UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA DOUTORADO INTERINSTITUCIONAL UFG/UEMA/UFMA/UESPI IVONIZETE PIRES RIBEIRO PREVALÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS VÍRUS LINFOTRÓPICOS DE CÉLULAS T HUMANAS 1 E 2 EM PRIMODOADORES DE SANGUE E SEUS FAMILIARES NO ESTADO DO PIAUÍ Goiânia 2014 ii TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Ivonizete Pires Ribeiro E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ ] Dissertação [X]Sim [X] Tese [ ] Não Vínculo empregatício do autor: Professora UESPI Agência de fomento: Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Sigla: CAPES Superior País: Brasil UF: GO CNPJ: Título: Prevalência e caracterização molecular dos vírus linfotrópicos de células T humanas 1 e 2 em primodoadores de sangue e seus familiares no Estado do Piauí Palavras-chave: HTLV-1, HTLV-2, doadores de sangue. Título em outra Prevalence and molecular characterization of human T-lymphotropic virus 1 língua: and 2 in the first-time blood donors and their family members in the State of Piauí Palavras-chave em outra língua: HTLV-1, HTLV-2, blood donors Área de concentração: Microbiologia Data defesa: (dd/mm/aaaa) 15/12/2014 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública – IPTSP/UFG (DINTER) Orientador (a): Profa. Dra. Regina Maria Bringel Martins E-mail: [email protected] Co-orientador (a):* Gevina da Silva Pinheiro E-mail: *Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [ ] SIM [X] NÃO1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ________________________________________ Assinatura do (a) autor (a) Data: ____ / ____ / _____ 1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo. ii IVONIZETE PIRES RIBEIRO PREVALÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS VÍRUS LINFOTRÓPICOS DE CÉLULAS T HUMANAS 1 E 2 EM PRIMODOADORES DE SANGUE E SEUS FAMILIARES NO ESTADO DO PIAUÍ Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientadora: Dra. Regina Maria Bringel Martins Co-orientadora: Dra. Gevina da Silva Pinheiro Goiânia 2014 ii Ficha catalográfica elaborada automaticamente com os dados fornecidos pelo(a) autor(a), sob orientação do Sibi/UFG. Ribeiro, Ivonizete Pires Prevalência e caracterização molecular dos vírus linfotrópicos de células T humanas 1 e 2 em primodoadores de sangue e seus familiares no Estado do Piauí [manuscrito] / Ivonizete Pires Ribeiro. 2014. xv, 73 f.: il. Orientador: Profa. Dra. Regina Maria Bringel Martins; co orientadora Dra. Gevina da Silva Pinheiro. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) , Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública, Goiânia, 2014. Bibliografia. Inclui siglas, abreviaturas, símbolos, lista de figuras, lista de tabelas. 1. HTLV-1. 2. HTLV-2. 3. Doadores de sangue. I. Martins, Regina Maria Bringel , orient. II. Pinheiro, Gevina da Silva , co-orient. III. Título. Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO Aluno (a): Ivonizete Pires Ribeiro Orientador (a): Profa. Dra. Regina Maria Bringel Martins Co-orientador (a): Dra. Gevina da Silva Pinheiro Membros: 1. Profa. Dra. Regina Maria Bringel Martins 2. Dra. Aline Garcia Kozlowski 3. Profa. Dra. Fabíola de Souza Fiaccadori 4. Profa. Dra. Megmar Aparecida dos Santos Carneiro 5. Profa. Dra. Renata Carneiro Ferreira Data: 15/12/2014 iii DEDICATÓRIA A Deus, pela graça concedida e sustento dos meus sonhos, tornando cada recaída um estímulo de perseverança, para a concretização desta trajetória, e por estar presente nos momentos mais difíceis de minha vida, iluminando meus caminhos. iv AGRADECIMENTOS À minha querida mãe Elza, por acreditar no sucesso da minha árdua caminhada, e incentivo na busca de novas realizações; Ao meu esposo, Gilson, pelo incentivo, por ter suportado e dividido todos os momentos de stress nestes anos de estudo; Às minhas filhas, Maria Vitória e Mariana, pelo amor incondicional; Aos meus irmãos Ivonise e Evandro, pela credibilidade e apoio nesta árdua caminhada; À Profa. Dra. Regina Maria Bringel Martins que me orientou de uma forma sábia, com paciência, compreensão, diante de tantas dificuldades encontradas; Ao Centro de Hematologia e Hemoterapia, na pessoa do Dr. Lages e Dra. Gevina, pelo apoio e compreensão para realização deste trabalho; A minha colega de trabalho Débora, pelas palavras de incentivo e pelos momentos de descontração; À minha amiga, Lúcia Marques, pelas palavras certas, nos momentos certos, que não fizeram com que desistisse de um grande sonho, apesar dos problemas. Muito Obrigada!; Às minhas colegas e amigas, Gisela, Mirian e Sheilla, pela amizade, pelos momentos de desabafo, pelo companheirismo; Aos companheiros do Laboratório de Virologia do IPTSP/UFG, Ágabo, Nádia, Andréia e Marina, por ter me acolhido e me dado suporte quando precisei. Pelo importante auxílio na execução dos testes sorológicos e moleculares; À Drª Aline Garcia Kozlowski que tanto contribui na realização deste estudo; v Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG, pelo auxílio prestado ao longo desses quatros anos; Aos professores do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG, pela convivência, conhecimento e auxílios; Aos colegas do HEMOPI, pelo apoio durante a coleta de dados, no processamento e armazenamento das amostras; À Banca do Exame de Qualificação, composta pelas professoras, Dra.Márcia Alves Dias de Matos; Dra. Carmem Luci Rodrigues Lopes e Fabíola Fiaccadori, pelas críticas construtivas e valiosas sugestões; Aos doadores e familiares, pela participação no estudo. Obrigada pelas experiências e expectativas compartilhadas; Enfim, a todos que contribuíram de forma direta ou indireta na realização deste trabalho. vi SUMÁRIO ÍNDICE DE TABELAS FIGURAS E QUADROS................................................................... x SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ....... .................................................................. xii RESUMO ................................................................................................................................ xiv ABSTRACT ............................................................................................................................. xv 1.INTRODUÇÃO .......................................................................................................................1 1.1 Vírus Linfotrópicos de Células T Humanas......................................................................... 1 1.1.1 Vírus linfotrópicos de células T humanas 1e 2 ................................................................ 1 1.1.2 Replicação viral................................................................................................................ 6 1.1.3 Variabilidade genética....................................................................................................... 7 1.1.4 Distribuição dos subtipos do HTLV-1.............................................................................. 9 1.1.5 Distribuição dos subtipos do HTLV-2.............................................................................. 10 1.2 Aspectos Clínicos .............................................................................................................. 10 1.3 Diagnóstico Laboratorial.................................................................................................... 12 1.4 Epidemiologia.................................................................................................................... 14 1.4.1 Transmissão..................................................................................................................... 14 1.4.2 Prevalência...................................................................................................................... 15 1.5 Prevenção e Controle.......................................................................................................... 17 2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................................. 19 3. OBJETIVOS......................................................................................................................... 20 3.1 Objetivo Geral.................................................................................................................... 20 3.2 Objetivos Específicos......................................................................................................... 20 4. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................. 21 4.1 Delineamento...................................................................................................................... 21 4.2 População Estudada............................................................................................................ 21 vii 4.2.1 Grupo 1 - Primodoadores de sangue no Estado do Piauí.................................................. 21 4.2.2 Grupo 2 - Familiares primodoadores HTLV-1/2 soropositivos....................................... 21 4.3 Entrevista e Coleta de Sangue............................................................................................ 22 4.4 Testes Sorológicos............................................................................................................. 22 4.4.1 Ensaio imunoenzimático (ELISA).................................................................................. 22 4.4.2 Line immunoassay (LIA)................................................................................................. 23 4.5 Testes Moleculares............................................................................................................. 23 4.5.1 Extração de DNA............................................................................................................. 23 4.5.2 Nested-PCR..................................................................................................................... 24 4.5.3 Eletroforese em gel de agarose....................................................................................... 26 4.5.4 Purificação do DNA........................................................................................................ 26 4.5.5 Sequenciamento e análise filogenética............................................................................ 27 4.6 Processamento e Análise de Dados..................................................................................... 27 5. RESULDADOS.................................................................................................................... 28 5.1 Primodoadores de Sangue (Grupo 1)................................................................................... 28 5.1.1 Características da população estudada............................................................................. 28 5.1.2 Detecção de anticorpos anti-HTLV.................................................................................. 29 5.1.3 Caracteríticas de risco para infecção pelo HTLV-1 e HTLV-2........................................ 30 5.1.4 Detecção do DNA proviral e análise filogenética da região LTR do HTLV-1 e HTLV2................................................................................................................................................ 31 5.2 Familiares dos Primodoadores de Sangue HTLV-1/2 Soropositivos (Grupo 2)............................................................................................................................................... 34 5.2.1 Família 1.......................................................................................................................... 34 5.2.2 Família 2.......................................................................................................................... 35 5.2.3 Família 3.......................................................................................................................... 37 6. DISCUSSÃO........................................................................................................................ 41 viii 6.1 Primodoadores de Sangue................................................................................................... 41 6.2 Familiares dos Primodoadores de Sangue HTLV-1/2 Soropositivos.................................. 44 7. CONCLUSÕES.................................................................................................................... 48 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 49 ix ÍNDICE DE TABELAS, FIGURAS E QUADROS Tabela1 - Características demográficas dos primodoadores de sangue estudados no Estado do Piauí, agosto/2011-julho/2012 ................................................................................................. 28 Tabela 2 - Prevalência da infecção pelo HTLV-1 e 2 em 37.306 primodoadores de sangue no Estado do Piauí,agosto/2011-julho/2012.................................................................................. 