Fernanda Cristina Koser Gustavo

Pró-Reitoria de Graduação
Curso de Biomedicina
Trabalho de Conclusão de Curso
IMUNOLOCALIZAÇÃO DE LC3 EM MACRÓFAGOS MURINOS
INFECTADOS COM PARACOCCIDIOIDES SPP
Autora: Fernanda Cristina Koser Gustavo
Orientador: Prof. Dr. André Moraes Nicola
Brasília - DF
2015
FERNANDA CRISTINA KOSER GUSTAVO
IMUNOLOCALIZAÇÃO DE LC3 EM MACRÓFAGOS MURINOS INFECTADOS
COM PARACOCCIDIOIDES SPP
Monografia apresentada ao curso de
Graduação
em
Biomedicina
da
Universidade Católica de Brasília, como
requisito parcial para obtenção do Título
de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. André Moraes Nicola
Brasília
2015
Monografia de autoria de Fernanda Cristina Koser Gustavo, intitulada
IMUNOLOCALIZAÇÃO DE LC3 EM MACRÓFAGOS MURINOS INFECTADOS COM
PARACOCCIDIOIDES SPP, apresentada como requisito parcial para obtenção do
grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 25 de
maio de 2015, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
_________________________________________
Prof. Doutor André Moraes Nicola
Orientador
Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina - UnB
_________________________________________
Profa. Doutora Patrícia Albuquerque de Andrade Nicola
Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia - UnB
_________________________________________
Profa. Msc. Stella Maris Freitas de Lima
Universidade Católica de Brasília, Curso de Odontologia - UCB
Brasília
2015
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Luiz e Sandra, minha irmã
Ana Flávia, minha tia Sandra e meu primo
Lucca, com todo o meu carinho e amor.
AGRADECIMENTOS
Esta jornada não teria sido concluída sem a ajuda de inúmeras pessoas. Em
primeiro lugar gostaria de agradecer meu orientador André Moraes Nicola por ter me
dado a oportunidade de participar do seu grupo de pesquisa e por tudo que me
ensinou.
Á toda equipe do laboratório e colegas que me ajudaram com os
experimentos, com as células quando elas morriam, com o meio de cultura que
acabava ou contaminava, em especial Stella, Kellyane e Ananésia.
Aos amigos que foram feitos ao longo da graduação, em especial Marina,
Mariana e Ana Paula, que quero levar para a vida toda e que foram parceiras de
trabalho, festas, viagem e muitas risadas.
Á minha tia por me acolher em sua casa com muito carinho, amor e por ter
sido quase uma mãe para mim. Ao meu primo que foi meu companheiro, quase
irmão, e por ter me aturado todo esse tempo.
Agradeço ao meu namorado, Angelo, por me ajudar com os experimentos e
por me dar força, carinho, amor e companhia.
Por fim, dedico e agradeço por este trabalho as pessoas mais importantes da
minha vida, minha família. Aos meus pais, por terem me criado com muito amor, por
sempre me apoiarem nas minhas decisões e serem os responsáveis por eu ser a
pessoa que sou hoje e por me ajudar a suportar a distância entre nós durante esses
4 anos. Á minha irmã que sempre me apoiou, deu conselhos e foi minha amiga
mesmo com a distância.
RESUMO
GUSTAVO, Fernanda Cristina Koser. Imunolocalização de LC3 em macrófagos
murinos infectados com Paracoccidioides spp. 2015. Trabalho de Conclusão de
Curso em Biomedicina – UCB. Brasília, 2015.
O Paracoccidioides brasiliensis e o P. lutzii são fungos termo-dimórficos, que
apresentam dois tipos de morfologia, micélio, à temperatura ambiente (25°C) e
levedura, à 37°C. São os agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM), uma
das micoses sistêmicas mais importantes da América Latina. Os macrófagos são as
principais células efetoras na resposta imunológica contra Paracoccidioides spp, e a
relação entre essas células é fundamental para compreender a fisiopatologia da
PCM. A autofagia é um processo celular de reciclagem de materiais como
organelas, que são englobadas por vesículas chamadas de autofagossomos que se
fundem com lisossomos posteriormente. Este mecanismo também desempenha
importantes tarefas imunitárias a patógenos intracelulares como protozoários,
bactérias, vírus e fungos. O presente trabalho faz parte de um projeto amplo cuja
hipótese de trabalho é que a autofagia de macrófagos seja importante na resposta
imunitária à infecção por Paracoccidioides spp. Dentro desta linha de pesquisa mais
ampla, o objetivo desta monografia é verificar se há a presença do marcador de
autofagossomos LC3 em vacúolos contendo o fungo fagocitado por macrófagos.
