uso do método de biureto para determinação de proteína

CONEXÃO FAMETRO: ÉTICA, CIDADANIA E
SUSTENTABILIDADE
XII SEMANA ACADÊMICA
ISSN: 2357-8645
USO DO MÉTODO DE BIURETO PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA
Érika Paula Farias da Silva; Jéfferson Malveira Cavalcante.
FAMETRO – Faculdade Metropolitana da Grande Fortaleza
PROMIC – Programa de Monitoria e Iniciação Científica
[email protected]
Sessão Temática – Desenvolvimento de Produtos e Projetos
RESUMO
Dentre os macronutrientes a proteína tem perfil construtivo e reparador, sendo de
grande importância para proteção e funcionamento do organismo. A análise de alimentos
é uma ferramenta importante para atuação do nutricionista no mercado de trabalho, pois
lhe dá o conhecimento da composição dos alimentos. A aula prática em universidades tem
como principal finalidade contextualizar o conteúdo visto em sala com a realidade
profissional do futuro nutricionista e, para análise de proteínas, muitas vezes o cenário
acadêmico prende-se ao uso do método Kjeldahl. No entanto os métodos colorimétricos
mostram-se como alternativas viáveis para análise de proteína e de fácil aplicabilidade em
laboratórios acadêmicos. Esse estudo tem por objetivo realizar uma revisão bibliográfica
do uso do método de biureto para determinação de proteína, sugerindo ao final que o
teste seja mais amplamente aplicado em análise de alimentos, haja vista a pouca
informação científica existente.
Palavras-chave: Análise de proteína. Método de Biureto. Bromatologia. Métodos
colorimétricos.
INTRODUÇÃO
As proteínas têm papel importante na alimentação devido ao seu caráter construtor,
estruturador, hormonal, enzimático, transportador e imunológico (KRAUSE & MAHAN,
2013). Essas importantes funções fazem com que devamos ter uma atenção especial na
hora do consumo de proteína, buscando consumir o mínimo recomendado de 0,8 g/kg/dia
(WHO/FAO, 1972), que pode ser alterado de acordo com a idade do indivíduo, fase da
vida, saúde e objetivos estéticos.
Tendo em vista as necessidades de consumo adequado de nutrientes, os alimentos
são cada vez mais pesquisados para que possamos conhecer a sua composição, sendo
esse conhecimento fundamental para o alcance da segurança alimentar no país. As
Tabelas de composição de alimentos dão suporte à educação nutricional, controle da
qualidade e segurança dos alimentos, avaliação e adequação da ingestão de nutrientes
de indivíduos ou populações (TACO, 2011).
Portanto é de fundamental importância que um discente do curso de nutrição tenha
entre suas valências desenvolvidas a prática laboratorial de análise de alimentos, como
preconiza o parágrafo IV do artigo 4º da Lei Nº 8.234 (BRASIL, 1991), que regulamenta a
profissão do nutricionista.
A determinação de proteína baseia-se na determinação de nitrogênio, geralmente
feita pelo processo de digestão Kjeldahl (IAL, 1985), no entanto existem outros métodos
alternativos ao Kjeldahl, que possuem menor valor de investimento inicial associado,
necessita de menos horas trabalhadas, já que este método demanda uma média de 20h,
e confiabilidade similar (ZAIA & LICHTIG, 1998; GARCIA et al., 2015).
O conhecimento de metodologias diferentes de determinação de proteínas auxilia
professores a conseguirem trazer a realidade para o aluno, aplicando práticas de
determinação com metodologias exequíveis à realidade do laboratório. Segundo Zaia,
Zaia e Lichtig (1998), a metodologia para determinação de proteína muitas vezes é
escolhida com base na popularidade, no entanto, outros critérios devem ser considerados,
tais como: custo; exatidão; quantidade de amostra; e tempo.
O método de biureto é a técnica preconizada por Gornall em 1949 e adaptada por
vários autores, recomendada pela Associação Americana de Análises Clínicas, mesmo
com a sua sensibilidade inferior a outros métodos. Em contrapartida é um método rápido,
com utilização de reagentes de baixo-custo e não apresenta variação de absortividade
específica para diferentes proteínas (ZAIA, ZAIA & LICHTIG, 1998).
O procedimento experimental é simples e econômico, pois o sulfato de cobre
dissolvido em solução alcalina é adicionado à proteína, formando um íon complexo, no
qual cada átomo de cobre está ligado a quatro nitrogênios peptídicos, apresentando
coloração azulada e a medição é realizada com auxílio da espectrofotometria (POLESEL,
SINHORINI & PERONE, 2010).
O objetivo deste artigo é verificar, através de levantamento bibliográfico, a
utilização do método de biureto na determinação de proteínas em produtos alimentícios,
de forma a aplica-lo nas práticas acadêmicas da disciplina Bromatologia, do curso de
Nutrição da Faculdade Metropolitana da Grande Fortaleza - FAMETRO.
DESENVOLVIMENTO / PERCURSO METODOLÓGICO
Para levantamento das diversas metodologias existentes para determinação
proteica por biureto, foram utilizadas as bibliotecas virtuais existente na rede internacional
de computadores, World Wide Web, sendo estes bancos o SCIELO, LILACs e PUBMed.
No total foram encontrados 40 artigos abertos que relatavam o uso do método de
biureto para determinação de proteína, aplicado a finalidades diversas, tais como
alimentos, plasma
sanguíneo
de
humanos
e
animais, tratamento
de efluentes,
composição vegetal, fertilizantes e ainda artigos comparativos entre métodos.