30 Tabela 3 - Características dos primodoadores infectados pelo HTLV-1 e 2 no Estado do Piauí, agosto/2011-julho/2012............................................................................................................ 31 Tabela 4 - Características de risco para infecção pelo HTLV-1 relatadas pelos familiares da primodoadora de sangue PI-39.................................................................................................. 35 Tabela 5 - Características de risco para infecção pelo HTLV relatadas pelos familiares da doadora de sangue PI-37........................................................................................................... 36 Tabela 6 - Características de risco para infecção pelo HTLV relatadas pelos familiares da doadora de sangue PI-23........................................................................................................... 38 Figura 1 - Árvore filogenética comparando vírus da leucemia bovina (BLV) e vírus linfotrópico de célula T de primatas (PTLV)................................................................................................. 2 Figura 2 - Representação esquemática da partícula do HTLV................................................... 3 Figura 3 - Representação esquemática do genoma do HTLV..................................................... 3 Figura 4 - Representação esquemática do ciclo de replicação do HTLV................................... 7 Figura 5 - Classificação dos subtipos do HTLV-1 e HTLV-2.................................................... 9 Figura 6 - Fluxograma para diagnóstico laboratorial do HTLV-1 e 2....................................... 13 Figura 7 - Distribuição dos principais focos de infecção pelo HTLV-1…................................ 15 Figura 8 - Taxas de prevalência do anti-HTLV-1/2 (a cada 1.000 doações) em doadores de sangue das capitais de 26 Estados e do Distrito Federal do Brasil ……………............…..…. 16 Figura 9 - Fluxograma dos testes sorológicos realizados para anti-HTLV .............................. 29 Figura 10 - Árvore filogenética da região LTR do HTLV-1, incluindo 22 isolados de primodoadores de sangue no Estado do Piauí e 22 sequências do Genbank dos subtipos a-e.. 32 Figura 11 - Árvore filogenética da região LTR do HTLV-2, incluindo 11 isolados de primodoadores de sangue no Estado do Piauí e 11 sequências do Genbank dos subtipos a, b e d ............................................................................................................................................. 33 x Figura 12 - Heredograma dos familiares da doadora de sangue PI-39 …………........…..…... 34 Figura 13 - Heredograma dos familiares da doadora de sangue PI-37..................................... 36 Figura 14 - Heredograma dos familiares da doadora de sangue PI-23...................................... 37 Figura 15 - Árvore filogenética da região LTR do HTLV-1, incluindo quatro isolados, sendo um do primodoador de sangue PI-37 e outro do PI-39 e de dois familiares no Estado do Piauí e 20 sequências do Genbank dos subtipos a-e ............................................................................. 39 Figura 16 - Árvore filogenética da região LTR do HTLV-2, incluindo quatro isolados de familiares de primodoadores de sangue no Estado do Piauí e 12 sequências do Genbank dos subtipos a, b e d ........................................................................................................................ 40 Quadro 1 - Proteínas codificadas pela região pX........................................................................ 5 Quadro 2 - Estudos de prevalência do HTLV-1 e 2 em doadores de sangue no Brasil, 20032014.......................................................................................................................................... 17 Quadro 3 - Iniciadores genéricos para a região tax do HTLV .................................................. 24 Quadro 4 - Iniciadores específicos para a região tax do HTLV-1 ............................................ 25 Quadro 5 - Iniciadores específicos para a região LTR do HTLV-1 ......................................... 25 Quadro 6 - Iniciadores específicos para a região LTR do HTLV-2 ......................................... 25 xi SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ATL BLV bZIP CA CDC CREB DNA dNTP’s DST EDTA ELISA ENV EUA F GLUT1 HAM/TSP HBV HBZ HCV HEMOPI HIV HLA HSPG HTLV IC ICTV IFA IN IPTSP/UFG Kb Kda LIA LTR M MA MT MgCl2 MHC nm mRNA NC NRP-1 OMS Leucemia de células T do adulto Vírus da leucemia bovina Zíper de leucina básico Capsídeo Center for Disease Control and Prevention Proteína ligante ao elemento de resposta do AMPc Ácido desoxirribonucleico Deoxinucleotídeos trifosfatados Doença sexualmente transmissível Ácido etilenodiamino tetra-acético Ensaio imunoenzimático Envelope Estados Unidos da América Feminino Transportador de glicose Paraparesia espástica tropical/Mielopatia associada ao HTLV-1 Vírus da hepatite B Fator de zíper de leucina básico do HTLV-1 Vírus da hepatite C Centro de Hematologia e Hemoterapia do Estado do Piauí Vírus da imunodeficiência humana Antígeno leucocitário humano Heparan Sulfate Proteoglycans Vírus linfotrópico de células T humanas Intervalo de confiança International Committee on Taxonomy of Viruses Imunofluorescência indireta Integrase Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/Universidade Federal de Goiás kilobase Quilodaltons Line immunoassay Long terminal repeats Masculino Maranhão Proteína da matriz Cloreto de magnésio Complexo principal de histocompatibilidade nanômetro RNA mensageiro Nucleocapsídeo Neuropilin-1 Organização Mundial de Saúde xii ORF pb PCR PI PNH PR PRO/POL PTLV RIPA RNA STLV SU TCLE TM TMB TR UDI UESPI UV WB Open reading frame Pares de base Reação em cadeia pela polimerase Piauí Primatas não humanos Protease viral Protease/polimerase Vírus linfotrópico de células T de primatas Radioimunoprecipitação Ácido ribonucleico Vírus linfotrópico de células T de símios Proteína de superfície Termo de consentimento livre e esclarecido Proteína transmembrana Tetrametilbenzidina Transciptase reversa Usuário de drogas injetáveis Universidade Estadual do Piauí Ultravioleta Western blot xiii RESUMO O vírus linfotrópico de células T humanas 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da leucemia de células T do adulto (ATL) e mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP), além de outras doenças inflamatórias. O HTLV-2 tem sido associado com síndrome similar a HAM/TSP e outras manifestações clínicas. O presente estudo tem como objetivo investigar os aspectos soroepidemiológicos e moleculares da infecção pelo HTLV-1/2 em primodoadores de sangue e seus familiares no Estado do Piauí. No período de agosto/2011 a julho/2012, 37.306 primodoadores de sangue foram triados para detecção de anticorpos antiHTLV-1/2 por ensaio imunoenzimático (ELISA), no Centro de Hematologia e Hemoterapia do Estado do Piauí (HEMOPI). Os indivíduos reagentes foram recrutados para segunda coleta de sangue e entrevista, ocasião que seus familiares foram convidados para participar da investigação. Os soros foram testados por ELISA, e a reatividade confirmada pelo line immunoassay (LIA). As amostras de sangue total dos indivíduos anti-HTLV-1/2 reagentes foram submetidas à detecção do DNA proviral por reação em cadeia pela polimerase (PCR) e sequenciamento, seguido da análise filogenética. Dos 37.306 primodoadores de sangue triados para anti-HTLV-1/2, 48 foram reagentes pelo ELISA. Ao testar a segunda amostra desses indivíduos também por ELISA, 47 (0,13%) permaneceram como reagentes. Dest as, 22 (0,06%) foram anti-HTLV-1 e 14 (0,04%) anti-HTLV-2 positivas pelo LIA. A maioria dos doadores infectados pelo HTLV-1 ou 2 relatou características de risco relacionadas à transmissão vertical e sexual. A caracterização genética demonstrou que os 22 isolados do HTLV-1 foram pertencentes ao subtipo Cosmopolita (HTLV-1a) do subgrupo Transcontinental (A). Para o HTLV-2, 11/14 (78,6%) amostras anti-HTLV-2 positivas foram amplificadas e, posteriormente, caracterizadas como do subtipo a (HTLV-2a/c). De 21 famílias dos primodoadores de sangue HTLV-1/2 soropositivos contactadas, cinco concordaram em participar do estudo. Três famílias apresentaram, além do caso índice (doador), pelo menos dois outros membros anti-HTLV-1 ou 2 soropositivos (ELISA/LIA). Combinando os dados epidemiológicos dos membros da primeira família com a análise molecular de seus isolados, foi evidenciada a ocorrência de transmissão intrafamiliar/vertical do HTLV-1 e, na segunda e terceira famílias, do HTLV-2. Adicionalmente, nesta última, a transmissão sexual do HTLV-2 pode ser considerada. A prevalência encontrada para o HTLV1/2 no presente estudo (0,13%; IC 95%: 0,09-0,17) é concordante com as estimadas em doadores de sangue no Brasil, e os subtipos do HTLV-1 e 2 identificados nesta investigação corroboram a predominância desses no País. Este estudo fornece, ainda, evidência de transmissão intrafamiliar do HTLV-1 e 2. xiv ABSTRACT Human T-lymphotropic virus type (HTLV-1) is the etiological agent of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL), HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), and other inflammatory diseases. HTLV-2 has been associated with a syndrome similar to HAM/TSP and other clinical manifestations. The present study aimed to investigate the seroepidemiologic and molecular aspects of HTLV-1/2 infection in the first-time blood donors and their family members in the state of Piauí. Between August 2011 and July 2012, 37,306 first-time blood donors were screened by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the presence of anti-HTLV-1/2 antibodies in the Centro de Hematologia e Hemoterapia do Estado do Piauí (HEMOPI). The positive individuals were recruited for a second blood collection and interview, when their family members were invited to participate to this investigation. Sera were tested by ELISA, and the positivity confirmed by line immunoassay (LIA). Whole-blood samples of anti-HTLV seropositive individuals were submitted to proviral DNA detection by polymerase chain reaction (PCR) and nucleotide sequencing, followed by phylogenetic analysis. Of 37,306 first-time blood donors, 48 were anti-HTLV-1/2 reactive by ELISA. By testing the second serum samples, 47 (0.13%) wer e also reactive by ELISA. Amo ng t hese, 22 (0.06%) were anti-HTLV-1 and 14 (0.04%) anti-HTLV-2 positive by LIA. Most of HTLV-1 or 2 infected patients reported risk characteristics related to vertical and sexual transmission. Genetic characterization demonstrated that all 22 HTLV-1 isolates belonged to the Cosmopolitan subtype HTLV-1a Transcontinental subgroup A. For HTLV-2, 11/14 (78.6%) anti-HTLV-2 positive samples were amplified and then identified as subtype a (HTLV-2 a/c). Of 21 families invited to take part in the study, five agreed to participate. Three had, in addition to the index case (blood donor), two or more anti-HTLV-1 or 2-positive members (ELISA/LIA). By combining epidemiological data of the first family members with molecular analysis of their isolates, intrafamilial/vertical transmission of HTLV-1 was suggested, as well as the transmission of HTLV-2 among the second and the third families. Additionally, HTLV-2 sexual transmission could be considered in the last family. The prevalence of 0.13% (CI 95%: 0.11-0.17) for HTLV-1/2 found in this study is similar to those observed in blood donors in Br azil, and HTLV-1 and 2 subtypes identified in this investigation were consistent with those circulating in Brazil. In addition, this study provides evidence of intrafamilial transmission of HTLV -1 and 2. xv 1. INTRODUÇÃO 1.1 Vírus Linfotrópicos de Células T Humanas Os vírus linfotrópicos de células T humanas 1 e 2 (HTLV-1 e 2) foram os primeiros retrovírus descritos em humanos. Em 1977, Uchiyama et al. (1977) verificaram a presença de um retrovírus em células provenientes de um paciente com leucemia de células T do adulto (ATL) no sudeste do Japão. Concomitantemente, mas de modo independente, o HTLV-1, então denominado de um novo retrovírus tipo C, foi identificado em 1979, nos Estados Unidos da América (EUA), a partir de uma linhagem de células T de pacientes com linfoma cutâneo (Poiesz et al. 1980, Gallo 2005, 2011). Em 1982, O HTLV-2 foi isolado em células de um paciente com leucemia de células T pilosas (Kalyanaraman et al. 1982). Entretanto, estudos posteriores sobre esse vírus não demonstraram sua associação com a leucemia (Roucoux & Murphy 2004). Em 2005, foi descrito o HTLV-3 em três indivíduos assintomáticos anti-HTLV-1/2 positivos por ensaio imunoenzimático (ELISA) e western blot (WB) indeterminados. Esses indivíduos eram nativos de comunidades rurais da África Central que mantinham estreito contato com primatas não humanos (PNH) (Calattini et al. 2005). No mesmo ano, foi isolado outro tipo viral, o HTLV-4, com perfil semelhante ao descrito para o HTLV-3, sendo proveniente de caçador da mesma região (Wolfe et al. 2005). Porém, ainda são necessários estudos para saber se esses vírus estão associados com algum tipo de patologia (Calattini et al. 2005, Mahieux & Gessain 2009, 2011, Gessain et al. 2013). Os HTLVs, juntamente com os vírus linfotrópicos de células T de símios (STLVs), compõem o grupo de vírus linfotrópicos de células T em primatas (PTLVs). Esse grupo é subdividido em PTLV-1, PTLV-2 e PTLV-3, que incluem HTLV-1, HTLV-2 e HTLV-3, e seus análogos STLV-1, STLV -2 e STLV-3, os quais infectam primatas humanos e não humanos, respectivamente. O grupo PTLV-4 possui apenas o HTLV-4 (Calattini et al. 2005, Wolfe et al. 2005, Switzer et al. 2009, Gessain et al. 2013) (Figura 1). 