCTTTCACATACTGCTGGTA
Senso
AGCTCAAGTTCCGGAAGAAA
Antisenso
GCGATCACCTGACGGATATT
Senso
TCCGCTACGACCAACTCATA
Antisenso
GGGGAATGCTGGAGATTGTA
Senso
ACTAGCCCCCATCTCAATCA
Antisenso
ATTTTGCGTAGCTGGGTTTG
Senso
GCGTCCCTTTCTCCATAAAA
Antisenso
GGCTCATGGTAGGGGTAAAA
Senso
TCACACCTCATATCCTCCCTACTAT
Antisenso
GGAGTGGGTGTTGAGGGTTAT
Senso
AGGCGCTATCACCACTCTGT
Antisenso
TTGGTTGATGCCGATTGTAA
159
Referências
Sly et al., 2001
TB
1e2
Gene associado à
Mira et al., 2004
hanseníase
1e2
Gene associado à
Zhang et al., 2009
hanseníase
1e2
Gene associado à
Ferreira, 2011
hanseníase
1e2
Gene possivelmente
Ferreira, 2011
associado à hanseníase
1e2
Gene associado à
Ferreira, 2011
hanseníase
2
Gene associado à
Ferreira, 2011
hanseníase
2
Gene associado à
Ferreira, 2011
hanseníase
2
Gene associado à
Ferreira, 2011
hanseníase
2
Gene associado à
hanseníase
Ferreira, 2011
THP-1 +
THP-1 + BCG
THP-1 +
THP-1 + BCG
cepas de
Moreau
cepas de
Moreau e M.
Gene
BCG 2:1
e M. lep 2:1
BCG 10:1
lep 10:1
Fita
mtCOX2
x
x
x
x
mtCYTb
mtATP6
SECII
LTA
Ninjurina1
BCL2
IDO1
IDO2
LRRK2
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
qPCR (1) ou PCR
Importância em
Seqüência (5' - 3')
multiplex (2)
nosso trabalho
Senso
GGCCTGACTGGCATTGTATT
1e2
Gene associado à
Antisenso
TCAGTGAATGAAGCCTCCTATG
Senso
AGACGCCCTCGGCTTACTT
Antisenso
ATGTGGGGAGGGGTGTTTA
Senso
GCCACCTACTCATGCACCTAAT
Antisenso
TTAAGGCGACAGCGATTTCTA
Senso
GGAGAACGGGGAGGAATATG
Antisenso
AGATGAGGAAAATTAAAGGGATAAGA
Senso
CTGGGGTCTCCAATGAGGT
Antisenso
GTTGGCCTCACACCTTCAG
Senso
CTTGACAAGGAAGATGAGCAG
Antisenso
AAGGCCGTCGTGGAACAG
Senso
CCCCTGGTGGACAACATC
Antisenso
CAGCCAGGAGAAATCAAACAG
Senso
GGGAAGACCCAAAGGAGTTT
Antisenso
GGAGGAACTGAGCAGCATGT
Senso
TGCTTCATGCCTTTGATGAG
Antisenso
GGAAGGTGCTGAGTGGATGT
Senso
TGATGACAGCACAGCTAGGAA
Antisenso
CCAAACGGTCAAGCAAGATT
160
Referências
Ferreira, 2011
hanseníase
1e2
Gene associado à
Ferreira, 2011
hanseníase
1e2
Gene associado à
Ferreira, 2011
hanseníase
1
Gene possivelmente
Ferreira, 2011
associado à hanseníase
2
Gene associado à
Yamamura et al., 1991
hanseníase
2
Gene associado à
Cardoso et al., 2007
hanseníase
2
Gene associado à
Hasan et al., 2006a
hanseníase
2
Gene associado à
de Souza Sales et al., 2011
hanseníase
2
Gene associado à
de Souza Sales et al., 2011
hanseníase
2
Gene associado à
hanseníase
Zhang et al., 2009
THP-1 +
THP-1 + BCG
THP-1 +
THP-1 + BCG
cepas de
Moreau
cepas de
Moreau e M.
Gene
BCG 2:1
e M. lep 2:1
BCG 10:1
lep 10:1
Fita
PINK1
x
x
x
x
Senso
qPCR (1) ou PCR
Importância em
Seqüência (5' - 3')
multiplex (2)
nosso trabalho
GCCTCCAGACGTGAGACAG
2
Referências
Gene associado à parkina Poole et al., 2008
(possível associação à
ZNRF1
x
x
x
x
Antisenso
CACCCCAGAGGCTTAGATGA
Senso
TGCTTGCTGACTCCTCTCAA
hanseníase)
2
É uma E3-Uligase
Araki & Milbrandt, 2003
(possível associação à
TNFSF15
RIPK2
ZNF79
C6orf136
E3-Uligase
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Antisenso
GGAGGAAGGGAGAACCATGA
Senso
CAGGAGTTTGCACCTTCACA
Antisenso
TGCTGTGTGGGAGTTTGTCT
Senso
GGGATAGCACCATTTCTGGA
Antisenso
ATACCAGGCTGCAGACGTTC
Senso
TCCAGGAGCCTTGTCCTACT
Antisenso
CTCTGGTGGTGATCCAGATATAA
Senso
CTTGCTCTTTTTGCGGTTCT
Antisenso
TAGACGATGGCGACAAATGA
Senso
CCATCTTCACTGAGCAGGAGTTA
hanseníase)
2
Gene associado à
Zhang et al., 2009
hanseníase
2
Gene associado à
Zhang et al., 2009
hanseníase
2
Gene possivelmente
Ferreira, 2011
associado à hanseníase
2
Gene possivelmente
Ferreira, 2011
associado à hanseníase
2
Gene associado à parkina Ferreira, 2011
(possível associação à
BAK
x
x
x
x
Antisenso
GAACCACTGCATCTGAATAGAGTTG
Senso
ACGACATCAACCGACGCTAT
Antisenso
CACTCTCAAACAGGCTGGTG
161
hanseníase)
2
Gene associado à
hanseníase
Hasan et al., 2006a
THP-1 +
THP-1 + BCG
THP-1 +
THP-1 + BCG
cepas de
Moreau
cepas de
Moreau e M.
