KELLY ALINE DE SOUZA SANTIAGO Epidemiologia Molecular

KELLY ALINE DE SOUZA SANTIAGO
Epidemiologia Molecular Aplicada ao Controle de Infecções por
Enterococos Resistentes à Vancomicina (VRE) em um Hospital de
Oncologia Pediátrica
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2009
KELLY ALINE DE SOUZA SANTIAGO
Epidemiologia Molecular Aplicada ao Controle de Infecções por
Enterococos Resistentes à Vancomicina (VRE) em um Hospital de
Oncologia Pediátrica
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Mestre em Ciências.
Orientador:
Prof.
Antonio
Carlos
Campos Pignatari
Co-orientador: Dr. Carlos Alberto Pires
Pereira
São Paulo
2009
ii
SANTIAGO, Kelly Aline de Souza
Epidemiologia Molecular Aplicada ao Controle de Infecções por
Enterococos Resistentes à Vancomicina (VRE) em um Hospital de
Oncologia Pediátrica. Kelly Aline de Souza Santiago - São Paulo,
2009. xx, 117f.
Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Molecular Epidemiology Applied to the Control of
Vancomycin-resistant Enterococci (VRE) Infections in a Pedriatric
Oncology Hospital
Key-words:1.Enterococos,2.resistência bacteriana, 3.antimicrobianos,
4.vancomicina, 5.epidemiologia molecular, 6.oncologia, 7.pediatria.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Angelo Amato Vincenzo de Paola
Coordenador do Curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
São Paulo
2009
iv
KELLY ALINE DE SOUZA SANTIAGO
Epidemiologia Molecular Aplicada ao Controle de Infecções por
Enterococos Resistente à Vancomicina (VRE) em um Hospital de
Oncologia Pediátrica
BANCA EXAMINADORA:
Titular: Dr. Guilherme Henrique Campos Furtado
Titular: Profa. Dra. Dulce Barbosa
Titular: Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Suplente: Dra. Rosemeire Cobo Zanella
Aprovada em: ___/___/___
v
“Unir-se é um bom começo, manter a união é um progresso, e trabalhar em
conjunto é a vitória.”
Henry Ford
vii
Dedico este trabalho a Deus, pela proteção, pelos caminhos trilhados e pelo
auxílio dado em todos os momentos. Obrigada pelo conhecimento e pelas
pessoas que fazem e fizeram parte da minha vida, pois sem elas eu jamais
teria conseguido. Obrigada, Senhor!
Aos meus pais, Ivan Cássio e Maria das Graças, pelo amor e pela sábia
educação. Aos meus irmãos, Cássio e Isis, pelos momentos felizes. Embora
estejamos todos distantes, a preocupação e o carinho que sentimos uns pelos
outros, supera tudo. Amo vocês e obrigada por vocês existirem na minha vida.
À minha família e a todos os meus amigos, pelos incentivos, pelos conselhos,
pelo apoio e momentos engraçados.
Aos meus mestres e educadores, pelos sábios métodos de ensino que
contribuíram na minha formação.
viii
Agradeço a DEUS, acima de tudo, pela dádiva da vida e por
proporcionar-me a sua paz e a serenidade para enfrentar os obstáculos que
atravessei e superar os desafios.
ix
Agradecimentos
Várias pessoas contribuíram para que este trabalho chegasse a bom
termo. A todas elas registro minha gratidão.
Agradeço ao meu querido orientador Prof. Antonio Carlos Campos
Pignatari, pela sua generosidade, credibilidade e apoio a nós, estudantes
vindos de outros Estados, à procura de novos desafios. Pela oportunidade que
me foi dada em fazer parte da família LEMC/ALERTA, proporcionando novos
conhecimentos, novas conquistas e, acima de tudo, novas amizades que foram
fundamentais para superar o desafio que é estar longe de casa. Obrigada pela
confiança, paciência e pelos valiosos conselhos e sugestões que me deram
coragem e força para novas conquistas.
A toda equipe da CCIH do Instituto de Oncologia Pediátrica
(IOP/GRAAC): Dr. Carlinhos, Cida e Fabianne, pela constante preocupação e
compromisso com o bem estar dos pacientes. A toda equipe de saúde do IOP
pelo empenho oferecido para realização deste trabalho.
A todos os funcionários do Laboratório de Microbiologia do Hospital São
Paulo, em especial a Eliete e Thomás, pela força, sabedoria e bondade em
ajudar sempre o próximo. Espero que a parceria formada entre estes três
grupos, IOP, LEMC e Laboratório de Microbiologia - HSP, nunca seja quebrada
e que essa tríplice aliança gere bons frutos por muito tempo.
A todos os meus queridos amigos do grupo LEMC e ALERTA. Acho que
essa é a parte mais difícil e como nosso grupo é muito grande, tenho medo de
acabar esquecendo alguém. A TODOS vocês, gostaria de dizer que valeu pela
força, pelo carinho e companheirismo durante essa jornada de cinco anos no
x
LEMC. Aos amigos que já saíram do laboratório (Jacy, Suzane, Cristiane,
Julianas, Andreias,....), fica o meu agradecimento pelos ensinamentos e
saudades dos nossos momentos divertidos e descontraídos. Aos que
acabaram de chegar, desejo-os boas vindas e uma frase: Aprendemos quando
compartilhamos experiências e o aprendizado deve ser constantemente
repassado e não permitam que jamais se quebre o que foi construído. E aos
que ainda estão, fica aqui meus eternos agradecimentos pela força,
discussões, ensinamentos, aprendizados e muitas alegrias. Torço muito para
que todos consigam achar a ponta do iceberg e quero que saibam que valeu
muito cada período passado perto de vocês. Desejo-lhes muito SUCESSO nos
novos desafios.
Em particular, aos meus eternos amigos, colaboradores e “pau pra toda
obra” (prefiro não comentar...rsrsrsrsrs). Agradeço toda a ajuda, apoio,
momentos partilhados, sorrisos e lágrimas, conversas e silêncio: tudo sempre
repleto de uma sensação de maravilha e de conforto. Em especial à Minoue
(Fernanda Inoue) e Cayô (Rodrigo). Amigos, não tenho palavras para
agradecer por todo apoio dado, pelos momentos felizes e sábio convívio.
Tenho certeza de que, se perguntassem qual seria a mistura de um prato típico
perfeito a base de um ingrediente baiano, um paulista (japonês) e um mineiro,
com certeza a resposta seria a junção de Kelly, Fernanda e Rodrigo. Obrigada
a Deus pelo nosso encontro.
xi
SUMÁRIO
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ____________________________ xv
ÍNDICE DE TABELAS __________________________________________ xviii
ÍNDICE DE FIGURAS ___________________________________________ xix
1 - INTRODUÇÃO _______________________________________________ 1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ____________________________________ 10
2.1 - Agente Etiológico _________________________________________ 10
2.2 - Epidemiologia das Infecções por Enterococcus spp. _____________ 12
2.3 - Infecções por Enterococcus spp. em Pacientes Oncológicos _______ 16
2.4 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por
Enterococcus spp. ____________________________________________ 20
2.4.1 - Glicopeptídeos _______________________________________ 23
2.4.1.1 – Mecanismo de Ação _________________________________ 25
2.4.1.2 - Mecanismo de Resistência ____________________________ 28
2.5 - Importância do Controle Racional da Vancomicina em Pacientes
Oncológicos _________________________________________________ 33
2.6 - Biologia Molecular Aplicada ao Controle de Surtos Hospitalares ____ 35
3 - OBJETIVOS ________________________________________________ 37
3.1 - Objetivo Principal _________________________________________ 37
3.2 - Objetivos Específicos ______________________________________ 37
4 - MATERIAL E MÉTODOS ______________________________________ 38
4.1 - Local de Estudo __________________________________________ 38
4.2 - Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do IOP ____________ 39
4.3 - Desenho do Estudo _______________________________________ 41
4.3.1 - Estudo Retrospectivo __________________________________ 41
4.3.2 - Estudo Prospectivo ____________________________________ 42
4.3.2.1 - Coleta das Amostras _________________________________ 43
4.3.2.2 - Processamento das Amostras __________________________ 43
xii
4.4 - Identificação Fenotípica do Gênero ___________________________ 44
4.4.1 - Prova da Catalase _____________________________________ 44
4.4.2 - Hidrólise Enzimática da L-pyrrolidonyl β-naphtylamide (PYR) ___ 44
4.4.3 - Hidrólise da Bile Esculina _______________________________ 45
4.4.4 - Crescimento em Caldo 6,5% de NaCl ______________________ 45
4.5 - Identificaçao Fenotípica das Espécies _________________________ 45
4.5.1 - Fermentação de Carboidratos ____________________________ 46
4.5.2 - Teste de Motilidade ____________________________________ 46
4.5.3 - Produção de Pigmento _________________________________ 47
4.6 - Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos ____________________ 47
4.6.1 - Disco Difusão ________________________________________ 48
4.6.1.1 - Inóculo ____________________________________________ 48
4.6.1.2 - Inoculação das Placas ________________________________ 48
4.6.1.3 - Aplicação dos Discos e Interpretação dos Resultados _______ 49
4.6.2 - Etest _______________________________________________ 49
4.7 - Técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) _____________ 50
4.8 - Electroforese em Campo Pulsado (PFGE) _____________________ 51
5 - RESULTADOS ______________________________________________ 54
5.1 - Resultados do Estudo Retrospectivo __________________________ 54
5.2 - Resultados do Estudo Prospectivo ___________________________ 58
5.3 - Caracterização dos Isolados de VRE _________________________ 60
5.4 - Tipagem Molecular das Amostras de E. faecium ________________ 62
5.4.1 - Critério de Inclusão das Amostras Isoladas para Tipagem Molecular
_________________________________________________________ 62
5.4.2 - Análise da Tipagem Molecular Segundo Critérios de Tenover ___ 65
5.4.3 - Análise da Tipagem Molecular pelo Programa BioNumerics ____ 65
5.4.4 - Correlação entre Tipagem Molecular e Internação dos Pacientes_67
5.4.4.1 - Padrão de PFGE versus Unidades de Internação ___________ 67
5.4.4.2 - Padrão de PFGE versus período de internação ____________ 69
5.4.4.3 - Padrão de PFGE versus Período de Internação versus Unidade
de Internação, com Foco no Fluxo dos Pacientes no IOP ____________ 70
xiii
6 - DISCUSSÃO________________________________________________ 75
7 - CONCLUSÕES______________________________________________ 87
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ______________________________ 89
9 - RESUMO _________________________________________________ 109
10 - ABSTRACT_______________________________________________ 111
11 - ANEXO __________________________________________________ 113
xiv
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS - Acquired Immune Deficiency Syndrome
AMB - Ambulatório
ATCC - American Type Culture Collection
BHI - Brain Heart Infusion
CCIH - Comissão de Controle de Infecção Hospitalar
CDC - Centers for Disease Control and Prevention
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute
CVC - Cateter Venoso Central
EARSS - European Antimicrobial Resistance Surveillance System
EORTC - European Organization for Research and Treatment of Cancer
EPM - Escola Paulista de Medicina
EUA - Estados Unidos da América
FDA - Food and Drug Administration
GRAACC - Grupo de Apoio ao Adolescente e à Criança com Câncer
HICPAC - Hospital Infection Control Practices Advisory Committee
HL - High Level
ICS - Infecção de Corrente Sanguínea
IDSA - Infectious Diseases Society of America
IOP - Instituto de Oncologia Pediátrica
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
mDNA - Ácido Desoxirribonucleico Mensageiro
MGB - Metil-α-D-Glucopiranisídeo
xv
MLST - Multilocus Sequence Typing
MR - Multiresistentes
MRSA - Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
NAG - N-acetilglucosamina
NAM - Ácido N-acetilmurâmico
NNIS - National Nosocomial Infection Surveillance
ORF - Open Read Fream
ORSA - Oxacillin-resistant Staphylococcus aureus
pb - Pares de Bases
PCIH - Programa de Controle de Infecção Hospitalar
PCR - Polymerase Chain Reaction
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis
PYR - Pyrrolidonyl-Arylamidase
rDNA - Ácido Desoxirribonucleico Ribossomal
SCIH - Serviço de Controle de Infecção Hospitalar
SCOPE - Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance
SNC - Sistema Nervoso Central
TBE - Tris-Borato EDTA
TMO - Transplante de Medula Óssea
tRNAfMet - Ácido Ribonucléico Transportador Inciador
TSB - Tryptone Soya Broth
UFC - Unidades Formadoras de Colônia
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo
UPGMA - Unweighted Pair-Groups Method using Arithmetic Averages
UTI - Unidades de Terapia Intensiva
xvi
VRE - Vancomycin-Resistant Enterococcus
VRE-EF - Vancomycin-Resistant Enterococcus faecalis
VRE-EFM - Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium
VRSA - Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus
VSE-EF - Vancomycin-Susceptible Enterococcus faecalis
VSE-EFM - Vancomycin-Susceptible Enterococcus faecium
xvii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação dos genes que conferem resistência aos glicopetídeos
em Enterococcus spp................................................................................................
30
Tabela 2 - Custo atual dos novos antimicrobianos em relação à vancomicina
(2009) de acordo com regime terapêutico padrão............................................................ 33
Tabela 3 - Unidades e distribuição dos leitos no Instituto de Oncologia Pediátrica IOP/UNIFESP............................................................................................................. 39
Tabela 4 - Caracterização das 43 amostras de VRE isolados durante os estudos
retroprospectivo e prospectivo isolados de 89 pacientes do hospital IOP de acordo
os espécimes clínicos, unidades hospitalares de isolamento e perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos.............................................................................
61
Tabela 5 - Caracterização molecular das 35 amostras de E. faecium, selecionadas
através
do
perfil
de
sensibilidade
à
vancomicina
(33
VRE
e
2
VSE)............................................................................................................................ 64
Tabela 6 - Características fenotípicas utilizadas para a identificação presuntiva de
Enterococcus e gêneros relacionados....................................................................... 115
Tabela 7 - Características fenotípicas utilizadas para a identificação das espécies
de Enterococcus e gêneros relacionados.................................................................
xviii
115
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Prevalência da resistência à vancomicina entre isolados clínicos de
Enterococcus faecium na Europa em 2007.............................................................
2
Figura 2 - Estrutura molecular da vancomicina......................................................
23
Figura 3 - Etapa da Transpeptidação: Formação das ligações cruzadas nas
cadeias peptídicas...................................................................................................
25
Figura 4 - Ligação entre vancomicina e a porção terminal D-Ala-D-Ala do
peptidoglicano..........................................................................................................
26
Figura 5 - Interação eletrostática repulsiva entre vancomicina e a porção terminal
modificada D-Ala-D-Lac do peptidoglicano..............................................................
29
Figura 6 - Representação esquemática do Transposon Tn1546. ........................... 31
Figura 7 - Distribuição das espécies de Enterococcus spp. isoladas dos pacientes
do IOP, durante o período de estudo retrospectivo realizado entre janeiro a
agosto de 2008.......................................................................................................... 54
Figura 8 - Gel de agarose a 1% demostrando o resultado de amplificação de
gene vanA (732 pb)................................................................................................... 55
Figura 9 - Distribuição das 17 amostras de VRE-EFM isoladas do IOP durante os
meses de estudo retrospectivo (jan-ago/08), correlacionados as casos clínicos de
infecção..................................................................................................................... 56
Figura 10 - Sítios de isolamento dos casos de Enterococcus spp. ao longo do
período retrospectivo................................................................................................ 57
xix
Figura 11 - Resultados do estudo prospectivo, mostrando o número de coletas de
swab anal realizadas em cada etapa das culturas de vigilância, o número de
isolados de VRE-EF e VRE-EFM em cada estudo e ao lado, a variação do
percentual dos casos de VRE-EFM ao longo do estudo........................................... 59
Figura 12 - Dendrograma com o resultado da análise de similaridade de bandas
dos padrões genéticos por PFGE das amostras de E. faecium ............................... 67
Figura 13 - Distribuição dos perfis de PFGE dos isolados de E. faecium por
unidade de internação............................................................................................... 68
Figura 14 - Distribuição dos perfis de PFGE dos isolados de E. faecium de
acordo com os meses de isolamento ....................................................................... 69
Figura 15 - Fluxograma dos pacientes internados no IOP no período de janeiro dezembro de 2008..................................................................................................... 71
xx
INTRODUÇÃO
1 - INTRODUÇÃO
O aumento da prevalência de enterococos resistente à vancomicina
(VRE) tem sido documentado globalmente desde sua emergência na década
de 80. Atualmente as infecções por VRE estão entre a segunda e terceira
(1,2)
causa mais comum de infecções hospitalares nos Estados Unidos
. Dados
do programa SENTRY, publicado em 2007, avaliando 155 amostras de VRE
isolados na América do Norte (Estados Unidos e Canadá) e Europa,
demonstram que o fenótipo VanA foi o mais freqüente em ambos continentes,
com 76% e 40%, respectivamente; e que todos os isolados apresentaram
elevadas taxas de resistência a outras classes antimicrobianas
(3)
. O estudo
identificou por PFGE 35 padrões endêmicos de VRE multiresistentes nas
regiões analisadas e concluiu que a disseminação clonal parece ser um fator
dominante para o aumento desses isolados em ambos os continentes (3).
Uma revisão recente de Werner e colaboradores
(4)
, sobre o panorama
atual de VRE em hospitais da União Européia (UE), demonstrou que a
resistência adquirida à vancomicina parece ser um grave e crescente desafio
terapêutico entre isolados de enterococos nessa região, conforme demonstrado
na Figura 1. A situação atual da prevalência de VRE nesta região é diversa,
variando de < 1% a > 40%
(4)
. Nesse estudo, alguns países como Irlanda,
Alemanha e Grécia tiveram uma tendência no aumento de VRE ao longo do
tempo, ao contrário de outros países (países nórdicos e Holanda) onde a
prevalência de VRE ainda é baixa. Alguns poucos países apresentaram
diminuição nas taxas de VRE, como Áustria, Portugal e Itália, contudo, as
razões para esta tendência permanecem incertas (4).
1
INTRODUÇÃO
Figura 1 - Prevalência da resistência à vancomicina entre isolados clínicos de
Enterococcus faecium na Europa em 2007 (Adaptado do artigo de Werner e
colaboradores
resultados
(115)
dos
). As taxas foram estimadas principalmente com base nos
relatórios
resistência
em
isolados
de
infecções
invasivas
(Hemoculturas) do European Antimicrobial Resistance Surveillance System - EARSS.
A ampla distribuição hospitalar de clones de E. faecium sensíveis a
vancomicina e resistentes à ampicilina na Europa é preocupante, uma vez que
os determinantes vanA/B predominantemente se propagam entre isolados de
E. faecium e a experiência obtida nos Estados Unidos e em outros países com
elevadas taxas de VRE demonstraram que o aumento das taxas de VRE
ocorreu vários anos após a aquisição de clones de E. faecium sensíveis a
vancomicina e que se estabeleceram no ambiente hospitalar (5,6).
Embora dados do programa SENTRY realizados na America Latina
entre 1997 a 2001
(7)
tenham mostrado que a prevalência de resistência aos
2
INTRODUÇÃO
glicopeptídeos
ainda
permanece
baixa
nesse
continente
(97,5%
de
sensibilidade à vancomicina) e que tal fenótipo nesta região está relacionado à
disseminação clonal; Furtado e colaboradores
(8)
, realizando um estudo de três
anos (2000-2002) em um hospital universitário localizado na região sudeste do
Brasil, verificou um aumento progressivo na incidência de VRE, chegando, em
2002, a 15,8% das cepas de Enterococcus spp. serem resistentes à
vancomicina no Hospital São Paulo, maiores inclusive que os 7% descritos por
Sader e colaboradores
(7)
no Brasil. Este dado é preocupante uma vez que no
período de 1994 a 1995, na mesma instituição, não se encontrou nenhuma
cepa resistente, embora tenha relatado a existência de 8 cepas intermediárias
a vancomicina (9).
Em uma meta-análise, realizada por DiazGranados e colaboradores
(2)
,
abordando a relação da resistência à vancomicina associada à mortalidade
entre pacientes com infecção sanguínea por enterococos, verificou-se que em
1.614 episódios de infecção sanguínea por enterococos (VRE, 683 episódios;
VSE - Enterococos sensíveis à vancomicina, 931 episódios) de nove estudos
elegíveis para a análise; quatro destes estudos relataram nenhuma associação
significativa entre a resistência à vancomicina e à mortalidade, e cinco
relataram uma associação significativa. Os pacientes com bacteremia causada
por VRE evoluíram mais para o óbito do que aqueles com bacteremia por VSE
(OR 2,52; IC 95% 1,9-3,4) (2).