1.1.1 Vírus linfotrópicos de células T humanas 1 e 2 Esses vírus são classificados na família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae, gênero Deltaretrovirus (ICTV 2013). 1 Figura 1 - Árvore filogenética comparando vírus da leucemia bovina (BLV) e vírus linfotrópico de célula T de primatas (PTLV). Fonte: Thomas et al. (2010) Os vírus linfotrópicos de células T humanas possuem morfologia similar a de outros retrovírus. Suas partículas virais são esféricas com diâmetro que varia de 80 a 100 nanômetros (nm) (Ohtsuki et al. 1982). Essas são constituídas de envelope lipoproteíco, capsídeo icosaédrico e genoma, formado por duas cópias de RNA fita simples (ss RNA) com polaridade positiva. O envelope viral apresenta lipídeos, derivados da membrana da célula hospedeira, e proteínas virais de superfície (SU), transmembrana (TM) e da matriz (MT). O capsídeo (CA) forma o cerne da partícula viral que abriga seu genoma, o qual está associado a proteínas do nucleocapsídeo (NC), incluindo o complexo ribonucleoproteico e as enzimas protease (PR), transcriptase reversa (RT) e integrase (IN) (Poiesz et al. 2003, Van Dooren 2005) (Figura 2). 2 Figura 2 - Representação esquemática da partícula do HTLV (modificada) Fonte: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd08_08.pdf Os genomas do HTLV-1 e HTLV-2 apresentam aproximadamente 70% de identidade nas sequências de nucleotídeos. O genoma do HTLV-1 possui 9032 pares de base (pb) (Seiki et al. 1983), e do HTLV-2 é um pouco menor (8952 pb) (Shimotohno et al. 1985). Os genes codificantes do HTLV-1 e 2 incluem gag, com a função de codificar proteínas do capsídeo e antígenos de grupo específico (MT, CA e NC), pro/pol (protease/polimerase) e env (envelope) (Figura 3). A região denominada pX apresenta quatro fases abertas de leitura (ORFs - Open Reading Frames) para o HTLV-1, e cinco para o HTLV-2, sendo que as ORFs III e IV são as mais estudadas e codificam as proteínas reguladoras rex e tax, respectivamente (Feuer & Green 2005, Nicot et al. 2005). Figura 3 - Representação esquemática do genoma do HTLV (modificada) Fonte: http://gydb.uv.es/element.viewer.php?element=HTLV-2 3 O genoma viral possui, nas extremidades 5’ e 3’, duas regiões denominadas LTR (Long Terminal Repeats), que são sequências terminais repetitivas, as quais desempenham função promotora da integração e regulação da transcrição do genoma proviral, compostas por três regiões denominadas U3, R e U5 (Johnson et al. 2001, Legros et al. 2009, Kannian & Green 2010). O gene gag codifica uma poliproteína precursora com peso molecular de 53 quilodaltons (KDa), que posteriormente é clivada resultando nas proteínas da matriz (p19), capsídeo (p24) e o nucleocapsídeo (p15), que estão envolvidas na montagem e liberação dos vírions (Le Blanc et al. 2001). A região pro, sobreposta entre os genes gag e pol, apresenta uma ORF que codifica a protease viral (p14) (Hiramatsu et al. 1987, Nam et al. 1988). Essa enzima cliva a poliproteína gag-pol, resultando nas enzimas transcriptase reversa (p55) e integrase (p32), importantes para a síntese viral (Li et al. 2010). A transcriptase reversa exerce as seguintes funções: (i) atividade de DNA polimerase RNA-dependente, sintetizando o DNA do vírus a partir do RNA de polaridade positiva do genoma viral; (ii) ribonuclease H, que degrada a fita molde de RNA após síntese do DNA; (iii) DNA polimerase DNA- dependente, responsável pela síntese da segunda fita de DNA. Já a integração do DNA viral com o da célula hospedeira é catalisada pela enzima integrase (Katz & Skalka 1994, Katz et al. 2011). A região env codifica duas glicoproteínas do envelope viral: proteína de superfície (gp46) e a transmembrana (gp21) (Le Blanc et al. 2001, Manel et al. 2005). A glicoproteína de superfície é a mais externa, sendo responsável pela adsorção do vírus ao receptor da célula hospedeira. A glicoproteína transmembrana é responsável pela entrada do vírus na célula por fusão do envoltório viral com a membrana celular (Delamarre et al. 1996, Le Blanc et al. 2001, Edwards et al. 2011). Na porção 3’ do genoma viral, encontra-se a região pX, que codifica proteínas regulatórias e acessórias. O Quadro 1 apresenta as proteínas codificadas pelas fases abertas de leitura da região pX do genoma do HTLV-1 e HTLV-2 (Seiki et al. 1982, Ciminale et al. 1995). 4 Quadro 1 – Proteínas codificadas pela região pX HTLV – 1 HTLV - 2 ORF I p12 / p8 p10 ORF II p30 / p13 p28 ORF III p27rex / p21rex p26rex / p24rex ORF IV p40tax P22 / p20 p37tax ORF V p11 No HTLV-1, as proteínas acessórias são sintetizadas a partir das ORFs I e II, dando origem a p12/p8 e p30/p13, respectivamente, por processamentos (splicing) alternativos. Essas proteínas modulam a transcrição gênica, apoptose, ativação e proliferação celular, além da infecciosidade e transmissão viral. Portanto, são capazes de modular vários mecanismos virais e celulares, controlando, assim, as interações vírus-célula (Edwards et al. 2011). As proteínas acessórias p10, p28 e p11 do HTLV-2 são codificadas pelas ORFs-I, II e V, respectivamente. A p28 tem função homóloga da p30 do HTLV- 1, reprimindo a replicação viral pós-transcrição e retendo o mRNA tax/rex no núcleo da célula. Já as proteínas p10 e p11 são codificadas por processamentos duplos do mRNA em quadros de leituras separadas. O papel dessas proteínas pouco se sabe; no entanto, acredita-se que p10 tenha função similar à p12 do HTLV-1, enquanto que p11 se liga a cadeia pesada do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Johnson et al. 2000, Li & Green 2007). As proteínas virais reguladoras tax e rex são codificadas, respectivamente, pelo mRNA subgenômico de processamento duplo das ORFs IV e III da região pX (Azran et al. 2004). Tax é uma fosfoproteína nuclear de 40 e 37 KDa no HTLV-1 e HTLV-2, respectivamente, que interage com elementos localizados na região U3 da LTR proviral ativando ou reprimindo a transcrição dos genes virais. Além de ser essencial para o processo de replicação viral, exerce papel importante na transformação das células infectadas (Azran et al. 2004, Feuer & Green 2005). Rex codifica as proteínas p21 e p27 no HTLV-1, e p24 e p26 no HTLV-2. Essas regulam o processamento dos RNAs mensageiros, ao exportar seletivamente o mRNA gag/pol e env do núcleo para o citoplasma, aumentando a tradução das proteínas estruturais e enzimáticas. Dessa forma, exercem papel fundamental no controle pós-transcricional dos genes virais (Smith & 5 Greene 1991, Azran et al. 2004). A comunidade científica tem mostrado interesse por uma proteína codificada por um mRNA transcrito a partir da fita negativa do genoma proviral, denominada de fator de zíper de leucina básico do HTLV-1 (HBZ) e sua proteina de ligação CBP/p300 (fatores celulares de transcrição). Possui uma base de leucina em zíper (bZIP) que se liga ao DNA, e interage com CREB-2 e sua proteína de ligação CBP/p300 (fatores celulares de transcrição) (Gaudray et al. 2002). Durante o curso da infecção pelo HTLV-1, a expressão dos genes de tax e HBZ é inversamente proporcional, ou seja, a tax ativa a expressão de HBZ, que por sua vez reprimi a de tax, o que favorece a persistência viral (Yasunaga & Matsuoka 2011, Zhao & Matsuoka 2012). Outro fato importante é que a expressão dessa proteína não compromete a sobrevida da célula infectada, podendo ainda promover o aumento da expressão de Foxp3 (fator de transcrição de linfócito T) (Satou et al. 2011). A expressão de HBZ é responsável pela proliferação de células T humanas. Portanto, HBZ é essencial para a contínua expansão de células ATL nas formas aguda e crônica da infecção pelo HTLV-1 (Yasunaga & Matsuoka 2011, Satou et al. 2011). Em relação ao HTLV-2, foi identificada uma proteína denominada APH-2 (proteína antisense do HTLV-2), que também inibe a transcrição mediada por tax. No entanto, sua atividade é mais fraca que a de HBZ, e não foi evidenciada sua capacidade de induzir a proliferação celular (Barbeau et al. 2013, Ciminale et al. 2014). 1.1.2 Replicação viral O HTLV-1 apresenta tropismo por células linfóides T periféricas, envolvendo linfócitos T CD4+ e CD8+, monócitos e células dendríticas, enquanto que o HTLV-2 por linfócitos TCD8+. A replicação viral depende da interação de glicoproteínas do envelope viral, a gp46, com o receptor celular, enquanto a gp21 promove a fusão do envelope viral à membrana da célula-alvo. Os receptores celulares incluem o transportador de glicose 1 (GLUT-1), neuropilina 1 (NRP-1) e proteoglicanos de superfície heparan-sulfato (HSPGs), sendo o último apenas para o HTLV-1 (Gessain 2004, Manel et al. 2005). Após a fusão do envelope viral com a membrana celular, há penetração do nucleocapsídeo no citoplasma da célula e a liberação do RNA viral. Sequencialmente, ocorre a transcrição reversa do genoma viral de RNA para DNA, pela enzima transcriptase reversa. Em seguida, o DNA viral é transportado para o núcleo da célula hospedeira, sendo integrado no 6 cromossomo da célula hospedeira, pela proteína integrase, formando o provírus (Figura 4) (Gessain 2004, Manel et al. 2004). Após a integração do genoma viral, há transcrição, com a síntese do RNA viral utilizando o DNA proviral como molde, formando os RNA mensageiros (mRNAs). O mRNA genômico, correspondente ao genoma completo, codifica os produtos dos genes gag e pol, enquanto o mRNA subgenômico, após o processamento (splicing) simples, codifica as proteínas do envelope, e o terceiro mRNA, após processamento duplo, origina as proteínas regulatórias/acessórias codificadas pela região pX (Smith & Greene 1991). Assim, os mRNAs servem como molde para síntese de proteínas virais estruturais, enzimáticas e regulatórias. Durante a maturação, ocorre o processamento das proteínas do capsídeo e do envoltório viral, e a formação das partículas virais. Essas emergem da superfície celular por brotamento, carregando consigo parte da bicamada lipídica da membrana celular, modificada pelas proteínas de superfície do virus, como constituinte do seu envelope (Goff 2001, Manel et al. 2004). Figura 4 - Representação esquemática do ciclo de replicação do HTLV (modificada) Fonte: Brasil (1998) 1.1.3 Variabilidade genética O HTLV apresenta alta estabilidade genética quando comparado a outros retrovírus. Sua 7 taxa de evolução é em torno de 3,44 x 10-7 e 6, 55 x 10-7 substituições de nucleotídeos por sítio por ano para env e LTR, respectivamente (Van Dooren et al. 2004, Lemey et al. 2005). Estudos relacionam a estabilidade genética do virus à estratégia de replicação viral. Além disso, tem sido demonstrada uma associação entre o polimorfismo genético do HTLV e sua origem/ migração geográfica (Van Dooren et al. 2004, Lemey et al. 2005). Análises do genoma proviral mostram que as regiões LTR e env do HTLV-1 apresentam maior variabilidade quando comparadas às regiões gag e pol. Por essa razão, as sequências LTR são preferidas para a caracterização genética dos subtipos virais (Komurian-Pradel et al. 1992, Miura et al.1994, Santos & Lima 2005). Estudos com base na análise filogenética da região LTR classificaram o HTLV-1 em sete subtipos, denominados de a-g (Figura 5), cujas sequências variam entre 2 e 8% (Hahn et al. 1984, Gessain et al. 1991, Bastian et al. 1993, Miura et al. 1994, Vandamme et al. 1994, Chen et al. 1995, Mahieux et al. 1997, Miura et al. 1997, Salemi et al. 1998, Cassar et al. 2005, Rego et al. 2008). O subtipo 1a pode ainda ser classificado em cinco subgrupos (A, B, C, D e E), de acordo com a localização geográfica. Com a descoberta de tais variantes, estudos moleculares foram realizados a fim de aprofundar o conhecimento sobre a origem e evolução do HTLV-1, possibilitando, assim, a comparação de sequências provenientes de várias áreas do mundo (Cassar et al. 2005). O HTLV-2 é classificado em três subtipos denominados HTLV-2a (variante 2a/c), HTLV-2b e HTLV-2d (Figura 5), com base na análise filogenética da região LTR (Eiraku et al. 1995, Salemi et al. 1996, Vandamme et al. 1998, Lewis et al. 2000). 