Aula 06 - azevedolab.net

© 2015 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.
Macromoléculas Biológicas
Objetivos
Visualizar a estrutura tridimensional de peptídeos e proteínas, usando-se recursos
computacionais. Montar modelos estruturais de proteínas, usando-se kit de plástico.
Materiais
1. Computador iMac;
2. Programa VMD (Visual Molecular Dynamics) para visualização de macromoléculas
biológicas;
3. Kit de montagem de proteína “Protein Folder”;
4. Arquivos com coordenadas atômicas de proteínas.
Introdução
Na análise da estrutura de uma proteína, podemos visualizar diferentes níveis de
complexidade. Do mais simples para o mais complexo. A sequência de resíduos de aminoácidos é a
estrutura primária. A identificação das partes da estrutura primária que formam hélices, fitas e laços é
a estrutura secundária. As coordenadas atômicas de todos os átomos que formam a proteína é a
estrutura terciária. Por último, se a proteína tem mais de uma cadeia polipeptídica, esta apresenta
uma estrutura quaternária. A figura abaixo ilustra os níveis de complexidade estrutural para a proteína
purina nucleosídeo fosforilase. Todas as proteínas têm até a estrutura terciária, as que apresentam
mais de uma cadeia peptídica formando um oligômero têm estrutura quaternária.
Figura 1. Níveis estruturais das proteínas. A proteína mostrada na figura é a purina nucleosídeo
fosforilase humana.
A tabela 1 mostra a denominação para as principais estruturas quaternárias de proteínas
Tabela 1. Principais estruturas quaternárias de proteínas.
Estrutura quaternária
Número de monômeros
Dímero
2
Trímero
3
Tetrâmetro
4
Pentâmero
5
Hexâmero
6
Heptâmero
7
Octâmero
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Procedimento
1) CDK2
Ao entrar em processo de divisão, a célula eucariótica segue uma série de eventos chamados de
ciclo celular. A figura abaixo ilustra tais eventos (figura 2).
Figura 2. Progressão do ciclo celular (fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle). G0 é a fase
quiescente, G1 é chamado gap 1 (intervalo 1), onde a célula aumenta de tamanho. S (síntese),
quando ocorre a replicação do DNA. G2 é o gap 2, a célula continua a crescer, este é o intervalo
entre a replicação do DNA e a mitose (fase M).
Para passar de G1 para S (etapa onde ocorre a replicação do DNA) é necessário que uma
proteína esteja ativa, a CDK2, sigla em inglês para Cyclin-Dependent Kinase 2, ou seja, quinase
dependente de ciclina 2. Para sua ativação a CDK2 precisa ligar-se numa outra proteína, chamada
ciclina, e sofrer fosforilação no resíduo Thr 161 e desfosforilação nos resíduos Thr 14 e Tyr 15, como
indicado no diagrama abaixo (figura 3) (CANDURI & DE AZEVEDO, 2005).
Figura 3. Ativação da CDK2. Fosforilação do resíduo Thr 161 pelo complexo CDK7-ciclina H e
desfosforilação dos resíduos Thr 14 e Tyr 15 pela fosfatase cdc25 (Fonte: CANDURI & DE
AZEVEDO, 2005).
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Descobriu-se que, aproximadamente 50 % dos tumores cancerígenos apresentam mutação no
gene que codifica uma proteína inibidora de CDK2, ou seja, há uma correlação entre a não inibição
de CDK2 e câncer. Tal observação levou à procura de pequenas moléculas (moléculas com massa
molecular menor que 1000 Dáltons) que pudessem inibir a CDK2, e apresentarem atividade
anticancerígena. Para isto foi elucidada a estrutura tridimensional da CDK2, a partir da técnica de
cristalografia por difração de raios X. O estudo da estrutura permitiu a identificação do sítio ativo da
CDK2 e o desenho de inibidores competitivos. A figura 4 ilustra a estrutura da CDK2 com um fármaco
anticancerígeno, chamado roscovitine (DE AZEVEDO et al., 1997).
Figura 4. Estrutura tridimensional da CDK2 em complexo com o fármaco roscovitine.
A estrutura da CDK2 é formada por dois lóbulos, um com preponderância de fitas beta
(terminal N) e outro com preponderância de hélices alfas, o inibidor liga-se no sítio ativo localizado
entre estes dois lóbulos.
Carregar coordenadas atômicas da proteína CDK2 (arquivo CDK2.pdb) no programa VMD.
Visualizar a proteína nos seguintes esquemas de visualização (Graphics Representations
Drawing Method nas opções: line, VDW, CPK e NewCartoon;
2) Montagem de Modelos Estruturais
Os canais de K+ dependentes de voltagem são de fundamental importância na sinalização nervosa
(comunicação entre a célula pré-sináptica e célula pós-sináptica), assim qualquer interferência com
esta proteína transmembranar pode ter efeitos danosos à transmissão do sinal nervoso. Algumas
espécies de escorpião tiram vantagem disso para paralisar suas presas. Podemos pensar no veneno
de escorpiões como um coquetel de peptídeos e proteínas. Um dos componentes do veneno do
escorpião (Leiurus quinquestriatus hebraeus)(figura 5) apresenta uma neurotoxina, formada por um
peptídeo de 38 resíduos de aminoácidos (agitoxina 2), que bloqueia o canal de K+ dependente de
voltagem, paralisando sua vítima.
