Técnica de PCR

Técnica de
PCR
Bruna dos Santos
Graduanda do 3º ano do curso de Medicina Veterinária
Unesp- Botucatu
Agosto de 2012
Extração de DNA
 PCR
 Visualização dos resultados:
Eletroforese em gel de agarose

Extração de DNA

É realizada para a que o DNA seja
separado dos demais componentes
celulares (proteínas e lipídios, por
exemplo). Com sua precipitação pode
então ser coletado das amostras e
utilizado para técnica de PCR.
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
 Replicação de DNA “in vitro”
 Reagentes da reação:
-DNTPs(nucleotídeos A, T,C eG)
-Solução tampão
-MgCl²
-Primers
-DNA polimerase

PCR

1
C
i
c
l
o
Para que ocorra a reação são
necessárias mudanças na temperatura:
- 94-96ºC por 1minuto de modo a
separar as duas cadeias de DNA
- 50-65ºC, durante 1 minuto para ligação
dos primers a cadeia de DNA
- temperatura eleva-se a 72 ºC/1 minuto
e a enzima Taq polimerase replica a
cadeia de ADN.
*Valores de TºC e tempo não são fixos
PCR
São realizados em média nas reações
de 30 ciclos, permitindo que a uma
única molécula de DNA na amostra
possa originar 1.073.741.793
 Essa variação e repetição de
temperatura é feita no laboratório por
um equipamento chamado
Termociclador

Visualização dos resultados:
Eletroforese em gel de agarose
Princípio da eletroforese:
-Macromoléculas que possuem carga
elétrica são capazes de movimentar-se,
quando submetidas à um campo
elétrico, sendo atraídas pelo pólo de
carga oposta.
 Gel de agarose (meio suporte): separa
as moléculas de DNA pelo tamanho. As
moléculas maiores tem mais dificuldade
de passar através do gel

Visualização dos resultados:
Eletroforese em gel de agarose

No gel é incluído Brometo de etídio,
substância fluorescente em luz
ultravioleta e que liga ao DNA,
permitindo a visualização das bandas
Resumo enviado para o XXIV
Congresso de Iniciação
Científica
 Detecção molecular de Histoplasma
capsulatum em quirópteros da região de
Botucatu, São Paulo
-89 morcegos (amostras de pulmão)
-PCR utilizando os primers ITS4 e ITS5;
Nested-PCR utilizando os primers HC1
eHC2
-31 positivos
-34,8%
dos
animais
naturalmente
infectados