8 Figura 5 - Classificação dos subtipos do HTLV-1 e HTLV-2 (modificada) Fonte: Cadernos Hemominas - HTLV (2006) 1.1.4 Distribuição dos subtipos do HTLV-1 Cinco dos sete subtipos do HTLV-1 são provenientes da África: HTLV-1b, 1d, 1e, 1f e 1g (Verdonck et al. 2007). HTLV-1a é o único subtipo que se tornou cosmopolita (Miura et al. 1994, 1997). HTLV-1b circula na África Central (Vandamme et al. 1994). HTLV-1c, ou Melanésio, é endêmico em Papua Nova Guiné e aborígenes da Austrália (Bastian et al. 1993, Cassar et al. 2007). HTLV-1d foi isolado em pigmeus de Camarões e somente em um indivíduo do Gabão (Mahieux et al. 1997). HTLV-1e foi descrito na República Democrática do Congo. HTLV-1f foi identificado em um indivíduo do Gabão (Salemi et al. 1998), e o HTLV-1g na África Central (Wolfe et al. 2005). Os cinco subgrupos do subtipo Cosmopolita (HTLV-1a) apresentam distribuição geográfica distinta, isto é, A, ou Transcontinental, é encontrado em quase todo o mundo; B (ou Japonês) é endêmico no Japão e em áreas isoladas da América do Sul; C está presente no oeste da África, Caribe e Guiana Francesa; D circula no norte da África (Miura et al. 1994), enquanto E, em afrodescendentes do Peru (Van Dooren et al. 1998). No Brasil, o subtipo Cosmopolita, subgrupo A, Transcontinental foi identificado em isolados provenientes das cinco regiões geográficas (Laurentino et al. 2005, Alcantara et al. 2006, Kashima et al. 2006, Vallinoto et al. 2006, de Queiroz et al. 2007, Mota et al. 2007, de 9 Almeida Rego et al. 2008, 2010, Magalhães et al. 2008, Mota-Miranda et al. 2008, Santos et al. 2009, Martins et al. 2010, Magri et al. 2012, de Oliveira et al. 2012, Souza 2012, Kozlowski 2013, Pessôa et al. 2014). Por outro lado, o subgrupo B foi raramente detectado em isolados de imigrantes japoneses (Vallinoto et al. 2004, Kashima et al. 2006, Pessôa et al. 2014). 1.1.5 Distribuição dos subtipos do HTLV-2 O HTLV-2 é considerado um vírus ancestral nas Américas. Os subtipos a e b são encontrados na América do Norte e Europa em populações urbanas, como usuários de drogas injetáveis (UDI), e também em ameríndios de norte a sul do continente (Salemi et al. 1996, Abad et al. 2011, Treviño et al. 2012). O subtipo HTLV-2d foi isolado em um pigmeu da República Democrática do Congo (Vandamme et al. 1998). No Brasil, o subtipo predominante é o HTLV-2a (variante 2a/c), que foi primeiramente identificado em populações indígenas da Amazônia, e depois em urbanas das cinco regiões geográficas, como UDI e pacientes HIV soropositivos (Lewis et al. 2000, Ishak et al. 2001, Shindo et al. 2002, Vallinoto et al. 2002, Alcantara et al. 2003, Kleine Neto et al. 2009, Santos et al. 2009, de Almeida Rego et al. 2010, Magri et al. 2010, 2013, de Oliveira et al. 2012, Kozlowski 2013, Barreto et al. 2014). O subtipo b foi inicialmente encontrado na Região Sul (Renner et al. 2006, Morimoto et al. 2007) e, posteriormente, na Regiões Sudeste (São Paulo) e Norte (Belém do Pará) (Novoa et al. 2007, Santos et al. 2009). 1.2 Aspectos Clínicos O HTLV-1 está etiologicamente ligado a doenças graves como a leucemia/linfoma de células T do adulto e mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Esse vírus causa infecções que persistem ao longo da vida, porém a maioria dos indivíduos permanece assintomática, e somente 5% desenvolvem tais doenças (Gonçalves et al. 2010). Várias outras patologias têm sido associadas ao HTLV-1, incluindo manifestações dermatológicas, oftalmológicas, reumatológicas, endocrinológicas, urológicas e gastrointestinais, sendo as mais estudadas as neurológicas e as hematológicas (Carneiro-Proietti et al. 2002, Verdonck et al. 2007). O HTLV-2 tem sido associado com síndrome similar à HAM/TSP (Barbeau et al. 2014), além do aumento da incidência de doenças respiratórias, como pneumonia e bronquite, e de 10 condições inflamatórias como artrite (Roucoux & Murphy 2004). No entanto, essas associações ainda são controversas e muito discutidas. Os indivíduos infectados pelo HTLV-1 que desenvolvem ATL permanecem por um longo período em latência clínica. Assim, essa leucemia geralmente ocorre em idade adulta, em média de 20 a 30 anos após a infecção (Proietti et al. 2005). A ocorrência da ATL parece estar associada a transmissão vertical, principalmente, pelo aleitamento materno prolongado (Proietti et al. 2005, Sonoda et al. 2011). A ATL foi inicialmente classificada em quatro tipos, baseados no tempo de evolução, na extensão da doença, incluindo alterações linfocitárias e bioquímicas (Shimoyama 1991). A forma aguda, ou fulminante da doença, apresenta linfócitos circulantes anormais e células em forma de flor, com infiltração de linfonodos e vísceras, além de manifestações tumorais. A linfomatosa é semelhante ao linfoma com a ausência de células malignas circulantes. Essas duas formas são consideradas mais graves ou agressivas, apresentando pior prognóstico. Por outro lado, as formas crônica e latente apresentam melhor prognóstico; contudo, podem evoluir para a forma aguda. Os sintomas são geralmente inespecíficos, tais como: pápulas, placas, tumores ou eritrodermia de longa duração (Brasil 2006, Bittencourt & Farré 2008). Bittencourt et al. (2007) propuseram uma quinta categoria, tipo tumoral cutâneo primário, o qual se caracteriza por ausência de linfadenomegalia, linfocitose, hipercalcemia leucêmica e envolvimento de órgãos internos; no entanto, apresenta pior prognóstico quando comparado com as formas crônica e latente. A paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 é a doença neurológica mais frequente dentre as síndromes associadas a esse vírus. Essa doença foi reconhecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS), em 1988, como uma doença de evolução lenta e progressiva, caracterizada por acometimento insidioso e progressivo de fraqueza muscular nos membros inferiores e espasticidade associada em grau variado a distúrbios esfincterianos e sensitivos (Martins et al. 2012). Menos de 5% dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 desenvolvem HAM/TSP décadas após a exposição ao vírus (Montanheiro et al. 2005, Grassi et al. 2011). Essa doença apresenta uma prevalência três vezes maior em mulheres do que em homens. Estudos revelam que pode estar associada à presença de hormônios feminios em níveis elevados, ou evolução clínica mais rápida da doença (Levin & Jacobson 1997, Gotuzzo et al. 2004, Lima et al. 2005). Os mecanismos pelos quais os portadores assitomáticos desenvolvem a doença ainda 11 não estão bem esclarecidos. No entanto, estudos propõem que a expressão de uma única sequência pX do genoma proviral possa contribuir para tal. A região pX, ao codificar Tax, pode iniciar um processo de ativação das células T (CD4+ e CD8+) e a proliferação por eventos subsequentes, levando a danos no sistema nervoso central (HAM/TSP), ou transformação maligna resultante em ATL (Tendler et al. 1990, Marsh 1996, Levin & Jacobson 1997). O fator HBZ é indispensável para o desenvolvimento de ATL, sendo reconhecido nas células leucêmicas de pacientes com leucemia de células T do adulto, podendo induzir a imortalização de linfócitos T primários (Matsuoka & Green 2009). O HBZ é essencial para a manutenção da oncogênese, enquanto a tax contribui para o crescimento celular, ao provocar a instabilidade genética. O HBZ promove a proliferação de células T infectadas pelo HTLV-1 implicando, assim, na patogênese de HAM/TSP. Com isso, essa proteína pode ser alvo para terapia de ATL e HAM/TSP (Matsuoka & Green 2009). 1.3 Diagnóstico Laboratorial O diagnóstico da infecção pelo HTLV-1/2 inclui testes de triagem (ensaio imunoenzimático ou aglutinação em partículas de látex) e confirmatórios (western blot e reação em cadeia pela polimerase/polymerase chain reaction – PCR). Esses últimos possibilitam a diferenciação da infecção por HTLV-1 e HTLV-2 (Williams et al. 2000, Gessain 2011). O ensaio imunoenzimático (ELISA - enzyme linked immunosorbent assay) é o teste mais utilizado na triagem sorológica. Sua sensibilidade é de até 98,6% para ensaios de terceira geração (testes com antígenos recombinantes), e especificidade maior que 92,9% para detecção de HTLV-1/2, porém não ocorre a distinção da infecção por HTLV-1 ou HTLV-2 (Jacob et al. 2007, 2009). Apesar do aumento da especificidade e sensibilidade do teste, as infecções recentes podem não ser identificadas, uma vez que a quantidade de anticorpos específicos nem sempre é suficiente para sua detecção (Santos & Lima 2005, Berini et al. 2008). O ELISA é o teste de escolha na triagem sorológica do HTLV em bancos de sangue de todo o País. A Figura 6 apresenta o fluxograma para o diagnótico laboratorial preconizado pelo Ministerio da Saúde (Brasil 2004). 12 Figura 6 - Fluxograma para diagnóstico laboratorial do HTLV-1 e 2 Fonte: Brasil (2004) As reações de aglutinação são ensaios sorológicos, caracterizados pela presença de partículas de gelatina ou látex sensibilizadas com antígenos inativados, capazes de se aglutinarem na presença de anticorpos específicos presentes no soro ou plasma. Esses testes são de rápida e fácil execução, e apresentam sensibilidade alta (Brasil 2004, Satake et al. 2012). A confirmação da positividade pode ser realizada por western blot (WB), imunofluorescência indireta (IFA) e ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA), considerados testes sorológicos confirmatórios, sendo o WB o mais utilizado. Esse teste consiste na detecção de anticorpos específicos no soro ou plasma, com capacidade de diferenciar o HTLV-1 e HTLV-2. Como apresenta alta sensibilidade para detectar anticorpos contra epítopos recombinantes e uma frequência menor de reações inespecíficas, reduz a possibilidade de resultados falso-positivos (Santos & Lima 2005, Costa et al. 2011). No entanto, resultados indeterminados podem ocorrer, sendo necessária a utilização de testes moleculares (Thorstensson et al. 2002, Abrams et al. 2011). Os testes moleculares detectam o DNA proviral extraído de células do sangue periférico, uma vez que há pequena circulação de RNA do vírus no plasma. As sequências específicas do 13 DNA, selecionadas por iniciadores, são amplificadas exponencialmente pela reação em cadeia pela polimerase. A PCR tem se tornado o método de referência para o diagnóstico da infecção pelo HTLV. Apresenta maior sensibilidade e especificidade do que os métodos sorológicos, caracterizando as amostras não tipadas por western blot, sendo, portanto, capaz de confirmar e descriminar os dois tipos virais, além de permitir o diagnóstico da transmissão vertical (Brasil 2004, Costa et al. 2011, Gessain 2011). Mais recente foi descrita a PCR em tempo real. A mesma utiliza sondas ou corantes luminescentes, os quais se ligam a dupla fita de DNA, detectando o produto da PCR durante sua síntese. Assim, é capaz de detectar o DNA do HTLV e quantificar o número de cópias presente na amostra, dado importante no prognóstico de doenças associadas ao HTLV (Grassi et al. 2011). O sequenciamento de nucleotídeos e a análise filogenética do genoma viral, ou das regiões LTR e env, são importantes na investigação molecular da infecção, tendo em vista a elucidação dos mecanismos de transmissão e variabilidade do HTLV-1 e HTLV-2, identificando os subtipos virais circulantes (Sonoda et al. 2011). 1.4 Epidemiologia 1.4.1 Transmissão Os mecanismos de transmissão do HTLV-1 e 2 são semelhantes, incluindo as vias vertical, sexual e parenteral. A transfusão de sangue é um modo eficaz de transmissão do HTLV-1/2 por infusão de componentes celulares contaminados, nos países onde a triagem para esses vírus ainda não foi implantada nos bancos de sangue (Caderno Hemominas, 2006). No Brasil, a triagem para HTLV1-2, tornou-se obrigatória nos bancos de sangue por meio da portaria n 1376 de 19 de novembro de 1993, do Ministério da Saúde (Brasil 1993). Armazenamento de concentrados de hemácias e plasmas a baixa temperatura pode diminuir o risco de transmissão, presumivelmente devido à morte dos linfócitos infectados pelo HTLV-1. A transmissão parenteral ocorre também pelo compartilhamento de agulhas e seringas contaminadas entre usuários de drogas injetáveis (Gonçalves et al. 2010, Pique & Jones, 2012). A transmissão vertical, da mãe para o filho, ocorre principalmente pelo aleitamento materno. A sua eficiência depende da duração do aleitamento, da concordância de HLA tipo I 14 entre mãe e filho e da carga proviral. Estima-se em torno de 20% a taxa de transmissão vertical. Outras formas de transmissão da mãe para o filho, incluindo a transplacentária ou durante o parto, podem ocorrer, embora sejam menos importantes (Fujino & Nagata 2000, Bittencourt et al. 2002, Gonçalves et al. 2010). A transmissão sexual do HTLV-1 é mais eficaz do homem para a mulher em cerca de quatro vezes, probabilidade associada à quantidade de linfócitos infectados e viáveis liberados durante a ejaculação. As doenças sexualmente transmissíveis (DSTs), sexo desprotegido, múltiplos parceiros sexuais, presença de úlceras genitais e relacionamento com parceiro HTLV positivo são fatores que podem aumentar a eficácia da transmissão (Gonçalves et al. 2010, Lairmore et al. 2011). A transmissão intrafamiliar do HTLV-1 e 2 pode ocorer, tanto por via vertical, quanto sexual. O vírus pode ser transmitido de geração em geração e perpetuar, assim, por várias gerações, se não for implantado medidas que bloqueiam a sua transmissão (Catalan-Soares et al. 2005a, Martins et al.2010, da Costa et al. 2013, Carneiro-Proietti et al. 2014, Mello et al. 2014). 