Utiliza o da t cnica de duplo h brido na identifica o de

IV Reunião Regional da FeSBE
ResumoID: 332-1
Utilização da técnica de duplo híbrido na identificação de interações entre proteínas
BORGES CL, SOARES CMA, SALEM-IZACC, SM, Bailao, AM
Universidade Federal de Goiás/DPTO BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOL, UFG
ICB II, SALA 206, CAMPUS SAMAMBAIA
Palavras-chaves: duplo híbrido em levedura, fungos, interação proteína-proteína
OBJETIVOS:
Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico causador da paracoccidioidomicose, uma doença endêmica na America
Latina. A transição da forma miceliana (22°C) para forma levedura (36 °C) é induzida pela mudança da temperatura do ambiente para
aquela no hospedeiro mamífero. Genes que são diferencialmente expressos nas fases de P. brasiliensis podem ser relevantes para o
dimorfismo, e para o estabelecimento da infecção. No presente trabalho descrevemos a análise de genes diferencialmente expressos
de P. brasiliensis. O gene da formamidase foi descrito como altamente expresso na fase miceliana de P. brasiliensis, isolado Pb01.
Formamida aminohidrolase (formamidase, EC 3.5.1.49) catalisa a hidrólise específica da formamida para produção de amônia e
formato. Nós identificamos a formamidase de P. brasiliensis, a qual reage com anticorpos presentes em soro de pacientes infectados
com P. brasiliensis. O objetivo do trabalho é a identificação de proteínas que possam interagir com a proteína formamidase ou com
outras proteínas de interesse estudadas no fungo patogênico humano P. brasiliensis.
MÉTODO:
O sistema de duplo-híbrido em Saccharomyces cerevisiae é utilizado para rastrear interações entre proteínas por meio da utilização de
uma biblioteca de cDNA e de um cDNA do qual se deseja rastrear interações (isca). Os cDNAs que representam a biblioteca são
clonados em vetor de expressão pGADT7-Rec (que confere auxotrofia para leucina) em fase de leitura com o domínio GAL4 de
ativação transcricional, os quais são utilizados para a transformação de leveduras AH109, com o gene LEU2 deletado. O cDNA da isca
é clonado em vetor pGBKT7, que contém gene TRP1, (que confere auxotrofia para triptofano) em fase de leitura com o domínio GAL4
de ligação ao DNA, o qual é utilizado para transformação de leveduras Y187, com o gene TRP1 deletado, utilizando-se sistema
comercial (MatchmakerTM Library Construction & Screening-Clontech Laboratories, Inc.). As duas linhagens de leveruas são
submetidas a acasalamento e as interações positivas são selecionadas em meio mínimo sem os aminoácidos triptofano, adenina, leucina
e histina. Os clones provenientes de interação positivas são seqüenciados (MegaBACE 1000 - GE Healthcare). Interações positivas in
vivo são confirmadas in vitro em sistema comercial de co-imunoprecipitação Matchmarker CO-IP (Clontech Laboratories, Inc.).
RESULTADOS:
A formamidase de P. brasiliensis foi submetida a ensaio em sistema de duplo híbrido para rastreamento de prováveis interações in vivo.
Dentre as seqüências identificadas foi encontrada a poliubiquitina (ubq10). Ubiquitinas são proteínas que se ligam covalentemente a
proteínas alvo que devem ser degradadas ou processadas, podendo estar envolvida no processamento ou degradação da formamidase
de P. brasiliensis. Uma peptidil-prolil-isomerase (FKBP) foi encontrada no rastreamento de duplo híbrido. Essas enzimas são
conhecidas por se ligarem a proteínas favorecendo seu dobramento, interações e endereçamento celular. A calnexina de P. brasiliensis
foi encontrada como proteína que interage com a formamidase. As calnexinas reconhecem proteínas glicosiladas no retículo
endoplasmático, sendo importante no enovelamento dessas proteínas glicosiladas nascentes que serão secretadas. Uma glicosil hidrolase
de parede celular de P. brasiliensis (Dfg5) também foi identificada nos seqüenciamentos. Dfg5 é uma proteína requerida para a
formação da parede celular e filamentação em fungos e sua detecção poderia estar também relacionada com a localização da
formamidase na parede celular de P. brasiliensis.
CONCLUSÃO:
A formamidase de P. brasiliensis deve desempenhar funções celulares relevantes, visto a alta expressão do transcrito e da proteína, e a
expressão diferencial em condições que mimetizam infecção em nichos do hospedeiro. A localização celular da formamidase na
superfície de P. brasiliensis poderia estar relacionada à destruição celular e resistência à ambientes ácidos, além de seu provável papel
no metabolismo de nitrogênio do fungo. As interações da proteína formamidase com outras proteínas em P. brasiliensis deve estar
relacionada com sua localização incomum na parede celular/membrana e com suas possíveis funções antigênicas do fungo, bem como
de resistência do fungo a ambientes ácidos e da possível função de destruição tecidual efetuada pelos metabólitos da formamidase,
importante para o sucesso da infecção por P. brasiliensis.
Apoio Financeiro: FINEP-CNPq