Reação de PCR

Reação de Polimerização em
Cadeia - PCR
1-Introdução
2-Automatização da PCR
3-Sistema de reação
4-Iniciadores – primers
 A PCR é um sistema para a
replicação do DNA in vitro, que
permite que uma seqüência
“alvo” de DNA seja amplificada
em milhares de cópias em
apenas algumas horas.
Introdução
 1985 – Primeira Publicação - Science
 Cetus Corporation – R. Saiki; F. Faloona; G. Horn; K.
Mullis; H. Erlichand; N. Arhneim.
 Descreveu a PCR: Fragmento específico de DNA
multiplicado milhares de vezes – amplificação
 1993 – Prêmio Nobel em Química
Kary Mullis
Ciclos da PCR - Gráfico
Etapa 1:
DESNATURAÇÃO
94-96˚C por 30’
1˚ Ciclo
Etapa 2:
ANELAMENTO
50- 65˚C por 1min
2˚ Ciclo
Etapa 3:
POLIMERIZAÇÃO
72˚C por 1min
Número de ciclos numa reação: 30 a 35
 Taq DNA Polimerase
 Bactéria termoestável Thermus aquaticus
Automatização da PCR
Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas,
controladas por computador
Termociclador
Componentes da PCR
Mg 2+
Taq Polimerase
Tampão 10x
dCTP
dNTP
dGTP
dATP
dTTP
H20 Milli-Q
Iniciadores:
Forward/Reverse
4-Iniciadores - primers
• Tamanho – entre 10 a 30 bases
• Composição de bases - ~50% de
G/C
• Seqüências – não devem ter
complementaridades intra ou inter
molecular
• Cálculo da Tm
4-Iniciadores - primers
Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos
iniciadores
• Do inglês: melting temperature
• Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio
entre a formação e a dissociação dos híbridos
gerados pelo estabelecimento de pontes de
hidrogênio
• Para o cálculo:
• Tm= 2(A+T) + 4(G+C)
APLICAÇÕES:
Medicina forense;
identificação de patógenos (diagnóstico molecular);
Genótipos (identificação de vírus, p. ex.)