Aula 12 PCR
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Universidade Tiradentes Mestrado em Biotecnologia Industrial PCR Sibele Borsuk [email protected] [email protected] REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) PCR Polymerase Chain Reaction Amplificação in vitro de uma seqüência específica de DNA * replicação in vitro Aplicações da Técnica de PCR Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas Amplificação de genes para posterior clonagem e expressão Determinação de variabilidade genética Deteção de OGMs Sexagem de embriões Estudo da expressão gênica História Kary Mullis (1983) Prêmio Nobel Química (1993) Revolucionou genética pesquisa genética medicina forense genética molecular Componentes da reação DNA molde Oligonucleotídeos (primer) dNTP’s DNA Polimerase Magnésio Tampão Água Equipamento TERMOCICLADOR CICLOS PCR Programa 94 0C por 5 min 94 0C por 1 min 55 0C por 1 min 72 0C por 1 min 72 0C por 5 min 4 0C 35 ciclos ETAPAS -Extração de DNA -Desenho dos Primers -Reação de PCR - Análise dos resultados Obtenção do DNA genômico DELINEAMENTO DE PRIMERS Os iniciadores (oligos / primers) são a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR. - Tamanho dos primers; - Estabelecimento das temperaturas corretas a serem utilizadas; DELINEAMENTO DE PRIMERS Primer Forward 5’ TAGAAGCTTCCAGCCATGAACTCAG 3’ Tm: 57.9 Enzima: Hind III Anelamento: 16 nt Total primer: 25 nt Primer Reverse 5’ ACGGAATTCTCAGAGTGCAGTTTG 3’ Tm: 56.4 56. Enzima: Eco RI Anelamento: 15 nt Total primer: 24 nt ANELAMENTO E POLIMERIZAÇÃO ETAPAS DA PCR 30-60°C ETAPAS DA PCR DESNATURAÇÃO ANELAMENTO POLIMERIZAÇÃO Eletroforese Eletroforese em Gel de Agarose Eletroforese em gel de agarose Visualização do DNA em luz ultravioleta Resultados Eletroforese do DNA em gel de agarose 0.8% Resultados Limitações Extração do DNA da amostra é crítica Alguns compostos podem inibir a polimerase Condições específicas para cada reação Falsos resultados positivos devido a contaminação. Falsos resultados negativos. Análises conduzidas em laboratórios especializados. http://www.pcrlinks.com/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Tipos de PCR AFLP Alu-PCR Asymmetric PCR Colony PCR DD-PCR Degenerate PCR Hot-start In situ PCR Inverse PCR Long-PCR Multiplex PCR Nested PCR PCR-ELISA PCR-RFLP PCR-SSCP QC-PCR RACE RAPD Real-Time PCR Rep-PCR RT-PCR TAIL-PCR Touchdown PCR Vectorette PCR Aditivos PCR Additivos Aumentam a especificidade da reação DMSO (dimethyl sulfoxide), genomas ricos em GC Formamide Estabilizante de enzima Non-ionic detergents –Triton X 100 Tween 20 or NP-40estabilizante de enzima TMAC (tetramethylammonium chloride) BSA (bovine serum albumin),
