Purificação e detecção de Antígenos

Purificação e detecção de
Antígenos
Imunocromatografia
Cromatografia de afinidade
Eletroforese SDS page
Western blotting
Imunohistoquímica
Cromatografia
Método físico-químico de separação, fundamentado na
migração diferencial dos componentes de uma
mistura, que ocorre devido a diferentes interações,
entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase
estacionária.
A cromatografia pode ser subdividida em cromatografia
em coluna e cromatografia planar.
Cromatografia planar: cromatografia em papel,
cromatografia por centrifugação e à cromatografia
em camada delgada
Cromatografia em coluna, de acordo com fase móvel:
líquida, gasosa.
Imunocromatografia
O método, conhecido como imunocromatografia, ou teste
de migração lateral, vale-se de uma membrana de
nitrocelulose no formato de fita. Impregnada em cada
trecho com Antígenos ou Anticorpos específicos e
marcados (ex: ouro coloidal), ela reage com a amostra,
indicando ou não a existência dos Acs (ex: Ac anti
HIV) ou dos Ags (ex: hormônio betaHCG) pesquisados.
A leitura do resultado é feita a olho nu e independe
de especialistas.
Cromatografia de Afinidade
Cromatografia de afinidade (coluna e líquida)
Separa proteínas por suas especificidades de ligação
mistura de proteínas
é adicionada à coluna
contendo polímeros com
ligantes específicos para
proteína de interesse
proteína de interesse
deixa coluna com
a solução de ligantes
Eletroforese
Método utilizado para separar e purificar macromoléculas
(proteínas, RNA, DNA) de diferentes tamanhos, carga ou
conformação.
Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico,
migram para o pólo positivo ou negativo.
Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre
negativa (fosfato)
Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel.
O gel é submerso em um tampão que possui íons para a
corrente passar.
GEL para Eletroforese
Compostos de agarose ou poliacrilamida
Agarose: polissacarídeo extraído de alga
marinha. Usada em concentrações de 0,5 a
2%. Fácil de preparar. Não-tóxico.
Géis de Agarose possuem ampla capacidade de
separação mas baixa resolução. Muito
utilizado para ácidos nucleicos.
GEL para eletroforese
Poliacrilamida: polímero de ligação cruzada de acrilamida.
Comprimento das cadeias do polímero dependem da
concentração usada (3,5 a 20%).
Mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a
polimerização precisam ser montados entre placas de
vidro.
Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado
com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para
pesar o pó.
A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem
ser usadas pela possível presença de acrilamida livre
Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de
separação mas alta capacidade de resolução. Muito
utilizado para separação de proteínas
Coloração Gel
Coloração com Blue Coomassie que se
liga inespecificamente a praticamente
todas as proteínas.
Eletroforese – SDS page
proteínas migram de acordo com
tamanho e forma
• a proteina é denaturada,
as subunidades se separam
cátodo
ânodo
SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Eletroforese de proteínas
Western blotting
Gel blotting: técnica de visualização/separação de
macromoléculas (DNA,RNA, Proteínas) em uma
mistura complexa.
protein blotting ou westernblotting ou imunoblotting
É um método analítico que envolve a imobilização das
proteínas em membranas para posterior
detecção/identificação utilizando anticorpos
monoclonais ou policlonais
A proteína previamente separada e denaturada na
Eletroforese (SDS page), técnica que fornece
informações sobre o peso molecular e a possível
existência de isoformas da proteína em estudo, é
então imobilizada em membranas como a de
nitrocelulose e reconhecida pelos anticorpos marcados
Western blotting
Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida
 Separação e caracterização de proteínas
 Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação
 Transferência para membrana por força elétrica
 Proteína alvo é identificada por Ac mono ou policlonal
 Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente
ou radioativo
 Informa o tamanho e a quantidade das proteínas
Western blotting
Imunohistoquímica
O príncípio básico: reconhecimento do Ag (presente no tecido analisado) por
um anticorpo específico, associado a diversos tipos de processos de
visualização/revelação.
Cada Ac reconhece apenas um único Ag, que pode ser, uma proteína de uma
célula normal ou neoplásica ou de um microrganismo.
A técnica usual utiliza um Ac secundário, que se liga ao Ac primário e é
associado a um complexo de visualização (complexo avidina-biotinaenzima-cromógeno ou polímero com amplificação).
Atualmente há disponibilidade de grande número de Ac primários para uso
em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina, permitindo
o exame imuno-histoquímico de biópsias, peças cirúrgicas e de necropsias
arquivados.
Preparados citopatológicos também podem ser utilizados nos exames imunocitoquímicos.
Imunohistoquímica
Imunofluorescencia
Trata-se de uma reação imunológica revelada com um marcador
fluorescente
A primeira técnica utilizada foi a imunofluorescência direta, onde se
pesquisou um Ag em uma reação com Ac preparado com o
fluorocromo.
Para este tipo de reação são utilizados
Ac purificados específicos para
um determinado Ag conjugados
com um fluorocromo.
Esta técnica também é
chamada de técnica de
camada simples.
Imunofluorescencia
A reação da imunofluorescência indireta, ou técnica de dupla camada, é
realizada por Ag fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um
Ac específico não fluorescente. E por último coloca-se um Ac
fluorescente, contra determinantes antigenicos do primeiro Ac.
Esta técnica apresenta como vantagem à possibilidade de se ter uma
fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo fluorescente se
ligar apenas aos anticorpos primários.
A técnica de imunofluorescência por sanduíche recebe este nome porque
o antígeno fica entre dois anticorpos. Esta técnica é aplicada para
estudar tecidos linfóides e descobrir que tipo de anticorpos está
sendo produzido.
(A)
(B)
(C)
Imunofluorescência indireta. O Anticorpo primário marcado com um fluorocromo (A) é excitado
a emitir cor (B), que é visualizado na foto de um lâmina (C).