1.4.2 Prevalência Gessain & Cassar (2012) estimaram um total de 4,5 a 9,3 milhões de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e mostraram a distribuição dos principais focos dessa infecção (Figura 7). Figura 7 - Distribuição dos principais focos de infecção pelo HTLV-1 (modificada) Fonte: Gessain & Cassar (2012) 15 A infecção pelo HTLV-1 e 2 encontra-se presente em todas as regiões brasileiras, mas as taxas de prevalência divergem de um estado para outro, sendo mais elevadas na Bahia, Pernambuco e Pará (Carneiro-Proietti et al. 2002). A soroprevalência varia de acordo com as características sociodemográficas da população e os comportamentos de risco (Proietti et al. 2005, Lima et al. 2010, Pinto et al. 2012). Em doadores de sangue, taxas de 0,04% a 1% para HTLV-1/2 foram estimadas, sendo superiores nas Regiões Norte e Nordeste, e inferiores no Sul do Brasil (Figura 8). No Estado do Piauí, um índice de 0,21% foi encontrado (Catalan-Soares et al. 2005b). Dados de outros estudos realizados em doadores de sangue no País, nos últimos 10 anos, são apresentados no Quadro 2. Figura 8 - Taxas de prevalência do anti-HTLV-1/2 (a cada 1.000 doações) em doadores de sangue das capitais de 26 Estados e do Distrito Federal do Brasil Fonte: Catalan-Soares et al. (2005b) 16 Quadro 2 - Estudos de prevalência do HTLV-1 e 2 em doadores de sangue no Brasil, 20032014 Referência Região Norte Colin et al. (2003) Mota-Miranda et al. (2008 ) Região Nordeste Viana et al. (2014) Souza et al. (2003) Gomes & Euleotério Júnior et al. (2011) Carneiro-Proeitti et al. (2012) Lima et al. (2013) Mota et al. (2006) Região Centro-Oeste Kozlowski (2013) Região Sudeste Namen-Lopes et al. (2009 ) Dias-Bastos et al. (2010) Carneiro-Proeitti et al. (2012) Lima et al. (2010) Goncalez et al. (2006) Carneiro-Proeitti et al. (2012) Pinto et al. (2012) Região Sul Garcia (2010) Borelli et al. (2013) Maresch et al. (2008) 1.5 Local N HTLV-1/2 (%) HTLV-1 (%) HTLV-2 (%) Rio Branco Rio Branco 11.121 219 0,11 0,46 0,07 0,46 0,02 Maranhão Ceará Ceará 365.564 264.593 679.610 0,15 0,66 0,02 0,02 0,005 Recife Caruarú Salvador 89.371 61.881 104.835 0,21 0,05 0,48 Goiânia 0,13 Minas Gerais Minas Gerais Minas Gerais Uberaba São Paulo São Paulo Ribeirão Preto 422.600 3.249.944 62.207 147.489 1.600 125.182 301.407 0,11 0,14 0,08 0,31 0,13 0,10 0,10 0,11 0,001 Porto Alegre Maringá Santa Catarina 197.032 8.337 68.701 0,10 0,04 0,04 0,08 0,02 Prevenção e Controle Em virtude da gravidade das doenças associadas ao HTLV-1 e HTLV-2, essas infecções devem ser consideradas como um problema de saúde pública, onde as ações de intervenção se estendam além das diretrizes e acordos firmados entre os governos, incluindo esforços envolvendo educadores em saúde, profissionais de saúde, hemocentros, organizações nacionais e internacionais (Proietti et al. 2005, Gonçalves et al. 2010). Até o momento, não existe vacina contra o HTLV-1/2. O desenvolvimento de um imunobiológico contra a infecção ainda enfrenta obstáculos, porém a baixa variabilidade genômica e a presença de anticorpos neutralizantes em indivíduos infectados apresentam-se como principais pontos favoráveis para elaboração de uma vacina que possa prevenir e controlar a infecção por esses vírus (Verdonk et al. 2007). A triagem para o HTLV-1/2 nos bancos de sangue consiste em uma medida importante na prevenção da infecção em vários países (Gonçalves et al. 2010). O primeiro país a implantar 17 essa triagem foi o Japão em 1986, apresentando uma considerável diminuição da prevalência, seguido dos Estados Unidos, em 1989, e de outros países (Gonçalves et al. 2010, Satake et al. 2012). No Brasil, em novembro de 1993, tornou-se obrigatória a triagem para o HTLV-1/2 em todos os bancos de sangue do território nacional, o que resultou uma queda na prevalência global (Brasil 1993, Dias-Bastos et al. 2010). Ainda no sentido de prevenir a transmissão parenteral dessas infecções, os usuários de drogas injetáveis devem ser aconselhados sobre medidas de redução de danos, como o não compartilhamento de agulhas e seringas (Gonçalves et al. 2010). A prevenção da transmissão sexual do HTLV-1 e 2 apresenta também desafios, uma vez que envolve mudanças de comportamentos, como uso regular do preservativo e redução do número de parceiros sexuais (Roucoux & Murphy 2004, Gonçalves et al. 2010). A triagem pré-natal deve ser realizada em áreas geográficas específicas, associada ao aconselhamento das gestantes soropositivas para suspensão ou redução do tempo de amamentação (Carneiro-Proietti et al. 2002, Mylonas et al. 2010). Devido ao risco de desnutrição nos países em desenvolvimento, políticas públicas de saúde devem ser adotadas a fim de recomendar fórmula de alimentação alternativa para as crianças em risco de adquirir o HTLV-1 e 2 pelo leite materno. Recomenda-se também o parto cesário para minimizar o risco de transmissão perinatal (Carneiro-Proietti et al. 2002, Gonçalves et al. 2010, Hino 2011). No Brasil, o Programa de Proteção à Gestante tem sido implantado em alguns estados brasileiros como em Mato Grosso do Sul, Goiás e Alagoas, com a finalidade de acompanhar as soropositivas, como também orientá-las para evitar a transmissão vertical (Dal Fabbro et al. 2008, Gomes Filho et al. 2009). 18 2. JUSTIFICATIVA As investigações sobre a infecção pelo HTLV-1 são importantes, tendo em vista que esse vírus causa doenças graves como a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espática tropical e a leucemia/linfoma de células T do adulto, além de outras doenças/síndromes incluindo dermatite associada ao HTLV-1, lesões oculares, artropatia e poliomiosite (Lairmore et al. 2012). O estudo sobre o HTLV-2 também é relevante uma vez que o mesmo tem sido associado a casos de mielopatia que se assemelha a HAM/TSP (Barbeau et al. 2014), além de outras manifestações clínicas como pneumonia, bronquite e infecções do trato urinário, embora tais associações devam ser melhor investigadas (Murphy et al. 2004). O Brasil é o país com maior número absoluto de casos de infecção pelo HTLV-1 (Proietti et al 2005), com taxas altas de prevalência dessa infecção em alguns estados da Região Nordeste (Dourado et al. 2003, Catalan-Soares et al. 2005b), bem como já foi demonstrada a circulação do HTLV-2 nessa região (Santos et al. 2009, de Almeida Rego et al. 2010, de Oliveira et al. 2012). Contudo, ainda são escassos os estudos sobre as infecções pelo HTLV-1 e 2 no Piauí (de Oliveira et al. 2012). Assim, esta tese é de suma importância, uma vez que ampliará o conhecimento epidemiológico sobre as infecções pelo HTLV-1 e 2 em primodoadores e seus familiares no Piauí, ao estimar a prevalência e caracterizar os isolados virais, possibilitando elucidar os possíveis mecanismos envolvidos na disseminação desses vírus. Acredita-se que o desenvolvimento da mesma possibilitará o direcionamento de políticas na rede pública estadual de hemoterapia com ênfase na melhoria da qualidade do sangue doado. Além disso, poderá fornecer subsídios para nortear ações educativas e efetivas no acompanhamento/aconselhamento especializado dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 e/ou 2, visando uma melhor qualidade de vida dos doadores de sangue e seus familiares. 19 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Investigar os aspectos soroepidemiológicos e moleculares da infecção pelo HTLV-1 e 2 em primodoadores de sangue e seus familiares no Estado do Piauí. 3.2 Objetivos Específicos Estimar a prevalência da infecção pelo HTLV-1 e 2 em primodoadores de sangue no Estado do Piauí (HEMOPI); Verificar as características de risco para infecção pelo HTLV-1 e 2 relatadas pelos portadores desses vírus; Identificar os subtipos virais circulantes na população estudada; Investigar a ocorrência de transmissão intrafamiliar do HTLV-1 e 2. 20 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Delineamento Estudo de corte transversal incluindo dois grupos populacionais: (i) primodoadores de sangue no Estado do Piauí e (ii) familiares dos primodoadores HTLV-1/2 soropositivos. 4.2 População Estudada 4.2.1 Grupo 1 – Primodoadores de sangue no Estado do Piauí No período de agosto/2011 a julho/2012, foram triados 37.306 candidatos a primeira doação de sangue (primodoadores) no Centro de Hematologia e Hemoterapia do Estado do Piauí (HEMOPI). Destes, 9.110 eram do Hemocentro de Teresina e os demais do interior do Estado, correspondendo ao total de primodoadores de sangue da rede pública estadual de hemoterapia, no período do estudo. Convém ressaltar que a triagem sorológica foi realizada no Hemocentro da Capital (Teresina), incluindo as amostras (soros) dos primodoadores dos três Hemonúcleos localizados nas cidades de Parnaíba, Picos e Floriano. Após a realização do primeiro teste sorológico para HTLV, o setor de assistência social do HEMOPI entrou em contato com os primodoadores anti-HTLV-1/2 reagentes (n=48), por telefone ou carta (protocolo da instituição nos casos de sorologia positiva ou inconclusiva), para agendamento da segunda coleta de sangue, além da entrevista para esta investigação. Todos os convocados compareceram no HEMOPI, não havendo, portanto, recusa para participação do estudo. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual do Piauí (UESPI) e pela Comissão de Ética em Pesquisa do HEMOPI. 4.2.2 Grupo 2 - Familiares dos primodoadores HTLV-1/2 soropositivos Os familiares dos primodoadores de sangue com sorologia positiva para HTLV1/2 foram contactados por telefone, quando se procedeu ao convite para participar do estudo, bem como o agendamento da data e horário da entrevista/coleta de sangue em suas residências. 21 4.3 Entrevista e Coleta de Sangue Os primodoadores anti-HTLV-1/2 soro reagentes na triagem (ELISA) e seus familiares foram recrutados para participarem do estudo. Após esclarecimentos sobre os objetivos e procedimentos da investigação e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), foi aplicado um questionário padronizado para a obtenção de dados demográficos e de risco para infecção pelo HTLV [história e tempo de amamentação, números de parceiros sexuais, não uso/uso irregular de preservativo, relato de doença sexualmente transmissível (DST), antecedente de transfusão de sangue e uso de drogas injetáveis]. Após realização de cada entrevista, procedeu-se a coleta de aproximadamente 10 mL de sangue, utilizando seringa e agulha descartáveis. O sangue foi colocado em dois tubos de ensaio identificados com o número do questionário, um com anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e outro sem, para obtenção de sangue total e soro, respectivamente. As amostras foram armazenadas e estocadas a -20ºC no laboratório do HEMOPI até serem transportadas para o Laboratório de Virologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG). Todas as alíquotas (soro e sangue total) foram mantidas a -20ºC até a realização dos testes sorológicos e moleculares. Para verificar a ocorrência de coinfecções pelo HTLV e vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV), os resultados sorológicos dos primodoadores de sangue foram obtidos no HEMOPI. 4.4 Testes Sorológicos 4.4.1 Ensaio imunoenzimático (ELISA) As amostras de soro dos primodoadores e dos seus familiares foram testadas por ELISA qualitativo de terceira geração no Laboratório de Virologia do IPTSP, utilizando reagentes comerciais (Murex HTLV-I+II GE80/81, Murex Biotech Limited, UK). Resumidamente, o teste foi executado em microplacas revestidas com peptídeos sintéticos das regiões imunodominantes do envelope do HTLV-1 e 2 e uma proteína transmembrana recombinante do HTLV-2, onde foram incubados os soros dos pacientes e os controles (positivo e negativo). Após a lavagem da placa, foi realizada nova incubação com o conjugado, que consistiu em uma mistura dos mesmos peptídeos fixados previamente na placa acrescidos da proteína transmembrana do HTLV-1, ambos marcados com 22 peroxidase de rábano. O conjugado não fixado na placa foi removido com a segunda lavagem. Uma solução de 3,3’,5,5’- tetrametilbenzidina (TMB) e peróxido de hidrogênio foi adicionada a todas as câmaras da placa. Após incubação, uma solução de ácido sulfúrico foi acrescida também a todas as câmaras. A leitura espectofotométrica da absorbância foi feita em 450 nm, conforme instrução do fabricante. O cálculo do cut-off foi obtido pela média das absorbâncias dos controles negativos somado 0,2. Após análise dos critérios de validação e controle de qualidade, foram consideradas positivas as amostras que obtiveram leitura superior a 10% do valor do cut-off, indeterminadas aquelas com leitura no intervalo de 10% acima ou abaixo do valor do cut-off e negativas as amostras com leitura inferior a 10% do valor do cut-off. 4.4.2 Line immunoassay (LIA) As amostras de soro reagentes por ELISA foram testadas pelo ensaio confirmatório line immunoassay (LIA), empregando-se reagentes comerciais (INNO-LIA HTLV I/II, Innogenetics, Belgium). Esse ensaio utiliza fitas individuais de nylon contendo proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos das regiões gag (p19 I/II, p24 I/II) e env (gp46 I/II, gp21 I/II) do HTLV-1 e 2, para confirmar e diferenciar a reatividade para os vírus. As amostras e controles foram adicionados às fitas re-hidratadas com solução tampão. Após incubação, procedeu-se a lavagem de cada tira e a adição do conjugado (anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado à fosfatase alcalina). Após nova incubação e lavagem, foi adicionado o substrato (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/BCIP e azul de nitrotetrazólio/NBT) e, sob agitação, observou-se o aparecimento de bandas nas tiras reagentes. A reação foi interrompida pela remoção do substrato, seguida de incubação com a solução de parada. Logo após, a referida solução foi aspirada e as fitas secas. Os resultados foram interpretados conforme as instruções do fabricante. A diferenciação da infecção pelo HTLV-1 e 2 foi feita por meio da reatividade aos antígenos específicos para HTLV-1 (gag p19-I, env gp46-I) e HTLV-2 (env gp46-II). 