Uma vez que existem fármacos em desenvolvimento clínico cujo mecanismo de
ação é modular a maquinaria de autofagia do sistema imunitário, eventualmente este
resultado poderá ajudar no desenvolvimento de novas terapias para a PCM.
Palavras-chave:
macrófagos.
Paracoccidioides,
paracoccidioidomicose,
autofagia,
LC3,
e
ABSTRACT
Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii are thermo-dimorphic fungi, which show
two types of morphology, mycelia at room temperature (25oC) and yeast at 37oC.
These are etiologic agents of paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most
important systemic mycosis in Latin America. Macrophages are the major effector
cells in the immune response against Paracoccidioides spp, and the relationship
between those cells is important to understand the pathophysiology of PCM.
Autophagy is a cellular process of recycling materials such as organelles, which are
surrounded by vesicles called autophagosomes that later fuse with lysosomes. This
mechanism also plays important roles the immune response to intracellular
pathogens such as protozoa, bacteria, viruses and fungi. This work is part of a larger
project whose working hypothesis is that macrophage autophagy is important in the
immune response to infection by Paracoccidioides spp. Within this broader research
program, the aim of this monograph is to evaluate the presence of the
autophagosome marker LC3 in macrophages vacuoles containing phagocytosed
Paracoccidioides spp yeast cells. As there are drugs in clinical development whose
mechanism of action is to modulate the autophagy machinery, eventually this result
might help develop new therapies for PCM.
Keywords:
macrophage.
Paracoccidioides,
paracoccidioidomycosis,
autophagy,
LC3
and
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Colônia de levedura do P. brasiliensis.
11 Figura 2: Colônia de micélio do P. brasiliensis.
12 Figura 3: Levedura do P. brasiliensis em forma de "roda de leme".
12 Figura 4: Levedura do P. brasiliensis em forma de "Mickey Mouse".
13 Figura 5: Distribuição da paracoccidioidomicose na América Latina.
14 Figura 6: Mortalidade da paracoccidioidomicose no Brasil.
15 Figura
7:
Imagens
de
crianças
com
a
forma
aguda/subaguda
paracoccidioidomicose.
Figura
8:
Jovens
e
da
17 adultos
apresentando
a
forma
aguda/subaguda
da
paracoccidioidomicose.
18 Figura 9: Cacterísticas clínicas da forma crônica da paracoccidioidomicose.
19 Figura 10: Imagens da paracoccidioidomicose.
19 Figura 11: Processo de formação do autofagossomo.
21 Figura 12: Controles da imunolocalização de LC3 (verde) em células RAW264.7. 27 Figura 13: Experimento de imunolocalização com células RAW264.7 infectadas.
28 LISTA DE SIGLAS
IL
Interleucina
IFN-γ
Interferon-gama
NK
Célula Natural Killer
MHC
Complexo principal de histocompatibilidade
Pb01
Isolado 01 do Paracoccidioides lutzii
Pb18
Isolado 18, altamente virulento do Paracoccidioides brasiliensis
Pb265
Isolado 265 menos virulento do Paracoccidioides brasiliensis
PBS
Salina tamponada com fosfato
PCM
Paracoccidioidomicose
PRR
Receptor de reconhecimento padrão
Th
T-helper
TLR
Receptor “toll-like”
TNF-α
Fator de necrose tumoral-α
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 10 2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 11 2.1 PARACOCCIDIOIDES spp .......................................................................... 11 2.2 PARACOCCIDIOIDOMICOSE ..................................................................... 13 2.2.1 Epidemiologia ........................................................................................ 14 2.2.2 Imunologia ............................................................................................. 15 2.2.3 Manifestações clínicas........................................................................... 16 2.3 AUTOFAGIA................................................................................................. 20 2.3.1 3 Autofagia na imunidade ......................................................................... 21 METODOLOGIA................................................................................................. 23 3.1 CULTIVO DE P. BRASILIENSIS E P. LUTZII .............................................. 23 3.2 CULTIVO DE MACRÓFAGOS ..................................................................... 23 3.3 INFECÇÃO IN VITRO DE MACRÓFAGOS COM P. BRASILIENSIS E P.
