produção de vacina bcg recombinante expressando - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE
PÚBLICA
ABADIO DE OLIVEIRA DA COSTA JÚNIOR
PRODUÇÃO DE VACINA BCG RECOMBINANTE
EXPRESSANDO PROTEÍNA DE FUSÃO CMX E AVALIAÇÃO
DA INDUÇÃO DE CÉLULAS B DE MEMÓRIA.
Goiânia
2014
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR
AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás
(UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações
(BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o
documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou
download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico:
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a):
Abadio de Oliveira da Costa Júnior
E-mail:
[email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página?
[ X ] Dissertação
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Vínculo empregatício do autor: Não existente
Agência de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento científico e Tecnológico
Sigla:
CNPq
País:
Brasil
UF:
GO CNPJ:
Título:
Produção de vacina BCG recombinante expressando proteína de fusão CMX e avaliação da indução
de células B de memória.
Palavras-chave:
Tuberculose; BCG; linfócito B; BCG recombinante.
Título em outra língua: Recombinant vaccine BCG production expressing fusion protein CMX and evaluation
of memory B cells induction.
Palavras-chave em outra língua: Tuberculosis; BCG; B cells; recombinant BCG
Área de concentração:
Imunologia
Data defesa: 05/12/2014
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador (a):
Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
E-mail: [email protected]
Co-orientador (a):*
Prof. Dr. André Kipnis
E-mail: [email protected]
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
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__________________________________
Assinatura do autor
1
Data: 05 / 12 / 2014
Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo
suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante
o período de embargo.
ABADIO DE OLIVEIRA DA COSTA JÚNIOR
PRODUÇÃO DE VACINA BCG RECOMBINANTE
EXPRESSANDO PROTEÍNA DE FUSÃO CMX E AVALIAÇÃO
DA INDUÇÃO DE CÉLULAS B DE MEMÓRIA.
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
e Saúde Pública da Universidade Federal de
Goiás para obtenção do Título de Mestre em
Medicina Tropical e Saúde Pública.
Orientador: Dr. Ana Paula Junqueira Kipnis
Co-orientador: Dr. André Kipnis
Goiânia
2014
ii
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Abadio de Oliveira da Costa Júnior
Orientador (a): Prof. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
Co-orientador (a): Prof. Dr. André Kipnis
Membros:
1. Prof. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
2. Prof. Dra. Ludimila Paula Vaz Cardoso
3. Prof. Dra. Simone Gonçalves da Fonseca
Data: 05 de dezembro de 2014
iii
Dedico o desenvolvimento deste estudo a todos os cientistas, in memorian,
vitimados pela queda do avião em território ucraniano quando transitavam para a
20ª Conferência de AIDS, realizada na Austrália em julho do corrente ano.
iv
AGRADECIMENTOS
O homem nada seria não fossem àqueles que o cercam, que de maneira direta ou
indireta contribuem para a formação do seu caráter. Em toda minha caminhada até o
momento não foram poucos os que contribuíram para a minha formação pessoal,
acadêmica, profissional e científica.
Aos meus orientadores, Dr. Ana Paula Junqueira-Kipnis e Dr. André Kipnis, todo
o meu reconhecimento, admiração e agradecimento. Não apenas por permitirem e
confiarem a mim o desenvolvimento deste estudo, mas também pela imensurável
capacidade científica e acadêmica apresentada por ambos. Estou certo de que a minha
formação acadêmica e científica não seria a mesma não fosse o compromisso de ambos
com a mesma e já vivi na prática a diferença de ter meu berço científico com os Kipnis.
Por todo o tempo em que prontamente dedicaram a minha formação, meu mais sincero
agradecimento.
