Aminoácidos, péptidos e proteínas Ficheiro - Moodle
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Aminoácidos, péptidos e proteínas Algumas funções de proteínas: Luciferina e luciferase Hemoglobina Queratina Funções das proteínas 1.Catálise enzimática 2.Transporte e armazenamento 3.Movimento coordenado 4.Suporte mecânico 5.Protecção imune 6.Geração e transmissão de impulsos nervosos 7.Controlo do crescimento e diferenciação Estrutura geral de um aminoácido como ião dipolar Convenção: Código de 3 letras : as três primeiras letras do nome Código com uma letra: Margaret Dayhoff (1925 – 1983) diminuir o tamanho dos ficheiros. CHIMSV – 6 aa – a 1ª letra do nome (é única) ex. cisteína, histidina AGLPT – 5 aa – a 1ª letra (não é única) dos aa mais comuns . Ex.leucina é mais comum que lisina. RFYW – 4 aa – sugerido fonéticamente Ex. aRginine, tYrosine DNEQ -4 aa – letras sugeridas pelos nomes Ex. asparDic, asparagiNe K – lisina - sobravam poucas letras e era a letra mais perto do L As proteínas são constituídas apenas por L-aminoácidos Relação estérea dos estereoisómeros da alanina com a configuração absoluta do L- e D- gliceraldeído Os aminoácidos podem ser classificados com base nas propriedades do grupo R Grupos R alifáticos, não polares Glicina Alanina Prolina Valina Leucina Isoleucina Metionina Grupos R aromáticos Fenilalanina Tirosina Triptofano Grupos R sem carga, polares Serina Treonina Cisteína Asparagina Glutamina Cisteína Cistina Cisteína Grupos R carregados positivamente Lisina Arginina Histidina Grupos R carregados negativamente Aspartato Glutamato Aminoácidos não comuns também têm papéis importantes Paredes celulares de plantas Colagéneo 4 - Hidroxiprolina 5 - Hidroxilisina Colagéneo 6 – N - Metillisina Miosina – proteína contráctil do músculo γ - Carboxiglutamato Protrombina – proteína envolvida na coagulação do sangue Outras proteínas que se ligam ao Ca Alguns resíduos de aa podem ser modificados transientemente (adição de grupos fosforil, metil, acetil, etc) – modificações regulatórias Ornitina e citrulina – aa envolvidos na biossíntese de arginina e no ciclo da ureia. Forma não iónica Forma zwiteriónica O estado de ionização de um aminoácido depende do pH Os aminoácidos podem funcionar como ácidos ou bases fracos Titulação de um aminoácido Efeito do ambiente químico sobre o pka Curva de titulação do glutamato Curva de titulação da histidina Sumário: •Os 20 aa têm um grupo α-carboxílico e um grupo α-amino. O C α é assimétrico. Nas proteínas apenas há L- aa. • Outros aa menos comuns, existem quer nas proteínas (após modificação) ou como metabolitos livres •Os aa são classificados em 5 grupos com base na sua polaridade e carga (a pH 7) do seu grupo R. •Os aa variam nas suas propriedades ácido-base e têm curvas de titulação características. Péptidos e Proteínas A ligação peptídica Ligação peptídica dipéptido Ligação peptídica dipéptido tripéptido tetrapéptido pentapéptido ... oligopéptido...polipéptido MM‹10 000 Da Um pentapéptido Terminal N ou amina Terminal C ou carboxilo Ser–Gly–Tyr–Ala–Leu serilgliciltirosilalanileucine SGYAL Estrutura predominante do tetrapéptido alanilglutamilglicillisina a pH7 Carga global 0 pI = 7 Ponto isoelétrico de uma proteína – pH ao qual a carga global é zero Péptidos com importância biológica adoçante L-aspartil-L-fenilalanina metiléster hormona Piroglutamato Prolilamida Histidina piroGlu-His-Pro-NH2 TRH - hormona de libertação da tirotropina hormona Piroglutamato Prolilamida Histidina piroGlu-His-Pro-NH2 TRH - hormona de libertação da tirotropina forma-se no hipotálamo a partir de Glu-His-Pro Outras hormonas que são péptidos Oxitocina (9 res) – pituitária; estimula as contracções uterinas Bradicinina (9 res) – inibição da inflamação de tecidos Vasopressina – aumento a tensão arterial Insulina (2 cadeias com 30 res) – reduz a glucose no sangue promovendo a sua entrada nas células. Venenos Amanitina Amanitin is the most powerful poison ... Antibióticos gramicidinas, polimixinas, bacitracinas, glicopéptidos, etc Neuropéptidos: encefalinas, endorfinas... Massa Molecular de