LUTZII .................................................................................................................... 23 3.4 IMUNOLOCALIZAÇÃO DE LC3 EM MACRÓFAGOS INFECTADOS ......... 24 3.5 CONTROLES ............................................................................................... 24 3.6 PROCESSAMENTO DE IMAGENS ............................................................. 25 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 26 5 CONCLUSÃO..................................................................................................... 29 6 REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO ..................................................................... 30 10
1
INTRODUÇÃO
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelos fungos
Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii, endêmicos na América Latina. Estima-se
que cerca de dez milhões de pessoas que vivem em áreas endêmicas são
infectadas com P. brasiliensis, das quais apenas 2% desenvolvem a doença
(MCEWEN et al., 1995).
A PCM acomete uma pequena porcentagem das pessoas infectadas pelos
fungos e a diferença entre as pessoas que carregam os microrganismos sem
nenhum sintoma e aquelas que apresentam sintomas está na resposta imune eficaz
dos primeiros.
Já se sabe que a autofagia de macrófagos tem uma grande importância na
resposta
imune
contra
fungos
patogênicos
humanos
como
Cryptococcus
neoformans, Candida albicans e Aspergillus fumigatus (NICOLA, et al., 2012;
KYRMIZI, et al., 2013).
Portanto, é importante a realização de estudos que elucidem o processo de
imunidade de indivíduos que são capazes de conter o patógeno, para eventualmente
encontrar medidas para a prevenção e terapia da PCM.
11
2
2.1
REVISÃO DE LITERATURA
PARACOCCIDIOIDES spp
O P. brasiliensis e o P. lutzii são fungos patogênicos humanos e causadores de
uma micose sistêmica, a paracoccidioidomicose (PCM). Estes são considerados
fungos termo-dimórficos, pois apresentam duas formas de vida: levedura, à 37oC, e
filamentoso, em temperatura ambiente (25oC) (SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006;
THEODORO, et al., 2012).
Macroscopicamente, as colônias in vitro de leveduras apresentam uma
coloração creme, são onduladas e com dobras e reentrâncias, conferindo um
aspecto cerebriforme (Figura 1). Já as colônias filamentosas aderem-se ao meio de
cultura e na parte superior, formando o micélio aéreo, possuem coloração branca
(Figura 2) (BRUMMER, et al., 1993).
Figura 1: Colônia de levedura do P. brasiliensis.
12
Figura 2: Colônia de micélio do P. brasiliensis.
Fonte: LACAZ, et al., 1999.
Microscopicamente, pode ser observado, nas colônias de levedura,
brotamentos únicos ou múltiplos quando estão em processo de reprodução, que
acabam formando figuras microscópicas sugestivas e reconhecidas como “roda de
leme” (Figura 3) e “Mickey Mouse” (Figura 4). (SIDRIM, ROCHA, 2004; BRUMMER,
et al., 1993)
Figura 3: Levedura do P. brasiliensis em forma de "roda de leme".
Fonte: http://ongdoencas.blogspot.com.br/2011/09/blastomicose-sul-americana-ou.html
13
Figura 4: Levedura do P. brasiliensis em forma de "Mickey Mouse".
Fonte: http://quizlet.com/43550374/bcc-_-parasitology-_-test-04-flash-cards/
2.2
PARACOCCIDIOIDOMICOSE
A infecção de um indivíduo por Paracoccidioides spp ocorre pela via inalatória.
Esta contaminação ocorre pelo fato do fungo provavelmente viver no solo na forma
de micélio produtor de conídios. Quando há uma movimentação neste solo, os
conídios ficam suspensos no ar e podem ser inalados. O microrganismo se instala
no pulmão e, com a temperatura corporal (37oC), adquire a forma de levedura,
caracterizada como forma causadora da doença. O mesmo pode se disseminar por
via linfática e hematogênica para outros órgãos do corpo humano, dependendo da
virulência do fungo, quantidade do inóculo e da patogenicidade (WANKE, AIDÊ,
2009).
O microrganismo, após se estabelecer no corpo humano, pode permanecer em
estado latente, porém viável e ao longo de algum tempo, a infecção pode progredir e
assim iniciam-se as manifestações clínicas. Em indivíduos saudáveis, ou seja, com
resposta imunológica satisfatória, a infecção pode ser contida e resultando numa
resolução (WANKE, AIDÊ, 2009).