Treitman e colaboradores
(10)
avaliaram prospectivamente 18.586
isolados de Enterococcus spp. no período de 1993 a 2002 em um hospital em
Chicago. Esse estudo verificou um aumento percentual de 28,2% (1993) para
72,4% (2002) (P < 0,001) de E. faecium com resistência à vancomicina.
3
INTRODUÇÃO
Entretanto, o aumento de E. faecalis resistente à vancomicina observado no
mesmo período não foi estatisticamente significante
(10)
. Embora E. faecium
seja mais freqüentemente associado com resistência à vancomicina do que E.
faecalis, fato este observado principalmente nos Estados Unidos e na maioria
dos países europeus, vários estudos têm demonstrado que a associação entre
mortalidade e resistência à vancomicina é independente das espécies
(2,11)
Sendo assim, levando em consideração todos os dados publicados, Lode
.
(12)
conclui que a resistência à vancomicina é um fator preditor independente de
morte em pacientes com infecções sanguíneas por enterococos (12).
Em vários outros estudos, a proporção de pacientes colonizados com
VRE que posteriormente desenvolveram infecção da corrente sanguínea (ICS)
por VRE apresentou variação, dependendo da população de pacientes
estudada
(13-16)
. Em meta-análise conduzida por Salgado & Farr
(17)
comparou
pacientes com ICS causadas por VRE com aquelas causadas por VSE. O
estudo demonstrou que pacientes com ICS por VRE apresentam maior
aumento da taxa de recorrência de ICS (16,9% vs 3,7%, respectivamente, P
<.0001); na taxa de letalidade (risco relativo [RR], 2,57; IC 95% 2,27-2,91),
aumento da mortalidade devido à bacteremia (RR, 1,79; IC 95% 1,28-2,50), e
aumento dos custos hospitalares no valor de US$ 27.000 por episódio de ICS
(P = 0,04), em comparação com aqueles com ICS por VSE
(17)
. Outros estudos
também demonstraram impacto negativo de infecções por VRE sobre a taxa de
mortalidade bem como no tempo e custos da internação (12,18-20).
Uma associação entre colonização por VRE e, subseqüente, infecção da
corrente sanguínea pelo mesmo patógeno foi relatado por Montecalvo e
colaboradores
(21)
em 1994, em um surto de ICS por VRE em uma unidade de
4
INTRODUÇÃO
oncologia adulta no período de 1991 a 1992. Sete (1,7%) de 413 pacientes
desenvolveram ICS por VRE, dos quais, todos tinham sido detectados VRE em
culturas de vigilância em swab anal, no momento ou pouco tempo após o
diagnóstico da ICS. Cinco pacientes (1,2%) tinham múltiplas hemoculturas
positivas para VRE variando de 7 a 63 dias após o diagnóstico da ICS. Quatro
pacientes, os quais eram neutropênicos, morreram com ICS persistentes. Para
3 pacientes, foram selecionados pares isolados de VRE provenientes de
colonização e de ICS para a tipagem molecular. Destes, 1 par era idêntico e 2
pares estavam intimamente relacionados, sugerindo que os pacientes se
infectaram com as suas próprias cepas de VRE colonizadoras
resultado foi obtido por Olivier e colaboradores
(21)
. O mesmo
(22)
, que avaliaram
retrospectivamente 768 pacientes colonizados com VRE no período de janeiro
de 2002 a junho de 2005. Dos 768 pacientes colonizados com VRE, 31 (4,0%)
desenvolveram ICS por VRE. Destes 31 pacientes colonizados por VRE, 23
(74%) foram isolados VRE em sítios estéreis. Em 19 (83%) dos 23 pacientes, o
isolado causador da infecção foi geneticamente relacionado por PFGE da
colonização (22).
Um estudo de coorte prospectivo
(23)
avaliou pacientes neutropênicos e
com leucemia aguda, que apresentaram colonização por VRE de 1992 a 1996.
Entre
os
56
pacientes
colonizados
com
VRE,
verificou-se
que
10
desenvolveram ICS por este patógeno e todos tinham leucemia aguda. A taxa
de ICS por VRE foi de 7,4 por 10.000 pacientes-dia ou 63 por 10.000
neutropênicos-dia. Pacientes que desenvolveram ICS por VRE tinham mais
dias de neutropenia; mais episódios simultâneos de infecção por Clostridium
difficile, mais dias de tratamento com antibióticos (tais como vancomicina,
5
INTRODUÇÃO
piperacilina e ciprofloxacina) e mais dias de internação, em comparação com
pacientes colonizados que não desenvolveram ICS por VRE. Análise
multivariada mostrou que entre esses pacientes colonizados, infecção por C
difficile foi o único fator de risco independente para o desenvolvimento de ICS
por VRE (23).
Historicamente, os laboratórios relatam que 80 a 90% dos enterococos
isolados são E. faecalis, enquanto E. faecium representam 5 a 10% dos
enterococos
(10)
. Apesar disso, estudos têm demonstrado uma mudança no
panorama das infecções causadas por enterococos. Um relato do SENTRY
demonstrou que em 2001, E. faecium era responsável por 20% dos isolados
clínicos nos Estados Unidos
(24)
. De acordo com Willems e colaboradores
(6)
,o
aumento na taxa de infecção por E. faecium pode estar relacionado ao
complexo clonal 17 (CC17), caracterizado pela resistência a ampicilina e que
tem sido associado com surtos nosocomiais por E. faecium nos cinco
continentes. Um aumento no número de infecções causadas por E. faecium
resistentes a ampicilina pertencentes para CC17 também tem sido observado
em muitos países e isso tem sensivelmente alterado as taxas de infecções
causadas por E. faecalis vs E. faecium. Esta mudança é um problema em
potencial, uma vez que E. faecium é mais comumente associado com
resistência à vancomicina que qualquer outra espécie de enterococos
(25)
. Um
estudo de vigilância nos hospitais norte americanos realizado por Deshpande e
colaboradores (3) demonstrou que 93% dos VRE isolados foram E. faecium. Em
um estudo recente sobre infecções associadas à assistência a saúde, Hidron e
colaboradores
(26)
, verificaram que E. faecium representava 5,6% dos isolados
em ICS e era o terceiro patógeno mais comum, atrás apenas de
6
INTRODUÇÃO
Staphylococcus coagulase negativa e Staphylococcus aureus, sendo inclusive,
mais freqüente que E. faecalis (26).
Acredita-se que a habilidade e o sucesso de E. faecium em disseminar
no ambiente nosocomial não esteja somente relacionado à presença de genes
de resistência, mas também a aquisição de determinantes os quais podem
aumentar a capacidade do microrganismo em sobreviver, colonizar e/ou
infectar pacientes. Entretanto, em termos de fatores de virulência, E. faecium
parece não apresentar certos determinantes importantes previamente descritos
como relacionados ao processo de infecção em E. faecalis, como hemolisinas,
gelatinase, locus fsr e fatores de agregação
(27)
. Contudo, o gene hyEfm, que
codifica uma proteína homóloga a hialuronidase, foi postulada como um
potencial fator de virulência de isolados de E. faecium, desde que este gene é
mais comum em isolados de E. faecium VRE que nos isolados VSE da mesma
espécie
(28)
. Este gene também tem sido associado com isolados pertencentes
ao complexo clonal CC17. Além disso, um plasmídeo carreando hyEfm tem
sido previamente relacionado à colonização gastrointestinal em modelos
animais (29).
Arias e colaboradores
(30)
demonstraram pela primeira vez a evidência
de um plasmídeo apresentando um papel na patogênese de E. faecium e
peritonites em modelos animais, e que este plasmídeo continha o gene hyEfm
e genes de resistência. Além disso, foi demonstrado que o plasmídeo
carreando o gene hyEfm foi transferido por conjugação para cepas
pertencentes ao complexo CC17 isoladas em diferentes parte do mundo,
confirmando que a aquisição do plasmídeo hyEfm pode ser uma estratégia em
aumentar a virulência in vivo ou habilidade em sobreviver em cepas
7
INTRODUÇÃO
nosocomiais
de
E.
faecium.
O
aumento
da
prevalência
de
cepas
multiresistentes de E. faecium CC17 contendo um plasmídio nos EUA e Europa
é uma perspectiva preocupante (30).
O aumento da prevalência de E. faecium e conseqüente aumento da
resistência aos glicopeptídeos tem se tornado um problema mundial. A grande
capacidade de permanecer em ambiente hospitalar e a facilidade em adquirir
genes de resistência e virulência permitem o sucesso alcançado pelos
enterococos como um dos principais causadores de infecção hospitalar. Ainda
que medidas de controle possam e devam ser aplicadas, o diagnóstico rápido e
preciso não somente dos genes de resistência, bem como da espécie é de
primordial importância no controle por parte das comissões de controle de
infecção relacionada à assistência a saúde na disseminação deste patógeno no
ambiente hospitalar. O uso de técnicas moleculares, entre elas destaca-se a
PCR em tempo real, diminui drasticamente o tempo na liberação dos laudos
por parte dos laboratórios de microbiologia, o que permite uma maior eficácia
na adequação da terapia antimicrobiana. Aliado ao diagnóstico rápido e as
medidas de controle de infecção hospitalar, o uso racional de antimicrobianos
dentro do ambiente hospitalar também apresenta um papel chave no combate
a infecções por VRE
(154)
, uma vez que o uso prolongado e indiscriminado de
vancomicina, principalmente como terapia empírica, está relacionado à
emergência da resistência a esta classe de antimicrobianos.
Baseando-se na importância dos enterococos no ambiente hospitalar, no
aumento das taxas de VRE em nossa instituição nos últimos anos e no
aumento da prevalência de E. faecium ocorrido no Instituto de Oncologia
Pediátrica da UNIFESP, optamos por caracterizá-lo epidemiologicamente, já
8
INTRODUÇÃO
que de acordo com os dados citados aqui comprovam o impacto negativo das
infecções por VRE no curso clínico neste grupo de pacientes. Sendo assim,
esperamos que os dados apresentados neste trabalho possam servir de
embasamento para o conhecimento de nossa epidemiologia hospitalar de
modo que medidas e melhorias possam ser feitas no combate a disseminação
de VRE em nossa instituição.
9
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 - Agente Etiológico
Os enterococos foram inicialmente classificados como cocos Grampositivos e incluídos no gênero Streptococcus
(31)
. No início da década de 30
foram considerados como estreptococos do grupo D, diferenciando-se dos
demais estreptococos devido as suas características sorológicas distintas,
baseadas em propriedades antigênicas de polissacarídeos de composição
variável (carboidrato C), localizado na parede celular e detectado através de
técnicas imunológicas
(32)
. Ao final de 1930, Sherman recomendou que o táxon
Enterococcus fosse especificamente utilizado para o grupo dos estreptococos
do grupo D que crescessem entre temperaturas de 10 e 45°C; em pH 9,6; em
caldo enriquecido contendo cloreto de sódio (NaCl) a 6,5%; que hidrolisassem
a esculina e que sobrevivessem a 60°C por pelo menos 30 minutos (33).
Apenas em meados da década de 80, estudos envolvendo composição
de ácidos graxos, hibridação de ácidos nucléicos (DNA-DNA e DNA-rDNA) e
catalogação comparativa da subunidade 16s do RNA ribossomal, evidenciaram
claramente diferenças genotípicas, com conseqüente reclassificação dessas
bactérias dando origem ao gênero Enterococcus, o que ocorreu apenas em
1984 (34).
Atualmente
o
gênero
Enterococcus,
pertencente
à
família
Streptococcaceae, é formado por 19 espécies, a saber: E. faecalis, E. faecium,
E. casseliflavus, E. gallinarum, E. avium, E. cecorum, E. columbae, E. dispar,
E. durans, E. flavescens, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtti, E. psedoavium,
E. raffinosus, E. sacharolyticus, E. seriolicida, E. solitarius e E. sulfureus
(35-37)
.
10
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Entretanto, na maioria dos cenários clínicos em todo o mundo, as espécies E.
faecalis e E. faecium são as mais relacionadas a infecções em humanos, e as
duas representam aproximadamente 80-90% de todos enterococos clínicos
isolados, com maior ocorrência para espécie E. faecalis, aparecendo numa
proporção de três a cinco casos para um de E. faecium em regiões como
Pacífico, Europa e América do Norte; e taxas de até 17:1 na América do Sul, de
acordo com um estudo SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program) realizado
entre 1997 - 2000 (38).
Dentro da família Streptococcaceae, outros gêneros como Aerococcus,
Gemella, Lactococcus, Peptococcus e Streptococcus podem ser isolados e
confundidos na rotina microbiológica com o gênero Enterococcus. Para
distinguir esse gênero dos demais, as principais provas ainda utilizadas pelos
laboratórios de rotina são a bile esculina, o caldo NaCl a 6,5% e o teste da Lpyrrolidonyl β-naphtylamide (PYR) (31, 35, 36).
As
espécies
pertencentes
ao
gênero
Enterococcus
apresentam
morfologia cocóide, Gram-positivas, dispostas aos pares (diplococos) ou em
cadeias curtas. Podem apresentar hemólise variável frente a meios de
crescimento à base de sangue, predominando a γ-hemólise (ausência de
hemólise). São negativos para o teste da catalase, entretanto, há espécies que
reagem fracamente com o H2O2 produzindo uma reação pseudopositiva (31).
Os enterococos são anaeróbios facultativos e estão amplamente
distribuídos na natureza, sendo encontrados em solo, alimentos, água e como
microbiota intestinal de muitos animais
(36)
. Por sobreviverem mais tempo na
água do mar do que outros coliformes, os enterococos foram considerados pela
Agência de Proteção ao Meio Ambiente dos Estados Unidos, como indicadores
11
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
mais confiáveis de doenças transmitidas por contato com água contaminada.
Vale ressaltar que, sítios como cavidade oral, trato genitourinário e pele, podem
ser frequentemente colonizados por esse microrganismo, contudo, menos
frequentemente isolados. Em ambientes nosocomiais podem sobreviver inertes
em fômites e superfícies inanimadas por até 24 horas (39).
Tradicionalmente os enterococos foram considerados como agentes
patogênicos de baixo grau de patogenicidade, entretanto, na década de 90,
emergiu como uma importante causa de infecções nosocomiais (40).
2.2 - Epidemiologia das Infecções por Enterococcus spp.
Desde o início do século 20, os cocos Gram-positivos já tinham sido
reconhecidos como patógenos humanos em potencial
(33)
. O gênero
Enterococcus foi considerado relativamente inócuo até o início dos anos 70,
quando foi identificada a primeira amostra multiresistente. Passadas duas
décadas foi reconhecido e identificado o potencial patogênico dessa bactéria
causadora
de
diferentes
infecções
nosocomiais.
Atualmente
este
microrganismo é o segundo ou terceiro gênero bacteriano mais importante
isolado em infecções adquiridas em hospitais, a depender do centro médico em
estudo, particularmente em grupos de alto risco como no caso de neonatos e
portadores com doenças hematológicas
(41)
. Os possíveis fatores de risco para
a colonização ou infecção por VRE variam conforme a população de estudo e a
instituição de saúde. Em estudos brasileiros realizados por Barbosa e
colaboradores sobre a prevalência de pacientes colonizados por VRE
submetidos à diálise e transplante renal, a taxa observada foi de 14,4% e
13,6%, respectivamente. Entre os fatores de risco identificados associados na
12
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
população submetida à diálise foram o tipo de tratamento dialítico
(hemodiálise), internação hospitalar e duração da estadia hospitalar. Já nos
pacientes transplantados, esses fatores de risco não foram associados (156, 157).
O papel dos enterococos em infecções urinárias foi primeiramente
relatado em 1906, sendo posteriormente confirmado por outros pesquisadores
(33, 42)
. Sua presença no trato urinário pode ocorrer, normalmente, como
colonização urinária assintomática e na maioria das vezes a infecção é
hospitalar, podendo levar a casos de prostatite e abscessos perinéfricos
(43-46)
.
Também pode estar associado com instrumentação ou anormalidades
estruturais do trato urinário, com infecções urinárias recorrentes (43, 47).
Após um surto de infecção hospitalar ocorrido entre os anos de 1986 a
1989 nos Estados Unidos, os enterococos ganharam destaque como o
segundo patógeno mais isolado, sendo a urina seu principal sítio de isolamento
(24, 43, 48)
. Com o passar dos anos, vários autores têm relatado um aumento na
incidência de infecções do trato urinário por enterococos adquiridos em
hospitais
(49-53)
. Entre os fatores que contribuíram para esse aumento
encontram-se: idade avançada do paciente, doença de base e o uso de
antibioticoterapia prévia, sobretudo o uso de cefalosporinas de amplo espectro
(54)
. O seu uso prolongado (principalmente cefalosporinas de 3º geração) e a
resistência intrínseca dos enterococos a esses β-lactâmicos, são fatores que
contribuem para as infecções enterocócicas, uma vez que estes agentes
causam uma pressão seletiva (49-52, 55, 56).
Depois da infecção urinária, as infecções intra-abdominais e pélvicas
são as mais frequentemente causadas por enterococos. No entanto,
geralmente nas culturas obtidas desses dois últimos sítios são polimicrobianas,
13
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
o que dificulta a melhor compreensão sobre o Enterococcus spp. como sendo
causa da infecção
(43)
. Vale salientar que este microrganismo pode ocasionar
formação de abscessos abdominais e pélvicos e em alguns casos podem
evoluir para um quadro de sepse (31, 43, 55).
Bacteremia é a terceira causa de infecção enterocócica mais comum (43),
sendo normalmente originada em pacientes com quadro clínico compatível com
endocardite, podendo também ser decorrente de infecção do trato urinário,
intra-abdominal e infecções intravenosa ou intra-arterial
(43, 49, 53, 55)
. A taxa de
mortalidade associada à bacteremia por enterococos pode estar relacionada ao
comprometimento clínico do paciente
(49, 52, 53, 55, 57)
. Nos Estados Unidos e no
Canadá, a taxa de enterococos isolados de hemoculturas encontra-se em torno
de 9%; índice mais alto que em países da América Latina. Esses dados
corroboram com estudos realizados pelo SENTRY, nos anos de 1997 a 2001
(58)
.
Dados do Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiologic
Importance (SCOPE), projeto que monitora infecções de corrente sangüínea
em pacientes hospitalizados nos Estados Unidos, indicou que 60% das
infecções nosocomiais de corrente sanguínea no período de três anos (19951998) estavam relacionadas a bactérias Gram-positivas. Dessas, enterococos
ocupou a terceira posição com 11,1% (59).
A partir de 1912, começaram a ser associados a uma série de doenças,
incluindo casos de endocardite
(33, 42)
. Nos casos das endocardites bacterianas,
os enterococos podem causar cerca de 10 a 20% das ocorrências; sendo a
terceira principal causa de endocardite infecciosa, a depender do centro
hospitalar
(60)
. Entre as infecções relacionadas às espécies de E. faecalis e E.
14
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
faecium, 85% dos casos são de fonte endógena. Os casos de endocardite por
enterococos, normalmente, costumam estar relacionado a pessoas que já
possuem histórico cardíaco ou danos em válvulas cardíacas. Suas principais
portas de entrada são o trato genitourinário e a via biliar, frequentemente mais
comum em pessoas com idade superior a 50, sendo os homens afetados com
mais freqüência que as mulheres (61). Outro grupo de risco importante que pode
adquirir endocardite são os usuários de drogas endovenosas
(62, 63)
. A
mortalidade de endocardite por enterococos é relativamente baixa e não
mudou nas últimas décadas. Casos de infecção relacionada a próteses
vasculares estão associadas a um pior prognóstico (60).
Outras infecções enterocócicas menos frequente são infecções no
sistema nervoso central e infecções neonatais. Enterococos raramente causam
infecções respiratórias ou osteomielite
(64)
. Em adultos, infecção do sistema
nervoso central ocorre em pacientes com histórico de cirurgia e/ ou
quimioterapia, assim como osteomielite e infecção pulmonar
(31, 43, 65, 66)
.
Meningites são bastante raras, e quando ocorre, são encontradas na maioria
das vezes em recém-nascidos em estado grave (67).
Atualmente, os enterococos predominam como agentes patogênicos
mais isolados em infecções nosocomiais, tornando-se a segunda causa mais
comum de microrganismos isolados em Unidades de Terapia Intensiva (UTI)
(48)
. Em estudo realizado pelo programa SENTRY na América Latina, foi
verificado um crescente aumento no número de isolados, de 29,8% nos cinco
primeiros anos (1997- 2001), para 72,5% nos últimos cinco anos desse estudo
(2002-2007). E. faecalis (78,2%) e E. faecium (12,7%) foram às espécies mais
15
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
freqüentemente isoladas, sendo que sangue (41,4%) e pele/tecidos moles
(11,0%) representaram os sítios mais freqüentemente isolados (68).