Aos meus colegas e colaboradores do Laboratório de Imunopatologia das Doenças
Infecciosas, Beatriz Fonseca, Bruno Santos, Danilo Resende, Fábio de Oliveira, Joseane
Damaceno, Lázaro Marques-Neto, Renato Machado, Rogério das Neves, Suelen Castilho e
Viviane Rocha, agradeço por terem contribuído na construção da minha personalidade
profissional e científica. Sou grato ainda àqueles com quem pouco convivi, Michelle Reis e
Alexsander da Silveira, mas que também muito me ensinaram com sua postura diante das
situações do dia a dia que é preciso muito mais do que conhecimento para esta jornada, é
preciso também ter temperança. À Rafaela Alves, agradeço com muito carinho e afeto por
me permitir contribuir, mesmo que com pouco, com o início de seu aprendizado científico.
Às colaboradoras, Adeliane da Costa e a Sarah Nogueira, agradeço por terem
contribuído significantemente com a construção desta dissertação e da minha formação
científica, não apenas no desenvolvimento dos experimentos, mas também, na
interpretação de resultados, nas discussões dos mesmos, e por terem sido apoio nos
resultados falhos e mal sucedidos.
v
Aos profissionais e instituições colaboradoras, que atuaram como suporte para o
desenvolvimento deste estudo, meu agradecimento. À Dr. Aline Batista da Faculdade de
Odontologia da UFG; ao Prof. Dr. Jaime Santana da Universidade de Brasília; à Dr.
Patrícia de Brito e a farmacêutica Ana Carolina Dias, ambas da Associação de Combate ao
Câncer em Goiás; e à Dr. Isabela Wastowski da Universidade Estadual de Goiás.
Aos professores, Ludimila Cardoso, Michelle dos Reis, Patricia Loyola e Simone
da Fonseca, meus agradecimentos por aceitaram participar da banca de avaliação deste
estudo. Por sua disponibilidade e compreensão meus mais sinceros agradecimentos. Não
posso deixar ainda de agradecer as professoras, Dra. Liliana Menezes-Leite, Dra. Mariane
Stefani e Dra. Simone da Fonseca, por muito gentilmente terem contribuido com o
melhoramento deste estudo no momento do exame de qualificação.
Às minhas companheiras de todas as horas, amigas e irmãs, Bruna Daniella Silva,
Duanne Silva e Monalisa Trentini, não quero apenas agradecer, quero deixar registrado o
quanto amo vocês. Vocês foram cruciais para minha chegada aqui, foram inúmeros
conselhos, horas de ouvido e rios de lágrimas. Por serem meu suporte, apóio e base para
sobreviver aos momentos em que as forças para continuar já me faltavam, por terem sido
minha família quando a mesma, devido a distância, não podia estar presente. Juntos
vivemos inigualáveis e incomparáveis momentos que jamais serão esquecidos, mesmo que
nunca mencionados, eternamente estarão gravados em minha história e em meu coração.
Ào meus irmãos Arthur da Costa e André da Costa, que sempre demonstraram,
cada um a seu modo, o carinho, compreensão e apóio na decisão profissional que tomei.
Especialmente, ao Arthur, pelos momentos em que sofreu com minhas crises de mal humor
e de intolerância quando sem saber me procurava em momentos de insegurança acadêmica
e pessoal, minhas desculpas e meu muito obrigado.
Aos meus pais, Abadio da Costa e Francisca Ângela da Costa, que são sem a menor
sombra de dúvida meu alicerce, meus maiores amores, são meu tudo. Sempre presentes,
apesar de distantes, foram apóio nos momentos em que me deparei sem dinheiro no bolso,
comida na geladeira, mas, sobretudo nos momentos de meus diagnósticos mais difíceis.
Enfim, por terem demonstrado, mesmo que por telefone, que podia contar com vocês eu
sou mais do que grato. Nunca poderei retribuí-los a altura por tudo que já fizeram por mim
vi
e estejam certos de que não importa a força do vento, se estivermos os cinco juntos a
tempestade não vai passar de um chuvisco.