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Figura 5. Escorpião Leiurus quinquestriatus hebraeus (Fonte da foto:
http://www.latoxan.com/VENOM/SCORPION/Leiurus-quinquestriatus-hebraeus.php)
Carregar coordenadas atômicas da proteína (arquivo agitoxina2.pdb) no programa VMD.
Visualizar a proteína no seguinte esquema de visualização (Graphics Representations
Drawing Method na opção: NewCartoon. No Coloring Method na opção Secondary Structure. Faça
um esboço (desenho) da estrutura secundária da Agiotoxina 2.
Use o kit de montagem “Protein Folder” e monte a estrutura que você está visualizando na tela.
3) Visualização da Hemoglobina S
A partir da elucidação da estrutura tridimensional da hemoglobina (uma proteína formada
preponderantemente por hélices) foi possível identificar as bases estruturais da patologia conhecida
como anemia falciforme. Tal doença é caracterizada pela mutação de um resíduo de aminoácido da
hemoglobina. A mutação é de glutamato para valina, na posição 6 da cadeia beta. Esta
denominação de cadeia beta não está relacionada com a estrutura secundária. Pessoas com tal
patologia apresentam problemas de circulação devido à perda de flexibilidade da hemácia. Vamos
visualizar a estrutura da hemoglobina de pessoas que apresentam tal mutação.
Carregar coordenadas atômicas da hemoglobina S (arquivo hemoglobinaS.pdb) no programa VMD.
Visualizar a proteína nos seguintes esquemas de visualização (Graphics  Representations 
Drawing Method  NewCartoon. No Coloring Method na opção Chain. Você tem na tela a estrutura
da hemoglobina S, presente em pacientes com anemia falciforme.
Qual a estrutura quaternária desta proteína? (Use a Tabela 1)________________________
A mutação que leva à anemia falciforme ocorre na posição 6 das cadeias betas ( chains B e D).
Clique no VMD main em Extension -> Analysis->Sequence viewer. Com esta opção você pode
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identificar o resíduo da posição 6 das cadeias B e D. O resíduo esperado nesta posição é um
glutamato (Glu).
Qual o resíduo da posição 6 da cadeia beta?________________________
O resíduo modificado encontra-se na superfície da proteína?____________________
Por que esta mutação causa a patologia conhecida como anemia falciforme?
4) Visualização da Protease do HIV
A AIDS surgiu como pandemia há algumas décadas atrás e causou grande temor, pois
inicialmente não havia conhecimento da sua causa. O estudo da AIDS registra um dos maiores
sucessos da moderna abordagem do desenho de fármacos, usando-se recursos computacionais. A
AIDS é causada pelo HIV. Os vírus são formados por uma capa de proteína que envolve seu material
genético, no caso do HIV é o RNA. Aqui descreveremos o uso da protease do HIV, como alvo para o
desenvolvimento de fármacos contra a AIDS.
As proteases são enzimas que catalisam a clivagem de outras proteínas, a protease do HIV
catalisa tal clivagem. Esta protease realiza uma importante etapa no ciclo da infecção viral. Como em
outros vírus, o HIV leva a célula infectada a produzir muitas cópias de suas proteínas. Tais proteínas
apresentam-se inicialmente como uma cadeia polipeptídica (poliproteína), que apresenta várias
proteínas coladas numa cadeia. A função da protease do HIV é catalisar a clivagem da poliproteína
em unidades menores funcionais. A correta execução de tal clivagem é crítica para o processo de
infecção viral.
A poliproteína intacta é necessária no início do processo de infecção, quando monta a forma
imatura do vírus. Em seguida a poliproteína tem que ser clivada, para formar o vírus maduro, que
pode então infectar uma nova célula. As reações de clivagem da poliproteína têm que ser
coordenadas perfeitamente, o que permite a montagem do vírus. Devido a tal sensibilidade e seu
papel essencial para infecção viral, a protease do HIV é um alvo importante para o desenho de
fármacos contra a AIDS. A inibição da protease do HIV impede a maturação do vírus, cessando a
progressão da infecção.
Repita o procedimento visto anteriormente para as outras estruturas e visualize a estrutura da
protease do HIV, arquivo hiv_prot.pdb .
Referências:
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 4a edição. Artmed editora, Porto Alegre, 2004 (Capítulo 3).
DE AZEVEDO WF, LECLERC S, MEIJER L, HAVLICEK L, STRNAD M, KIM SH. Inhibition of cyclin-dependent
kinases by purine analogues: crystal structure of human cdk2 complexed with roscovitine. Eur J Biochem. 1997;
243(1-2): 518-26.
CANDURI F, DE AZEVEDO WF Jr. Curr Computer-Aided Drug Design 2005; 1(1): 53-64.
LESK, A. M. Introduction to Protein Architecture. Oxford University Press, New York, 2001.
BRANDEN, c. & TOOSE, J. Introduction to Protein Structure. 2nd Ed. Garland Publishing, Inc. New York, 1999.
http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/
http://www.fi.muni.cz/usr/mejzlik/mirrors/www.nyu.edu/pages/mathmol/software.html
http://www.rcsb.org/pdb/
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