14
2.2.1 Epidemiologia
A PCM foi descrita por Lutz em 1908 e teve seu primeiro caso relatado em
criança por Montenegro em 1911. É uma das micoses mais importantes e
endêmicas da América Latina (PEREIRA, et al., 2004).
Os países que apresentam a maior incidência da micose são Colômbia,
Argentina, Venezuela e Brasil, sendo esse último o país que tem o maior número de
casos registrados e sua maioria nas regiões Centro-Oeste, Sudeste e Sul (Figura 5)
(WANKE, AIDÊ, 2009; PALMEIRO, et al.,2005).
Figura 5: Distribuição da paracoccidioidomicose na América Latina.
Fonte: SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006.
A incidência anual da doença é por volta de três casos a cada cem mil
habitantes. Entre os anos de 1980 e 1995, foram registrados 3.181 casos de óbitos,
uma taxa de mortalidade de 1,45 por milhão de habitantes por ano, se posicionando
como a oitava causa de mortalidade por doença infecciosa e parasitária crônica no
Brasil, segundo Ministério da Saúde (Figura 6) (SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006;
COUTINHO, et al., 2002).
15
Figura 6: Mortalidade da paracoccidioidomicose no Brasil.
Fonte: COUTINHO, et al., 2002.
Dentre as faixas etárias em que a doença é mais comum, há um predomínio
em pessoas entre 30 e 60 anos de idade, caracterizada pela forma crônica,
observando-se uma razão de 13 homens para 1 mulher, podendo sofrer uma
variação nesta proporção. Uma explicação para este fato é que o estrogênio seria
um fator protetor das mulheres, inibindo a transformação do fungo de conídios para
levedura (BRUMMER, et al., 1993, ARISTIZABAL, et al., 1998; RESTREPO, et al.,
1984).
2.2.2 Imunologia
No mecanismo da resposta imunológica inata, ocorre a ativação das
proteínas do sistema complemento por via alternativa. As células natural-killer (NK),
macrófagos, neutrófilos e monócitos, que são células da resposta inata, são
importantes na resistência contra o P. brasiliensis. Já na resposta adaptativa, que
16
atua no desenvolvimento de memória imunológica baseada na ligação antígenoanticorpo, o fungo induz as células por meio de citocinas que foram produzidas pelas
células durante a interação com fagócitos (FORTES, et al., 2011; SILVA, 2013).
Experimentos e estudos clínicos comprovaram que, na resposta imunológica
assintomática da PCM, a resposta que é gerada tem uma polarização para resposta
do tipo T-helper 1 (Th1), já na doença nas formas mais graves, é Th2 (PINZAN, et
al., 2010).
Na resposta imunológica Th1 há indução na produção de interferon-γ (IFN-γ),
que regula a autofagia e na Th2 de interleucina-4 (IL-4) e IL-13, que inibem a
autofagia em macrófagos. Outra resposta encontrada no sistema imunológico, é a
Th17, fonte de IL-22, inicia a resposta imune inata, e IL-17, principal mediador de
inflamação e uma citocina fundamental na defesa do hospedeiro contra fungos
extracelulares (NASCIMENTO, 2012; XU, et al., 2010; TAKATORI, et al., 2008).
Recentemente pode ser observado que a resposta Th17 está associada não
só com doenças autoimunes e doenças inflamatórias crônicas, mas também em
doenças infecciosas (NASCIMENTO, 2012).
Estudos
experimentais
e
em
pacientes
que
apresentavam
PCM,
demonstraram que as citocinas TNF-α e IFN-γ possuem um efeito sinérgico
importante para a resistência do hospedeiro e uma atividade fungicida contra o P.
brasiliensis eficaz (FORTES, et al., 2011).
2.2.3 Manifestações clínicas
A PCM pode ser classificada de duas formas: Paracoccidioidomicose infecção
e Paracoccidioidomicose doença. A PCM infecção pode ser assintomática e
apresentar uma regressão espontânea, deixando apenas a hipersensibilidade tardia
e anticorpos transitórios como indícios da infecção. A PCM doença ocorre uma vez
que a capacidade imunológica insuficiente ou retardada do indivíduo permite a
proliferação e disseminação do fungo para outros órgãos, assim manifestando a
doença. (SIDRIM, ROCHA, 2004)
As formas da PCM doença são divididas em: aguda/subaguda, crônica e
sequelar (SIDRIM, ROCHA, 2004).
