RAMOS, Juliana da C., SILVA, Ana CG 1 ., FEIJÓ

Produção de Controles Positivos para o Diagnóstico
Molecular do Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV)
e Vírus da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética
(IHHNV) em Camarões Cultivados
*RAMOS, Juliana da C., SILVA, Ana C G1., FEIJÓ, Rubens G1., ABREU, Paulo C.1, MARINS, Luis F.1
¹ Universidade Federal do Rio Grande (FURG), Av. Itália, km 8 /Rio Grande- RS,
Contato: [email protected]
Palavras chaves: PCR, enfermidades, WSSV, IHHNV.
Introdução
Ao longo da última década, têm sido registrados problemas consideráveis com
enfermidades na carcinicultura, principalmente devido a doenças virais (FAO, 2003). Dentre as
principais doenças virais que acometem crustáceos, o vírus da Infecção Hipodermal e Necrose
Hematopoiética (IHHNV) é o mais comumente encontrado nos cultivos brasileiros. Já o vírus da
Síndrome da Mancha Branca (WSSV) é o que provoca os maiores índices de mortalidade em
crustáceos (LIGHTNER, 2005).
Para o diagnóstico dos vírus WSS e IHHN em crustáceos podem ser utilizadas técnicas
histopatológicas e/ou ferramentas moleculares, a exemplo da reação em cadeia da polimerase
(PCR), considerada de caráter confirmatório pela sensibilidade e especificidade gerada no
diagnóstico de enfermidades de organismos aquáticos (OIE, 2003).
Diante do exposto acima, o objetivo deste trabalho é a clonagem e produção de
controles positivos para o diagnóstico molecular do WSSV e do IHHNV em camarões
cultivados.
Metodologia
Para a obtenção de fragmentos de DNA do WSSV e IHHNV foram utilizados amostras
de camarões contaminados adquiridos do Centro de Estudos de Enfermidades de Organismos
Aquáticos (CEDECAM) da Universidade Federal do Ceará. Os controles positivos para a
detecção dos vírus foram obtidos a partir do isolamento de 1447 pb do WSSV e 389 pb do
IHHNV amplificados por PCR em amostras WSSV+ e IHHNV+ de camarões.
Os fragmentos foram ligados em vetor de clonagem e utilizados para transformar cepas
de E. coli. O DNA plasmidial foi extraído pelo método de miniprep e os controles positivos
foram confirmados por PCR utilizando-se primers específicos para a detecção os vírus WSS e
IHHN (Duran & Lightner, 2002; Tang & Lightner, 2001).
Resultados e Discussão
A análise de PCR dos controles positivos construídos confirmou a presença de 1447 pb
para o WSSV e 389 pb para o IHHNV usando como amostras as diluições seriais (100 a 10-9)
do DNA plasmidial (Figuras 1 e 2).
Fig. 1 - Validação por PCR do controle positivo produzido para a detecção do WSSV. 100 a 10-9 diluições seriadas; M: marcador
molecular (1 Kb DNA ladder plus); B: controle negativo.
Fig. 2 - Validação por PCR do controle positivo produzido para a detecção do IHHNV. 100 a 10-9 diluições seriadas; M: marcador
molecular (1 Kb DNA ladder plus); B: controle negativo.
A técnica de clonagem gênica permite a produção in vitro de controles positivos a partir
de clones transformados com fragmentos de DNA de patógenos específicos, evitando o
emprego direto de amostras de animais contaminados.
Conclusão
Os controles positivos para os vírus WSS e IHHN aqui produzidos serão fundamentais
para garantir uma maior confiabilidade na execução de diagnósticos moleculares realizados
pelo Laboratório de Biologia Molecular (FURG), envolvendo desde a detecção molecular do
patógeno por PCR convencional até a quantificação de sua carga viral por PCR em Tempo
Real (qPCR).
Referências Bibliográficas
FAO - Global Aquaculture Production. Diponível em: http://www.fao.org.
LIGHTNER, V. D. Biosecurity in Shrimp Farming: Pathogen Exclusion through use of SPF Stock
and Routine Surveillance. 2005
OIE - OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES. OIE Listed diseases. Disponível em:
http://www.oie.int/fr/normes/fmanual/A_00048.htm
DURAND, S. V & LIGHTNER, D. V. Quantitative real time PCR for the measurement of white
spot syndrome virus in shrimp. 2002.
TANG, K. F. J. & LIGHTNER, D. V. Detection and quantification of infectious hypodermal and
hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp by real-time PCR. 2001.