4.5 Testes Moleculares 4.5.1 Extração de DNA As amostras de sangue total, correspondentes aos soros reagentes pelo ELISA, foram submetidas à extração de DNA proviral, utilizando reagentes comerciais (QIAamp 23 DNA Blood Mini Kit) (QIAGEN), seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante, exceto o dobro de volume de sangue total e a metade do volume recomendado para eluição do DNA, afim de maximizar a detecção do DNA viral. Resumidamente, as amostras de sangue total foram adicionadas nos tubos contendo proteinase K e tampão de lise e, em seguida, os tubos foram homogeneizados e incubados por uma hora. Logo após, adicionou-se etanol absoluto aos tubos, que foram novamente homogeneizados e centrifugados brevemente. A solução foi transferida para uma coluna de captura de DNA, com uma base para reter o líquido após a centrifugação. Posteriormente, desprezou-se o líquido e trocou-se a base por uma nova, procedendo-se duas lavagens, acrescentando-se, sobre a coluna de captura, tampão de lavagem 1 e 2, separadamente, seguidas de centrifugação em ambas as etapas. Ao DNA retido na coluna, foi adicionado tampão de eluição, com posterior incubação em temperatura ambiente e centrifugação, finalmente o produto obtido foi armazenado a - 20ºC. 4.5.2 Nested-PCR O DNA obtido na extração foi amplificado por nested-PCR, utilizando iniciadores genéricos (região tax) do HTLV (Quadro 3). Quadro 3 - Iniciadores genéricos para a região tax do HTLV (Wolfe et al. 2005) Sentido Localização Sequência 5’-3’ Ptlvpt Sense 7481-7505 TYACCTRGGACCCCATCGATGGACG Pgtaxr1 Antisense 8116-8138 GAIGAYTGIASTACYAAAGATGGCTG Ph2REV Sense 7530-7553 CCTTATCCCTCGICTCCCCTCCTT Pgtaxr2 Antisense 8108-8086 PCR-2 PCR-1 Iniciadores TTIGGGYAIGGICCGGAAATCAT Posteriormente, novas amplificações por nested-PCR foram realizadas, para diferenciação do HTLV-1 e 2, utilizando iniciadores específicos para as regiões tax (Quadro 4) e LTR (Quadro 5) do HTLV-1, e da região LTR do HTLV-2 (Quadro 6). 24 Quadro 4 - Iniciadores específicos para a região tax do HTLV-1 (Furukawa et al. 2000) Sentido Localização Sequência 5’-3’ Taxhtlv1f2 Sense 7297-7316 ATACAAAGTTAACCATGCTT Taxhtlv1r1 Antisense 8470-8490 TGAGCTTATGATTTGTCTTCA Taxhtlv1f1 Sense 7280-7299 TCGAAACAGCCCTGCAGATA Taxhtlv1r2 Antisense 8397-8416 AGACGTCAGAGCCTTAGTCT PCR-2 PCR-1 Iniciadores Quadro 5 - Iniciadores específicos para a região LTR do HTLV-1 (Liu et al. 1994) Sentido Localização Sequência 5’-3’ Hfl1 Sense 24-39 GACAATGACCATGAGC Hfl6 Antisense 881-901 GTTAAGCCAGTGATGAGCGGC Hfl9 Sense 124-144 AAGGCTCTGACGTCTCCCCCC Hfl10 Antisense 779-796 TCCCGGACGAGCCCCCAA PCR-2 PCR-1 Iniciadores Quadro 6 - Iniciadores específicos para a região LTR do HTLV-2 (Eirakuet al. 1996) Sentido Localização Sequência 5’-3’ 3ltr2FE Sense 7911 – 7929 ACTTCTCCCCTATCACTCC 3ltr2RE Antisense 8900 – 8919 GCCTGCCTATAGCAATAGAC 3ltr2F Sense 8068 – 8086 TTCCATCCCTCCTATCTAC 3ltr2R Antisense 8893 – 8911 ATAGCAATAGACCTCTCCC PCR-2 PCR-1 Iniciadores Na primeira PCR, foi feita uma mistura onde foram adicionados 2 µL de cada iniciador externo (Quadros 3 a 6) em uma concentração de 200 ng, 1 µL de dNTP’s (deoxinucleotídeos trifosfatados – 0,4 mM), 10 µL de tampão (1x), 4 µL de MgCl2 (cloreto de magnésio - 2,0 mM), 0,5 µL (2,5 U) de Taq DNA polimerase (Invitrogen, Life Technologies) e 26,5 µL de água UltraPure, totalizando um volume de 46 µL. Em seguida, adicionou-se 4 µL do DNA previamente extraído. Nesta etapa, foram adicionados controles positivos e negativos, os tubos foram colocados em termociclador (Master Cycler Eppendorf AG 22331, Hamburg), com a seguinte programação: 96ºC por 3 minutos, 45 ciclos de 96ºC por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto. 25 Na segunda PCR (PCR-2), 3 µL do produto obtido foi novamente amplificado utilizando iniciadores internos (Quadros 4 a 6), nas mesmas condições descritas acima, exceto pelo acréscimo de 1 µL no volume água UltraPure, e com a seguinte programação: 96ºC por 3 minutos, 40 ciclos de 96ºC por 30 segundos, 55ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto. 4.5.3 Eletroforese em gel de agarose Os produtos da segunda PCR foram misturados ao brometo de etídeo e submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão TAE (Tris-Acetato EDTA). Em seguida, o gel foi observado sob luz ultravioleta (UV) em transiluminador, para visualização dos fragmentos de tamanho esperado, os quais foram comparados com os do controle positivo e marcador de peso molecular (quando necessário), com aproximadamente 556 pares de base (pb) para a região tax do HTLV; 1136 e 672 pb para tax e LTR do HTLV-1; e 843 pb para LTR do HTLV-2. 4.5.4 Purificação do DNA Os produtos da segunda amplificação da região LTR do HTLV-1 e 2 foram purificados utilizando o QIAquick PCR purification kit (QIAGEN), seguindo as instruções do fabricante. Em tubo tipo eppendorf, foi adicionado tampão de captura ao produto da PCR, essa mistura foi transferida para uma coluna de captura fornecida pelo kit. Em seguida, foi centrifugada e o líquido retido descartado, acrescentando-se então à coluna tampão de lavagem, sendo realizada nova centrifugação. Logo após, adicionou-se de 10 a 50 µL do tampão de eluição (volume variável dependendo da intensidade da banda visualizada no gel de agarose) na membrana da coluna, com posterior incubação em temperatura ambiente e centrifugação. O DNA purificado foi armazenado a -20ºC. Após a purificação, o DNA foi quantificado aplicando-se 4 µL de cada produto purificado e do marcador de massa e peso molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen, Life Technologies) em gel de agarose a 2%. A visualização do gel sob luz UV possibilitou comparar a intensidade das bandas e calcular a concentração, permitindo assim, determinar o volume de DNA utilizado no sequenciamento. Foi considerada satisfatória a concentração de 40 a 60 ng/µL de DNA purificado. 26 4.5.5 Sequenciamento e análise filogenética O produto purificado foi sequenciado utilizando-se os iniciadores internos para as regiões LTR específicas do HTLV-1 e 2 e o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Foster City, CA, USA). Em uma placa específica para sequenciamento, foi feita uma mistura empregando-se o reagente Big Dye Terminator, tampão do kit, iniciadores internos utilizados na segunda PCR e água UltraPure até o volume de 10 µL. O produto purificado foi adicionado a essa mistura, e a placa colocada no termociclador com um programa de 25 ciclos: 96ºC por 15 segundos, 50ºC por 10 segundos e 60ºC por 4 minutos. Em seguida, as amostras foram precipitadas utilizando-se isopropanol a 75% e, logo após, centrifugadas tendo o sobrenadante descartado e o sedimento seco (95°C por 2 minutos) em termociclador e, posteriormente, desnaturado (95°C por 5 minutos). O DNA foi então ressuspenso com formamida (HD especial para sequenciamento), e levado ao sequenciador automático ABI 3130 – Applied Biosystems, para a leitura dos eletroferogramas. As sequências obtidas foram analisadas e editadas pelo programa CHROMAS versão 1.45 (Griffith University) e SEQMAN II versão 5.01 (DNASTAR). Posteriormente, foram utilizados os programas Clustal X (Thompson et al. 1997) e BIOEDIT, para alinhamento das mesmas e edição do alinhamento, respectivamente. A análise filogenética foi feita, pelo método de Neighbor-joining, usando o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versão 4.0, com modelo de substituição de nucleotídeos Kimura 2 parâmetros (Tamura et al. 2007), e a robustez dos grupos filogenéticos foi avaliada utilizando bootstrap de 1.000 repetições. Os subtipos do HTLV 1 e 2, foram determinados acrescentando-se sequências de referência representativas dos principais subtipos dos vírus, disponíveis no GenBank. 4.6 Processamento e Análise de Dados Os dados obtidos nas entrevistas, bem como os resultados dos testes sorológicos e moleculares, foram digitados e analisados utilizando o programa estatístico Epiinfo versão 3.5.1, desenvolvido pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Prevalência para o HTLV-1 e 2 foi calculada com intervalo de confiança de 95% (IC 95%). Média de idade com respectivo desvio padrão e frequência das características foram calculados. 27 5. RESULTADOS 5.1 5.1.1 Primodoadores de Sangue (Grupo 1) Características da população estudada Em relação aos dados demográficos dos doadores de sangue estudados, observou-se que a idade variou de 18 a 65 anos, e a distribuição por faixa etária é mostrada na Tabela 1. A maioria era do sexo masculino (60,1%) e solteira (61%). Quase metade da população (46,8%) informou ter de seis a nove anos de escolaridade. Tabela 1 - Características demográficas dos 37.306 primodoadores de sangue estudados no Estado do Piauí, agosto/2011-julho/2012 Característica Idade (anos) < 25 ≥ 25 a < 35 ≥ 35 a < 45 ≥ 45 a < 55 ≥ 55 N % 8.991 13.542 9.625 4.104 1.044 24,1 36,3 25,8 11,0 2,8 Sexo Feminino Masculino 14.512 22.794 39,9 60,1 22.775 13.430 1.101 61,0 36,0 3,0 103 10.230 17.469 9.504 0,3 27,4 46,8 25,5 Estado civil Solteiro Casado/União consensual Viúvo/ Separado Escolaridade (anos) Nenhuma 1-5 6-9 >10 28 5.1.2 Detecção de anticorpos anti-HTLV Inicialmente, as 37.306 amostras de soro dos primodoadores de sangue foram triadas pelo HEMOPI para detecção de anticorpos para HTLV-1/2, sendo 48 reagentes pelo ELISA. Em seguida, a segunda amostra de cada indivíduo soro reagente foi testada novamente por ELISA, e 47 (0,13%) permaneceram como reagentes. Estas amostras foram submetidas ao line immunossay. Vinte e duas amostras (0,06%) foram positivas para antiHTLV-1 e 14 (0,04%) para anti-HTLV-2 (Figura 9 e Tabela 2). Total de primodoadores (n = 37.306) ELISA 1 Amostras reagentes (n = 48) ELISA 2 Amostras reagentes (n = 47) Line immunoassay (LIA) Amostras anti-HTLV 1 positivas (n = 22) Amostras anti-HTLV 2 positivas (n = 14) Amostra indeterminada (n = 1) Amostras negativas (n = 10) Figura 9 – Fluxograma dos testes sorológicos realizados para anti-HTLV 29 Tabela 2 - Prevalência da infecção pelo HTLV-1 e 2 em 37.306 primodoadores de sangue no Estado do Piauí, agosto/2011-julho/2012 Marcadores (Ensaios) Positivo IC 95% N % Anti-HTLV-1/2 (ELISA) 47 0,13 0,09 - 0,17 Anti- HTLV-1 (LIA) 22 0,06 0,04 - 0,09 Anti- HTLV-2 (LIA) 14 0,04 0,02 – 0,06 IC: intervalo de confiança; ELISA: ensaio imunoenzimático; LIA: line immunoassay 5.1.3 Características de risco para infecção pelo HTLV-1 e HTLV-2 Os primodoadores infectados pelo HTLV-1 (Tabela 3) apresentaram idade variando de 23-52 anos, sendo a maioria do sexo feminino (63,6%). Quase todos os indivíduos infectados relataram que foram amamentados (90,9%), sendo que cerca de 70% por mais de seis meses. Além disso, foram referidas as seguintes características de risco: antecedentes de transfusão de sangue (18,2%), sendo esses episódios anteriores a 1993 (antes da triagem para HTLV em bancos de sangue); uso irregular ou não uso de preservativo (90,9%); múltiplos parceiros sexuais (22,7%) e relato de DST (31,8%). Observou-se coinfecção pelo HBV em 4,5% destes doadores. A idade dos primodoadores infectados pelo HTLV-2 variou de 18 a 58 anos (Tabela 3). Este grupo apresentou uma distribuição homogênea em relação ao sexo. Todos relataram ter sido amamentados, sendo que a grande maioria por mais de seis meses (92,8%). Características de risco relacionadas à transmissão sexual, tais como: uso irregular ou não uso de preservativo (78,6%), múltiplos parceiros sexuais (28,6%) e relato de DST (42,9%) foram informadas. História de hemotransfusão também foi mencionada (14,3%; antes de 1993). Verificou-se, ainda, coinfecção pelo HBV (21,4%) e HCV (7,1%). 