17
A forma aguda/subaguda acomete crianças, adolescentes e adultos até 30-35
anos e representa de 3 a 5% dos casos da PCM, sendo a distribuição em crianças
entre os gêneros masculino e feminino semelhante nesta forma da doença. Esta
apresenta um desenvolvimento mais rápido, o paciente procura um médico entre 4 a
12
semanas
após
a
infecção
e
os
sintomas
mais
comuns
são:
hepatoesplenomegalia, linfonodomegalia, febre, lesões ósteo-articulares e cutâneas
(Figuras 7 e 8) (SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006; WANKE, AIDÊ, 2009).
Figura 7: Imagens de crianças com a forma aguda/subaguda da paracoccidioidomicose.
A – abscessos em regiões frontal e clavicular, originados do acometimento ósteo-clavicular. B –
acometimento linfático abscedado. C – linfonodomegalia inguinal. D – acometimento linfático
abdominal com ascite e hepatoesplenomegalia.
Fonte: SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006.
18
Figura 8: Jovens e adultos apresentando a forma aguda/subaguda da paracoccidioidomicose.
A – presença de massas ganglionares em região supraclavicular, cervical e submandibular. B –
linfonodomegalia. C – lesões ulceradas em face de aspecto verruciforme. D- lesões de aspecto
pápulo-nodular e ulceradas.
Fonte: SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006.
A forma crônica corresponde a aproximadamente 90% dos casos e acomete
principalmente adultos do sexo masculino com mais de 30 anos de idade. A doença
age de forma silenciosa, pois progride lentamente, podendo levar anos até ser
diagnosticada. Nesta forma, há o comprometimento pulmonar, resultando em
sintomas e sinais como: tosse produtiva, lesões mucocutâneas, disfagia, rouquidão
e perda de peso (Figuras 9 e 10) (SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006; Brasil. Ministério
da Saúde, 2009).
19
Figura 9: Cacterísticas clínicas da forma crônica da paracoccidioidomicose.
A – lesões cutâneas na face e lesões papulosas e ulcero-crostosas. B – acometimento peri-oral e
mentoniano. C – linfonodos cervicais e submandibulares fisturizados. D – lesões com bordas
irregulares na região peri-anal.
Fonte: SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006.
Figura 10: Imagens da paracoccidioidomicose.
A – radiologia convencional mostrando imagem em “asa de borboleta”. B – opacidades nodulares e
micronodulares difusas. C – tomografia de pulmão mostrando múltiplas cavitações. D – aumento
bilateral de adrenais. E e F – envolvimento do sistema nervoso central, imagens de aspecto
hipodenso e com realce de contraste em forma de anel.
Fonte: SHIKANAI-YASUDA, et al., 2006.
20
A fase sequelar é classificada uma vez que a doença não está mais em
atividade no momento da avaliação. Esta apresenta somente lesões fibróticascicatriciais e podendo ocorrer também a presença de calcificações (SIDRIM,
ROCHA, 2004).
2.3
AUTOFAGIA
Autofagia é um processo de reciclagem de material intracelular que ocorre em
eucariotos, no qual o conteúdo (por exemplo, citoplasma ou organelas) é consumido
e degradado pelo lisossomo. Tem sido caracterizada como uma resposta à privação
de nutrientes e da homeostase (KUBALLA, et al., 2012).
O processo ocorre mediante o isolamento do material intracelular formando uma
vesícula de membrana dupla conhecida como autofagossomo, que envolve o
material a ser reciclado. O mau funcionamento da autofagia pode elevar a
susceptibilidade a infecções (MIZUSHIMA, 2007; KUBALLA, et al., 2012).
Uma resposta imunológica a alguns patógenos intracelulares como bactérias,
vírus e protozoários também faz parte do papel da autofagia (LEVINE, et al., 2011).
No processo de autofagia estão envolvidas algumas proteínas citoplasmáticas
que são responsáveis pela formação do autofagossomo. Algumas dessas proteínas
são: Atg5, Atg16, Atg12, Atg8/LC3 (LC3 I), LC3 II (ZHAO, et al., 2008).
