Cromatografia de troca iônica

Métodos para a
quantificação de
proteínas
Biotecnologia
Prof. Priscilla Russo
Proteínas
Como estudar uma proteína?
1. Separá-la e purificá-la.
2. Determinar a sua massa molecular.
3. Determinar a sua composição e seqüência de
aminoácidos.
4. Elucidar a sua estrutura tridimensional.
5. Caracterizá-la funcionalmente.
Para separar proteínas
• Utilizam-se diferenças nas
propriedades físico-químicas das
proteínas, resultantes das diferentes
sequências de aa:
– Tamanho
– Solubilidade
– Carga
– Afinidade de ligação
Técnicas de separação e
purificação de proteínas:
• Diálise, ultrafiltração, centrifugação,
precipitação
• Cromatografia de exclusão molecular
• Cromatografia de troca iônica e da fase
reversa
• Cromatografia de afinidade
• Eletroforese
Princípio: diferente dimensão
e forma molecular
• Diálise
• A solução contendo a proteína é colocada no
interior do saco de diálise, que é imerso em
um grande volume de solvente
• Chega-se ao equilíbrio entre as
concentrações dos dois meios, sendo que as
proteínas continuam no interior do saco de
diálise e as outras moléculas no exterior.
Ultracentrifugação Zonal
• A solução contendo as proteínas é
colocada no topo de um gradiente de
densidade.
• Durante a centrifugação, cada proteína
se move de acordo com seu coeficiente
de sedimentação.
• Após a centrifugação, as zonas
individuais são recolhidas com auxílio
de uma seringa.
Centrifugação Diferencial
• A centrifugação separa os
componentes celulares por tamanho
e densidade
• Componentes maiores e mais densos
sedimentam (pellet) e os
componentes menores e menos
densos permanecem suspensos
(sobrenadante).
Gradiente de Densidade
Princípio: diferença de
solubilidade (precipitação)
• A solubilidade das proteínas varia
com:
– pH
– Temperatura
– Força iônica
– Constante dielétrica do solvente
Técnicas baseadas em
diferenças de solubilidade
• Precipitação isoelétrica (variação de
pH)
• Salting in / salting out (variação da força
iônica)
• Precipitação por solventes orgânicos
• Salificação (salting in): a
solubilidade aumenta até certo
ponto, com o aumento da
concentração de sal
• Dessalificação (salting out): os
sais com concentração muito
elevada retiram a água de
hidratação da proteína, então as
suas moléculas precipitam
Cromatografia
• É uma série de processos de separação de
misturas.
• Ocorre pela passagem de uma mistura
através de duas fases: uma estacionária
(fixa) e outra móvel.
• A grande variabilidade de combinações entre
a fase móvel e estacionária faz com que a
cromatografia tenha uma série de técnicas
diferenciadas.
Métodos cromatográficos
de separação de proteínas
• Diferentes tipos:
– Exclusão
molecular
– Troca iônica
– Afinidade
– Fase reversa
Cromatografia de exclusão
molecular
• Utilizado para a determinação do peso
molecular de diferentes proteínas
• Após o empacotamento da coluna, aplicase a amostra e é feita a eluição
• As moléculas maiores, que não são
capazes de penetrar nos poros do gel,
serão eluídas antes das moléculas
menores.
Cromatografia de troca iônica
• As colunas são
carregadas com grânulos
de carga oposta, retendo
as proteínas
– Ex: moléculas de carga
negativa ficam retidas,
enquanto as de carga
positiva passam pela
coluna
Cromatografia de Troca iônica
Cromatografia de afinidade
• A fase estacionária consiste geralmente de
agarose ligada a brometo de cianogênio,
formando uma ligação covalente.
• A amostra é aplicada e a proteína que possui
afinidade pelo ligante se liga a ele enquanto
as demais são eluídas da coluna.
• A proteína de interesse é então liberada da
coluna, com o uso de uma substância que
tenha mais afinidade pela proteína do que o
ligante
Determinação da composição dos
aminoácidos de uma proteína
• Ex: determinação da composição de aa
do fragmento
Ala-gly-asp-phe-arg-gly
1. Hidrolise ácida (HCl 6N, 110ºC, 24h)
2. Reação de revelação dos aa (ex ninidrina)
3. Separação e quantificação dos aa (ex.
cromatografia)
Separação e quantificação dos aa
por cromatografia HPLC
• High Pressure Liquid Chromatography
(cromatografia líquida de alta eficiência)
• Matriz de separação: utilizando diferentes
propriedades físicas de cada um dos aa, ex
carga, forma, hidrofobicidade
• Eluente: variação controlada das condições
do meio
• Detecção: após sua derivação
Resultado de uma cromatografia de aa
Integrando os picos, determina-se a quantidade
relativa de cada aa, mas não a sequência
Uso da cromatografia no diagnóstico clínico
• Leucinose
• Ex.: aumento de
leucina, isoleucina e
valina
• Defeito da
desidrogenase dos
alfa-cetoacidos
ramificados