Historicamente, a proporção de infecções enterocócicas provocadas
pela
espécie
E.
faecalis
em
relação
às
demais
espécies
chega
aproximadamente a 10:1. Entretanto, nos últimos anos, o que se percebe é um
declínio nessa taxa para 3:1
(69)
. Embora E. faecalis continue sendo a espécie
mais predominante em infecções clínicas, isolados de E. faecium vêm
aumentando gradativamente. Esta mudança pode ser verificada em um estudo
realizado nos Estados Unidos em 1999, realizada por pesquisadores da área
farmacêutica voltada a vigilância de bactérias multiresistentes, onde verificouse que, em relação aos isolados de enterococos de hemoculturas, houve uma
diminuição no número de E. faecalis em relação a E. faecium, caindo de 3,7:1
em 1996, para 1,9:1 em 1999, dados recolhidos a partir de 235 instituições
durante o período do estudo. A explicação sugerida para este fato seria o
aumento da resistência aos antimicrobianos verificados em E. faecium, no qual
de 1.263 amostras dessa espécie testadas quase 31% apresentaram
resistência aos antibióticos ampicilina, gentamicina e estreptomicina e
principalmente a resistência à vancomicina (40,70).
2.3 - Infecções por Enterococcus spp. em Pacientes Oncológicos
O câncer pediátrico representa de 0,5% a 3% de todos os tumores na
maioria das populações. Internacionalmente, entre as neoplasias, os tumores
pediátricos mais comuns são as leucemias, os linfomas e os tumores do
Sistema Nervoso Central (71, 72). De acordo com dados brasileiros, com base em
16
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
referências dos registros de base populacional, são estimados mais de 9.000
casos novos de câncer infanto-juvenil por ano (73).
A causa mais comum de doença e morte em pacientes com câncer é
infecção. Tratamentos que alteram o sistema imunitário como quimioterapia,
radioterapia, transplante de medula óssea e corticosteróides; além de
procedimentos que rompam a integridade da pele como as cirurgias, biópsias,
inserção de cateteres e uso prolongado de cateteres venosos centrais,
proporcionam maiores riscos para o desenvolvimento de infecções que, na
maioria das vezes, está relacionada a bactérias. Contudo, mesmo sendo as
infecções bacterianas mais prevalentes, as fúngicas são geralmente as de
maior morbidade (74).
Complicações infecciosas estão entre os motivos mais freqüentes para
a admissão de crianças com câncer nas UTIs, no qual representam como
principal causa de morte das que não falecem da própria doença oncológica.
Em pacientes neutropênicos, o risco de bacteremia e sepse é eminente,
principalmente durante a primeira semana, onde são provocadas normalmente
por bactérias aeróbias (85-90%) (75).
Os episódios mais graves de infecções estão atribuídos as bactérias
Gram-negativas;
contudo,
infecções
por
bactérias
Gram-positivas
têm
aumentado nas ultimas décadas, provavelmente devido ao aumento do uso de
cateter venoso central e o uso de antibioticoterapia profilática (74,76,77).
Entre os antimicrobianos utilizados como antibioticoterapia empírica, no
tratamento de pacientes com infecção bacteriana por microrganismo
desconhecido estão antibióticos de amplo espectro, eficazes contra bactérias
Gram-negativas e Gram-positivas. Entre os agentes comumente utilizados
17
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
incluem aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, glicopeptídeos e β-lactâmicos,
como penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos e monobactâmicos (74,76).
A melhora na cobertura antibiótica tem alterado a incidência e
prevalência dos agentes bacterianos nas últimas décadas (78). De acordo com a
literatura, o uso de cefalosporinas de amplo espectro e de glicopeptídeos tem
contribuído para o aumento no número de casos de infecções nosocomiais por
enterococos em pacientes oncológicos. É o que foi verificado por Volkow e
colaboradores
(79)
, em um estudo retrospectivo num centro oncológico do
México durante o período de 10 anos (1986-1996). De acordo com esses
pesquisadores, foi verificado um aumento na taxa de infecções enterocócicas
em quase 7 vezes a partir de 1987, obtendo seus maiores índices entre os
anos de 1994 e 1995. Segundo os autores, a provável causa para esse
aumento foi o uso indiscriminado de cefalosporinas de terceira geração (79).
Paralelo ao aumento da prevalência de infecções enterocócicas no meio
hospitalar há um aumento da resistência antimicrobiana ao principal
antimicrobiano utilizado na prática clínica para os cocos Gram-positivos, a
vancomicina. O aumento da resistência a vancomicina representa um grave
problema dado que, além de limitar as opções terapêuticas, a presença de
VRE em ambiente hospitalar representa um risco potencial, uma preocupação
crescente e fundamental na área de controle de infecção hospitalar, uma vez
que os VRE carreiam genes de resistência a vancomicina que podem ser
transferidos para outras bactérias do mesmo gênero
(80)
, ou para outras
espécies mais virulentas, como o caso dos S. aureus resistentes à oxacilina
(ORSA) (81, 82).
18
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Enterococos resistentes à vancomicina é causa substancial de
morbidade e mortalidade em pacientes imunossuprimidos. Em estudo
retrospectivo realizado por Matar e colaboradores
(16)
, de 2.115 pacientes
imunossuprimidos, 99 (4,7%) estavam colonizados por VRE E. faecalis (VREEF), sendo que 12,5% eram relacionados a pacientes oncológicos e o maior
percentual representava pacientes com leucemia. Entre os 99 pacientes
colonizados por VRE-EF, 29 (29,29%) desenvolveram bacteremia e 32
(32,32%) episódios de infecção por VRE em outros sítios. A colonização por
VRE apresentou o valor preditivo negativo de 99,9% e valor preditivo positivo
de 29,3% para o desenvolvimento de bacteremia. Deste modo, os autores
concluíram que a identificação de pacientes colonizados por VRE ajudaria a
identificar os possíveis subgrupos de alto risco suspeitos a desenvolverem
infecção (16).
Em estudo realizado por Montecalvo e colaboradores
(83)
em unidade
oncológica, verificou que a colonização por VRE em pacientes hospitalizados
persistiu pelo menos durante 7 semanas
(83)
. O tempo prolongado de
colonização aumenta consideravelmente o risco de infecção e dependendo da
população de doentes estudada, o risco de se ter infecção por VRE a partir de
uma colonização aumenta consideravelmente.
Outro estudo realizado por Hachem & Raad
pacientes
imunocomprometidos
(leucemia,
(84)
em três grupos de
transplantados
e
sarcoma)
colonizados por VRE E. faecium (VRE-EFM), mostrou que ao longo de três
meses, 12/50 (24%) desses pacientes apresentaram bacteremia por esse
microrganismo
(84)
. Em estudo comparativo realizado entre pacientes com
prognóstico por bacteremia por VRE versus bacteremia por enterococos
19
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
sensíveis a vancomicina (VSE), realizado entre 1995 - 1997, foi verificado que,
em relação à falha terapêutica, houve uma maior taxa nos pacientes com
bacteremia por VRE (60% contra 40%); assim como a taxa de mortalidade,
onde nesse mesmo grupo, também foi maior (52% contra 27%) (19).
Entre as espécies enterocócicas, a aquisição por VRE-EFM tem
apresentado
um
maior
problema
do
que
a
aquisição
de
VRE-EF,
principalmente por ser entre as espécies de enterococos a que apresenta uma
maior virulência e pela sua resistência intrínseca a muitos antimicrobianos,
incluindo β-lactâmicos e aminoglicosídeos, o que tem dificultado a eficácia do
tratamento (21, 85-87).
2.4 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por
Enterococcus spp.
As principais espécies enterocócicas causadoras de infecção no homem
(E. faecalis e E. faecium) apresentam resistência intrínseca a diversos
antimicrobianos,
incluindo
aztreonam;
clindamicina,
cefalosporinas
e
cotrimoxazol (Sulfametoxazol/Trimetoprima). Habitualmente tem pequena
sensibilidade aos aminoglicosídeos e à penicilina G, moderada sensibilidade à
ampicilina e ao cloranfenicol, mas são bastante sensíveis aos glicopeptídeos
(88-91)
.
Entretanto, é notável a habilidade dos enterococos em adquirir novos
genes de resistência, como a resistência a macrolídeos (gene ermB),
tetraciclina (genes tetM e tetN), cloranfenicol (enzima cloranfenicol acetiltransferase),
aminoglicosídeos
(via
enzimas
modificadoras
de
aminoglicosídeos) e vancomicina (vanA, vanB...) (31).
20
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Geralmente, as infecções enterocócicas graves são tratadas com a
associação de antimicrobianos
(92)
. A endocardite enterocócica é o protótipo da
infecção em que a terapia combinada é superior à monoterapia
(93)
. A
associação mais utilizada é ampicilina ou penicilina com aminoglicosídeos
(gentamicina, por exemplo). A vancomicina é uma opção em pacientes
alérgicos aos β-lactâmicos. Essas combinações agem sinergicamente devido à
penetração de um inibidor da síntese protéica (aminoglicosídeos) pela parede
celular defeituosa causada, por exemplo, por um β-lactâmico ou glicopeptídeo.
Esse efeito sinérgico ocorre quando não há um nível alto de resistência aos
aminoglicosídeos (MIC < 2.000 µg/L) ou resistência aos inibidores da parede
celular (94).
A extensão desse princípio a outras infecções enterocócicas necessita
investigação. A necessidade de combinações bactericidas no tratamento de
outras infecções enterocócicas é menos clara, particularmente em pacientes
com bacteremia e sem endocardite. Nesses casos, a terapia combinada só é
recomendada em situações especiais (95).
Alguns antimicrobianos alternativos apresentaram boa atividade in vitro
contra enterococos, entretanto é desconhecido o verdadeiro impacto desses
resultados na prática médica. Um exemplo é o que foi observado em relação à
trospectomicina (aminociclitol), que tem sido relatada como superior à
estreptomicina, mas devido ao fato de ser inativada pelas mesmas enzimas
que degradam a estreptomicina e a gentamicina, os resultados obtidos in vitro
(94% de sensibilidade) devem representar uma falsa sensibilidade
estudo realizado por Barry e colaboradores
(96)
(96, 97)
. Em
para avaliação da atividade
antimicrobiana da trospectomicina, verificou-se que para a maioria dos
21
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
enterococos o perfil de sensibilidade foi apenas moderado (CIM50 = 16 µg/mL)
(96)
.
Cloranfenicol e tetraciclina são antimicrobianos para os quais é comum
observar sensibilidade dos enterococos, contudo, no passado já se tentou
utilizar o cloranfenicol no tratamento desses patógenos, sem êxito. As
tetraciclinas também não parecem apresentar resultados clínicos satisfatórios,
especialmente em infecções potencialmente graves (98).
Agentes antimicrobianos de várias classes, incluindo fluoroquinolonas,
estreptograminas e novobiocina (em baixas concentrações), têm sido testados
contra enterococos e têm demonstrado inibir o crescimento in vitro
(98)
. A
novobiocina já foi utilizada previamente para o tratamento de infecções por
microrganismos Gram-positivos, mas devido à sua relativa toxicidade e à alta
taxa de surgimento de resistência, ela foi gradativamente abandonada. Apesar
disso, quando começaram a surgir estafilococos resistentes à oxacilina, a
utilização desse antimicrobiano voltou a ser avaliada. Para enterococos,
entretanto, dados disponíveis até o momento não são suficientes para analisar
sua eficácia e há estudos demonstrando apenas atividade discreta contra
esses patógenos
(99)
. Além disso, a ligação protéica desse antimicrobiano é
muito alta, o que pode interferir na sua eficácia in vivo, (99, 100).
Outra classe de agentes antimicrobianos que demonstra atividade in
vitro contra enterococos é o grupo das fluoroquinolonas
(101, 102)
. As novas
fluoroquinolonas têm demonstrado boa atividade contra enterococos, em
especial a clinafloxacina (cujo radical pirrolidinil na posição 7, garante maior
atuação contra bactérias Gram-positivas
(103)
difluorinatado do ácido quinolona-carboxílico
, e a esparfloxacina (membro
(104)
. Em estudo realizado por
22
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Jones e colaboradores
(104)
, a concentração de antimicrobiano necessária para
inibir 50% das amostras de enterococos estudadas (CIM50) foi de 0,5 μg/mL e a
concentração necessária para inibir 90% das amostras (CIM90) foi 2 μg/mL. As
CIMs variaram de 0,12 a 2 μg/mL. No entanto tem-se observado emergência
de resistência in vitro, bem como de falha terapêutica
(104)
, além disso, foram
retiradas do mercado por efeitos colaterais.
Em infecções enterocócicas graves, que necessitam de um tratamento
prolongado e com administração intravenosa, a vancomicina é, entre os
antimicrobianos disponíveis, um dos mais adequados para o tratamento (104).
2.4.1 - Glicopeptídeos
A classe dos glicopeptídeos é formada por estruturas cíclicas complexas
de açucares e aminoácidos (Figura 2). Entre os antimicrobianos que fazem
parte desse grupo, a vancomicina se destaca.
Figura 2 - Estrutura molecular da vancomicina (105).
23
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A vancomicina é um antimicrobiano bactericida que foi isolado pelo
grupo de Eli Lilly em 1956, a partir da fermentação do fungo Amycolatopsis
orientalis (relacionado à Nocardia) encontrado em amostras de solo coletado
no interior das selvas de Bornéu (106).
Com o nome originado da expressão inglesa “to vanquish” (aniquilar,
destruir, vencer), vancomicina tornou-se quase uma lenda devido ao seu
excelente desempenho frente a cepas de ORSA. Possui atividade contra cocos
Gram-positivos, C. difficile e Corynebacterium spp., contudo, não possui
atividade contra bactérias Gram-negativas e micobactérias (105).
Sua disponibilidade para uso clínico ocorreu em 1958, após aprovação
pelo Food and Drug Administration (FDA). Nessa mesma época, outros
agentes
anti-estafilocócicos
(tetraciclinas,
cefalosporinas,
eritromicina
e
meticilina) passaram a serem utilizados, recebendo maior aceitação do que a
vancomicina devido aos seus aparentes efeitos tóxicos (ouvidos e rins),
levando a vancomicina a ser relegado para a posição de uma droga de última
instância (105, 107).
Avanços em processos de fermentação microbiológica e técnicas de
separação permitiram a produção de vancomicina com alta pureza, resultando
na eliminação de muitos dos seus efeitos colaterais. Com a incidência
crescente de resistência bacteriana frente aos outros agentes quimioterápicos,
o emprego clínico da vancomicina foi difundido e sua obtenção tornou-se objeto
de grande interesse acadêmico e industrial (105).
24
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.4.1.1 – Mecanismo de Ação
Da mesma maneira que os antimicrobianos β-lactâmicos agem, a
vancomicina age no metabolismo de construção da parede celular bacteriana,
através da ligação da porção terminal D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo
encontrado em precursores de peptidoglicano, interferindo na etapa de
transpeptidação (Figura 3) (105,108).
Figura 3 - Etapa da Transpeptidação: Formação das ligações
cruzadas nas cadeias peptídicas (108).
O peptidoglicano (heteropolissacarídeo, tendo na sua constituição os
monossacarídeos ácido N-acetilmurâmico - NAM e N-acetilglucosamina - NAG)
é responsável pela rigidez e forma da parede celular bacteriana
Especificamente,
a
vancomicina
impede
incorporação
do
ácido
(108)
.
N-
acetilmurâmico e o N-acetilglucosamina, que são subunidades constituintes da
matriz do peptidoglicano, principal componente estrutural da parede celular das
bactérias Gram-positivas (109).
25
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Com a sua característica hidrofílica, a molécula de vancomicina forma
ligações através de seus átomos de hidrogênio com as interações do terminal
D-Ala-D-Ala ligadas aos peptídeos NAM e NAG. Esses pontos de ligação
formados (cinco) previnem a junção entre as subunidades do peptidoglicano
(Figura 4) (105,109).
Figura 4 - Ligação entre vancomicina e a porção terminal
D-Ala-D-Ala do peptidoglicano (105).
A consolidação da vancomicina como um antimicrobiano importante
frente a bactérias Gram-positivas multiresistentes, trouxe um período de certa
tranqüilidade nos programas de investigação e desenvolvimento de novos
agentes antimicrobianos pelas empresas farmacêuticas. Entretanto, com o
surgimento das primeiras cepas de enterococos resistentes à vancomicina e a
emergência da sua disseminação no ambiente hospitalar, levou a necessidade
da busca de novos antimicrobianos para o tratamento deste patógeno
multirresistente (105).
26
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Apesar da natureza não patogênica dos enterococos com relação a
pessoas sadias, o relato em 1988 dos primeiros casos de resistência destas
bactérias causou enorme alarme, pois os enterococos são capazes de infectar
pacientes imunodeficientes, tais como transplantados e vítimas de AIDS. A
ocorrência de colonização intestinal de VRE em pacientes com longos períodos
de internação em hospitais pode não resultar em sintomas infecciosos, mas
servirá de reservatório para transmissão a outros pacientes. A bactéria pode
espalhar-se pelo contato direto ou indireto dentro de uma clínica de saúde ou
hospital, bem como através de profissionais de saúde que trabalham em mais
de uma instituição, e ainda por pacientes que são transferidos e que já haviam
sido infectados. Em uma situação mais preocupante, o temor de que genes
causadores de resistência à vancomicina presentes nos VRE fossem
transmitidos para os ORSA foi recentemente confirmado em alguns casos
isolados (n=7) surgidos na América do Norte, sendo conhecidos como VRSA
(“vancomycin-resistant” S. aureus) (81,110).
Em uma publicação de 2003, Chang e colaboradores
(111)
notificaram
que em uma amostra de VRSA isolada de uma ponta de cateter de um
paciente de Michigan, com quadro de insuficiência renal, foi isolado tanto o
gene de resistência mecA (que confere resistência a oxacilina), quanto o gene
vanA (encontrado em enterococos resistente a vancomicina). Essa presença foi
confirmada através da PCR localizado em um plasmídeo de 60 kb e a
seqüência de DNA do gene vanA VRSA foi idêntica à de uma amostra de E.
faecalis resistente à vancomicina isolada a partir da mesma cultura de ponta
cateter (111).
27
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Embora a vancomicina esteja inserida na prática clínica desde o final da
década de 50, sua resistência surgiu somente 30 anos após sua introdução nos
Estados Unidos
(112)
. Desde então, esse país vem enfrentado um aumento
progressivo de VRE nos hospitais, principalmente relacionada à espécie E.
faecium, que apresenta uma maior freqüência que E. faecalis
Jones e colaboradores
(113)
. Segundo
(114)
, os índices médios de E. faecalis resistente a
vancomicina são 2,8% e de E. faecium, 24,2%
(114)
. Na América Latina, de
acordo com estudo realizado por Gales e colaboradores
(68)
, sobre a freqüência
de Enterococcus spp. durante 10 anos de estudo SENTRY (1997 - 2006),
verificou-se que a espécie E. faecalis continua sendo mais prevalente em
relação à espécie E. faecium, com 78,2% contra 12,7% (n=2.026),
respectivamente. Embora o número de E. faecalis e E. faecium apresentando
fenótipo VRE foram semelhantes, a percentagem de VRE-EFM (19,8%) foi
proporcionalmente superior ao VRE-EF (3,3%) em relação ao número total de
isolados. Em 2006 foi verificado um aumento significativo de VRE-EFM no
Brasil (68).
2.4.1.2 - Mecanismo de Resistência
A resistência bacteriana à vancomicina em enterococos ocorre através
de uma modificação genética no gene bacteriano, sintetizando, como exemplo,
D-alanina-D-lactato (D-Ala-D-Lac) ao invés do dipeptídeo D-alanina-D-alanina
(D-Ala-D-Ala)
(105)
. A modificação do aminoácido terminal D-alanina por D-
lactato introduz uma interação eletrostática repulsiva no lugar da ligação de
hidrogênio (Figura 5). Em conseqüência, a afinidade da vancomicina com a
camada de peptidoglicano diminui em uma escala superior a 1000 vezes (109).
28
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 5 - Interação eletrostática repulsiva entre vancomicina e
a porção terminal modificada D-Ala-D-Lac do peptidoglicano (105).
A aquisição do mecanismo de resistência a vancomicina é mediada por
vários genes
(115)
. Embora a origem da sensibilidade de enterococos frente à
teicoplanina envolva mecanismos diferentes daquele da vancomicina, essas
características de sensibilidade e resistência frente aos dois glicopeptídeos
servem como base para uma classificação clínica (105).