A proteína Atg5 é responsável pela ação de dois sistemas de conjugação. O
primeiro sistema gera um conjugado de Atg5 e Atg12 que são associados com o
Atg16 e alongam a membrana dupla que irá isolar o material desejado. No segundo
sistema, a parte terminal do Atg8/LC3 (LC3 I) é trocada por um fosfolipídeo,
fosfatidiletanolamina, que por meio desta troca é gerado o LC3 II. O LC3 I consegue
passar pela membrana dupla, diferente do LC3 II, que fica preso na membrana por
ter a presença do fosfolipídeo. Por este motivo o LC3 II é conhecido como marcador
de autofagossomo (Figura 11) (ZHAO, et al., 2008).
21
Figura 11: Processo de formação do autofagossomo.
Esquema explicando alguns passos de como ocorre o processo de formação do autofagossomo com
a presença das proteínas Atg5, Atg12, Atg16, Atg8/LC3 e LC3 II. A – Fagófago de membrana dupla.
B – Conjugado de Atg5 e Atg12 associados com Atg16 para realizar o alongamento da membrana
dupla. C – Troca da parte final do Atg8/LC3 1 por um fosfolipídeo, fosfatidiletanolamina, formando o
LC3 II. D – Formação do autofagossomo e do autofagolisossomo.
2.3.1 Autofagia na imunidade
A autofagia é um processo de reciclagem em células eucarióticas e vem
demonstrando um papel na resposta imune na invasão microbiológica, como em
vírus, bactérias, protozoários e fungos. Para ocorrer uma restrição do crescimento
desses microrganismos, a autofagia atua enviando os patógenos para o lisossomo,
no qual ocorre a degradação. Atua também fornecendo antígenos para o complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e II, que induzirá a resposta
adaptativa (BIRMINGHAM, et al. 2007; SILVA, 2013).
A resposta Th2 atua como um supressor da autofagia, no qual protege os
microrganismos e elementos a serem eliminados pelo mecanismo. Na resposta Th1,
22
ocorre a indução e então a eliminação do material (DERETIC, et al., 2009; XU, et al.,
2010).
23
3
3.1
METODOLOGIA
CULTIVO DE P. BRASILIENSIS E P. LUTZII
Foram utilizados para este trabalho três linhagens diferentes de fungo: Pb18,
Pb265 e Pb01. O Pb18 é um isolado clínico de maior virulência de P. brasiliensis, e
o Pb265 é considerado um isolado menos virulento desta mesma espécie. O Pb01
foi classificado recentemente como uma nova espécie P. lutzii.
A forma de cultivo das três linhagens fúngicas foi realizada por meio de repique
semanal, em tubos de ensaio de vidro com tampa, utilizando o meio Fava-Netto e
incubação em estufas a 37oC. Foi utilizada a forma de levedura neste experimento.
3.2
CULTIVO DE MACRÓFAGOS
A célula que foi utilizada no experimento é a RAW 264.7, uma linhagem
imortalizada de macrófagos de camundongos. Cultivada em placas descartáveis e
estéreis de cultura contendo o meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal
bovino e antibióticos em estufa a 37oC com 5% de CO2. Essas células foram
repicadas a cada três dias, de forma para obter células com uma melhor confluência
(NICOLA, 2011).
3.3
INFECÇÃO IN VITRO DE MACRÓFAGOS COM P. BRASILIENSIS E P.
LUTZII
O experimento foi realizado em placas de 24 poços contendo lamínulas
circulares estéreis de 12 mm de diâmetro. Após contagem em câmara de Neubauer,
foi realizada uma suspensão contendo 2,5 x 105 células por mL em meio DMEM, e
então adicionou-se as células RAW 264.7 nos poços. Foram incubadas por 24h para
aderência. As linhagens de P. brasiliensis e P. lutzii em forma de levedura foram
coletadas de repiques de cinco dias e contadas em câmara de Neubauer da mesma
forma que as células, feita uma suspensão de 2,5 x 105 células por mL em meio
24
DMEM, e inoculadas nos poços que continha os macrófagos. Sendo assim, a
proporção de fungo e macrófagos foi de 1:1. A placa foi incubada por mais 24h a
37oC em estufa com 5% de CO2 para permitir a infecção dos macrófagos (NICOLA,
2011).