Àquele que me permite respirar, viver e amar. À Deus toda a honra e glória por me
permitir chegar aqui e pelo conforto de saber que no futuro, mesmo que ainda incerto, há
muitas outras vitórias sendo providenciadas. Peço a ele que abençõe todas as pessoas aqui
mencionados, mas também àqueles que ele certamente Ele está providenciando pelo meu
caminho.
vii
SUMÁRIO
QUADROS, FIGURAS E ANEXOS .................................................................................... x
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ....................................................................... xi
RESUMO ........................................................................................................................... xiv
ABSTRACT ........................................................................................................................ xv
1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DE LITERATURA ......................................................... 16
1.1. Tuberculose.............................................................................................................. 16
1.2. Resposta imune ao Mtb .......................................................................................... .19
1.3. Bacilo Calmette-Guérin – BCG ............................................................................... 24
1.3.1. Resposta imune ao BCG ................................................................................... 26
1.4. Linfócitos B ............................................................................................................. 29
1.4.1. Desenvolvimento dos linfócitos B .................................................................... 30
1.5. Novas vacinas para tuberculose (BCG recombinantes) ........................................... 38
1.6. Proteína de fusão recombinante – CMX .................................................................. 44
2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 47
3. OBJETIVOS ................................................................................................................... 49
3.1. Objetivos específicos ............................................................................................... 49
4. MÉTODOS ..................................................................................................................... 50
4.1. Construção dos plasmídios recombinantes. ............................................................. 50
4.2. Obtenção das vacinas BCG recombinantes (rBCGs) .............................................. 51
4.3. Determinação das concentrações das vacinas recombinantes ................................. 52
4.4. Preparo da BCG-Moreau ......................................................................................... 52
4.5. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ................................................................. 53
4.6. Análise da expressão da CMX pelos recombinantes (rBCGs). ............................... 54
4.7. Animais .................................................................................................................... 55
4.8. Preparo dos inóculos vacinais e imunização ........................................................... 55
4.9. Estabilidade plasmidial in vivo ................................................................................ 55
4.10.Desenho experimental in vivo.................................................................................. 56
4.11.M. tuberculosis (H37Rv) e inóculo para desafio de animais ................................... 57
4.12.Ensaio Imuno-enzimático (ELISA) ......................................................................... 58
4.13.Obtenção das células do baço .................................................................................. 59
4.14.Citometria de fluxo .................................................................................................. 59
viii
4.15.Determinação da carga bacilar no pulmão .............................................................. 60
4.16.Avaliação da inflamação pulmonar induzida após desafio ..................................... 60
4.17.Análise Estatística ................................................................................................... 60
5. RESULTADOS .............................................................................................................. 62
5.1. Transformação e expressão da proteína de fusão CMX pelos recombinantes ........ 62
5.2. Teste de estabilidade plasmidial de rBCG-CMX in vivo ........................................ 64
5.3. Detecção de anticorpos específicos para CMX ....................................................... 67
5.4. Células B de memória induzidas pela imunização com rBCG-CMX ..................... 70
5.5. Proteção induzida pela vacina BCG-CMX .............................................................. 77
5.6. Inflamação Pulmonar após infecção por Mtb .......................................................... 78
6. DISCUSSÃO .................................................................................................................. 80
7. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 84
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................... 85
9. REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 86
10. ANEXO ...................................................................................................................... 112
ix
QUADROS, FIGURAS E ANEXOS
Quadro 1. BCGs recombinantes produzidas nos últimos 10 anos ......................... 40
Quadro 2. Distribuição dos animais em grupos experimentais ............................. 56
Figura 1.
Estimativa da incidência de tuberculose no mundo em 2012 ............... 17
Figura 2.
Modulação da resposta imune ao M. tuberculosis pelas células B........ 24
Figura 3.
Processo de desenvolvimento da resposta imune de células B de
memória específicas para antígenos ..................................................... 34
Figura 4.
Representação do processo de construção da proteína recombinante
CMX ..................................................................................................... 46
Figura 5.
Desenho experimental in vivo .............................................................
Figura 6.
Produto de amplificação para a sequência codificadora da proteína
58
de fusão CMX .....................................................................................
62
Figura 7.
Expressão de CMX pelos transformantes ...........................................
63
Figura 8.
Estabilidade plasmidial de rBCG-CMX in vivo .................................
65
Figura 9.