30 Tabela 3 - Características dos primodoadores infectados pelo HTLV-1 e 2 no Estado do Piauí, agosto/2011-julho/2012 HTLV-1 HTLV-2 37,7 (23-52) 43,8 (18-58) Masculino 36,4% (8/22) 50,0% (7/14) Feminino 63,6% (14/22) 50,0% (7/14) História de amamentação 90,9% (20/22) 100% (14/14) Tempo de amamentação > 6 meses 68,2% (15/22) 92,8% (13/14) Antecedentes de transfusão de sangue 18,2% (4/22) 14,3% (2/14) 0% (0/22) 0% (0/14) Múltiplos parceiros sexuais (>5) 22,7% (5/22) 28,6% (4/14) Uso irregular ou não uso de 90,9% (20/22) 78,6% (11/14) História de DST 31,8% (7/22) 42,9% (6/14) Coinfecção com HBV 4,5% (1/22) 21,4% (3/14) Coinfecção com HCV 0% (0/22) 7,1% (1/14) Coinfecção com HIV 0% (0/22) 0% (0/14) Idade (anos) Média (variação) Sexo % (n/N) Características de risco % (n/N) Uso de drogas injetáveis preservativo DST: doença sexualmente transmissível; HBV: vírus da hepatite B; HCV: vírus da hepatite C; HIV: vírus da imunodeficiência humana 5.1.4 Detecção do DNA proviral e análise filogenética da região LTR do HTLV-1 e HTLV-2 A região LTR do HTLV-1 foi amplificada nas 22 amostras anti-HTLV-1 positivas, sendo todas elas pertencentes ao subtipo Cosmopolita (HTLV-1a) do subgrupo Transcontinental (A) (Figura 10). Foi possível amplificar a região LTR do HTLV-2 em 11/14 (78,6%) amostras antiHTLV-2 positivas. Todos os isolados deste vírus foram caracterizados como pertencente ao subtipo a (HTLV-2a/c) (Figura 11). 31 PI-28 65 DQ471201 Doador de sangue PI-24 PI-40 PI-09 PI-10 PI-45 PI-15 PI-27 DQ005555 IDUSSA PI-11 42 PI-32 GQ443755 K344 PI-38 GQ443757 K535 EU108721 TRANSCONTINENTAL PI-20 44 PI-06 PI-39 COSMOPOLITA PI-25 PI-12 58 GU225731 FS67 HTLV06 África do Sul PI-22 18 74 GQ443748 BS130 36 64 HTLV18 África do Sul PI-31 PI-19 91 PI-33 74 38 HTLV24 África do Sul 62 PI-34 PI-37 44 AF054627 RKI4 Peru 40 93 M37299 H5 Japão 53 J02030 ATM Japão 85 HTLV-1aE HTLV-1aB U12805 OD Mauritania 85 U12806 PR52 Marrocos HTLV-1aD U12804 BO Argelia 47 D13784 HS35 Caribe HTLV-1aC L76310 PYG19 África Central 64 98 S74562 EL República Democrática do Congo Z32527 ITIS República Democrática do Congo Y17014 Efe1 HTLV-1e HTLV-1d HTLV-1b HTLV-1e L02534 Mel5 Melanesia HTLV-1c Figura 1 0 – Árvore filogenética da região LTR do HTLV-1, incluindo 22 isolados de primodoadores de sangue no Estado do Piauí e 22 sequências do Genbank dos subtipos a-e. 32 L42509 Kay73 PI-46 PI-36 AF139382 SP PI-44 PI-30 PI-41 HTLV-2 a/c PI-26 PI-35 L42508 Kay139 PI-23 PI-13 PI-29 PI-7 U73022 6-2 M10060 mo HTLV-2a AF412314 USA AF074965 G2 GU212851 Pygmy AY442374 SP11 HTLV-2b Y13051 Y14365 pyg HTLV-2d Figura 1 1 - Árvore filogenética da região LTR do HTLV-2, incluindo 11 isolados de primodoadores de sangue no Estado do Piauí e 11 sequências do Genbank dos subtipos a, b e d. 33 5.2 Familiares dos Primodoadores de Sangue HTLV-1/2 Soropositivos (Grupo 2) De 21 famílias contactadas, cinco concordaram em participar do estudo. Três famílias apresentaram membros HTLV-1/2 soropositivos. A relação de parentesco destes familiares está representada nas Figuras 12, 13 e 14. 5.2.1 Família 1 A primeira família foi constituída pela doadora PI-39 (anti-HTLV-1 positiva, caso índice) e seis membros. Destes, três foram anti-HTLV-1 soropositivos (sua mãe - F39.2 e os dois filhos - F39.4 e F39.5), dois negativos e um com sorologia desconhecida (Figura 12). As características de risco relatadas pelos indivíduos soropositivos são apresentadas na Tabela 4. O DNA proviral do HTLV-1 foi detectado nas amostras da doadora PI-39, de sua mãe - F39.2 e de um filho - F39.4. Pela análise filogenética da região LTR desse vírus, os três isolados foram caracterizados como pertencentes ao subtipo Cosmopolita (HTLV-1a) do subgrupo Transcontinental (A) (Figura 15). Figura 12 - Heredograma dos familiares da doadora de sangue PI-39 34 Tabela 4 – Características de risco para infecção pelo HTLV-1 relatadas pelos familiares da primodoadora de sangue PI- 39 Características HTLV-1 soropositivos F39.2 PI-39 F39.4 Idade (anos) 75 34 17 8 Sexo F F F M Local de residência PI PI PI PI Tempo de amamentação (meses) 12 30 7 48 Tansfusão de sangue Não Não Não Não Uso de droga injetável Não Não Não Não 1 3 0 - História de DST Não Sim - - Uso irregular/não uso de preservativo Não Sim - - Número de parceiros sexuais F39.5 F= feminino; M= masculino; PI= Piauí; DST = doença sexualmente transmissível 5.2.2 Família 2 Na Figura 13, verifica-se que a segunda família foi constituída pela doadora PI-37 (anti-HTLV-1 positiva, caso índice) e 14 familiares. Dentre eles, quatro HTLV-2 soropositivos: sua mãe (F37.1) e três irmãos (F37.3, F37.4 e F37.5), sete negativos e três com sorologia desconhecida. A Tabela 5 mostra as características de risco relatadas pelos indivíduos HTLV-1 ou 2 soropositivos. O DNA proviral da amostra da doadora PI-37 foi amplificado e subtipado como HTLV-1a (Cosmopolita) do subgrupo Transcontinental (A) (Figura 15), enquanto o das amostras de sua mãe - F37.1 e de um irmão - F37.3 foram caracterizados como do subtipo a do HTLV-2 (HTLV-2a/c) (Figura 16). 35 Figura 13 - Heredograma dos familiares da doadora de sangue PI-37 Tabela 5 – Características de risco para infecção pelo HTLV relatadas pelos familiares da doadora de sangue PI-37 Características HTLV-1/2 soropositivos F37-1 F37-3 F37-4 F37-5 PI-37 Idade (anos) 84 51 49 49 45 Sexo F F M F F MA MA MA MA MA Amamentação (meses) 18 18 30 30 12 Transfusão de sangue Não Não Não Não Sim Uso de droga injetável Não Não Não Não Não 1 2 4 0 0 Não Sim Não - - Local de residência Número de parceiros sexuais História de DST Uso irregular/não uso de Não Sim Sim preservativo F= feminino; M= masculino; MA= Maranhão; DST = doença sexualmente transmissível 36 5.2.3 Família 3 A família da doadora PI-23 (anti-HTLV-2 positiva, caso índice) apresenta cinco outros membros, sendo dois HTLV-2 soropositivos (seu pai – F23.1 e sua mãe - F23.2), uma irmã negativa e dois com sorologia desconhecida (Figura 14). Na Tabela 6, observam-se as características de risco relatadas pelos indivíduos HTLV-2 soropositivos. O DNA proviral do HTLV-2 foi detectado nas amostras da doadora PI-23 e de seu pai – F23.1, sendo estes dois isolados identificados como do subtipo a (HTLV-2a/c) (Figura 16). Figura 14 - Heredograma dos familiares da doadora de sangue PI-23 37 Tabela 6 – Características de risco para infecção pelo HTLV relatadas pelos familiares da doadora de sangue PI-23. Características HTLV-2 soropositivos F23-1 F23-2 PI- 23 Idade (anos) 73 65 41 Sexo M F F Local de residência PI MA PI Tempo de amamentação (meses) 12 24 30 Transfusão de sangue Não Não Sim Uso de droga injetável Não Não Não 1 1 0 História de DST Não Não - Uso irregular/não uso de preservativo Não Não - Número de parceiros sexuais M= masculino; F= feminino; PI= Piauí; MA= Maranhão; DST = doença sexualmente transmissível 38 PI-39 65 F39-4 F39-2 25 DQ005555 IDUSSA 28 68 GQ443757 K535 JF271845 BRSP20608 98 GQ443748 BS130 TRANSCONTINENTAL HTLV06 África do Sul 46 98 44 46 GQ443755 k344 EU108721 CA422 COSMOPOLITA HTLV24 África do Sul 95 PI-37 75 59 53 81 KF202323 Bahia JF271839 BRSP3402 M37299 H5 Japão HTLV-1aB 81 J02030 ATM Japão U12805 OD Mauritânia 75 U12806 PR52 Marrocos 82 94 40 U12804 BO Argelia HTLV-1aC D13784 HS35 Caribe L76310 PYG19 África Central Z32527 ITIS República Democrática do Congo 56 HTLV-1aD HTLV-1d HTLV-1b HTLV-1e Y17014 Efe1 L02534 Mel5 Melanésia HTLV-1c 0.01 Figura 1 5 – Árvore filogenética da região LTR do HTLV-1, incluindo quatro isolados, sendo um do primodoador de sangue PI-37 e outro do PI-39 e de dois familiares no Estado do Piauí e 20 sequências do Genbank dos subtipos a-e. 39 AF139382SP 68 L42509Kay73 38 F37-1 30 64 F37-3 70 L42508Kay139 PI-23 100 65 F23-1 U73022-6-2 M10060mo 98 53 HTLV-2a AF412314USA AF074965G2 GU212851Pygmy670802 79 HTLV-2b Y13051Gab 80 41 29 AY442374SP11 JN222943BDAR2 Y14365pyg2d HTLV-2d 0.005 Figura 16 - Árvore filogenética da região LTR do HTLV-2, incluindo quatro isolados de familiares de primodoadores de sangue no Estado do Piauí e 12 sequências do Genbank dos subtipos a, b e d. 40 6 . DISCUSSÃO Para nosso conhecimento, a presente tese representa o primeiro estudo epidemiológico e molecular dos vírus linfotrópicos de células T humanas 1 e 2 em primodoadores de sangue e seus familiares no Estado do Piauí. Neste estudo, foi possível estimar a prevalência do HTLV1/2 e identificar os tipos/subtipos circulantes por sequenciamento e posterior análise filogenética. Os dados aqui apresentados, além de contribuírem para o conhecimento sobre a circulação destes vírus em nosso Estado, possibilitam um melhor acompanhamento e aconselhamento dos primodoadores de sangue e de seus familiares. 6.1 Primodoadores de Sangue Ao analisar os dados demográficos desta população, constatou-se que características como idade e sexo foram semelhantes às encontradas em outros estudos realizados no Brasil em doadores de sangue, que mostraram maiores frequências de indivíduos do sexo masculino (Lima et al. 2010, Gomes & Eleutério Junior 2011, Carneiro-Proeitti et al. 2012, Lindenberg et al. 2013, Kupek & Petry, 2014) e com idade inferior a 45 anos (Lima et al. 2010, CarneiroProeitti et al. 2012, Pinto et al. 2012, Lindenberg et al. 2013, Kupek & Petry, 2014). O nível de escolaridade foi semelhante ao observado em outras populações de doadores na Região Nordeste (Gomes & Eleutério Junior 2011, Queiroz et al. 2012), mas inferior ao reportado nas Regiões Sul e Sudeste (Goncalez et al. 2006, Maccarini et al. 2013, Kupek & Petry, 2014), o que reflete as diferenças na distribuição da população de 15 anos ou mais por região geográfica segundo escolaridade, ao considerar o Censo 2010 realizado no País (IBGE 2010). Ao comparar a prevalência de anti-HTLV-1/2 de 0,13% (IC 95%: 0,09-0,17) deste estudo com outras em doadores de sangue na Região Nordeste, verificou-se que a mesma foi semelhante à estimada no Maranhão (0,15%; IC 95%: 0,14-0,17) (Viana et al. 2014), mas inferior à publicada em Salvador (0,48%; IC 95%: 0,44-0,52). Por outro lado, ficou dentro da variação mostrada no Ceará (0,02% a 0,66%) (Souza et al. 2003, Gomes & Eleutério Júnior et al. 2011) e em Pernambuco (0,05% em Caruaru e 0,21% em Recife) (Carneiro-Proeitti et al. 2012, Lima et al. 2013). Notou-se, ainda, que a prevalência para o HTLV-1/2 em doadores de sangue no Piauí foi concordante com as taxas descritas em outras regiões do Brasil, tais como: Centro-Oeste 41 (Goiânia - 0,13%; IC 95%: 0,11-0,17) (Kozlowski 2013); Norte (Acre - 0,11%; IC 95%: 0,060,19) (Colin et al. 2003); Sudeste (Minas Gerais - 0,08% a 0,14% e São Paulo - 0,10% a 0,13%) (Goncalez et al.2006, Namen-Lopes et al. 2009, Dias-Bastos et al. 2010, CarneiroProeitti et al. 2012, Pinto et al. 2012) e Sul (Maringá/Paraná - 0,04%; IC 95%: 0,01-0,11 e Porto Alegre - 0,10%; IC 95%: 0,09-0,12) (Garcia 2010, Borelli et al. 2013). No entanto, foi ligeiramente superior à prevalência reportada em Santa Catarina (0,04%; IC 95%: 0,03-0,06) (Maresch et al. 2008). Catalan-Soares et al. (2005b), ao realizarem um estudo transversal em candidatos a doadores de sangue nas capitais dos 26 estados brasileiros e o Distrito Federal, no período de 1995 a 2000, também mostraram uma menor soropositividade para anti-HTLV-1/2 em Florianópolis (0,4/1000) e taxas elevadas em Salvador (9,4/1000) e São Luís (10/1000). Esses autores concluíram que, no geral, as taxas de soropositividade foram menores na Região Sul do País, tendendo a aumentar nas Regiões Nordeste e Norte. Neste estudo, das 47 amostras soro reagentes pelo ELISA, 36 foram positivas para o HTLV-1 ou HTLV-2 pelo LIA, resultando em um índice de confirmação da infecção de 76,6%, o qual corresponde ao limite superior (83,2%; IC 95%: 50,88-97,06) do observado em investigações realizadas em doadores de sangue no Brasil, cujos índices variaram de 7,6% a 83,2% (Catalan-Soares et al. 2003, Colin et al. 2003, Santos et al. 2003). Apesar do elevado índice de confirmação das amostras pelo LIA, deve-se ressaltar que a soroprevalência pode ser superestimada quando é realizada a triagem empregando apenas o ELISA. No presente estudo, a prevalência do HTLV-1 de 0,06% (IC 95%: 0,04-0,09) foi semelhante às verificadas em doadores no Acre (0,07%; IC 95%: 0,03-0,15) (Colin et al. 2003) e em Porto Alegre (0,08%; IC 95%: 0,07-0,09) (Garcia 2010), mas ligeiramente superior à estimada no Ceará (0,02%; IC 95%: 0,01-0,02) (Gomes & Eleutério Júnior et al. 2011) e, por outro lado, menor que à publicada em Minas Gerais (0,11%; IC 95%: 0,10-0,12) por NamenLopes et al. (2009). Para o HTLV-2, a prevalência de 0,04% (IC 95%: 0,02-0,06) em doadores de sangue no Piauí foi concordante também com a encontrada (0,02%; IC 95%: 0,0-0,07) por Colin et al. (2003) e Garcia (2010) no Acre e em Porto Alegre, respectivamente; no entanto, foi maior do que às mostradas no Ceará (0,005%) (Gomes & Eleutério Júnior et al. 2011) e em Minas Gerais (0,001%) (Namen-Lopes