Dos sete fenótipos descritos atualmente (Tabela 1), os genes vanA e
vanB são, de longe, os mais prevalentes no mundo todo e são descritos
principalmente entre as espécies E. faecalis e E. faecium, sendo essa segunda
a mais prevalente em hospitais norte-americanos e europeus
(113)
. Cepas
enterocócicas com fenótipo VanA apresentam alto grau de resistência a
vancomicina e teicoplanina e a resistência pode ser induzida pela presença de
glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina, avorpacina, ristocetina) e por
agentes não glicopeptídeos, como bacitracina e polimixina B
(116)
. O tipo VanB
29
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
apresenta altos níveis de resistência a vancomicina enquanto a sensibilidade a
teicoplanina é mantida, porém o gene encontra-se em elementos móveis que
podem ser transferidos entre espécies enterocócicas (116).
O terceiro fenótipo mais presente é do tipo VanC, descrito apenas nas
espécies de E. casseliflavus, E. gallinarum e E. favescens (embora haja algum
desacordo sobre esta espécie ser uma legítima espécie de enterococos)
(117)
.
Diferente do fenótipo VanA e VanB, o fenótipo VanC possui em sua porção
terminal o D-Ala-D-Ser, causando resistência intrínseca a vancomicina (baixo
nível), mas sensibilidade a teicoplanina (116).
Tabela 1 - Classificação dos genes que conferem resistência aos glicopeptídeos em Enterococcus
spp. (115,118).
Resistência
Intrínseca
Resistência Adquirida
Fenótipo
VanA
VanB
VanD
VanE
VanG
VanL
VanC
Gene
vanA
vanB
vanD
vanE
vanG
vanL
vanC
CIM (µg/mL)
Vancomicina
16 - 1000
4 - 32 (-1000)
64 - 128
8 - 32
16
8
2 - 32
CIM (µg/mL)
Teicoplanina
(4-) 16 - 512
0,5 - 1
4 - 64
0,5
0,5
Sensível
0,5 - 1
Modificação
do alvo
D-Ala-D-Ala
D-Ala-D-Ala
D-Ala-D-Ala
D-Ala-D-Ser
D-Ala-D-Ser
Induzida
Induzida
Constitutiva
Induzida
Induzida
Induzida
Constitutiva /Induzida
Plasmidial/
Cromossomo
Plasmidial/
Cromossomo
Cromossomo
Cromossomo
Cromossomo
Cromossomo
Cromossomo
Tn1546
Tn1547 ou
Tn1549
.....
.....
.....
.....
.....
+/-
+/-
−
−
+
−
−
Expressão
Localização
Elemento
Móvel
Transferência
por
Conjugação
Distribuição
entre as
espécies
enterocócicas
1
E. faecium
E. faecalis
E. durans
E. hirae
E. gallinarum1
E. casseliflavus1
E. raffinosus
E. avium
E. mundtii
E. faecium
E. faecalis
E. durans
E. gallinarum1
E. faecium
E. faecalis
E. raffinosus
E. faecalis
E. faecalis
D-Ala-D-Ser
E. faecalis
E. gallinarum (vanC1)
E. casseliflavus (vanC2/3)
E. flavescens
Eventos raros de espécies que adquiriu gene de resistência vanA ou vanB, além da presença do vanC1 ou vanC2/3.
30
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Os detalhes do mecanismo de resistência à vancomicina tem sido
melhor documentado com o gene vanA mediado pelo transposon Tn1546, que
se encontra localizado em plasmídeo ou cromossomo da célula bacteriana.
Esse transposon codifica nove polipeptídeos que atuam em conjunto na
conferência da resistência a vancomicina (Figura 6). Estes polipeptídeos
podem ser distribuídos em quatro grupos funcionais: Transposição, Regulação,
Resistência e Proteínas acessórias (não-essenciais) (119-121).
Regulação
Transposição
Resistência
Não- essenciais
Desconhecida
Transposase
Resolvase
Reguladora
Prot. quinase
Dehidrogenase
Ligase
Dipeptidase
D,D-carboxipeptidase
Figura 6 - Representação esquemática do Transposon Tn1546. A orientação dos
genes é indicada pelas setas (122).
Na região da função de transposição, encontram-se dois “open read
fream” (orf1 e orf2) que são descritos em direções opostas e codificam a
produção de duas enzimas, transponase e resolvase. A regulação dos genes
que conferem resistência a vancomicina é controlada pelos genes vanR e
vanS. Esses genes codificam proteínas que sinalizam a presença da
vancomicina no meio extracelular, ativando assim os genes de resistência
(vanH, vanA e vanX). Os genes de resistência aos glicopeptídeos são
responsáveis pela produção de dipeptídeos. O gene vanA é responsável pela
produção da terminação D-Ala-D-Lac, e esta formação depende do gene vanH,
que atua como uma desidrogenase reduzindo piruvato em D-lactato, o
31
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
substrato usado pelo vanA. Já a vanX produz uma D,D dipeptidase que
hidrolisa o D-Ala-D-Ala excedente, mas não hidrolisa D-Ala-D-Lac, impedindo a
síntese de precursores finais desses tipos de dipeptídeos e sua inserção ao
tripeptídeo precursor. Entre as proteínas não-essenciais, a proteína vanY,
uma D,D carboxi-peptidase, poderia ajudar a resistência aos glicopeptídeos por
clivar o terminal D-Ala dos precursores tardios resultantes da incorporação de
D-Ala-D-Ala que escaparam da hidrólise por vanX, tornando-as sem afinidade
pela vancomicina e o vanZ confere baixo grau de resistência a teicoplanina,
mas seu mecanismo ainda é desconhecido (113, 119-123).
Estudos epidemiológicos da década de 1990 demonstraram um
crescimento significativo das infecções por Enterococcus spp. resistentes aos
glicopeptídeos, em especial a vancomicina (95). Embora muitas combinações de
drogas tenham sido propostas e testadas para o tratamento das infecções
provocadas pelo VRE, à terapia conjugada ideal nestes casos nunca ficou bem
definida. Como crescimento de isolados de VRE geralmente ocorre em
pacientes com defesas significativamente comprometida e graves comorbidades, isto aumentou a importância de um efetivo tratamento
antimicrobiano (119).
Entre os antimicrobianos lançados nos últimos anos pelas indústrias
farmacêuticas para o combate de microrganismos multiresistente, alguns já
foram aprovados pelo FDA como opção terapêutica para os enterococos
multiresistentes. Entre os recentes antimicrobianos introduzidos na prática
clínica nos últimos anos estão: Quinupristina/dalfopristina (estreptograminas);
Linezolida (oxazolidinonas); Daptomicina (lipopeptídeos cíclicos) e Tigeciclina
(glicilciclinas). Apesar dos altos custos, representam ótimas opções para estes
32
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
casos. Entretanto, esses medicamentos apresentam certas limitações para o
uso e a resistência em alguns já foi relatada (115).
Embora
existam
essas
novas
opções
terapêuticas,
o
uso
da
vancomicina ainda é o mais prevalente para o tratamento de isolados de
enterococos e ainda mais para o tratamento de cepas MRSA. Este fato decorre
não apenas devido à sua comprovada eficácia ao longo das décadas, mas,
sobretudo, porque ainda é o mais acessível economicamente (Tabela 2).
Tabela 2 - Custo atual dos novos antimicrobianos em relação à vancomicina (2009)
de acordo com regime terapêutico padrão.
Antimicrobiano
Vancomicina
Regime Terapêutico Padrão Administração
Custo diaa
(R$)
2g / 2 x dia
IV
216,52
400mg / 1 x dia
IV ou IM
557,69
1,2g / 2 x dia
IV ou VO
1.094,22
Daptomicina (Cubicin ®)
400mg / 1 x dia
IV
312,7
Tigeciglina (Tygacil ®)
100mg / 1 x dia
IV
365,00
Teicoplanina (Targocid ®)
Linezolida (Zyvox ®)
a
: média por paciente pesando 60 quilos e com função renal normal. IV: intravenosa; IM: intramuscular; VO: via oral.
Dado: http://www.consultaremedio.com.br (acessado em outubro de 2009).
2.5 - Importância do Controle do uso da Vancomicina em Pacientes
Oncológicos
Segundo recentes recomendações da Sociedade Americana de
Doenças Infecciosas, IDSA, os Gram-positivos são hoje responsáveis por 6070% dos episódios de infecção documentada em episódios de neutropenia
febril, decorrente, na maioria das vezes, pela translocação de bactérias
presentes no aparelho gastrointestinal
(124)
, dentre os quais, tem se destacado
os enterococos (125).
33
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A escolha da antibioticoterapia empírica em pacientes com neutropenia
febril depende do uso prévio do antimicrobiano e da flora microbiológica
existente na instituição
(124)
. Entre as opções de monoterapias empíricas
indicadas atualmente para esses casos, a cefepima está entre as mais usadas
nos hospitais. Estudos recentes indicam o uso da cefepima como uma das
melhores opções, uma vez que possui cobertura sobre várias bactérias Grampositivas como Staphylococcus spp. (incluindo as produtoras de β-lactamase) e
Streptococcus spp. (abrangendo S. pneumoniae com resistência intermediária
à penicilina), o que permite adiar o uso dos glicopeptídeos e por possuir menor
poder de indução de seleção de bactérias resistentes, quando comparada à
ceftazidima. Entretanto, o uso desse antimicrobiano não se aplica para os
isolados de MRSA e enterococos; já que a cefepima não possui ação sobre
estes (125).
Para isolados de MRSA e enterococos o uso de vancomicina seria a
escolha ideal, no entanto sabe-se que o uso da terapia prévia abusiva desse
antimicrobiano aumenta o número de casos de cocos Gram-positivos com
resistência a esse fármaco, principalmente entre as espécies de enterococos.
Frente a esse crescente aumento mundial, provavelmente relacionado ao seu
uso abusivo, diversos órgãos de referência internacional [“Hospital Infection
Control Practices Advisory Committee” (HICPAC) of the “Centers for Disease
Control and Prevention” (CDC), “European Organization for Reserarch and
Treatment of Cancer” (EORTC) e “National Cancer Institute of Canada”]
sugerem que o uso da vancomicina ou outro glicopeptídeo (teicoplanina)
devem ser reservados para uma segunda etapa no manejo do paciente
34
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
imunodeprimido neutropênico febril, não indicando estas drogas na terapia
empírica inicial (126,127).
2.6 - Biologia Molecular Aplicada ao Controle de Surtos Hospitalares
Para que um surto de infecção hospitalar possa ser controlado, é
necessária que haja uma investigação epidemiológica a fim de elucidar as
fontes e vias de transmissão. Os recursos laboratoriais disponíveis envolvem
desde os métodos clássicos de tipagem bacteriana até as mais recentes
técnicas de biologia molecular. Muitas destas técnicas oferecem elevado grau
de discriminação entre bactérias aparentemente iguais, permitindo um melhor
conhecimento dos aspectos epidemiológicos da infecção hospitalar (35).
Entre as técnicas moleculares de tipagem utilizada na análise de surtos
de infecções hospitalares e na avaliação da disseminação de cepas
multirresistentes no ambiente hospitalar, ou mesmo entre diferentes hospitais,
utiliza-se o Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE), técnica ainda considerada
“padrão ouro” para análise desse tipo de estudo. Apesar disso, a técnica de
Multilocus
Sequence
epidemiológicos globais
Typing
(MLST)
é
mais
utilizada
para
estudos
(128-130)
. Esses estudos são normalmente associados à
avaliação da sensibilidade das bactérias a antimicrobianos através de testes
especiais de sensibilidade. Embora não exista uma técnica definitiva para
tipagem molecular de enterococos, estudos indicam que PFGE é atualmente a
técnica que tem apresentado os melhores resultados em termos de poder
discriminatório e reprodutibilidade para este microrganismo (129,131).
A detecção de amostras bacterianas com perfil molecular idêntico ou
semelhante durante um surto sugere uma interpretação epidemiológica
35
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
fortemente relacionada a uma transmissão dos genes de resistência entre
pacientes ou através de uma fonte comum. Entretanto, quando o aumento da
taxa de infecção for causado por amostras com perfis moleculares distintos, a
provável causa poderia estar relacionada à seleção independente de mutantes.
Dependendo do tipo de caso, as medidas implementadas para o controle
seguem modelos distintos.
36
OBJETIVOS
3 - OBJETIVOS
3.1 - Objetivo Principal
•
Estudar a epidemiologia dos isolados de enterococos com resistência à
vancomicina (VRE) no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP/GRAACC)
no período de 2008/2009.
3.2 - Objetivos Específicos
Estudo Retrospectivo
•
Investigar a incidência de VRE no IOP, durante o período de janeiro a
agosto de 2008, através de levantamento de dados, seguidos de
técnicas fenotípicas e genotípicas para caracterização dos isolados;
Estudo Prospectivo
•
Rastrear isolados de VRE em pacientes internados no IOP, através de
suscessivas culturas de vigilância de swab anal;
•
Verificar a aplicabilidade do uso de técnicas de tipagem molecular na
caracterização e elucidação de possíveis surtos nas unidades de
internação de cuidados de pacientes oncológicos;
•
Avaliar o impacto do estudo na implementação de medidas de controle
de infecções por VRE no IOP.
37
MATERIAL E MÉTODOS
4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Local de Estudo
Esse estudo foi desenvolvido no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP) /
mantido pelo Grupo de Apoio ao Adolescente e à Criança com Câncer
(GRAACC), vinculada ao setor de Oncologia do Departamento de Pediatria da
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP/EPM), sendo referência de
ensino
no
tratamento
e
pesquisa
do
câncer
infanto-juvenil
e
no
desenvolvimento de pesquisas clínicas.
O IOP dispõe de: área de internação (enfermarias, UTI e centro
cirúrgico); laboratórios (hematologia e imunofenotipagem, citogenética, biologia
molecular e criopreservação) e suporte (reabilitação e prótese, controle da dor,
brinquedoteca terapêutica e Assistência social), além de área de Nutrição,
Psicologia, Enfermagem e Odontologia.
Anualmente o IOP realiza mais de 15 mil consultas, mil cirurgias, 20
transplantes de medula e mais de 11 mil sessões de quimioterapia anualmente,
atendendo em média 300 novos casos/ano. Mais de cinco mil crianças e
adolescentes já foram atendidas pela instituição ao longo dos 10 anos desde a
sua inauguração. Com o passar do tempo, o IOP se especializou no
atendimento de casos de alta complexidade, como tumores do sistema nervoso
central e ósseo, leucemias e outras neoplasias que necessitam de transplante
de medula óssea.
A distribuição dos leitos e a localização das especializações dentro da
estrutura do prédio estão representadas na Tabela 3.
38
MATERIAL E MÉTODOS
Tabela 3 - Unidades e distribuição dos leitos no Instituto de Oncologia Pediátrica IOP/UNIFESP.
Andar
1º
Nome
Ambulatório dos Médicos
Descrição
Quantidade de Leitos
Consultórios divididos por doenças, RX,
serviço social, triagem, inalação, pronto
atendimento, enfermagem, odontologia,
psicologia, psicopedagogia, nutrição,
anestesia, oftalmologia, ambulatório de
dor e atendimento multidisciplinar em
cirurgia pediátrica, neurocirurgia,
ortopedia e fisiatria.
2º
Quimioterapia Ambulatorial
O andar tem 25 postos com poltronas e
macas, salas de coleta de exames e uma
sala de procedimentos como punções,
coleta de mielograma, biopsias de medula
óssea e coleta de líquor.
3º
Laboratório de Hematologia
e Recreação
A brinquedoteca proporciona brincadeiras
e atividades importantes para as crianças e
acompanhantes enquanto aguardam as
consultas e procedimentos terapêuticos.
4º
Central de quimioterapia,
Farmácia e
Escritórios Médicos
Neste andar é onde é preparado a
quimioterapia e o laboratório de transplante
de medula óssea, onde se realiza, entre
outras atividades, a cultura de células e a
criopreservação de medula óssea e banco
de sangue.
5º
Centro Cirúrgico e Centro
de Transplante de Medula
Óssea
Neste andar estão o centro cirúrgico e a
unidade e transplante de medula óssea.
6º
Unidade de Cuidados
Especiais e UTI
Aqui estão localizados os leitos para os
que precisam permanecer internados até
receber alta.
7º
Internação
Aqui estão localizados os leitos para os
que precisam permanecer internados até
receber alta.
8º
Fisioterapia e Terapia
Ocupacional
Localizado o setor de fisioterapia e terapia
ocupacional. Também o Laboratório de
Citogenética e Biologia Molecular.
6 leitos de observação
6 leitos
4 leitos na Unidade de
Cuidados Especiais.
7 Leitos na Unidade de
Tratamento Intensivo
12 leitos para internação.
4.2 - Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do IOP
A Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) do IOP é
constituída de membros consultores e executores, todos profissionais da área
da saúde, formalmente designados a, planejar, elaborar, implementar, manter e
avaliar o Programa de Controle de Infecção Hospitalar (PCIH) adequando às
39
MATERIAL E MÉTODOS
características e necessidades da instituição. Entre as ações desenvolvidas
pelo CIH está a prevenção e a redução da incidência de infecções hospitalares.
Os membros consultores são responsáveis pelo estabelecimento das
diretrizes do CIH e os membros executores representam o Serviço de Controle
de Infecção Hospitalar (SCIH) e, portanto, são encarregados da execução das
ações programadas de controle de infecção hospitalar. O SCIH do IOP é
formado por dois membros, uma equipe médica e uma equipe de enfermagem.
Entre as normas de controle de infecção hospitalar para bactérias
multiresistentes nas unidades de internação do IOP estão: identificar
precocemente os pacientes colonizados e/ou infectados; programar as medidas
preventivas e possibilitar a intervenção mais precoce em eventuais surtos de
infecção hospitalar.
No quadro de bactérias multiresistentes, priorizadas para implementação
de medidas de controle, encontram-se os VRE. Um dos procedimentos
adotados para os casos de pacientes com este microrganismo é o isolamento
do paciente em quarto privativo, sendo que, na impossibilidade da conduta, o
leito do paciente deverá permanecer isolado, quando possível, com biombo. Os
aventais e outros acessórios exclusivos do isolamento deverão permanecer
próximos ao leito do paciente, assim como outras medidas de precauções
específicas, para contato, deverão ser adotadas. Entre estas medidas estão: a
identificação do isolamento por um cartaz chamativo; a comunicação para a
equipe de saúde sobre as medidas de isolamento; o uso obrigatório de luvas
de procedimentos, aventais e máscaras (nos casos de transmissão de
secreções por vias aéreas); a manutenção de aventais; o uso de estetoscópios
e termômetros exclusivos para a unidade de isolamento e a desinfecção das
40
MATERIAL E MÉTODOS
mãos com álcool gel, antes e após qualquer procedimento e a lavagem das
mãos quando necessária. Existe um fluxo dessa conduta ao qual pode ser
visualizado em anexo (Anexo 1).
4.3 - Desenho do Estudo
Foram realizados dois estudos distintos, retrospectivo e prospectivo,
ambos com enfoque epidemiológico de resistência à vancomicina em amostras
de enterococos isoladas de pacientes internados no Instituto de Oncologia
Pediátrica (IOP/GRAACC).
4.3.1 - Estudo Retrospectivo
Este estudo foi realizado através de um levantamento de dados do IOP,
seguidos de análises das amostras realizadas no Laboratório Especial de
Microbiologia Clínica (LEMC/UNIFESP), com intuito de verificar a incidência de
pacientes
colonizados
e/ou
infectados
por
enterococos
resistentes
à
vancomicina. Todos os isolados bacterianos de diversos sítios (culturas de
vigilância de swab anal e de sítios estéreis), armazenados no banco de
microrganismos do LEMC e previamente identificados como Enterococcus spp.
foram analisados no período de janeiro a agosto de 2008. Testes fenotípicos e
moleculares foram realizados para identificação da espécie, confirmação do
perfil de sensibilidade (principais antimicrobianos), investigação da presença do
gene vanA, através da técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) e
verificação da similaridade gênica, através da técnica de PFGE. Dados clínicos
41
MATERIAL E MÉTODOS
como: idade, sítio, data de isolamento, tempo e unidade de internação foram
obtidos a partir de informações da CCIH do IOP (Anexo 2).
4.3.2 - Estudo Prospectivo
Após o estudo retrospectivo, foi realizado um rastreamento dos
pacientes com suspeita de estarem colonizados por VRE, através de
sucessivas culturas de vigilância de swab anal. A seleção dos pacientes para o
estudo prospectivo foi realizada pelo CCIH do IOP, que estabeleceu os
seguintes critérios:
• Critérios de inclusão: todos pacientes internados no IOP no período
do estudo, independentes do período de internação, do uso prévio de
antimicrobianos, de estadias prévias em UTI, de transplantes de
medula óssea e procedimentos cirúrgicos.