3.4
IMUNOLOCALIZAÇÃO DE LC3 EM MACRÓFAGOS INFECTADOS
Após o período de incubação, as células foram fixadas com metanol gelado por
10 minutos e lavadas com solução PBS. Simultaneamente preparou-se a solução do
anticorpo primário (IgG policlonal de coelho contra LC3 humana) em diluição de
1:1000 e anticorpo secundário (IgG de cabra anti-IgG de coelho) em diluição de
1:2000. Cada incubação teve um tempo de 1h e logo após as lamínulas foram
montadas em lâminas contendo uma gota do meio de montagem Prolong Gold e
guardadas na geladeira e ao abrigo da luz para total secagem (NICOLA, 2011).
3.5
CONTROLES
Foram utilizados três controles neste projeto.
•
Células RAW264.7 não infectadas e não coradas: controle de
autofluorescência.
•
Células RAW264.7 não infectadas e coradas: controle negativo da
infecção e controle positivo da coloração.
•
Células RAW264.7 infectadas com Cryptococcus neoformans e coradas:
controle positivo, pois já se sabe que este fungo encontra-se em um
autofagossomo em macrófagos (NICOLA, 2011).
25
3.6
PROCESSAMENTO DE IMAGENS
As imagens foram observadas por microscopia de Epifluorescência no
equipamento Zeiss Axio Observer Z1 (Zeiss, Alemanha) equipado com objetiva de
63x NA 1.4.
As imagens coletadas foram processadas utilizando algoritmo de deconvolução
iterativa com o software ZEN, que está equipado ao microscópio. As fatias das
imagens processadas por deconvolução foram reconstituídas tridimensionalmente
por projeção-Z no software ImageJ.
26
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante este trabalho foram realizados experimentos com imunofluorescência
para observar se existe a presença de LC3 em volta de macrófagos murinos
infectados com fungos do gênero Paracoccidioides spp, de modo que possa auxiliar
no entendimento da interação da autofagia com estes microrganismos.
Os resultados obtidos com dois isolados de P. brasiliensis e um de P. lutzii
foram bem satisfatórios, juntamente com os três controles diferentes utilizados.
Pode-se observar na Figura 12 que todos os controles, negativos e positivos,
funcionaram adequadamente. No controle positivo, em que foi utilizado o
microorganismo C. neoformans por já se saber que existe a presença do
autofagossomo ao redor dessas células, a autofagia e a marcação do LC3 II
funcionaram como o esperado, assim como no controle não corado (negativo), no
qual não foi notada nenhuma presença de autofluorescência.
27
Figura 12: Controles da imunolocalização de LC3 (verde) em células RAW264.7.
A - controle de autofluorescência (células não coradas e não infectadas). B - controle negativo da
infecção e positivo da coloração (células coradas e não infectadas). C – controle positivo para a
formação de LC3 II (autofagossomo) em células infectadas com C. neoformans. A barra de escala
equivale a 5 µm.
No experimento, foi localizado ao redor dos três isolados de fungos do gênero
Paracoccidioides ssp fagocitados por macrófagos o marcador de autofagossomo
LC3 II (forma ativada) juntamente com a presença de LC3 I dentro do citoplasma
das células, conforme mostrado na Figura 13. Estes resultados sugerem que a
autofagia de fato parece ter um papel na resposta a P. brasiliensis e P. lutzii, de
maneira semelhante ao observado com C. neoformans e C. albicans A. fumigatus
anteriormente em outros experimentos (NICOLA, et al., 2012; KYRMIZI, et al., 2013).
28
Figura 13: Experimento de imunolocalização com células RAW264.7 infectadas.
A e B – células infectadas com isolados de P. brasiliensis, Pb18 e Pb265 respectivamente. C- células
infectadas com isolado de P. lutzii, Pb01. A barra de escala equivale a 5 µm.
29
5
CONCLUSÃO
A autofagia é um mecanismo fisiológico das células eucarióticas responsável
pela obtenção de energia através da ‘’reciclagem’’ de materiais celulares, tendo
também um papel de destaque na imunidade contra patógenos intracelulares
(KUBALLA, et al., 2012).
A imunolocalização de LC3 na membrana do autofagossomo durante a
infecção de macrófagos RAW 246.7 por fungos do gênero Paracoccidioides ssp,
demonstra que a autofagia é um mecanismo utilizado pelo fungo no processo de
internalização celular. Dessa forma, este trabalho contribui para o melhor
entendimento da interação patógeno-hospedeiro e encorajam uma investigação
mais aprofundada, assim como, propicia o desenvolvimento de novas formas
diagnósticas e terapêuticas para indivíduos portadores da paracoccidioidomicose.
30
6
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