Produto de amplificação para sequencia codificadora da CMX de
colônias recuperadas de animais imunizados com rBCG-CMX ........
66
Figura 10. Anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para CMX ...............................
67
Figura 11. Anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para HspX, MPT-51 e CMX...
68
Figura 12. Anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para extrato de BCG................
69
Figura 13. Avaliação de esplenócitos 30 e 90 dias após a imunização ................
71
Figura 14. Avaliação de células B de memória, no baço, 30 dias após a
imunização ..........................................................................................
73
Figura 15. Avaliação de células B de memória, no baço, 90 dias após a
imunização ..........................................................................................
75
Figura 16. Cinética do número de células das subpopulações de linfócitos B de
memória ..............................................................................................
76
Figura 17. Carga bacilar recuperada de pulmão de camundongos infectados
com Mtb ..............................................................................................
Figura 18. Avaliação da inflamação pulmonar após infecção por Mtb
Anexo 1.
Parecer do comitê de ética ..................................................................
77
79
112
x
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
Ag
Antígeno
AID
“Activation-induced cytidine deaminase”
AIDS
Sindrome da imunodeficiência adquirida
APC
Células apresentadora de antígeno
APRIL
Ligante de indutor de proliferação
BAAF
Fator de ativação de célula B
BAAFR
Receptor de fator de ativação de célula B
BCG
“Bacille Calmette-Guérin”
BCR
Receptor de célula B
Breg
Célula B reguladora
CDs
Células Dendríticas
CD40L
Ligante de CD40
CG
Centro Germinativo
CN
Controle negativo
CP
Controle positivo
CTLA-4
Antígeno associado ao linfócito T citotóxico–4
DAB
Diaminobenzidina
DTH
Hipersensibilidade do tipo tardio
EV
Via endovenosa
FcR
Receptor de porção Fc de imunoglobulina
HE
Hematoxilina e eosina
HIV
Vírus da imunodeficiência humana
ICOS
Coestimulador induzível
ICOSL
Ligante de coestimulador induzível
xi
ID
Via intradérmica
IFN-γ
Interferon-gama
IgD
Imunoglobulina D
IgG
Imunoglobulina G
IgM
Imunoglobulina M
IL-1α
Interleucina 1-alfa
IL-1β
Interleucina 1-beta
IL-4
Interleucina-4
IL-10
Interleucina-10
IL-12
Interleucina-12
IL-17
Interleucina-17
IL-23
Interleucina-23
IP
Via intraperitoneal
LTα
Linfotoxina-alfa
LTβ
Linfotoxina-beta
LTβR
Receptor de linfotoxina-beta
MHC
Molécula de histocompatibilidade
MO
Medula Óssea
MS
Mutação Somática
Mtb
Mycobacterium tuberculosis
NA
Não avaliado
NI
Não informado
NKT
Célula T natural killer
OADC
Ácido oléico, dextrose e catalase
OMS
Organização Mundial de Saúde
PAMP
Padrão molecular associado a patógenos
xii
PCR
Reação de Polimerase em cadeia
PRR
Receptor de reconhecimento de padrão
rBCG
BCG recombinante
S1P
Esfingosina-1-fosfato
SC
Via subcutânea
STOP-TB
“Strategy and the Global Plan to Stop TB”
TAPA/CD8 alvo de anticorpo anti-proliferativo
1
TB
Tuberculose
LTBI
Tuberculose infecção latente
TBP
Tuberculose pulmonar
TDM
Dimicolato de trealose
TGF-β
Fator de crescimento transformador beta
Th
Célula T helper
Th1
Célula T helper 1
Th17
Célula T helper 17
ThF
Célula T helper folicular
TLR
“Toll like receptor”
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
TNFR-I
Receptor de fator de necrose tumoral I
TST
Teste de sensibilidade a tuberculina
UFC
Unidades formadoras de colônias
xiii
RESUMO
A tuberculose (TB) constitui um problema de saúde pública mundial e apesar da recente
redução da incidência de novos casos e de mortes em todo mundo ainda há países em
desenvolvimento onde estes índices ainda não são tão otimistas. A única vacina indicada
pela Organização Mundial de Saúde (OMS) contra a TB é a BCG que embora esta seja
eficiente contra as formas graves de TB na infância, apresenta uma eficácia questionável
contra a tuberculose pulmonar (TBP) em adultos. Com o objetivo de contribuir para o
melhoramento molecular da BCG e possibilitar assim o aprimoramento de um método de