• Critérios de exclusão: pacientes ambulatoriais, que não possuíam
fatores de risco para VRE.
As coletas de todos os pacientes internados foram realizadas
mensalmente, no período de outubro a março de 2009, totalizando quatro
etapas de coletas de cultura de vigilância, sendo, as três primeiras
consecutivas e a última, após um intervalo de três meses. As datas das
culturas de vigilância foram estabelecidas em um consenso entre CCIH do IOP,
LEMC e Laboratório de Microbiologia do Hospital São Paulo.
42
MATERIAL E MÉTODOS
4.3.2.1 - Coleta das Amostras
As coletas dos swabs foram realizadas pela equipe de enfermagem da
instituição, de acordo com a orientação da CCIH. Cada coleta foi realizada no
mesmo dia, durante o período matutino, em todas as alas de internação. Swab
estéril e caldo NaCl 6,5% (5 mL) foram entregues para a equipe de
enfermagem, seguido de orientações para realização da coleta. O swab estéril
foi inserido na região do esfíncter anal do paciente (1 a 5 cm de diâmetro) e
com movimentos rotatórios foram obtidas a amostra. Após a coleta, a amostra
foi imediatamente introduzida no tubo de ensaio contendo o caldo NaCl 6,5% e
o swab descartado. As amostras devidamente etiquetadas e identificadas
seguiram imediatamente para o Laboratório de Microbiologia do Laboratório
Central do Hospital São Paulo para processamento das mesmas.
4.3.2.2 - Processamento das Amostras
Os tubos contendo a amostra foram colocados em estufa (± 35°C) por
um período de aproximadamente duas horas. Após esse tempo, com auxílio de
alça estéril descartável, a solução foi semeada em meios de cultura, utilizados
para triagem de VRE. Os meios utilizados nesse estudo foram: laminocultivo
VREBAC (Probac do Brasil, São Paulo, SP, Brasil)
(154)
e ágar Enterococossel
(BBL, Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, EUA)
acrescido de 6 μg/mL de vancomicina. Após semeadura os meios foram
incubados a ±35°C, por 24 e 48 horas, para posteriores leituras e análises.
43
MATERIAL E MÉTODOS
4.4 - Identificação Fenotípica do Gênero
As amostras que obtiveram crescimento em pelo menos um dos meios
screening utilizados, as colônias com morfologia suspeita de Enterococcus spp.
foram semeadas em ágar sangue para isolamento e posterior identificação.
Foram realizados os seguintes testes de identificação fenotípica: prova da
catalase; hidrólise da L-pyrrolidonyl β-naphtylamide (teste PYR), bile esculina e
caldo NaCl 6,5%. A interpretação dos resultados foi realizada através da
correlação destes testes (Anexo 3, Tabela1).
4.4.1 - Prova da Catalase
Para verificação da produção da enzima catalase utilizou-se uma gota
de peróxido de hidrogênio a 3%, aplicada sobre um esfregaço de colônias
bacterianas em lâmina de vidro. A ausência de formação de bolhas na amostra
indicou a não produção da enzima, característica do gênero Enterococcus.
Como controle positivo utilizou-se S. aureus ATCC (American Type Culture
Collection) 25.923 e, como controle negativo a cepa de E. faecalis ATCC
29.212.
4.4.2 - Hidrólise Enzimática da L-pyrrolidonyl β-naphtylamide
(PYR)
Sobre um disco contendo o substrato PYR, previamente umedecido com
água estéril, foi realizado um esfregaço da amostra. Após 5 minutos o reagente
dimetilaminocinamaldeído foi gotejado sobre o disco para detectar alfanaftilamina, substância liberada pela hidrólise do PYR (Probac do Brasil, São
44
MATERIAL E MÉTODOS
Paulo, SP, Brasil). O aparecimento de coloração púrpura a rósea é indicativa
de resultado positivo, o que caracteriza o gênero Enterococcus.
4.4.3 - Hidrólise da Bile Esculina
As amostras foram semeadas em tubo com ágar inclinado de bile
esculina (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EUA). Em seguida foram
incubadas por 18-24 horas a ± 35 ºC para posterior leitura. O enegrecimento do
meio indicou a hidrólise da esculina em esculetina que, combinado com o
citrato férrico do meio, promove um complexo fenólico de coloração negra,
característica do gênero Enterococcus.
4.4.4 - Crescimento em Caldo 6,5% de NaCl
A prova do caldo hipercloretado evidencia a capacidade de tolerância de
certas bactérias a altas concentrações de sal em caldo Brain Heart Infusion
(BHI, Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) acrescido de 6,5% de cloreto de sódio.
Esse teste é utilizado para diferenciar entre os gêneros Enterococcus e
Streptococcus. Em cada tubo com NaCl 6,5% foram acrescidas de 3 a 5
colônias da amostra e após homogeneização foi incubado em estufa ± 35°C
por 24 horas. A turvação (crescimento) do meio indicou teste positivo,
característica das espécies de Enterococcus spp.
4.5 - Identificação Fenotípica das Espécies
Os isolados que apresentaram características pertencentes ao gênero
Enterococcus foram submetidos à identificação das espécies, nos quais foram
45
MATERIAL E MÉTODOS
realizadas séries bioquímicas utilizando caldo base de Purple (Difco
Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) acrescido dos açúcares, teste da
motilidade e produção de pigmento, segundo a descrição de Facklan & Teixeira
(132)
. A interpretação dos resultados foi realizada através da correlação destes
testes (Anexo 3).
4.5.1 - Fermentação de Carboidratos
A análise dos carboidratos foi verificada em meio líquido, constituído por
caldo Purple acrescido a um dos seguintes carboidratos: Arabinose, Metil-α-DGlucopiranisídeo (MGB), Ácido piruvato, Arginina, Manitol, Sorbitol, Sorbose,
Rafinose (Sigma, Chemival Co., St. Louis, EUA) com concentração final de 1%.
Na seqüência de tubos contendo os açúcares (5 mL) descritos acima foram
inoculado de 3 a 5 colônias isoladas da amostra para identificação.
Devidamente homogeneizados foram incubados em estufa ± 35°C e as leituras
foram realizadas em 24 e 48 horas. A reação positiva foi verificada através da
mudança na coloração do meio de púrpura para amarela, provocada pelo
consumo do carboidrato através do processo de fermentação, deixando a
solução ácida, evidenciando-se o teste positivo através da mudança de cor
(amarela).
4.5.2 - Teste de Motilidade
Para o teste de motilidade foram utilizados 3 mL do meio semi-sólido
Motility Medium (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) distribuído em
tubos de ensaio. Com uma alça de níquel-cromo as amostras foram inseridas
46
MATERIAL E MÉTODOS
na região central do meio. Em seguida foram incubadas à ± 35ºC e as leituras
foram realizadas com 24 e 48 horas de incubação. A observação de
crescimento bacteriano apenas na linha da inserção é característica de
organismos imóveis (motilidade negativa), enquanto a turbidez observada ao
redor do pico do inóculo, evidencia a motilidade positiva.
4.5.3 - Produção de Pigmento
A produção de pigmento foi verificada em swab estéril, através do
raspado de colônias crescidas em placa de Müeller Hinton (Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra), após período de incubação de 18-24 horas a ± 35ºC. A observação
de coloração amarelada indica a produção de pigmento.
4.6 - Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos
Paralelo ao processo de identificação de espécie foi realizado teste de
disco difusão (método de Kirby-Bauer) de acordo com as recomendações do
Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)
(133)
. Os antimicrobianos (Oxoid,
Basingstoke, Inglaterra) testados foram: vancomicina (30 µg), teicoplanina (30
µg), ampicilina (10 µg), estreptomicina High Level (HL) (300 µg), gentamicinaHL (120 µg) e linezolida (30 µg). As placas foram incubadas a ± 35°C por 24
horas para posterior leitura do diâmetro dos halos do antibiograma.
Para as amostras que apresentaram resistência intermediária pelo
método de disco difusão a vancomicina e teicoplanina foram realizados testes
para determinar a concentração inibitória mínima (CIM), usando o método de
E-test® (AB Biodisk, Solna, Suécia) de acordo com as recomendações do
47
MATERIAL E MÉTODOS
fabricante. Foi realizado como controle de qualidade, cepas de S. aureus
(ATCC 29.213) e de E. faecalis (ATCC 29.212).
4.6.1 - Disco Difusão
4.6.1.1 - Inóculo
Para obtenção do inóculo, selecionou-se da placa de cultura de ágar
sangue 3 a 5 colônias isoladas, com mesmo tipo morfológico. Com auxílio de
uma alça estéril, os microrganismos foram transferidos para um tubo contendo
5 mL de solução salina. A suspensão bacteriana foi homogeneizada e a
turvação medida em turbidímetro digital (Baxter, Sacramento, EUA) e a escala
utilizada foi a correspondente a 0,5 de McFarland, o que corresponde a uma
concentração bacteriana em torno de 1 a 2 x 108 UFC/mL.
4.6.1.2 - Inoculação das Placas
O swab alginetado estéril foi inserido dentro do tudo contendo a
suspensão bacteriana ajustada. O excesso da solução no swab foi retirado
através de movimentos rotatórios contra a parede interna do tubo. A
semeadura foi realizada em placa de ágar Müeller-Hinton e o procedimento do
esfregaço na placa foi efetivado de forma uniforme, a fim de assegurar a
distribuição por igual do inóculo por toda superfície do ágar, como preconizado
pelo CLSI M100-S18 (133).
48
MATERIAL E MÉTODOS
4.6.1.3 - Aplicação dos Discos e Interpretação dos Resultados
Os discos de antimicrobianos foram dispensados na placa de ágar
Müeller-Hinton inoculada de forma distribuída e espaçadamente. As placas
foram colocadas em estufa a ± 35°C por 24 horas para posterior leitura dos
halos. Os halos foram interpretados como sensíveis, intermediários ou
resistentes; de acordo com os critérios de interpretação estabelecidos pelo
CLSI M100-S18 (133). A cepa ATCC utilizada para este teste foi S. aureus ATCC
29.213 e de E. faecalis ATCC 29.212.
4.6.2 - Etest
Para as cepas que apresentaram resistência intermediária, foi verificada
a CIM através da técnica de Etest. A preparação da suspensão bacteriana em
salina na escala 0,5 de McFarland e a inoculação das placas de Müeller-Hinton
seguiram os mesmos critérios realizados na técnica de disco difusão, como
descrito no item 4.5.1.3. A aplicação da fita em ágar inoculado foi seguida
conforme orientações do fabricante. As placas foram colocadas em estufa a ±
35°C e após período de 24 horas, foi feita a interpretação da zona elíptica. A
leitura da CIM foi realizada considerando a intersecção entre a fita de Etest e a
zona elíptica de inibição de crescimento bacteriano. Quando a intersecção
localizou-se entre duas numerações, foi considerada a concentração acima da
intersecção. A cepa ATCC utilizada para esse teste foi E. faecalis ATCC
29.212.
49
MATERIAL E MÉTODOS
4.7 - Técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Foram realizados ensaios de PCR para determinar a ocorrência do gene
vanA em amostras resistentes à vancomicina. A extração de DNA das
amostras testadas no estudo foi realizada a partir da retirada, com alça
calibrada de 1:1000, de 3 a 5 colônias obtidas do meio de ágar sangue, e
inseridas em tubo Eppendorf contendo 300 μL de água MiliQ estéril. A seguir,
essa suspensão foi submetida à fervura por 15 minutos, a fim de romper a
parede bacteriana e expor o DNA bacteriano. Após esta etapa, os tubos foram
submetidos à centrifugação durante 3 minutos a 13.000 rpm e o sobrenadante
com o DNA foi transferido para outro Eppendorf.
Para amplificação do gene vanA foram utilizadas seqüências iniciadoras
específicas segundo Dutka-Malen (134):
vanA F - GGGAAAACGACAATTGC
vanA R – GTACAATGCGGCCGTTA
Para cada reação foram utilizados: 5 μL da Master Mix GoTaq® Green
(Promega, Madison, WI, EUA); 0,5 μL de cada primer a 20 μM; 0,5 μL do DNA
e 3,5 µL de água MiliQ estéril, obtendo um volume final de 10 μL.
A reação de amplificação foi realizada no termociclador MasterCycler
gradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), utilizando o seguinte programa:
• 95ºC: 10 minutos
• 95ºC: 1 minuto, 50ºC: 1 minuto, 72ºC: 1 minuto por 35 vezes
• 72ºC: 10 minutos
50
MATERIAL E MÉTODOS
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
a 1%, contendo brometo de etídio. A eletroforese foi realizada em um tampão
de corrida (TBE 0,5X), a 100 volts por um período de 40 minutos. Como padrão
de peso molecular foi utilizado um marcador de 100 pb (Invitrogen, Carlsbad,
Califórnia, EUA). Os fragmentos de DNA de 732 pb, que corresponde ao peso
do gene vanA, foram observados em transiluminador de luz ultravioleta.
4.8 - Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE)
As amostras de E. faecium foram subcultivadas em ágar sangue para a
obtenção de colônias puras e isoladas. Foram transferidas aproximadamente
quatro colônias de cada amostra para um tubo contendo 4 mL de tryptic soy
broth (TSB - Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), onde foram incubadas por um
período de 18 a 24 horas. Após esse período, foram centrifugadas a 1.512 g
(gravidade) por 15 minutos, e as células precipitadas foram diluídas em 1 mL
de solução salina e transferidas para um tubo de microcentrifuga que foi
previamente pesado. Os tubos foram centrifugados novamente a 25.200 g por
aproximadamente 30 segundos e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado
e desprezado.
O centrifugado foi diluído em salina na proporção de 1:1 e um volume de
5 µL dessa solução foi transferida para outro tubo, onde foi adicionado 300 µL
da solução tampão TEM (Tris 100 mM; pH 7,5; EDTA 100 mM; NaCl 150 mM;
água destilada). Essa nova solução foi homogeneizada e misturada a 340 µL
de agarose de baixo ponto de fusão (FMC, Rockland, USA) para a formação de
pequenos blocos de géis contendo o DNA cromossômico. Os blocos foram
incubados por cinco horas em solução EC (Tris 6 mM, pH 7,5; NaCl 1 M; EDTA
51
MATERIAL E MÉTODOS
0,01 M; Brij 58 0,5%; Sarcosil 0,5%; Deoxicolato 0,2% e água destilada) a 37ºC
e a seguir foram incubados a 50ºC, em 2 mL de solução ES (EDTA 0,4 M, pH
9,3; Sarcosil 1,0%) contendo proteinase K (20 mg/mL, Sigma - P4914) por 12
horas. Após, os blocos foram lavados por quatro vezes com solução CHEF-TE
(Tris 0,1 M, pH 7,5; EDTA 0,1 M) e armazenados nessa solução até a digestão
enzimática.
Foi utilizada a enzima de restrição Smal (New England Biolab, Inc.,
Beverly, Mass, USA), 10 U por amostra, para a digestão do DNA bacteriano
das amostras de E. faecium estudadas. A digestão foi realizada por 12 a 18
horas a uma temperatura de 25ºC. Após a digestão, foi realizada a eletroforese
em gel de agarose a 1,2% no sistema CHEF-DR III (Bio-Rad, Richmond, CA,
EUA) e os padrões de variação da corrente elétrica foram 5 segundos iniciais e
60 segundos finais. A eletroforese foi realizada por um período de 23 horas, em
solução 0,5x TBE (Tris 0,089 M; Ácido bórico 0,089 M; EDTA, 0,002 M) à
temperatura de 14°C e utilizando uma corrente elétrica de 200 volts (6 V/cm).
Os géis foram corados com brometo de etídio (0,08 µL/mL) por uma hora,
descorados em água destilada por mais uma hora e fotografados sob luz
ultravioleta.
Os perfis migratórios obtidos após a fotografia do gel foram analisados
visualmente seguindo os critérios de Tenover e colaboradores
(131)
, onde
amostras são consideradas idênticas (mesmo clone) quando apresentam todas
as bandas iguais; amostras com até seis bandas serão consideradas um
subtipo de um mesmo clone, e amostras que apresentam sete ou mais bandas
discordantes
serão
consideradas
amostras
não
relacionadas
epidemiologicamente (131).
52
MATERIAL E MÉTODOS
Além da análise visual, os perfis de PFGE das amostras foram
submetidos ao programa de análise de géis BioNumerics (Applied Maths,
Kortrijk, Belgium) versão 5.0. Em todas as imagens, a definição de bandas foi
realizada automaticamente pelo programa e depois conferida visualmente. O
coeficiente de similaridade de Dice foi utilizado, e o dendrograma foi construído
utilizando o algoritmo de análise filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups
Method using arithmetic averages)
(135)
. Os valores de otimização e tolerância
utilizados para o conjunto de isolados foram de 0,8 e 2,0%, respectivamente.
Um coeficiente de similaridade acima de 80% foi selecionado para definir cada
cluster de isolados (136,137).
53
RESULTADOS
5 - RESULTADOS
5.1 - Resultados do Estudo Retrospectivo
Através do levantamento de dados de janeiro a agosto de 2008, 24
amostras de Enterococcus spp. foram isoladas de 14 pacientes do IOP. Das
dezenove espécies pertencentes ao gênero Enterococcus, apenas E. faecium e
E. faecalis foram isoladas nesse estudo, sendo 83,3% (20/24) relacionados à
espécie E. faecium e 16,7% (4/24) a E. faecalis, evidenciando uma proporção
5:1 entre as duas espécies, respectivamente (Figura 7).
Figura 7 - Distribuição das espécies de Enterococcus spp. isoladas dos pacientes do
IOP, durante o período de estudo retrospectivo realizado entre janeiro a agosto de
2008.
Das quatro amostras de E. faecalis identificadas nesse período de
estudo, duas foram associadas à infecção, sendo uma relacionada à ICS e
outra à urina. As outras duas restantes foram isoladas em cultura de vigilância
(swab anal). Em relação ao perfil de sensibilidade à vancomicina dessa
espécie, nenhuma amostra demonstrou resistência à mesma.
54
RESULTADOS
Vinte amostras isoladas de 11 pacientes foram identificadas como E.
faecium, 85% (17/20) apresentaram resistência à vancomicina, sendo que
64,7% (11/17) foram isoladas através de culturas de vigilância (swab anal) e
35,3% (6/17) estavam associadas à infecção sendo 4 ICS, 1 de trato
respiratório e 1 de trato urinário. Apenas três isolados de E. faecium não
apresentaram resistência à vancomicina, contudo, dois casos foram isolados
de ICS. Com relação ao gene que confere resistência à vancomicina, todas as
17 amostras de E. faecium analisadas apresentaram o gene de resistência
vanA pela técnica de PCR (Figura 8).
C+ P1
P2 P3 P4
P5
P6
P7
P8 P9 P10 P11 P12 P13
732 pb -
Figura 8 - Gel de agarose a 1% demonstrando o resultado de amplificação de gene
vanA (732 pb). C+ (controle positivo); P1 a P13 (amostras de E. faecium resistentes à
vancomicina isoladas de janeiro a agosto de 2008).
A distribuição de amostras de VRE-EFM, de acordo com os meses de
estudo retrospectivo, pode ser visualizada na Figura 9.
55
RESULTADOS
Figura 9 - Distribuição das 17 amostras de VRE-EFM isoladas durante os meses (janago/08), correlacionados aos casos clínicos de infecção.
De acordo com a Figura 9, observam-se três momentos onde foram
constatados casos de infecções por VRE-EFM: março, julho e agosto. Os dois
episódios ocorridos no mês de março foram isolados de ICS, porém estavam
atribuídos a um único paciente (P2). Nos três casos verificados no mês de
julho, um era infecção do trato respiratório (P3) e dois ICS (P6 e P2), sendo
esses dois últimos casos isolados de pacientes internados no sétimo andar
(7A) do hospital. Em agosto foi detectado apenas um caso de infecção urinária
de paciente de ambulatório. O aumento de infecções no mês de julho foi
acompanhado com o aumento do número de isolados de VRE-EFM, oito no
total, o maior verificado nesse estudo.
A distribuição dos sítios onde foram isoladas as amostras de
Enterococcus spp. ao longo dos oito meses do estudo retrospectivo pode ser
visualizado na Figura 10, assim como o número de casos de VRE-EFM
destacado em linha.
56
RESULTADOS
Figura 10 - Sítios de isolamento de Enterococcus spp. ao longo do período
retrospectivo. A linha azul representa a quantidade de casos de VRE-EFM verificados
em cada mês.