et al. 2009). Vale a pena ressaltar que muitos bancos de sangue no Brasil não realizam a testagem 42 confirmatória (WB e/ou PCR), não diferenciando, assim, o HTLV-1 do HTLV-2, o que dificulta o conhecimento da real prevalência desses dois vírus em candidatos a doadores de sangue no País, bem como a comparação dos resultados entre os diferentes estudos. Outrossim, o tamanho distinto das amostras, o uso de metodologias diferentes e pluralidade em relação às características sociodemográficas e epidemiológicas das populações estudadas podem explicar diferentes taxas encontradas nas diversas regiões do País. A média de idade dos primodoadores infectados pelo HTLV-1 ou 2 foi de 37,7 e 43,8 anos, respectivamente, o que pode refletir a exposição ao HTLV durante a vida. No grupo de doadores portadores do HTLV-1, constatou-se uma maior frequência de mulheres, sendo concordante com outros estudos (Souza et al. 2003, Mota et al. 2006, Carneiro-Proeitti et al. 2012), o que pode ser atribuído à maior eficiência da transmissão sexual do vírus no sentido homem-mulher (Paiva & Casseb 2014). A quase totalidade dos doadores de sangue infectada pelo HTLV-1 ou 2 relatou história de aleitamento materno, sendo que a maioria foi amamentada por mais de seis meses. Estes dados estão de acordo com a literatura e sugerem que amamentação seja um importante fator de risco para a transmissão desses vírus na população estudada, principalmente quando a mesma é realizada por longos períodos (Moriuchi et al. 2013). A via sexual é considerada uma importante rota de disseminação do HTLV-1/2 (Murphy et al. 1989, Kaplan et al. 1996, Gonçalves et al. 2010). Relacionada à mesma, observou-se, neste estudo, que a maioria dos portadores desses vírus informou o uso inconsistente ou não uso de preservativo. Adicionalmente, outras características de risco foram mencionadas em menores frequências como antecedentes de múltiplos parceiros sexuais e de DST. Tais características aumentam a vulnerabilidade ao HTLV-1/2, assim como a outras doenças sexualmente transmissíveis (Giuliani et al. 2000, Mota et al. 2006, Bautista et al. 2009, Gonçalves et al. 2010). De fato, quatro doadores HTLV-1/2 soropositivos eram coinfectados com o HBV. Ainda nesta investigação, história de hemotransfusão foi referida por 18,2% e 14,3% dos portadores do HTLV-1 e 2, respectivamente. Vale a pena ressaltar a importância da implantação da triagem sorológica para anti-HTLV nos bancos de sangue, onde a utilização de testes de alta sensibilidade, atrelada à triagem clínica, é de suma importância para identificar os doadores soropositivos, minimizando a transmissão transfusional desses vírus. Pela análise filogenética da região LTR do HTLV-1, todos os 22 isolados deste vírus 43 foram caracterizados como pertencentes ao subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental (HTLV-1aA). Estes achados corroboram os resultados observados por de Oliveira et al. (2012), em pacientes HIV soropositivos no Piauí, assim como os de outros estudos brasileiros, os quais descrevem o subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental (HTLV-1aA) como predominante no País (de Queiroz et al. 2007, Santos et al. 2009, de Almeida Rego et al. 2010, Magri et al. 2012, Kozlowski 2013, Pessôa et al. 2014). Verificou-se que estes isolados se agruparam com outros do Genbank, incluindo três isolados de afrodescendentes de Goiás e Mato Grosso do Sul, um da Bahia e três da África do Sul. Estes dados, em conjunto com os de outros estudos (Laurentino et al. 2005, Alcantara et al. 2006, Vallinoto et al. 2006, Mota et al. 2007, de Almeida Rego et al. 2008, Magalhães et al. 2008, Mota-Miranda et al. 2008, Martins et al. 2010), sugerem a introdução do HTLV-1 por africanos durante o tráfico de escravos e, assim, a presença desse subgrupo no Brasil. Recentemente, Pessôa et al. (2014), ao sequenciarem o genoma completo de isolados brasileiros desse vírus, sugeriram a introdução do HTLV-1 em múltiplas ocasiões. Onze isolados do HTLV-2 foram caracterizados como do subtipo brasileiro HTLV-2a, denominado a/c, o qual foi também encontrado em pacientes HIV soropositivos no Piauí (de Oliveira et al. 2012). Esse subtipo circula, tanto em populações indígenas da Amazônia, quanto em outras urbanas das cinco regiões geográficas do País. Adicionalmente, a análise filogenética desses isolados sugere que o HTLV-2a/c foi transmitido da população indígena para a urbana (Lewis et al. 2000, Ishak et al. 2001, Alcantara et al. 2003, Kleine Neto et al. 2009, Santos et al. 2009, de Almeida Rego et al. 2010, Magri et al. 2010, 2013, Kozlowski 2013, Barreto et al. 2014). 6.2 Familiares dos Primodoadores de Sangue HTLV-1/2 Soropositivos Na primeira família, dos sete membros, seis foram testados sorologicamente para o HTLV e quatro foram anti-HTLV-1 positivos (ELISA/LIA), incluindo o caso índice – a primodoadora PI-39, sua mãe - F39.2 e os dois filhos - F39.4 e F39.5. A matriarca desta família (F39.2, com 75 anos de idade) relatou, como única característica de risco, ter sido amamentada por 12 meses, inclusive o seu esposo e único parceiro sexual foi HTLV soronegativo. Sua filha, a primodoadora PI-39 (caso índice), foi amamentada por 30 meses. Semelhantemente, ela (PI39) referiu história de amamentação prolongada em relação aos seus dois filhos (F39.4 e F39.5, com 17 e 8 anos de idade, amamentados por sete e 48 meses, respectivamente) (Tabela 4). 44 Aliados a estes dados epidemiológicos e aos apresentados no heredograma (Figura 12), as sequências de nucleotídeos e a análise filogenética da região LTR do HTLV-1 (Figura 15) dos isolados da doadora PI-39, de sua mãe - F39.2 e de um filho - F39.4 mostraram alta similaridade, os quais foram caracterizados como pertencentes ao subtipo Cosmopolita (HTLV-1a) do subgrupo Transcontinental (A), evidenciando-se, assim, a ocorrência da transmissão intrafamiliar do HTLV-1 por três gerações. Estes resultados corroboram os de outros estudos que mostram a importância da transmissão vertical do HTLV-1, principalmente pelo aleitamento materno prolongado (Houinato et al. 1988, Wiktor et al. 1997, Gastaldello et al. 2005, Martins et al. 2010, Moriuchi et al. 2013). A segunda família teve como caso índice a doadora PI-37, infectada pelo HTLV-1. Surpreendentemente, quatro membros de sua família foram anti-HTLV-2 soropositivos (ELISA/LIA): sua mãe (F37.1) e três irmãos (F37.3, F37.4 e F37.5) (Figura 13). A matriarca desta família (F37.1, com idade de 84 anos) mencionou, como única característica de risco, ter sido amamentada por 18 meses. Semelhantemente, os seus filhos F37.3 (51 anos de idade), F37.4 e F37.5 (um casal de gêmeos, com 49 anos de idade) também foram amamentados por muito tempo (18 e 30 meses, respectivamente) (Tabela 5). Pelas sequências de nucleotídeos e análise filogenética da região LTR do HTLV-2 (Figura 16), os isolados provenientes da mãe (F37.1) e de um dos filhos (F37.3) apresentaram alta similaridade, sendo caracterizados como do subtipo a do HTLV-2 (HTLV-2a/c). Estes resultados indicam a ocorrência da transmissão intrafamiliar e vertical do HTLV-2a/c, provavelmente por amamentação materna, assim como os achados publicados por Ishak et al. (2001), em índios nativos na aldeia Kararao (Kayapó) no Pará, e por Catalan-Soares et al. (2005a), ao analisarem uma família urbana em Belo Horizante, Minas Gerais. Ainda em relação à segunda família, apesar do caso índice (primodoadora PI-37, 45 anos) ter sido amamentada por 12 meses, foi anti-HTLV-2 soronegativa. Por outro lado, somente ela se infectou com o HTLV-1 (HTLV-1aA, Figura 15) e apresentou história de transfusão de sangue (Tabela 5). Considerando que a implantação da triagem para anti-HTLV1/2 nos bancos de sangue no Brasil foi em novembro de 1993 (Brasil 1993) e que a PI-37 recebeu múltiplas transfusões em 1990 e 1991, pode-se inferir que o caso índice tenha se infectado pelo HTLV-1 por via parenteral, uma vez que a mesma informou que nunca teve relação sexual. Na terceira família, dos seis membros, quatro foram testados sorologicamente para o 45 HTLV e três foram anti-HTLV-2 positivos (ELISA/LIA), incluindo o caso índice - a primodoadora (PI-23, 41 anos), seu pai (F23.1, 73 anos) e sua mãe (F23.2, 65 anos) (Figura 14). Os três indivíduos soropositivos mencionaram, como única característica de risco, amamentação por longos períodos de tempo (12, 24 e 30 meses), uma vez que a PI-23 relatou história de hemotransfusão entre 1998 e 2006. Portanto, após a implantação da triagem para anti-HTLV-1/2 nos bancos de sangue no Brasil (Brasil 1993). Além disso, ela referiu que nunca teve relação sexual (Tabela 6), reforçando, assim, a possibilidade da mesma ter sido infectada pelo HTLV-2 por amamentação materna, o que é concordante com outras investigações (Ishak et al. 2001, Catalan-Soares et al. 2005a). O DNA proviral do HTLV-2 foi detectado nas amostras de sangue total da doadora (PI23) e de seu pai (F23.1), sendo estes dois isolados identificados como HTLV-2a/c (Figura 16), os quais mostraram alta similaridade genética, sugerindo a transmissão intrafamiliar do HTLV. Apesar de não ter sido possível a detecção do DNA proviral e a caracterização molecular do HTLV-2 na amostra da mãe (F23.2), ela foi infectada por este vírus, pois a presença de anticorpos anti-HTLV-2 no seu soro foi confirmada pelo line immunoassay. Diante do exposto e tendo em vista que a transmissão sexual é uma importante rota de transmissão do HTLV-2, especialmente no sentido homem-mulher (Catalan-Soares et al. 2005a, da Costa et al. 2013, Paiva & Casseb 2014), a mesma pode ser considerada na transmissão viral entre o casal F23.1 e F23.2. Apesar da limitação do presente estudo em relação à participação reduzida das famílias, os achados corroboram os de outras investigações realizadas no Brasil, indicando a importância da transmissão intrafamiliar do HTLV em áreas endêmicas, nas quais os vírus linfotrópicos de células T humanas 1 e 2 são disseminados silenciosamente pela via vertical e sexual (Ishak et al. 2001, Catalan-Soares et al. 2005a, Martins et al. 2010, da Costa et al. 2013, Mello et al. 2014). De fato, até a realização deste estudo, os familiares HTLV-1 ou 2 soropositivos dos primodoadores de sangue no Estado do Piauí desconheciam o status sorológico para esses vírus. Diante do exposto e considerando a inexistência de vacina e de terapia antiviral bem estabelecida para o HTLV, além do risco dos indivíduos infectados desenvolverem doenças graves como ATL e HAM/TSP, dentre outras (Roucoux & Murphy 2004, Gonçalves et al. 2010, Paiva & Casseb 2014), estratégias incluindo a triagem para o HTLV-1/2 durante o pré-natal e a suspensão ou a redução da amamentação materna nos casos de sorologia positiva, combinada a recomendação de fórmula de alimentação alternativa, são importantes para reduzir a 46 transmissão vertical desses vírus e, assim, prevenir o desenvolvimento de doenças futuras associadas ao HTLV-1 e 2 (Carneiro-Proietti et al. 2014, Moriuchi et al. 2013). Outrossim, se faz necessária a adoção de medidas visando à prática sexual segura (Paiva & Casseb 2014). Por fim, esperamos que os resultados deste estudo possam subsidiar políticas públicas visando, além da prevenção da transmissão vertical ou horizontal, o aconselhamento/ acolhimento adequado e contínuo dos doadores HTLV-1/2 soropositivos e de seus familiares, assim como a realização de programas de educação em saúde. Sugerimos, ainda, a realização de novas pesquisas sobre essas viroses ainda negligenciadas em nosso Estado. 47 7. CONCLUSÕES A prevalência da infecção pelo HTLV-1/2 em primodoadores de sangue no Estado no Piauí foi de 0,13% por ELISA. Adicionalmente, a soropositividade pelo LIA foi de 0,06% e 0,04% para o HTLV-1 e 2, respectivamente; A maioria dos portadores do HTLV-1 ou 2 relatou características de risco relacionadas à transmissão vertical e sexual. Por outro lado, poucos indivíduos informaram características associadas à transmissão parenteral; Os isolados do HTLV-1 foram caracterizados como do subtipo Cosmopolita (HTLV-1a), do subgrupo Transcontinental (A), e os do HTLV-2 como do subtipo a (HTLV-2 a/c), o que corrobora os dados de outros estudos brasileiros, demonstrando, assim, a predominância destes no País; A ocorrência de transmissão intrafamiliar/vertical do HTLV-1 foi evidenciada na primeira família analisada, e do HTLV-2 na segunda e terceira família. Adicionalmente, na última família, a transmissão sexual do HTLV-2 pode ter ocorrido. 48 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abad M, Dronda F, Dominguez E, Moreno S, Vallejo A 2011. HTLV-2b among HIV type 1coinfected injecting drug users in Spain. AIDS Res Hum Retroviruses 27: 579-583. Abrams A, Akahata Y, Jacobson S 2011. The prevalence and significance of HTLV-I/II seroindeterminate western blot patterns. Viruses 3: 1320-1331. Azran I, Schavinsky-Khrapunsky Y, Aboud M 2004. 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