algumas proteínas MM nº res nºcadeias Nº aproximado de aa de uma proteína = MM/110 Proteínas constituídas por uma cadeia polipeptídica Proteínas multiméricas – dois ou mais polipéptidos iguais ou diferentes, associados não covalentemente. As subunidades idênticas chamam-se protómeros. Ex. hemoglobina Algumas proteínas têm duas cadeias polipeptídicas ligadas covalentemente Ex.insulina bovina Composição em aminoácidos de duas proteínas Cálculo do nº de aminoácidos de uma proteína Massa molecular média dos aminoácidos = 138 Média ponderada dos aminoácidos mais frequentes = 128 Eliminação de uma molécula de água por ligação peptídica 128 – 18 = 110 Massa molecular média de um resíduo de aa numa proteína 110 Massa molecular da proteína / 110 = nº de aa de uma proteína “Simples” Proteínas Conjugadas Grupo prostético Proteína conjugada g.prostético exemplo Lipoproteína Lípido Β1-lipoproteína sangue Glicoproteína Fosfoproteína Hemoproteína glúcido Imunoglobulina G Caseína do leite Hemoglobina fosfato Hemo (Fe porfirinico) Metaloproteína Fe Ferritina “ “ “ Zn Alcooldesidrogenase Ca Calmodulina Mo Dinitrogenase Flavoproteína FAD Succinato desidrogenase Proteínas em solução Interacções electrostáticas entre macroiões Variação da solubilidade de proteínas com o pH e força iónica I = ½ ∑ MiZi 2 Salting in – Aumentando a concentração de sal, a solubilidade de uma proteína aumenta. Salting out – A concentrações salinas muito elevadas, a solubilidade das proteínas diminui. Células e tecidos usados em estudos bioquímicos E.coli, S.cerevisiae, chlamydomonas, folha de espinafre, fígado de rato, músculo esquelético Fonte homogénea e grande quantidade: culturas de microrganismos, tecidos, mutantes genéticos. Alguns materiais são ricos num componente específico: Músculo esquelético – actina e miosina Células do pâncreas – RER Células espermáticas – DNA Células do fígado – enzimas das vias biosintéticas Folhas de espinafre, eritrócitos, vírus, … As proteínas podem ser separadas e purificadas Tecido ou células ↓ lise Extracto bruto ↓Fraccionamento subcelular Extracto ↓ Fraccionamento de proteínas ↓ Proteína em estudo As proteínas podem ser separadas e purificadas Solubilidade – “Salting out” Tamanho – Diálise, cromatografia de exclusão molecular Carga – Cromatografia de troca iónica Afinidade – Cromatografia de afinidade Diálise Cromatografia em coluna reservatório Fase móvel (amostra de proteínas) Fase estacionária (matriz porosa) suporte poroso efluente proteínas Carga + + Carga + CargaCarga- - Partículas poliméricas com grupos funcionais negativos As proteínas movem-se através da coluna a velocidades dependentes da carga e do pH usado Cromatografia de troca iónica (catiónica) Explora diferenças de sinal e intensidade de carga eléctrica de proteínas a um determinado pH Questão: Um biólogo pretende separar dois péptidos por cromatografia de troca iónica. Ao pH da fase móvel a usar na coluna, um péptido (A) tem uma carga global de -3, devido à presença de mais resíduos Glu e Asp do que Arg, Lys e His. O péptido B tem uma carga global de +1. • Qual dos péptidos seria primeiro eluído de uma resina de troca catiónica? • Qual seria eluído primeiro de uma resina de troca aniónica? Cromatografia por exclusão ou filtração gel Partículas poliméricas porosas As moléculas de proteína separam-se por tamanho; as maiores saiem (eluem) primeiro Cromatografia de afinidade Proteína X ligando Amostra inicial (mistura de proteínas) Solução do ligando Mistura de proteínas é adicionada à coluna contendo um polímero com um ligando específico para a proteína X Proteínas diferentes de X são retiradas por lavagem da coluna Proteina X é eluida por solução de ligando HPLC- high performance liquid cromatography Exemplo de tabela de purificação do enzima X Passo Vol. fracção(ml) Prot. total(mg) Activ. Activ. espec. 