Quatro casos de bacteremia por VRE-EFM foram isolados de culturas
colhidas através de cateter venoso central. Os outros dois episódios de
bacteremia ocorridos no mês de julho, mês de maior prevalência, apresentaram
sensibilidade a vancomicina, sendo que um episódio estava relacionado a E.
faecalis e outro a E. faecium. Com esse mesmo perfil, as demais amostras de
E. faecium isoladas em sítio sanguíneo foram achadas em abril e agosto. Em
relação aos demais sítios de infecção analisados nesse estudo, visualizados
em julho e agosto, apenas um único caso de VRE-EFM foi verificado nas vias
respiratórias e no sítio urinário. Das 12 amostras de enterococos isolados em
swab anal, 10 estavam relacionadas à espécie E. faecium, sendo que 9 destes
57
RESULTADOS
apresentaram resistência à vancomicina. O número correspondente de cada
isolado e os sítios respectivos podem ser visualizado em Anexo 4.
Em relação ao perfil de sensibilidade aos demais antimicrobianos dos
isolados de VRE-EFM, todas as amostras apresentaram sensibilidade a
linezolida e resistência à ampicilina, teicoplanina e estreptomicina-HL. Para
gentamicina-HL foi verificado sensibilidade de 82,3% (14/17). Em relação às
amostras de VSE-EFM (E. faecium sensíveis à vancomicina), assim como a
vancomicina, as amostras apresentaram sensibilidade a teicoplanina e
linezolida. Semelhante as amostras de VRE-EFM, todas as amostras
apresentaram resistência a ampicilina e a estreptomicina-HL. Em relação à
gentamicina-HL, essas amostras apresentaram maior perfil de resistência
(66.7%) quando comparado aos VRE-EFM (17,7%).
5.2 - Resultados do Estudo Prospectivo
Esse estudo foi realizado durante três meses consecutivos: outubro a
dezembro de 2008, seguido por mais um mês (março de 2009), após um intervalo
de aproximadamente três meses. Um total de 98 amostras foi isolado nas quatro
etapas de coletas de cultura de vigilância de swab anal num total de 80 pacientes
estudados. A distribuição do número de coletas realizadas durante cada período e
o número de amostras positivas para VRE encontra-se representada na Figura
11.
58
RESULTADOS
Variação do percentual das amostras de VRE‐EFM ao longo do estudo 36,0%
9,4% 28,7%
0% Figura 11 - Resultados do estudo prospectivo, mostrando o número de coletas de swab
anal realizadas em cada etapa das culturas de vigilância, o número de isolados de VREEF e VRE-EFM em cada estudo e ao lado, a variação do percentual dos casos de VREEFM ao longo do estudo.
A coleta foi realizada em todos os pacientes internados no dia do estudo. A
média de pacientes por unidade de internação nos quais foram realizadas as
coletas foi: um em Ambulatório (AMB), quatro em Centro de Transplante de
Medula Óssea (TMO), quatro em Unidade de Terapia Intensiva (UTI), cinco em
internação do sexto andar (6A) e onze em internação do sétimo andar (7A),
totalizando em media 25 pacientes com amostras coletadas por dia estudado.
Dos 98 swabs coletados durante as quatro coletas de estudo, 26,5%
(26/98) foram positivos para VRE, sendo que 88,5% (23/26) estavam relacionadas
à espécie E. faecium e apenas 11,5% (3/26) a E. faecalis.
Em relação ao número de isolados de VRE-EFM, a primeira coleta de
cultura de vigilância (outubro) apresentou um percentual de 36%, aumentando
para 45,4% na segunda coleta (novembro), caindo para 16,7% na terceira etapa
59
RESULTADOS
(dezembro). Na quarta coleta realizada em março, não foi verificado nenhum caso
de VRE-EFM, observando-se apenas dois casos de VRE pertencentes à espécie
E. faecalis (Figura 11).
5.3 - Caracterização dos Isolados de VRE
Um total de 43 amostras de VRE foi isolado durante todos os 13 meses de
estudo (retrospectivo e prospectivo), coletados num total de 89 pacientes. Destes,
40 estavam relacionados à espécie E. faecium e apenas 7% (n=3) foi identificado
como sendo E. faecalis. Todos esses 43 isolados foram caracterizados conforme
os seguintes critérios: tipo de estudo, unidade hospitalar, pacientes (P), idade,
data da coleta, sítio de isolamento, diagnóstico de colonização ou infecção,
espécime clínico e perfil de resistência, como demonstrado na Tabela 4.
No anexo 5, é possível visualizar o fluxo geral do todas as coletas com
seus respectivos resultados. Como também o número de isolado de E. faecium
para realização da tipagem molecular.
60
RESULTADOS
Tabela 4 - Caracterização das 43 amostras de VRE isoladas durante os estudos
retrospectivo e prospectivo de 89 pacientes do hospital IOP de acordo os espécimes
clínicos,
unidades
hospitalares
de
isolamento
e
perfil
de
sensibilidade
aos
Unidade
P r o s p e c t iv o
Estudo
R e tr o s p e c tiv o
antimicrobianos
a
b
Pacientes
Idade (anos)
Data
Sítio
TMO
Amb
Amb
TMO
TMO
TMO
TMO
TMO
UTI
TMO
7A
7A
7A
UTI
UTI
Amb
6A
P1
P2
P2
P3
P4
P5
P4
P3
P5
P3
P6
P3
P7
P3
P3
P8
P9
16
11
11
17
7
4
7
18
4
18
5
18
2
18
18
13
1
jan/2008
Swab anal
mar/2008
Sangue
mar/2008
Sangue
mai/2008
Swab anal
mai/2008
Swab anal
jun/2008
Swab anal
jun/2008
Swab anal
jul/2008
Swab anal
jul/2008
Swab anal
jul/2008
Swab anal
jul/2008
Sangue
jul/2008
Swab anal
jul/2008
Sangue
jul/2008 Secreção Nasal
jul/2008 Aspirado Traqueal
ago/2008 Urina Jato Médio
ago/2008
Swab anal
1º coleta
1º coleta
1º coleta
1º coleta
1º coleta
1º coleta
1º coleta
1º coleta
1º coleta
6A
UTI
7A
UTI
7A
7A
7A
7A
7A
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
20
17
1
21
11
12
2
14
1
out/2008
out/2008
out/2008
out/2008
out/2008
out/2008
out/2008
out/2008
out/2008
2º coleta
2º coleta
2º coleta
2º coleta
2º coleta
2º coleta
2º coleta
2º coleta
2º coleta
2º coleta
UTI
7A
7A
7A
7A
UTI
6A
7A
7A
UTI
P14
P18
P19
P5
P20
P21
P22
P23
P24
P16
11
1
14
4
22
18
6
18
7
2
3º coleta
TMO
P25
3º coleta
7A
P5
3º coleta
6A
3º coleta
c
Espécie
Fenótipo de Resistência
C
I
I
C
C
C
C
C
C
C
I
C
I
C
I
I
C
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR, GEN
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR, GEN
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR, GEN
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
C
C
C
C
C
C
C
C
C
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR, GEN
nov/2008
nov/2008
nov/2008
nov/2008
nov/2008
nov/2008
nov/2008
nov/2008
nov/2008
nov/2008
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
Swab anal
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR, GEN
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR
AMP, VAN, TEC, STR, GEN
1
dez/2008
Swab anal
C
E. faecium
AMP, VAN, TEC, STR
4
dez/2008
Swab anal
C
E. faecium
AMP, VAN, TEC, STR
P26
22
dez/2008
Swab anal
C
E. faecalis
VAN, TEC, GEN
UTI
P27
18
dez/2008
Swab anal
C
E. faecium
AMP, VAN, TEC
3º coleta
7A
P28
9
dez/2008
Swab anal
C
E. faecium
AMP, VAN, TEC, STR
4º coleta
4º coleta
TMO
7A
P29
P30
5
17
mar/2009
mar/2009
Swab anal
Swab anal
C
C
E. faecalis
E. faecalis
VAN, TEC
VAN, TEC, GEN
Diagnóstico
a
Unidades de Internação dos Pacientes: Amb (Ambulatório); TMO (Transplante de Medula Óssea); UTI (Unidade de
Terapia Intensiva), 6A (sexto andar) e 7A (sétimo andar);
b
P, representa os pacientes numerados em ordem cronológica;
c
C, colonizados e I, infectados;
d
Antimicrobianos: AMP (ampicilina), VAN (vancomicina), TEC (teicoplanina), STR (estreptomicina) e GEN (gentamicina);
Todas as amostras foram positivas para o gene vanA.
61
d
RESULTADOS
De acordo com os dados verificados na Tabela 4, em relação às
unidades de internação, o 7º andar apresentou maior número de isolados
(n=18); seguidos pela UTI e TMO com 9 cada, o 6º andar em terceiro, com
quatro casos; e por último o ambulatório com apenas três isolados. Dos 30
pacientes onde foram isolados os 43 casos de VRE, a média de idade foi de
10,8 anos e com prevalência do sexo masculino, com uma proporção de mais
de três casos para cada um feminino.
Assim como no estudo retrospectivo, todas as amostras foram sensíveis
à linezolida. Em relação aos aminoglicosídeos, todos VRE-EF apresentaram
sensibilidade à estreptomicina-HL e em relação à gentamicina-HL apenas
33,3% (1/3). Já os VRE-EFM apresentaram 5% (2/40) de sensibilidade à
estreptomicina-HL e 85% (34/40) a gentamicina-HL. Em relação à ampicilina,
todas as amostras de VRE-EFM apresentaram resistência enquanto que os
três casos de VRE-EF apresentaram sensibilidade.
5.4 - Tipagem Molecular das Amostras de E. faecium
5.4.1 - Critério de Inclusão das Amostras Isoladas para
Tipagem Molecular
Dos 40 isolados de VRE-EFM totalizados de ambos os estudos, 33
foram selecionados para realização da tipagem molecular, utilizando-se a
técnica de PFGE, de acordo com os critérios pré-definidos. Conforme o critério
de inclusão das amostras do estudo retrospectivo (uma amostra de VRE
isolada por paciente) totalizou-se 10 isolados de VRE-EFM. A única exceção
ocorrida foi relacionada ao paciente P3, do qual foram selecionadas duas
62
RESULTADOS
amostras de VRE-EFM por terem sido isoladas em sítios distintos (swab anal e
aspirado traqueal).
Além das 10 amostras de VRE-EFM incluídas do estudo retrospectivo,
foram ainda acrescentadas na tipagem duas amostras de E. faecium sensíveis
a vancomicina, relacionadas aos pacientes P7 e P10, ambos pacientes
apresentando episódios com posterior isolamento de VRE-EFM. Em relação ao
paciente P7, as duas amostras foram isoladas em ICS. Já o paciente P10, a
primeira amostra foi isolada de ICS e, posteriormente, o VRE-EFM foi isolada
de cultura de vigilância de swab anal.
Com relação ao estudo prospectivo, todas as amostras isoladas de VREEFM foram incluídas, totalizando 23. Do primeiro, segundo e terceiro estudo
prospectivo, foram incluídas 9, 10 e 4 amostras, respectivamente. Nenhuma
amostra de março entrou nesse estudo devido à ausência de casos de VREEFM. Como todos os casos de VRE-EFM isolados do estudo prospectivo foram
incluídos para tipagem molecular, três amostras duplicadas, pacientes P5, P14
e P18, puderam ser analisadas quanto ao seu padrão. Com esses três casos,
através da caracterização molecular, pode-se verificar se as amostras
pertenciam a um mesmo clone, ou a amostra bacteriana adquiriu o gene de
resistência a vancomicina. Na Tabela 5 encontram-se todos os isolados de E.
faecium selecionadas para realização do PFGE de acordo com o estudo,
unidades de internação, data do pedido, gene de resistência e padrão
molecular pelo PFGE.
63
RESULTADOS
Tabela 5 - Caracterização molecular das 35 amostras de E. faecium, selecionadas
através do perfil de sensibilidade à vancomicina (33 VRE e 2 VSE).
a
Nº de amostras
Estudo
Pacientes
Unidade de Internação
Sítio
Data do Pedido
Gene
Padrão
1
RETRO
P1
TMO
Swab anal
29/01/2008
van A
A4
2
RETRO
P2
Amb
Sangue
25/03/2008
van A
A1
3
RETRO
P3
TMO
Swab anal
10/05/2008
van A
D
4
RETRO
P3
UTI
Aspirado Traqueal
25/07/2008
van A
B
5
RETRO
P4
TMO
Swab anal
17/06/2008
van A
B8
6
RETRO
P5
TMO
Swab anal
07/07/2008
van A
B
7
2º PROSP
P5
7A
Swab anal
04/11/2008
van A
B
8
RETRO
P6
7A
Sangue
09/07/2008
van A
A2
9
RETRO
P7
7A
Sangue
18/07/2008
van A
C
10
RETRO
P7
7A
Sangue
10/07/2008
AUSENTE
C
11
RETRO
P8
Amb
Urina Jato Médio
03/08/2008
van A
A2
12
RETRO
P9
6A
Swab anal
27/08/2008
van A
G
13
RETRO
P10
Amb
Sangue
29/08/2008
AUSENTE
B
14
1º PROSP
P10
6A
Swab anal
02/10/2008
van A
B2
15
1º PROSP
P11
UTI
Swab anal
02/10/2008
van A
B7
16
1º PROSP
P12
7A
Swab anal
02/10/2008
van A
B
17
1º PROSP
P13
UTI
Swab anal
02/10/2008
van A
B5
18
1º PROSP
P14
7A
Swab anal
02/10/2008
van A
B
19
2º PROSP
P14
UTI
Swab anal
04/11/2008
van A
B
20
1º PROSP
P15
7A
Swab anal
02/10/2008
van A
B
21
1º PROSP
P16
7A
Swab anal
02/10/2008
van A
NÃO TIPAVEL
22
2º PROSP
P16
UTI
Swab anal
04/11/2008
van A
B7
23
1º PROSP
P17
7A
Swab anal
02/10/2008
van A
A3
24
1º PROSP
P18
7A
Swab anal
02/10/2008
van A
A
25
2º PROSP
P18
7A
Swab anal
04/11/2008
van A
B1
26
2º PROSP
P19
7A
Swab anal
04/11/2008
van A
A
27
2º PROSP
P20
7A
Swab anal
04/11/2008
van A
A
28
2º PROSP
P21
UTI
Swab anal
04/11/2008
van A
E
29
2º PROSP
P22
6A
Swab anal
04/11/2008
van A
B6
30
2º PROSP
P23
7A
Swab anal
04/11/2008
van A
B
31
2º PROSP
P24
7A
Swab anal
04/11/2008
van A
B4
32
3º PROSP
P5
7A
Swab anal
04/11/2008
van A
NÃO TIPAVEL
33
3º PROSP
P25
UTI
Swab anal
17/12/2008
van A
F
34
3º PROSP
P27
6A
Swab anal
17/12/2008
van A
B3
35
3º PROSP
P28
Amb
Swab anal
17/12/2008
van A
B3
a
Perfis identificados de acordo com os critérios estabelecidos por Tenover
(131)
.
64
RESULTADOS
5.4.2 - Análise da Tipagem Molecular Segundo Critérios de
Tenover
Das 35 amostras selecionadas, apenas duas amostras não foram
possíveis ser tipadas, uma referente ao primeiro e outra ao segundo estudo,
devido a reações inespecíficas, o que deixou o resultado inconclusivo em
relação a sua linhagem. Das 33 amostras analisadas, de acordo com os
critérios de Tenover e colaboradores
(131)
, sete padrões de PFGE foram
encontrados (“A”, “B”, “C”, “D”, “E”, “F” e “G”). O padrão “B” e “A” foram os mais
prevalentes, com 19 e 8 amostras, respectivamente. O padrão “B” apresentou
nove subtipos e o padrão “A” apresentou cinco. Os padrões C, D, E, F e G não
apresentaram subtipos.
5.4.3
-
Análise
da
Tipagem
Molecular
pelo
Programa
BioNumerics
A Figura 12 demonstra o dendrograma construído a partir da análise de
similaridade utilizando o programa BioNumerics versão 5.0 (Applied Maths,
Kortrijk, Belgium). Pela análise do dendrograma, o grau de similaridade entre o
padrão “B” em relação ao “A” foi de 74,9% e em relação ao padrão “C” foi de
45,4%. A diferença entre a similaridade entre os padrões “A” e “C” foi
relativamente maior do que em relação à “B”, com 49%. Entre os nove subtipos
identificados na análise visual como padrão B (B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 e
B8), o grau de similaridade encontrado variou de 84,1% a 100%; sendo a maior
diferença encontrada no subtipo B6.
65
RESULTADOS
Em concordância com a interpretação visual do PFGE, o subtipo B foi o
que apresentou maior número de amostras com maior quantidade de padrões
apresentando similaridade, nove das 19 amostras encontradas. Além desses
subtipos, mais outros dois foram duplicados, “B3” e “B7”. Em relação ao subtipo
B3, ambas as amostras foram isoladas na terceira coleta do estudo
prospectivo, porém as unidades em que foram isoladas e os pacientes eram
distintos. Em relação ao subtipo B7, a UTI foi o local de isolamento dos dois
isolados, entretanto, esse padrão foi isolado entre a primeira e segunda coleta
do estudo prospectivo e entre pacientes diferentes.
Em relação ao percentual de similaridade encontrado nos subtipos A (A,
A1, A2, A3, A4), a variação entre o percentual de similaridade foi entre 80,4% a
100%. Dos oito casos isolados, três estavam relacionados ao subtipo A e
isoladas no sétimo andar. Curiosamente, os dois subtipos pertencentes ao A2
foram isolados de pacientes distintos, sítios e unidades diferentes após um
intervalo de aproximadamente 30 dias. O percentual de similaridade entre
esses dois subtipos (A e A2) foi de 80,4%.
Amostras
idênticas
(100%
de
similaridade)
de
acordo
com
o
dendrograma foram observadas em pacientes diferentes e unidades de
internação distintas, como verificado entre: P27 e P28 (Padrão B3); P6 e P8
(A2) e entre P10, P5 e P14.
66
RESULTADOS
Figura 12 - Dendrograma com o resultado da análise de similaridade de bandas dos
padrões genéticos por PFGE das amostras de E. faecium.
5.4.4 - Correlação Entre Tipagem Molecular e Internação dos
Pacientes
5.4.4.1 - Padrão de PFGE versus Unidades de Internação
O padrão “B” de PFGE, encontrado em 57,6% (19/33) das amostras, foi
encontrado nas cinco diferentes unidades do IOP (AMB, TMO, UTI, 6A e 7A),
possuindo maior incidência no sétimo andar com 36,7% (7/19) e UTI com 26,3%
(5/19), conforme demonstrado na Figura 13. Já o perfil “A”, apareceu em três
diferentes unidades (TMO, 7°Andar e AMB), sendo que no 7A foi encontrado o
maior número de amostras, com 62,5% (5/8). Embora sua maior disseminação
67
RESULTADOS
tenha prevalecido no 7A, o primeiro perfil “A” desse estudo foi reportado na
unidade de transplante de medula óssea (P1).
Figura 13 - Distribuição dos perfis de PFGE dos isolados de E. faecium por unidade de
internação.
No sétimo andar, a proporção entre o número de isolados entre os dois
perfis mais prevalentes (“A” e “B”) foi de 5:7, respectivamente. Em relação aos
isolados de sítios estéreis, o perfil “A” apresentou maior número dos isolados do
que o clone “B” (3:2), aparecendo em um dos casos neste andar, em ICS.
As unidades apresentando maior número de variantes de clones foram UTI,
TMO e 7A, com três perfis cada. Na UTI não foi reportado nenhum isolado com
padrão tipo “A” e, em todas as unidades, o padrão “B” foi o mais prevalente, com
71,4% (5/7); 50% (2/4) e 50% (7/14), respectivamente.
A menor quantidade de clones encontrados por andar foi dois padrões,
verificados no ambulatório e o sexto andar. No ambulatório, a proporção entre “A”
68
RESULTADOS
e “B” foi à mesma. Já no sexto andar o perfil “B” predominou em três das quatro
amostras.
5.4.4.2 - Padrão de PFGE versus Período de Internação
Pode se observar, de acordo com a Figura 14, uma predominância dos
dois clones mais isolados (“A” e “B”) logo no início do estudo prospectivo. No mês
de outubro, das oito amostras isoladas, 75% estavam relacionadas ao padrão “B”.
Em novembro o índice do padrão “B” caiu apenas cerca de 5%, sendo que, das
10 amostras isoladas, sete pertenciam a um mesmo subtipo B.