profilaxia amplamente utilizado, foram produzidos, por eletroporação da BCG (subcepa
Moreau), três recombinantes utilizando diferentes construções plasmidiais (pLA71, pLA73
e pMIP12), ambas, contendo sequência codificadora para a proteína de fusão CMX de
Mycobacterium tuberculosis. No entanto, apenas o transformante utilizando o pLA71
apresentou expressão da proteína CMX no imunoblot. Com o objetivo de avaliar o perfil de
células B de memória, anticorpos específicos para CMX e a eficácia da vacina,
camundongos BALB/c foram imunizados com dose única de BCG ou rBCG-CMX ou PBS
(controle). A avaliação do perfil de células B de memória induzido pela imunização foi
realizada 30 e 90 dias após a imunização, pela marcação de esplenócitos para citometria de
fluxo. Noventa dias após a imunização, os animais foram desafiados, via endovenosa, com
Mtb H37Rv e 45 dias após, foram obtidos pulmão dos camundongos para determinação da
carga bacilar e do nível de inflamação induzido pela infecção nos camundongos
imunizados. Não foram detectados níveis séricos de anticorpos específicos para proteínas
rCMX, rHspX e rMPT-51, no entanto, animais vacinados com a rBCG-CMX apresentaram
níveis de anticorpos séricos, das classes IgG1 (p<0,0001) e IgG2a (p=0,0007), específicos
para extrato de BCG superiores ao induzido em animais vacinados com a BCG. Além
disso, a vacina rBCG-CMX mostrou-se capaz de induzir tardiamente células B de memória
de vida longa (p=0,0069); reduzir a carga bacilar no pulmão de camundongos infectados
com Mtb (p=0,0041), semelhante ao BCG; e promover menor dano tecidual no pulmão de
animais vacinados e infectados com Mtb. A vacina BCG recombinante expressando a
proteína de fusão CMX mostrou-se capaz de induzir anticorpos específicos para extrato de
BCG e resposta de células B de memória mais robustas do que a BCG, entretanto, a
proteção induzida por ambas as vacinas (BCG e rBCG) foram semelhantes.
xiv
ABSTRACT
Tuberculosis is a global public health problem and despite the recent reduction in the
incidence of new cases and deaths worldwide, there are still developing countries where
these indices are not so optimistic. The only vaccine recommended to TB by WHO is BCG
that, although effective against severe forms of childhood TB, has a questionable efficacy
against pulmonary tuberculosis in adults. In the pursue for a molecular improvement for
BCG and thus enable the development of a widely used method of prophylaxis, a
recombinant BCG was produced by electroporation of BCG Moreau, using three different
recombinant plasmid constructions (pLA71, pLA73 and pMIP12), all of them containing
the fusion protein CMX coding sequence. However, only the pLA71 transformant
expressed the CMX fusion protein in the western blot. In order to evaluate the profile of
memory B cells, the specific antibodies against CMX and the efficacy of the vaccine,
BALB/c mice were immunized with a single dose of BCG or rBCG-CMX or PBS
(control). Serum samples were collected from all animals 30, 60 and 90 days after the
immunization and the induction of memory B cells was assessed by flow citometry of the
splenocytes cell suspensions. Ninety days after the last immunization, animals were
challenged with Mtb H37Rv by the intravenous route and forty five days later, lungs were
harvested to analyze the bacterial load and the level of inflammation induced by the
infection in immunized mice. Even though no specific antibodies against rCMX, rHspX
and rMPT-51 proteins were detected, animals immunized with rBCG-CMX showed
specific IgG1 (p<0,0001) and IgG2a (p=0,0007) levels against the BCG culture sediment,
higher than those induced in the animals vaccinated with BCG. Besides, the rBCG-CMX
vaccine was able to induced delayed long lived memory B cells (p=0,0069), reduced the
bacterial load in the lungs (p=0,0041) in a similar way as BCG and generated less tissue
damage when compared to BCG Moreau. The recombinant BCG vaccine expressing the
CMX fusion protein induced specific antibodies for BCG extract and B cell response to
stronger memory than BCG, but, the protection induced by both vaccines (BCG and
rBCG) were similar.
xv
1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DE LITERATURA
1.1.