Dos 40 artigos, apenas 10 traziam o método de biureto de forma quantitativa,
sendo que um artigo foi excluído por tratar-se de material associado à uma empresa
fabricante de reagentes, e dois não traziam detalhamento da metodologia da forma que
pudesse ser utilizada para comparativo, restando 07 (sete) artigos para análise.
APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS
O método do biureto é um processo químico que permite determinar a
concentração de proteínas em um alimento, o reagente do biureto (inclui sulfato de cobre,
NaOH e tartarato de sódio e potássio, usado para estabilizar os íons Cu2+ em meio
básico) é adicionado a uma solução da proteína e após estabilização durante 15-30
minutos à temperatura ambiente mede-se a absorbância relativamente a um branco do
reagente. No caso de a mistura reacional não se apresentar límpida é necessário efetuar
uma centrifugação ou filtração da mesma, antes de ler a absorbância. Para obter a
concentração proteica é necessário obter previamente uma curva padrão, usando para o
efeito albumina do soro bovino - BSA (FIGUEIREDO, 2009).
Em seu estudo comparativo Zaia, Zaia e Lichtig, 1998, informam que o método é
considerado rápido, de baixo custo, com grande variação de absortividade no entanto não
muito sensível, devido à interferência de substâncias que podem reagir com os íons de
cobre do reagente sulfato de cobre, necessário para análise. Dentre as diversas
substâncias interferentes apontadas pelo autor, que podem prejudicar a análise, estão
relacionadas à área de alimentos: Lipídeos (que aumenta a turbidez da amostra,
aumentando a absorção), Lactose e Amido (provocam falso positivo), glicose, peptídeos e
aminoácidos livres (reage com o cobre existente no reagente de biureto).
Os autores recomendam a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético e
posterior solubilização para determinação das mesmas (ZAIA, ZAIA & LICHTIG, 1998).
No entanto, dentre as vantagens do método estão a não interferência com
aminoácidos livres (UNAM, 2008), contradizendo Zaia, Zaia e Lichtig (1998), afirmando
ainda haver pequena influência da composição de aminoácido no desenvolvimento de cor,
além de concordar quanto a simplicidade da análise e a pouca sensibilidade.
Raimondo et al. (2013), mostra que a correlação entre a proteína analisada pelo
método Kjeldahl e a proteína analisada pelo método de biureto possuem uma correlação
positiva de 0.989, sendo então o método de biureto relatado por eles, uma técnica precisa
para análise das proteínas do soro lácteo de vacas da raça Jersey durante a lactação.
Cabe salientar que o autor, utilizou a centrifugação para diminuir a turbidez de
amostra, além da elaboração de soluções comparativas feitas com lactose e amostras de
soro lácteo.
Outro fator importante e que deve ser controlado para não interferência é o pH,
devendo os reagentes estarem em uma faixa de pH entre 7 e 3 e 0,01 mol/L de tampão
fosfato, para soluções-padrão de soro de albumina bovina (SEVERO et al.,2007).
Bertechine Jr. (2003), relatou que o método de biureto é confiável, rápido e de
baixo custo, diante dos resultados obtidos em seu estudo, no entanto ressalta que muitos
fatores são importantes em uma análise, a sensibilidade necessária nos equipamentos,
que é dependente da concentração na amostra e do volume de amostra disponível; a
rapidez do processo e o custo da metodologia, e não menos importante o grau de
confiabilidade nos resultados obtidos.
Miwa (2003), utilizou três métodos de determinação de proteína por biureto
diferentes para análise de tratamento de efluentes, o primeiro apenas com adição de
hidróxido de sódio e sulfato de cobre à solução contendo proteína (reagente de biureto).
O segundo método além do reagente de biureto, adiciona tartarato de sódio que estabiliza
o sobre em solução. O terceiro método adiciona o reagente de biureto e posteriormente
realiza centrifugação para diminuição da turbidez. A autora concluiu que o segundo
método não funcionou bem devido a competição entre o tartarato de sódio e as proteínas
pelos íons de cobre. O primeiro e o segundo método mostraram-se pouco sensível,
provavelmente devido à pequenas concentrações de proteína no efluente.
Para bons resultados com o teste de biureto é necessário que a amostra tenha
alta concentração de proteína, ente 1 e 20 mg (RAUNKJAER et al., 1994).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os métodos colorimétricos são frequentemente utilizados para determinação de
proteína, devido à eficiência, facilidade e baixo custo, sendo o teste de biureto o método
recomendando pela Associação Americana de Análises Clínicas até os dias atuais.
Foram identificados poucos estudos do uso do método de biureto para
determinação de proteína em alimentos, havendo a necessidade de mais estudos práticos
para análise da eficiência do método.
O método de biureto é uma boa opção para popularização da análise de proteína
em universidades, seja como alternativa ao Kjeldahl (padrão ouro) ou como análise
comparativa para conhecimento melhor das variadas formas de determinação de
macronutrientes.
Foi identificada a necessidade de mais estudos comparativos entre as diversas
formas de análise de proteína, vide poucas publicações encontradas, devendo os
resultados serem comparados com resultados reconhecidos no meio científico, no caso
de alimentos reconhecidamente a tabela TACO de composição de alimentos.
REFERÊNCIAS
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