2º estudo - Nov
1º estudo - Out
Retrospectiv
3º estudo - Dez
4º estudo - mar
Figura 14 - Distribuição dos perfis de PFGE dos isolados de E. faecium de acordo com
os meses de isolamento.
O perfil “B” foi encontrado tanto em cepas de E. faecium sensíveis quanto
em cepas resistentes à vancomicina (P10). Sua permanência pode ser verificada
69
RESULTADOS
desde junho, dando continuidade até o penúltimo mês estudado (dezembro) onde
se obteve dois dos três casos verificados. O mesmo não ocorreu com o padrão de
PFGE “A”, que a partir do mês de dezembro não foi mais visualizado, entretanto
pode-se verificar que sua permanência no ambiente hospitalar precede-se deste
janeiro.
A partir do mês de dezembro observou-se uma redução no número de
isolados e no número de padrões encontrados. Embora tenham sido isoladas
apenas três amostras de VRE-EFM nesse mês, duas destas ainda estavam
relacionadas ao padrão B.
5.4.4.3 - Padrão de PFGE versus Período de Internação versus
Unidade de Internação, com Foco no Fluxo dos Pacientes no
IOP
A Figura 15 mostra o resultado da tipagem molecular das 33 amostras de
VRE-EFM e 2 amostras de VSE-EFM com relação ao período de internação em
um ano (janeiro de 2008 a dezembro de 2008) e as unidades em que os 27
pacientes estiveram internados.
.
70
RESULTADOS
PACIENTES
P28
B3
P27
B3
P19
A
P10
B
B2
Legenda
P20
A
UTI
P21
E
6º ANDAR
P22
B6
7º ANDAR
P23
B
TMO
P24
B4
AMBULATÓRIO
B7
ALTA
P16
ISOLADO
P17
A3
P15
B
P18
A
B1
P14
B
B
P12
B
P11
B7
P13
B5
ÓBITO
P25
F
P9
G
P8
A2
P6
A2
P7
C
P5
C
B
P3
B
D
B
P4
B8
P2
A1
P1
A4
Janeiro
Fevereiro
Março
Abril
Maio
Junho
Julho
Agosto
Setembro
Outubro
Novembro
Dezembro
Janeiro
Figura 15 – Fluxograma dos pacientes internados no IOP no período de janeiro a dezembro de 2008. Os deslocamentos pelas unidades
estão representados por linhas distintas, distribuídas de forma semanal. Os símbolos representam: estrela (alta hospitalar), círculo
(isolamento do paciente) e cruz (óbito). Os padrões de PFGE encontrados também estão em destaque, de acordo com seus respectivos
padrões encontrados.
71
RESULTADOS
De acordo com a Figura 15, foi possível observar o fluxo dos pacientes de
acordo com seu trajeto nas unidades de internação ao longo das semanas e sua
desenvoltura durante todos esses meses de estudo. Observa-se que os primeiros
padrões A, B e D tiveram seus inícios na unidade TMO. Já os padrões C, E, F e G
tiveram seus inícios em unidades distintas, 7A, UTI, TMO e 6A, respectivamente.
Embora os padrões A e B tenham surgido na unidade TMO, observa-se que estes
obtiveram uma maior distribuição no 7A.
Na unidade TMO foi observado quatro padrões de PFGE, dentre os quais
dois apresentaram semelhança (B e B8). Entretanto, o grau de similaridade
encontrado entre ambos foi de 84,1%.
O subtipo A2, isolado primeiramente em julho num paciente (P6) internado
no 7A, foi em seguida isolado em um segundo paciente (P8). De acordo com o
fluxo, observa-se que, no período do primeiro isolamento, ambos os pacientes
encontravam-se no sétimo andar no mesmo período. De acordo com esses dados,
sugere-se que houve transmissão do paciente P6 para P8, ocorrido no sétimo
andar.
Constata-se que as unidades que mais contribuíram para a disseminação
do padrão B foram sexto e sétimo andar. O paciente P5 (paciente do TMO),
provavelmente, foi o foco da disseminação para os outros pacientes, já que foi o
primeiro caso de isolamento com esse perfil e, de acordo com seu deslocamento,
observa-se um longo período de internação, principalmente no 7A.
Em relação aos pacientes onde foram selecionados isolados de VSE-EFM
e com posterior isolamento de VRE-EFM (P7 e P10), verifica-se que em relação
ao paciente P7, o padrão de PFGE encontrado nos dois casos foi o “C”. Esse
padrão não foi verificado em nenhum outro isolado. O intervalo de isolamento
72
RESULTADOS
entre os dois isolados foi de uma semana. Já em relação ao paciente P10, o
padrão verificado foi semelhante (B e B2). O grau de similaridade encontrado
entre estes perfis foi de 86,8%. De acordo com o histórico do primeiro caso, P7, a
aquisição do plasmídeo contendo o gene vanA pode ter sido provocada pelo uso
de vancomicina, já que o mesmo fez uso prévio desse antimicrobiano durante seis
dias antecedentes à semana do isolamento do VRE-EFM. Em relação ao segundo
caso, a diferença entre os padrões de PFGE encontrados no intervalo desses dois
meses, pode ter sido provocada por uma mutação da cepa, ainda mais presente
com a pressão seletiva existente.
A coleta do paciente P22 foi exatamente no momento de sua admissão no
IOP. O padrão apresentado nesse caso foi semelhante ao clone mais prevalente
do instituto (padrão “B”). O grau de similaridade encontrado entre esses perfis foi
de 79,8% (o menor encontrado entre os perfis B). De acordo com o prontuário,
este paciente foi transferido de outra instituição hospitalar, do mesmo estado, já
apresentando histórico de VRE (espécie não especificada e amostra bacteriana
não armazenada).
Dos cinco óbitos ocorridos, quatro estavam relacionados ao clone B.
Contudo, nenhum dos casos estava relacionado à ICS e as causas das mortes
não foram associadas ao VRE-EFM.
73
DISCUSSÃO
6 - DISCUSSÃO
Historicamente, as infecções enterocócicas em humanos são causadas
por duas espécies, E. faecalis com 80 a 90% e E. faecium de 5 a 15%
Assim como na literatura mundial, Gales e colaboradores
(138)
.
(68)
, em estudo do
programa SENTRY sobre a freqüência de Enterococcus spp. em 10 anos na
América Latina, verificou percentual semelhante entre as duas espécies: E.
faecalis (78,2%) contra E. faecium (12,7%)
(68)
. O mesmo foi verificado em
outros estudos brasileiros, como os realizados por Hörner e colaboradores
e um recente por Bender
(139)
(140)
, em hospitais localizados na região sul do Brasil
também observou uma maior freqüência da espécie E. faecalis sobre E.
faecium. Os percentuais achados entre as duas espécies, E. faecalis e E.
faecium, nos respectivos estudos foram: 85% vs 6% (n=233) e 93% vs 4,4%
(n=203) (139, 140).
Diferente da maioria dos dados nacionais, em nosso estudo foi
verificado uma maior prevalência da espécie E. faecium em relação à segunda
espécie mais isolada, E. faecalis. O percentual verificado entre as duas foi de
83,3% contra 16,7%, numa freqüência de 5:1, respectivamente. De acordo com
dois estudos de vigilância do programa SENTRY, que incluem dados sobre
enterococos na América Latina, essa proporção difere das encontradas em
outros continentes. No primeiro estudo, realizado por Mutnick e colaboradores
(38)
, a proporção entre as espécies E. faecalis e E. faecium encontrada durante
os anos de 1997-2000 foi de 17:1, maior índice entre os demais continentes
estudados, onde fora observado de 3 a 5:1. Seis anos após, Gales e
colaboradores
(68)
, observaram em dez anos de estudo (1997-2006), uma
redução desta proporção (6:1).
75
DISCUSSÃO
Ao contrário dos relatos citados, dos vinte casos de E. faecium
analisados neste estudo retrospectivo, 85% (n=17) apresentaram resistência
aos glicopeptídeos, todos apresentando fenótipo VanA. Dos quatro casos de E.
faecalis observados nos oito meses de estudo retrospectivo, nenhum
apresentou perfil intermediário ou resistente aos glicopeptídeos. Este fato é
considerado raro, já que no Brasil a espécie E. faecalis está mais relacionada
com esse mecanismo de resistência (141).
O mês de julho foi o que apresentou tanto o maior número de isolados
de enterococos quanto o maior número de casos relacionados a infecções e de
casos de VRE (n=8). Este número foi elevado já que na instituição o máximo de
enterococos isolados era de dois casos por mês. De acordo com as análises do
fluxo dos pacientes em conjunto com a tipagem molecular, observa-se que no
fim do mês de junho houve a introdução de um perfil mais prevalente,
denominado de “clone B”. Isso explica o aumento de VRE-EFM posterior a
esse mês, já que na análise dos isolados do estudo prospectivo verificou-se
uma disseminação deste clone em todos os andares da instituição analisados,
caracterizando um surto por VRE-EFM.
Assim como no estudo retrospectivo, o estudo prospectivo realizado
durante etapas de coletas de cultura de vigilância confirmou a prevalência de
VRE-EFM no IOP. Dentre as quatro coletas realizadas, na primeira e na
segunda
coleta
(referentes
aos
meses
de
outubro
e
novembro
respectivamente), observou-se uma prevalência de 100% de VRE-EFM. Nas
duas últimas coletas, referentes aos meses de dezembro e março, observou-se
uma redução desses casos, sendo que na última coleta não foi verificado
nenhum VRE-EFM e apenas dois casos de VRE-EF foram observados. Essa
76
DISCUSSÃO
diminuição da predominância de casos de VRE-EFM sobre VRE-EF, ao final do
período analisado, pode ser considerada um fato positivo, visto que VRE-EF é
mais sensível aos antimicrobianos e por sua menor virulência em comparação
ao VRE-EFM.
Diversos estudos brasileiros observaram uma predominância de VREEF sobre VRE-EFM
(54, 142)
. A predominância de VRE-EFM sobre VRE-EF
verificada em nosso estudo pode estar relacionada a uma mudança dessas
taxas, já observadas nos relatos de Gales e colaboradores
(68)
e D’Azevedo e
colaboradores (128) no Brasil. Gales e colaboradores (68) verificaram um aumento
considerável de isolados de E. faecium (VRE-EFM) no ano de 2006 nos
centros participantes na América Latina, principalmente no Hospital São Paulo,
que, como o IOP, faz parte da rede de hospitais da UNIFESP. D’Azevedo e
colaboradores
(128)
constataram, na mesma instituição, que de 37 amostras
positivas para VRE, 54,1% estavam relacionadas à espécie E. faecium, as
demais a E. faecalis (25,9%) e todas isoladas em culturas de vigilâncias em
diferentes unidades de internação.
Todos esses dados corroboram com a hipótese de que clones de VREEFM podem estar emergindo no Brasil, principalmente na cidade de São Paulo,
e que, com o passar dos anos espera-se que VRE-EFM torne-se o mais
prevalente em nosso meio. Esse aspecto foi abordado por Cereda e
colaboradores
(141)
, através da caracterização e o modo de disseminação de
VRE-EFM no Brasil. Segundo este estudo, sete padrões de PFGE distintos
foram encontrados nas 22 amostras de VRE-EFM isoladas em sete centros
médicos brasileiros participantes e, destes, seis centros localizados na cidade
de São Paulo. Um único padrão, com quatro subtipos, foi detectado em 17 das
77
DISCUSSÃO
amostras isoladas em quatro diferentes hospitais. Baseado nas análises, os
pesquisadores indicaram uma ocorrência de disseminação intra e interhospitalar de VRE em São Paulo e que provavelmente, a disseminação deste
clone estava relacionada ao aumento da prevalência de VRE no Brasil (141).
Assim como os dados relatados por Cereda e colaboradores
(141)
, é
interessante verificar que em nosso estudo foi observado também o relato de
provável disseminação clonal inter-hospitalar. Considerando o paciente P22,
neste caso, a coleta de swab anal neste paciente foi exatamente na sua
entrada no hospital (realizada na segunda etapa de coleta - novembro). O
paciente em questão foi transferido de outra instituição hospitalar, localizada no
mesmo estado e já estava colonizado por VRE (espécie não especificada e
amostra bacteriana não armazenada). A tipagem molecular revelou que a
amostra apresentou perfil B6, subtipo do clone mais prevalente na instituição
(padrão “B”) (Figura 12), caracterizando a importância de culturas de vigilância
na admissão de pacientes provenientes de outras instituições.
Com relação ao perfil de sensibilidade, todas as amostras de VRE-EFM
desse estudo apresentaram resistência à ampicilina. De acordo com os
recentes estudos de genética populacional, a maioria dos VRE-EFM
relacionados a infecções nosocomiais isoladas em várias partes do mundo faz
parte de uma mesma linhagem pertencente ao complexo clonal denominada
CC17
(30)
. Cepas que apresentam esse perfil genético, além de possuírem
resistência à ampicilina, carreiam genes de proteínas de superfície (esp) e
hialuronidases (hyl) relacionados à virulência neste gênero bacteriano e, que
são relacionados a surtos nosocomiais nos cinco continentes (143). Em pesquisa
realizada por Titze-de-Almeida (2004)
(153)
sobre a virulência e variabilidade
78
DISCUSSÃO
genética de E. faecium isolados no Brasil, verificou que entre as 19 amostras
de VRE-EFM isoladas em São Paulo (Hospital Santa Marcelina), incluindo o
primeiro caso de VRE-EFM com fenótipo VanA do Brasil, a presença do gene
esp (marcador molecular localizado em ilhas de patogenicidade) foi detectada
em 63,2% das amostras, não sendo verificada em nenhum das 11 amostras de
VSE-EFM. Com base nesses resultados, o autor sugere que a resistência à
vancomicina está associada à presença de prováveis ilhas de patogenicidade e
desempenham um papel relevante na evolução dessa espécie de enterococos
(153)
.
Acredita-se que esse complexo clonal seja o responsável por alterar as
taxas de infecções causadas por E. faecalis versus E. faecium. Esta mudança
representa um problema em potencial, uma vez que E. faecium é mais
comumente associado à resistência a vancomicina do que E. faecalis
(25)
. Em
nosso estudo, o mesmo perfil de sensibilidade observado para ampicilina foi
também observado para teicoplanina (resistência), um dado concordante com a
literatura, uma vez que o gene vanA encontrava-se presente em todos os
isolados de VRE-EFM e, assim presente, proporciona altos níveis de
resistência aos dois glicopeptídeos.
De modo inverso, todas as amostras deste estudo apresentaram
sensibilidade a linezolida, indicando que esse antimicrobiano continua a ser
uma opção terapêutica adequada no tratamento das infecções por VRE. Altas
taxas de sensibilidade a este antimicrobiano são semelhantes aos encontrados
em outros países
(68, 144)
. Apesar de não ter sido verificado nenhum caso de
resistência a linezolida neste estudo, já foram relatados casos na cidade de
São Paulo. A primeira amostra relacionada à espécie E. faecalis, isolada em
79
DISCUSSÃO
2006
(145)
, a segunda a E. faecium, isolada em 2009
(146)
. O quadro clínico
nestes dois casos foi distinto (queimados e trombose da artéria hepática,
respectivamente), mas os enterococos resistentes a linezolida foram isolados
em ICS após administração prolongada desse antimicrobiano. Ambos os casos
possuíam o gene de resistência vanA e mutação G2576U no domínio V do
rRNA 23S e foram tratados com tigeciclina, obtendo uma resposta favorável
(145, 146)
. Constata-se que, assim como aconteceu com a vancomicina, o uso
inadequado e prolongado da linezolida pode ser considerado favorável para a
seleção de cepas apresentando esse fenótipo multiresistente.
Furtado e colaboradores
(8)
em estudo realizado no Hospital São Paulo
observou um aumento progressivo na incidência de VRE em três anos (2000 2002), com o aumento de 15,8% em 2002. Os sítios de maior isolamento foram
o urinário (36.6%) e o sanguíneo (20,8%), seguidos por infecções em partes
moles (7,9%)
(8)
. Diferente dos dados obtidos por Furtado, em nosso estudo o
sítio sanguíneo foi o mais prevalente (66,6%). Todos esses casos de ICS
estavam relacionados a cateter venoso central, o que sugere que a
manipulação deste foi a porta de entrada para as infecções. Deve-se salientar
que os autores analisaram dados de um hospital geral e nosso estudo se
deteve em pacientes oncológicos, na maioria neutropênicos.
Dados do European Antimicrobial Resistance Surveillance System
(EARSS) nos últimos sete anos corroboram com os nossos sobre o aumento
da incidência de VRE-EFM isolados de hemocultura. Em países como Portugal
o número de isolados alcançou 42,3%
colaboradores
(68)
(143)
. Do mesmo modo, Gales e
observaram que dos sítios infecciosos de VRE da America
80
DISCUSSÃO
Latina, houve uma maior predominância no sítio sangüíneo (42%), seguido
pelo trato urinário (16%) e partes moles (13%).
A relação de pacientes colonizados por enterococos resistente à
vancomicina com progressão à infecção, assim como infecções causadas por
diversos microrganismos, demonstra que infecções por VRE podem resultar no
aumento da morbidade, tempo de hospitalização e custos, bem como aumento
da mortalidade em pacientes com ICS
(147)
. Embora diversos estudos relatem a
presença de infecções relacionadas à colonização
(148)
, as taxas dessa
associação não são altas. Em um estudo de Roghmann e colaboradores
(23)
,
por exemplo, foi encontrado um percentual de 17,8% entre pacientes
colonizados por VRE que desenvolveram posterior ICS por esse patógeno.
Entretanto, no estudo de Montecalvo e colaboradores
(21)
, essa relação foi
baixa (1,7%). Contudo, de acordo com a literatura, ICS causadas por VRE, se
comparada a infecções causadas por VSE, apresentam maior taxa de
recorrência. Além disso, observou-se aumento na taxa de letalidade
(independente da espécie
(2, 17)
) e aumento nos custos hospitalares (US$
27.000,00 por episódio de ICS) (17).
Apesar dessas taxas não terem sido avaliadas em nosso estudo, em
virtude da coleta de vigilância não ser realizada como rotina em todo o hospital,
na unidade TMO é praticada essa rotina e foi possível verificar que, dentre 8
pacientes colonizados, dois desenvolveram infecção relacionada (25%). Por
outro lado, dos nove casos de óbito ocorridos em toda a instituição, nenhum foi
relacionado diretamente à colonização ou infecção por enterococos resistente à
vancomicina, apesar disto ser um fator preditor independente de morte em
pacientes, como demonstrado por Lode (12) em 2009.
81
DISCUSSÃO
Uma vez verificada a presença de enterococos resistente à
vancomicina numa instituição, as taxas de colonização e infecção tendem a
aumentar, o que conseqüentemente podem vir a se transformar em epidemia a
menos que sejam introduzidas medidas de controle eficazes (149).
Estudos demonstram que a incidência de pacientes colonizados é 10
vezes maior que de pacientes infectados, e, uma vez que não detectados
através de cultura de vigilância, a instalação de medidas de barreiras de
contato efetivas fica comprometida (8).
Os nossos estudos retro e prospectivo, possibilitaram a CCIH do IOP
conhecer a real situação da instituição sobre os índices de colonização por
VRE nos pacientes internados. A “foto análise” revelada através do estudo
prospectivo, possibilitou a identificação de todos os pacientes colonizados por
VRE num mesmo momento, sendo assim, possível uma intervenção mais
direcionada da CCIH. Com as medidas aplicadas, observou-se uma redução do
número de casos de colonização por VRE e consequentemente o número de
infecções, documentado no estudo prospectivo onde não foi relatado mais
nenhum caso de VRE.
As coletas de vigilância contínuas associadas às medidas de controle de
infecção são necessárias para o controle da disseminação de VRE-EFM
(143)
.
Desde 1995, o CDC aconselha ações para reduzir a propagação de VRE, que
incluem: identificação e isolamento de pacientes colonizados por VRE;
higienização das mãos dos funcionários da área da saúde, limpeza adequada
do ambiente e diagnóstico rápido.
(150)
. Estas recomendações auxiliam as
instituições hospitalares e podem ser modificadas de acordo com a sua
realidade. Em estudo de Santiago e colaboradores (2006), realizado no
82
DISCUSSÃO
Hospital de São Paulo, verificou-se que o uso de meio de triagem para VRE
(VREBAC) somado a técnicas de biologia molecular (PCR-Multiplex), reduziu o
intervalo de tempo entre a coleta do swab anal do paciente até o resultado final
para a CCIH do Hospital de 3 a 4 dias para 29 horas. Uma redução significante,
que somada a medidas de controle implementadas pela CCIH possibilitaram
uma redução de colonização por VRE em pacientes internados em UTI de
45,7% para 9,7% num período de quatro meses (155).