1 400 10 000 100 000 10 2. prec. c/ sulf. am. 280 3000 96 000 32 3. crom. troca ion. 90 400 80 000 200 4. filtração gel 80 100 60 000 600 5. crom. afinidade 6 3 45 000 15 000 1. extracto cru Actividade vs actividade específica Os dois copos contêm a mesma actividade da proteína. O segundo tem uma actividade específica mais elevada electroforese Amostras diferentes em cada poço poço direcção da migração Gel de poliacrilamida Purificação de RNA polimerase de E.coli 1 2 3 4 5 6 Determinação do peso molecular de uma proteína Isoelectrofocagem: separa proteínas conforme o pI Pontos isoeléctricos de algumas proteínas Electroforese a duas dimensões: combinação de isoelectrofocagem e electroforese em acrilamida Níveis de estrutura na proteína primário quaternário secundário terciário Estrutura covalente das proteínas A purificação de uma proteína é o principio… A função de uma proteína depende da sua sequência de aminoácidos • Proteínas com diferentes funções têm diferentes composições em aa. • Doenças genéticas humanas envolvendo alterações em aa, têm na origem proteínas com funções alteradas. • Proteínas com funções semelhantes em espécies diferentes, têm sequências de aa semelhantes (ex. a ubiquitina). Polimorfismo. A sequência de aminoácidos de uma proteína é invariante? 20-30% das proteínas no homem são polimórficas (variantes) Como determinar a sequência ? Sequência de aminoácidos da insulina bovina – a 1ª proteína a ser sequenciada Determinação da sequência em aminoácidos de uma proteína (estrutura primária) 1.Determinação da composição em aminoácidos: Proteína completamente hidrolisada (110 0 C, 24h em HCl 6N). Aa separados e quantificados por cromatografia de troca iónica 2. Identificação do aminoácido N – terminal Método de Sanger (FDNB) Degradação de Edman (fenilisotiocianato) polipéptido Reagente de Sanger Mistura dos restantes aa (inutil para prosseguir) 2,4dinitrofenil deriv. do polipép. 2,4-dinitrofenil deriv. do res N terminal Sequenciação de um polipéptido polipéptido Reagente de Sanger Mistura dos restantes aa (inutil para prosseguir) 2,4dinitrofenil deriv. do polipép. 2,4-dinitrofenil deriv. do res N terminal Apenas permite identificar aa do terminal N Sequenciação de um polipéptido polipéptido Reagente de Sanger Mistura dos restantes aa (inutil para prosseguir) 2,4dinitrofenil deriv. do polipép. Reagente de Edman 2,4-dinitrofenil deriv. do res N terminal PTIC feniltio isocia nato Identificação do aa N terminal aducto PTC Polipéptido com n-1 resíduos que reage de novo com PTIC cloreto de dansilo cloreto de dabsilo 3. Cisão das pontes dissulfureto As ligações dissulfureto interferem com o procedimento de sequenciação. Oxidação pelo ácido perfórmico Redução pelo ditiotreitol(DTT) ou β-mercaptoetanol lig.persulfureto Ditiotreitol (DTT) oxidação ac. perfórmico 2 res. ácido cisteico Redução por DTT acetilação por iodoacetato cisteínas acetiladas 4. Fragmentação dos péptidos A cadeia polipéptica é fragmentada em segmentos mais pequenos que são depois separados por métodos cromatográficos ou electroforéticos Especificidade de alguns métodos comuns de fragmentação de cadeias polipeptídicas reagente (fonte) ponto de clivagem Tripsina (pâncreas bovino) Submaxillarus protease (glândula submaxilar) Quimotripsina (pâncreas bovino) Protease V8 (Staphylococcus aureus) Asp-N- protease (Psedomonas fragi) Pepsina (estômago de porco) Endoprotease Lys C (Lysobacter enzymogenes) CNBr 5. Sequenciação dos péptidos Cada péptido é sequenciado pelo procedimento de Edman. 6. Ordenamento dos fragmentos do polipéptido inicial Utilizam-se outros enzimas ou químicos para reconstruir a sequência da proteína original Sequenciação de uma proteína 7. Localização das ligações dissulfureto A proteína é hidrolisada com um enzima (ou químico) mas sem antes se terem cindido as ligações dissulfureto. Os péptidos são separados por electroforese e comparados com o conjunto de péptidos gerados pelo mesmo enzima (químico). Por cada ligação dissulfureto não aparecerão dois péptidos e será visível um péptido maior. A sequência de aminoácidos pode ser deduzida por outros métodos A sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína fornece informações sobre: • Estrutura tridimensional •Função •Localização celular •Evolução Níveis de estrutura na proteína primário quaternário secundário terciário