Tuberculose
A tuberculose (TB) humana é uma doença infecto-contagiosa causada pelo
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), uma bactéria altamente patogênica que se estabelece
usualmente nos pulmões do hospedeiro (DUCATI et al., 2006). Portanto, a tuberculose
pulmonar (TBP) é a forma mais comum desta doença, adquirida pela inalação do bacilo
presente na tosse ou no espirro de indivíduos infectados (ZUMLA; GRANGE, 1998). No
cenário das doenças infecciosas, a TB é mais prevalentes nos seres humanos, sendo a
segunda principal causa de morte por doença infecciosa em todo o mundo, precedida
apenas pela AIDS, fatos estes que a tornam um grande problema de saúde pública mundial
(AZIZ et al., 2006). A transmissão do Mtb ocorre por via direta, de indivíduo para
indivíduo, através das gotículas de saliva. Essas gotículas podem ser expelidas pela
respiração, espirro ou tosse, que quando inalada pode causar a doença, que apresenta como
sintomas: tosse por três semanas ou mais, com a presença ou ausência de catarro; sudorese
noturna; febre; mal estar; dor no peito; falta de apetite e emagrecimento (BRASIL, 2011).
Em 2013 foram documentados cerca de 9 milhões de novos casos em todo o
mundo, com uma estimativa de 1,5 milhões de mortes, destas 0,36 milhões foram em
decorrência da co-infecção TB-HIV. O Brasil pertence ao grupo dos 22 países
responsáveis pelo maior numero de casos de tuberculose no mundo, tendo apresentado em
2013 uma incidência de 46 casos/100.000 habitantes (Figura 1) e uma prevalência de 57
casos/100.000 habitantes, com aproximadamente 2,2 mortes/100.000 habitantes (WHO,
2014). Dentre os estados da região centro-oeste, Goiás apresentou uma incidência de 13,7
casos/100.000 habitantes em 2012 (BRASIL, 2012).
16
Figura 1: Estimativa da incidência de tuberculose no mundo em 2013.
Fonte: Global Tuberculosis Report/ 2014/ OMS.
Este panorama epidemiológico da TB torna-se ainda mais preocupante quando
consideramos o fato de que a maioria dos indivíduos infectados desenvolve uma resposta
imune capaz de neutralizar e eliminar eficazmente o Mtb dos pulmões, estes indivíduos são
assintomáticos e não apresentam risco de contaminação (CAMINERO, 2003). Apenas
aproximadamente 10% dos indivíduos que entram em contato com o Mtb são infectados,
destes a maioria (90%) progride para uma apresentação assintomática da doença,
tuberculose infecção latente (TBL), e, apenas cerca de 5 a 10% destes apresentarão
reativação da doença (PHILIPS; ERNST, 2012). Na ausência de tratamento, cerca da
metade dessas pessoas morrem (YOUNG et al., 2014). Ainda assim, estima-se que um
terço da população mundial esteja infectado pelo Mtb (WHO 2012).
Alguns fatores estão associados com a suscetibilidade de indivíduos expostos a TB
e o risco de desenvolvimento da doença, são eles: aglomeração de pessoas, má nutrição,
algumas comorbidades (tais como, artrite reumatóide e outras doenças autoimunes), além
de fatores genéticos individuais (YOUNG et al., 2014; BARONNET et al., 2011). Além
disso, o Mtb apresenta um conjunto de estratégias de evasão do sistema imune que
17
possibilita a sua resistência e escape dos mecanismos de defesa do hospedeiro
(OTTENHOFF, 2012).