De acordo com os resultados verificados no estudo retrospectivo, entre
as condutas adotadas pela CCIH do IOP para o controle da disseminação de
VRE-EFM, a cultura de vigilância contínua em todos os pacientes internados
mostrou-se importante, uma vez que permitiu uma diminuição no número de
ocorrência de pacientes colonizados, uma redução de quase 5 vezes (36%
para 7,4%). A rapidez na liberação dos resultados também contribuiu para que
as que as ações de controle da CCIH fossem instituídas de forma mais rápida.
Os resultados das culturas de vigilância foram liberados para a CCIH entre 24 a
72 horas, com resultados parciais nas primeiras 24 horas, e os resultados finais
em 72 horas incluindo identificação, perfil de sensibilidade e detecção do gene
vanA.
Comparando as medidas de controle adotadas pela CCIH antes e
durante esse estudo, as mudanças determinantes foram no formato das
campanhas voltadas para conscientização do problema; iniciado pela
informação a todos os profissionais da área hospitalar. Foi realizada a
campanha das “mãos limpas”, onde foi reforçada a conscientização de todos
sobre a necessidade de higienização das mãos (lavagem ou uso de álcool gel)
através de cartazes e panfletos fixado por todo o hospital, utilizando um
83
DISCUSSÃO
personagem de história em quadrinhos conhecido pelas crianças e adultos
(“Smilingüido”). Os visitantes também foram incentivados a evitar o contato
excessivo com os pacientes, já que poderiam ser agentes facilitadores da
transmissão do agente, visto que este microrganismo pode permanecer viável
em superfícies ambientais de 7 a 14 dias com extensão de até dois meses (151),
além do isolamento de contato para todos os pacientes colonizados ou
infectados.
O controle rigoroso de antimicrobianos também foi uma das medidas
adotadas. Embora a literatura relate que a exposição prévia a cefalosporinas
de 3º geração contribua para a incidência de VRE, no IOP, a cefalosporina de
4º geração (cefepime) é muito utilizada, por fazer parte do tratamento inicial
dos episódios de neutropenia febril. Considerando que esse antimicrobiano
apresenta menor relação com a emergência de VRE comparado a
cefalosporinas de terceira geração, acreditamos que o uso empírico e
prolongado da vancomicina é quem mais tenha contribuído para o aumento de
VRE nesta instituição, uma vez que artigos publicados relatam seu maior poder
de provocar seleção natural do que cefepime
(152)
. No presente estudo foi
possível constatar a seleção de cepas VRE em paciente com uso da
vancomicina (paciente P7). Após uma semana de uso de vancomicina no
tratamento de ICS por VSE-EFM, foi isolado novamente E. faecium na corrente
sanguínea, agora com perfil VRE-EFM. A análise da similaridade genética por
PFGE das duas cepas isolados do paciente P7 demonstrou se tratar da mesma
da cepa (padrão “C”), documentando a importância da vancomicina na pressão
seletiva da resistência.
84
DISCUSSÃO
Como relatado anteriormente, o uso prévio de antimicrobianos é um
dos fatores de risco para aquisição de colonização e infecção por VRE e como
verificada em nossos dados, os clones de VRE mais prevalentes (A e B) foram
isolados da unidade TMO, unidade em que os pacientes mais usam
antimicrobianos. Entretanto, observa-se que nessa unidade o maior problema
não foi a disseminação clonal, uma vez que são verificados vários clones, mas
a existência de uma pressão seletiva; diferente da UTI, na qual embora o uso
de antimicrobiano seja freqüente, o que se verifica é o constante aparecimento
destes dois clones.
Através dos dados da tipagem molecular e da verificação do
fluxograma dos pacientes durante o período de internação, foi possível
constatar que no sétimo andar concentrou-se a maior distribuição dos dois
clones predominantes (“A” e “B”). É provável que este fato seja explicado pela
maior centralização de internados neste andar, maior número de leitos entre as
unidades estudadas e maior fluxo da equipe de saúde, o que favoreceu a
disseminação clonal intra-hospitalar, principalmente do padrão “B”, encontrado
em todas as unidades do IOP. Além disso, a disseminação do clone mais
prevalente (B) foi favorecida, principalmente, pelo tempo de internação,
deslocamento e manipulação do paciente P5, onde foi isolada a primeira cepa
com esse perfil (mês de junho), permanecendo este paciente colonizado até o
mês de novembro.
Com a mudança epidemiológica entre espécies de VRE observada na
cidade de São Paulo, verificada pelo aumento da prevalência de VRE-EFM em
alguns hospitais, acreditamos que essa diferença pode estar relacionada a um
clone
predominante,
provavelmente
um
dos
dois
clones
majoritários
85
DISCUSSÃO
encontrados neste estudo (A e B). Para elucidar esta hipótese, um estudo
epidemiológico de VRE-EFM a nível inter-hospitalar seria de grande
importância, já que esta espécie possui uma maior habilidade e sucesso de
sobrevivência que outras espécies de enterococos. Além disso, a presença de
do gene vanA isolados em VRE-EFM aumenta a probabilidade de transmissão
desse mecanismo de resistência para outras espécies mais virulentas, como S.
aureus, uma vez que já existem relatos dessa transmissão (81, 82).
86
CONCLUSÃO
7 - CONCLUSÃO
Estudo Retrospectivo
•
A resistência a vancomicina, mediada pelo gene vanA, no IOP foi
relacionada à espécie E. faecium, contrastando com a baixa
resistência a esta classe de antimicrobianos observada para E.
faecalis;
•
O aumento significante do número de casos de VRE, observado no
mês de julho no IOP, pode ser considerado como um surto causado
por este microrganismo nesta instituição;
Estudo Prospectivo
•
A alta incidência de colonização por VRE-EFM no IOP foi relacionada
à disseminação clonal, verificado pela alta prevalência dos clones A e
B disseminados em todas as unidades, principalmente no sétimo
andar;
•
O estudo prospectivo somado as estratégias de controle de infecção
coordenadas pela CCIH teve um impacto positivo, uma vez que não foi
observado o isolamento de VRE-EFM colonizando pacientes na última
coleta realizada em março de 2009, e não foi detectado nenhum caso
de infecção a partir de agosto de 2008 até março de 2009;
87
CONCLUSÃO
•
Embora as medidas de controle de infecção tenham sido efetivas na
redução dos casos de VRE-EFM no IOP, ainda foram detectados
casos de VRE-EF, demonstrando a importância da continuidade de
tais medidas e de avaliações epidemiológicos constante;
•
O uso de técnicas de biologia molecular demonstrou ser aplicável
apresentando impacto na rapidez e sensibilidade com que foram
liberados os laudos para a CCIH;
•
O modelo de culturas de vigilância continuada aplicado com êxito em
todos os pacientes internados pode servir como padrão epidemiológico
para as CCIH de outras instituições, a fim de conseguir resultados
satisfatórios como alcançado no presente estudo;
88
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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de Brasília. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Patologia
Molecular, 2004), p. 122.
154.
Martino
MDV.
“Enterococos
Resistente
à
Vancomicina
(VRE):
Aplicabilidade do Meio Cromogênico para o isolamento, Caracterização e
Prevalência de Portadores”, (Tese de Doutorado, Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo. Programa de Pós-Graduação em
Medicina/Pediatria, 2003), p. 100.
155. Santiago K, D’Azevedo P, Furtado G, Xavier DB, Titze-de-Almeida R,
Pignatari AC. Diagnóstico rápido de Enterococos Resistente à Vancomicina
(VRE) em swabs de pacientes hospitalizados. In: 40º Congresso Brasileiro de
Patologia Clínica e Medicina Laboratorial – SBPC/ML, Curitiba, 2006.
107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
156. Barbosa D, Lima L, Silbert S, Sader H, Cendoroglo M, Draibe S, Camargo
L, Vianna L, Belasco A, Sesso R. Evaluation of the prevalence and risk factors
for colonization by vancomycin- resistant Enterococcus among patients on
Dialysis. Am J Kidney Dis 2004; 44: 337-343.
157. Freitas MC, Pacheco-Silva A, Barbosa D, Silbert S, Sader H, Sesso R,
Camargo LF. Prevalence of vancomycin- resistant Enterococcus fecal
colonization among kidney transplant patients. BCM Infectious Dis 2006; 6:133.
108
RESUMO
9 - RESUMO
INTRODUÇÃO: O câncer pediátrico representa entre 0,5 - 3% dos tumores. As
infecções por VRE, nesta população, representam um risco potencial, relacionado a
altas taxas de morbi-mortalidade especialmente na aquisição de VRE-EFM, devido ao
seu maior poder de virulência e resistência. Embora a relação colonização versus
infecção seja relativamente baixa, a probabilidade do paciente oncológico desenvolver
infecção pela cepa colonizante é considerável. OBJETIVOS: Devido à alta incidência
de VRE isolados em pacientes do IOP, entre Janeiro a Agosto/08, foram adotadas
ações emergenciais, com a finalidade de rastrear os isolados de VRE e conter a sua
disseminação na instituição. O presente estudo teve como objetivo analisar
epidemiologicamente os isolados de VRE no IOP no período de Janeiro/08 a
Março/09. MATERIAL E MÉTODOS: No estudo retrospectivo foi realizado
levantamento de dados, seguidos de análises fenotípicas e genotípicas de amostras
de enterococos durante os oito primeiros meses de 2008, com a finalidade de verificar
a incidência de pacientes colonizados e/ou infectados por VRE. Os dados do estudo
prospectivo foram avaliados de acordo com quatro sucessivas etapas de culturas de
vigilância de swab anal realizadas em todos os pacientes internados no IOP em um
determinado dia, entre Outubro/08 a Março/09. Foram utilizados meios de cultura de
triagem e realizada caracterização fenotípica e molecular dos VRE, assim como PFGE
dos VRE-EFM. RESULTADOS: Verificou-se grande incidência de VRE (colonizados e
infectados) no IOP (70,8%). Todos os casos foram de E. faecium, sendo 23,5%
provenientes de ICS relacionada a CVC. O maior índice de isolados de VRE-EFM foi
verificado em julho (n=8), sendo três casos de infecção. No estudo prospectivo, as
sucessivas coletas de culturas de vigilância somadas às medidas de controle adotadas
no IOP mostraram uma redução significativa no índice de VRE-EFM, caindo de 36%
(Outubro/08) para 0% (Março/09). De acordo com o PFGE, houve a prevalência de
dois clones A e B, totalizando 27 dos 35 isolados de VRE-EFM analisados,
localizados, principalmente, no sétimo andar (12 casos). Acredita-se que este andar foi
o principal responsável pela disseminação deste patógeno no IOP. CONCLUSÃO: O
modelo prospectivo utilizado neste estudo, somado as estratégias de controle
coordenadas pela CCIH do IOP, apresentou impacto positivo no controle da
disseminação de VRE, uma vez que verificou-se uma drástica redução no número de
casos. Sendo assim, o presente estudo pode servir como modelo epidemiológico para
as CCIH de outras instituições no controle da disseminação de VRE no ambiente
hospitalar.
109
ABSTRACT
10 - ABSTRACT
BACKGROUND: The pediatric cancer represent between 0.5 - 3% of the tumors. VRE
infections in this population, is a potential risk related to high rates of morbidity and
mortality especially in the acquisition of VRE-EFM, due to their greater virulence and
resistance. Although the relationship between colonization versus infection is relatively
low, the likelihood of oncology patients develop infection with the colonizing strain is
considerable. OBJECTIVES: Due to high incidence of VRE isolated from patients in
IOP between January and August/08 were adopted emergency measures, in order to
trace the VRE isolates and contain its spread in the institution. The objective of the
present work was to study epidemiologically isolates of VRE in IOP during the
January/08 to March/09. MATERIAL AND METHODS: A retrospective study was
conducted on the data, followed by phenotypic and genotypic analysis of enterococcal
samples during the first eight months of 2008, in order to determine the incidence of
colonized patients and/or infected with VRE. Data from the prospective study were
evaluated according to four successive surveillance cultures of anal swabs taken from
all units of the IOP between Octuber/08 and March/09. We used screening media and
performed phenotypic and molecular characterization of VRE, and PFGE of VRE-EFM.
RESULTS: A high incidence of VRE (colonized and infected) in IOP (70.8%) was
observed. All cases were related to the species E. faecium, with 23.5% from BSI
associated to the CVC. The highest rate of isolates of VRE-EFM was observed in July
(n=8), and three cases related to infection. In the prospective study, successive
samples of surveillance cultures added to the new control measures adopted in IOP
showed a significant reduction in the rate of VRE-EFM, decreasing from 36%
(Octuber/08) to 0% (March/09). According to PFGE results, there was the prevalence
of two clones A and B, totalling 27 of 35 isolates of VRE-EFM analysed, mainly located
on the seventh floor (12 cases). We believed that this floor was the main responsible
for the dissemination of this pathogen in IOP. CONCLUSION: The prospectively study
used in this study, associated with control strategies coordinated by the HICC of IOP
showed a positive impact on controlling the spread of VRE, since there was observed a
significant reduction in the number of cases. Therefore, this study can serve as an
epidemiological model for HICC of other institutions in controlling the spread of VRE in
the hospital.
111
ANEXOS
11 - ANEXO
Anexo 1 - Fluxo de Conduta para Casos de Bactérias Multiresistentes (MR)
Adotadas pelo Programa de Controle de Infecção Hospitalar do IOP
Negativo
Precaução Padrão
Positivo
INSTITUIR AS PRECAUÇÕES POR CONTATO
•
•
•
•
•
•
Isolamento do paciente
Identificação do isolamento por um cartaz
colorido na porta
Reforçar a lavagem e desinfecção de mãos
Uso de luvas e aventais
Equipamento individualizado (estetoscópio,
esfigmo, etc.)
Comunicar médicos, enfermeiras e equipes de
apoio
•
Manter sempre as precauções de contato e
em todas as internações no caso de, P.
aeruginosa MR, Acinetobacter spp MR e
Enterococo resistente a vancomicina (VRE).
•
Para outros gram negativos como
Acinetobacter, Klebsiella e E.coli, colher
culturas de vigilância após o término do
tratamento. Se negativas, suspender as
precauções de contato
113
ANEXOS
Anexo 2 - Ficha Informativa dos Casos de Pacientes Relatados por Isolados
Bacterianos Multiresistentes.
Bactéria Multiresistente
CCIH / IOP
/
Data
/
Nome: ________________________________________________________
/
Data de nasc.:
Data de internação:
Doença de base:
/
/ /
Sexo: F
M
RH
Unidade:
________________________________________________
Motivo da hospitalização:________________________________________________
Bactéria:____________________________________________________________
Local (is) de isolamento:
Sangue
e
Urina
e Ferida cirúrgica
Secreção traqueal
Data do 1º isolado:
Pele
Líquor
Narina
Outros _________________
Catéter
/
/
Colonização:
Infecção:
Presença de:
Acesso vascular
(com permanência superior àe 24 horas)
Acesso venoso central: Sim
Não
Não
Dias-catéter
EOT: Sim
Não
Dias-tubo
2.
Não
Traqueostomia: Sim
Uso de antibioterapia prévia: Sim
Quais? 1.
Não
Dias-catéter
Catéter venoso de longa permanência: Sim
SVD: Sim
Sim
Não
Não
3.
4.
Data da implantação das precauções específicas
5.
6.
/
7.
/
Medidas tomadas:
________________________________________________________
Controle da disseminação: Sim
Não
114
ANEXOS
Anexo 3 - Resumo dos Principais Testes Laboratoriais Utilizados para a
Identificação do Gênero e da Espécie de Enterococcus spp.
Tabela 6 - Características fenotípicas utilizadas para a identificação presuntiva
de Enterococcus e gêneros relacionados.
Gênero Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Vagococcus Streptococcus Lactococcus Sensibilidade à Vancomicina Produção de PYR Hidrolise da Esculina R ou S R R S S S + ‐ ‐ + ‐ v + v v + v v Crescimento em NaCl 6.5% 10°C 45°C + v + + v + + + ‐ + ‐ + + v v v v v Abreviações e símbolos: PYR: pyrrolidonyl-arylamidase; (+): > 90% positivo; (-): < 10% positivo; (v): variável; R:
(132)
.
resistente; S: sensível. Fonte: Facklam, Sahn & Teixeira
Tabela 7 - Características fenotípicas utilizadas para a identificação das
espécies de Enterococcus e gêneros relacionados.
Espécies MAN SOR ARG ARA SBL RAF TEL MOT PIG SUC PYU MGP EFRO Grupo 1 E. avium + + - + + - - - - + + + R E. malodoratus + + - - + + - - - + + - S E. raffinosus + + - + + + - - - + + + R E. pseudoavium + + - - + - - - - + + + R E. saccharolyticus + + - - + + - - - + - + R Grupo 2 * E. faecalis +
* - +
* - + - + - - +
+ - R Lactococcus spp. + - + - - - - - - v - - S - * E. faecium +
* - + + v v - - - - S E. casseliflavus + - +*
+ v + -*
+*
+*
+ - + R E. mundii + + v + - - + + - - S * - + - + R E. gallinarum Grupo 3 - + * - +
* +
+ - + -
+
+
E. durans - - + - - - - - - - - - S E. hirae - - + - - + - - - + - - S E. dispar - - + - - + - - - + + + R Grupo 4 E. sulfureus - - - - - + - - + + - + R E. cecorum - - - - + + - - - + + - R Grupo 5 E. columbae + - - + + + - - - + + - R V. fluvialis + - - - + - - + - + - + R Abreviações e símbolos: MAN: Manitol; SOR: Sorbose; ARG: Arginina; ARA: Arabinose; SBL: Sorbitol; RAF: Rafinose;
TEL: Telurito; MOT: Motilidade; PIG: Pigmento; SUC: Sucrose; PYU: Piruvato; MGP: Metil-α-glicopiranosida; EFRO: disco de
eritromicina (100 µg); (+): > 90% positivo; (-): < 10% positivo; (v): variável; (*): exceções ocasionais (< 3%); R: resistente; S:
(132)
.
sensível. Fonte: Facklam, Sahn & Teixeira
115
ANEXOS
Anexo 4 - Fluxograma dos Isolados de Enterococcus spp. no Instituto IOP
durante Estudo Retrospectivo.
Estudo Retrospectivo
Janeiro - Agosto / 2008
24 amostras de
Enterococcus spp. de 14
pacientes
E. faecium
(20)
E. faecalis
(4)
VSE-EFM
(3)
VRE-EFM
(17)
C (11)
I (6)
Sangue
(4)
Urina
(1)
C (0)
VRE-EF
(0)
I (3)
Sangue
(3)
VSE-EF
(4)
I (2)
C (2)
Sangue
(1)
Urina
(1)
Secreção Traqueal
(1)
Abreviações: (n): número das amostras; VRE-EFM: E. faecium resistente à vancomicina; VRE-EF: E.
faecalis resistente à vancomicina; VSE-EFM: E. faecium sensível à vancomicina; VSE-EF: E. faecalis
sensível à vancomicina; I - Infecção; C - Colonização
116
ANEXOS
Anexo 5 - Fluxograma dos Isolados de VRE no IOP Durante Estudo
Prospectivo, Seleção das Amostras para Tipagem Molecular e Resultado da
Tipagem.
Estudo Prospectivo
Outubro - Dezembro/2008 e Março/2009
98 amostras de Cultura de
vigilância anal de 80 pacientes
1º Coleta (25)
Outubro
VRE-EFM
(9)
VRE-EF
(0)
2º Coleta (22)
Novembro
VRE-EFM
(10)
VRE-EF
(0)
3º Coleta (24)
Dezembro
VRE-EFM
(4)
4º Coleta (27)
Março
VRE-EF
(1)
VRE-EFM
(0)
VRE-EF
(2)
23 amostras positivas de
VRE-EFM - Prospectivo
10 amostras positivas de
VRE-EFM - Retrospectivo
2 amostras de VSE-EFM Retrospectivo
35 amostras de EFM selecionadas
para tipagem pelo PFGE
Tipadas (33)
Perfil
Subtipo
Número de isolados (%)
Não Tipadas (2)
Mais Prevalentes (n)
A
A – A4
8 (24,3%)
A (3) e A2 (2)
B
B – B8
19 (57,6%)
B (9), B3 (2) e B7 (2)
C
C
2 (6%)
D
D
1 (3%)
E
E
1 (3%)
F
F
1 (3%)
G
G
1 (3%)
Abreviações: (n): número das amostras; VRE-EFM: E. faecium resistente à vancomicina; VRE-EF: E. faecalis
resistente à vancomicina; VSE-EFM: E. faecium sensível à vancomicina; VSE-EF: E. faecalis sensível à vancomicina
117