Gene
BCG 2:1
e M. lep 2:1
BCG 10:1
lep 10:1
Fita
BAD
x
x
x
x
MIF
GAD2
LTA4H
PPARg
LPL
LDLR
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
qPCR (1) ou PCR
Importância em
Seqüência (5' - 3')
multiplex (2)
nosso trabalho
Senso
GAGGACGACGAAGGGATG
2
Gene associado à
Antisenso
TCCCTTCTTAAAGGAGTCCACA
Senso
CGCAGAACCGCTCCTACA
Antisenso
GAGTTGTTCCAGCCCACATT
Senso
CGGCAACTCACCAAGACATT
Antisenso
AAGTTTCTCAGTAGGGGGCTTAG
Senso
AATTGAATGAGTTTTTAGCACAGA
Antisenso
GCAGCCATCTGAATCGTATTT
Senso
AGTCCTCACAGCTGTTTGCAAGC
Antisenso
GAGCGGGTGAAGACTCATGTCTGT
Senso
AAAGGCACCTGCGGTATTT
Antisenso
TCACATGCCGTTCTTTGTTC
Senso
ACCAGGACGGCTACAGCTAC
Antisenso
GAGGTCTCAGGAAGGGTTCTG
162
Referências
Hasan et al., 2006a
hanseníase
2
Gene associado à
Yamada et al., 2002
TB
2
Gene possivelmente
Ferreira, 2011
associado à hanseníase
2
Gene associado à
Tobin et al., 2004
hanseníase
2
Gene asscociado à
Almeida et al., 2009
infecção micobacteriana
2
Gene associado à
Singh et al., 2010
TB
2
Gene possivelmente
associado à hanseníase
Gatfield & Pieters, 2000
Anexo II. Valores normalizados de expressão gênica avaliada por RT-PCR em tempo real, de
células THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 2:1
por 24 horas. Foram 8 replicatas biológicas utilizadas com 13 oligonucleotídeos: CCL2, CCL3,
CCL4, IL-1, IL-10, IL-12, IL-6, IL-8, TGF-β, TNF, OASL, IL-12, VDR e Catelicidina. Os genes
constitutivos utilizados foram HPRT1, RPL13 e RPS13. Como foi observado na figura abaixo,
não houve diferença significante na expressão gênica das células THP-1 tanto controle, quanto
infectadas pelas diferentes cepas de BCG, a não ser na expressão de OASL e TNF por células
infectadas com BCG Danish em relação à célula controle. Níveis de significância bi-caudais
inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e 0,1 (x) foram considerados como altamente significante,
significante e sugestivo, respectivamente.
163
164
Anexo III. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células
THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 2:1 por 24 horas. Foram 4
replicatas biológicas utilizadas com 18 oligonucleotídeos: CCL2, CCL3, CCL4, IL-1, IL-10, IL-6,
IL-8, TGF-β, TNF, SOD2, OASL, NOX3, SECII, NOD2 e alguns genes mitocondriais que foram
observados em arranjos realizados em nosso laboratório, mt_ATP6, mt_COX, mt_CYB e
mt_ND1. Como genes constitutivos, foram utilizados HPRT1, RPL13 e RPS13. Como foi
observado na figura abaixo, houve um aumento na expressão de IL-1, SOD2 e TGF-β em células
THP-1 infectadas com M. leprae, enquanto para os outros genes, não houve diferença
significante na expressão pelas células THP-1 tanto controle, quanto infectadas pelo BCG
Moreau e M. leprae. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e
0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.
165
166
Anexo IV. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células
THP-1 controle e infectadas com as cepas de BCG Danish, Moreau e Pasteur em MOI 10:1 por
24 horas. Foram 6 replicatas biológicas utilizadas com 13 oligonucleotídeos: CCL2, CCL3,
CCL4, IL-1, IL-10, IL-6, IL-8, TGF-β, TNF, OASL, SET1DB e SOD2. Os genes constitutivos
utilizados como normalizadores foram HPRT1, RPL13 e RPS13. Como foram observados na
figura abaixo, alguns dos genes são significativamente regulados positivamente quando
comparado aos controles, embora não tenha sido observado um padrão claro em relação à cepa de
BCG utilizada na infecção, porém não foram observadas diferenças quando foram comparadas as
linhagens entre si. Níveis de significância bi-caudais inferiores ou iguais a 0,01 (**), 0,05 (*) e
0,1 (x) foram considerados como altamente significante, significante e sugestivo, respectivamente.
167
168
Anexo V. Valores normalizados de expressão gênica por RT-PCR em tempo real, de células
THP-1 controle e infectadas com BCG Moreau e M. leprae em MOI 10:1 por 24 horas. Foram 4
replicatas biológicas utilizadas com 16 oligonucleotídeos: CCL2, CCL3, CCL4, IL-1, IL-10, IL-6,
IL-8, TGF-β, TNF, SOD2, OASL, NOX3, SET1DB e os genes mitocondriais, mt_ATP6,
mt_COX, mt_CYB e mt_ND1. Os genes constitutivos utilizados foram HPRT1, RPL13 e RPS13.
Como foi observado na figura abaixo, houve um aumento significante na expressão de CCL2, IL6, IL-10, SOD2 nas células THP-1 infectadas com BCG Moreau e um aumento na expressão de
TNF nas células infectadas com M. leprae.
169
170