Método alternativo de purificacao de produto de PCR para

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54º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
Bahia Othon Palace Hotel • Salvador • BA • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Método alternativo de purificacao de
produto de PCR para sequenciamento
Silva, NA1; Villela, PMS1; Boschiero, C1; Andrade, JLF1; Coutinho, LL1
Escola Superior de Agricultura “ Luiz de Queiroz” -Departamento de Zootecnia – Universidade de São Paulo - ESALQ/USP
[email protected]
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Palavras-chave: PCR, sequenciamento, purificação
O sequenciamento de produto de PCR é amplamente utilizado para identificar sequências de DNA e também para
confirmar regiões específicas do genoma de diferentes organismos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método
alternativo de baixo custo para purificação dos produtos de PCR, utilizando os reagentes isopropanol e etanol. A
purificação do produto de PCR é um passo importante, umas vez que, os nucleotídeos e os primers não incorporados
podem interferir na reação de sequenciamento. O método proposto consistiu em precipitar a reação de PCR com dois
volumes de isopropanol 65%, seguido de centrifugação à 13000 rpm por 5 minutos, lavagem com o mesmo volume
de etanol 70%, seguido de centrifugação à 13000 rpm por 5 minutos, deixando os tubos invertidos secando por
1 hora e ressuspendidos em 20 µl de água miliQ. Foi realizado um experimento comparando a eficiência do método
proposto com um kit comercial, utilizando dois pares de primers que amplificam regiões mitocondriais especificas de
Jacaré (Caiman latirostris) com 320 pb e 730 pb e dois pares de primers do gene IGF- I (insulin-like growth factor I)
de frango (Gallus gallus) 703 pb e 839 pb. Os produtos purificados com ambos os métodos foram utilizados para
reação de sequenciamento e após a purificação da mesma, as amostras foram processadas no sequenciador de DNA
ABI 3100. As sequências obtidas foram analisadas e comparadas utilizando o programa Phred, Phrap e Consed. O
resultado das sequências obtidas com os dois métodos, não apresentaram diferença significativa quanto ao número de
bases sequenciadas e quanto a qualidade das bases, ambas foram de boa qualidade (bases com qualidade Phred ≥ 20).
Em conclusão, o método de precipitação proposto pode ser utilizado para purificar produtos de PCR para reação de
sequenciamento.
Apoio financeiro: FAPESP, ESALQ/USP.
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