A incidência de casos de TB tem sofrido influência da epidemia de Aids, bem
como, da emergência de resistência a drogas anti-TB (AZIZ et al., 2006). A resistência a
fármacos surge principalmente como resultado do abandono ao tratamento pelo paciente,
seja devido ao seu longo período de tempo (seis meses nos casos de melhor prognóstico)
ou pelo desaparecimento dos sintomas logo após o início do uso dos medicamentos (DYE
et al., 2005; ARAUJO-FILHO et al., 2008b).
Dentre os fatores envolvidos na alta incidência da TB, um dos principais é a
dificuldade na realização do diagnóstico. O diagnóstico clínico é baseado na
sintomatologia e na apresentação radiológica, apesar destes serem por vezes inespecíficos.
Associado ao diagnóstico clínico e a radiografia de tórax, desde a descoberta do Mtb, em
1882 por Robert Koch, a baciloscopia tornou-se o esteio do diagnóstico da TB e ainda hoje
permanece como a opção de diagnóstico mais amplamente utilizado em países de baixa
renda (WHO, 2011). Entretanto, a comunidade científica tem constantemente buscado
desenvolver um método rápido, barato e confiável para a realização deste diagnóstico.
Como resultado desta busca, recentemente foi implantado o GeneXpert, que é uma tecnica
baseada na reação em cadeia da polimerase capaz de detectar, em apenas duas horas com
uma sensibilidade de aproximadamente 99%, simultaneamente a presença do Mtb e a
resistência a rifampicina (principal droga do coquetel contra a TB) (ZEKA; TASBAKAN;
CAVUSOGLU, 2011; BODMER; STROHLE, 2012).
Todas estas características apresentadas demonstram que a TB constitui um
problema de saúde pública mundial. Como reconhecimento deste fato, em 2006, a
Organização Mundial de Saúde (OMS) lançou um novo programa propondo esforços para
a diminuição da TB para 1 caso para cada 100.000 hab. até o ano 2050. O Strategy and the
Global Plan to Stop TB (STOP-TB), apresenta os novos paradigmas da TB como o
aumento do número de casos de resistência a drogas; ocorrencia de infecções simultâneas
com a pandemia de HIV; ausência de uma vacina eficaz em adultos; inexistência de um
teste diagnóstico simples, barato e capaz de distinguir os diversos grupos relacionados à
doença e os defasados sistemas de saúde dos países não desenvolvidos, incapazes de
prestar atendimento satisfatório a toda a população (LAWN; ZUMLA, 2011).
18
1.2.
Resposta imune ao Mtb
Após encontrar com o bacilo, a resposta imune desencadeada pode determinar o
rumo da infecção. Entretanto, a resposta do hospedeiro não é sempre uniforme em
populações expostas. De fato, a maioria dos humanos não desenvolve a doença apesar de
permanecer infectada por muitos anos (VYNNYCKY; FINE, 1997). Este fato também
pode estar relacionado com a duração e a intensidade da exposição, bem como a carga
bacilar e a participação da resposta imune inata (NICOL; WILKINSON, 2008). Estas
variações no curso da infecção por Mtb e em suas consequências epidemiológicas
dependem de um grande complexo de fatores, que ainda não foram completamente
elucidados, mas podem abranger variações no hospedeiro, no patógeno ou mesmo no meio
ambiente (HERNANDEZ et al., 2010).
Ao atingir o ambiente pulmonar, o Mtb transportado por partículas suspensas no ar
é rapidamente reconhecido por células fagocíticas, principalmente macrófagos alveolares,
células dendríticas locais (CDs), macrófagos intersticiais e possivelmente também células
epiteliais (OTTENHOFF, 2012). Estes tipos celulares reconhecem padrões moleculares
associados à patógenos (PAMPs) presentes no Mtb através da interação de receptores de
reconhecimento destes padrões (PRRs), promovendo a fagocitose do microrganismo, tais
como: receptores para porção Fc de imunoglobulinas (FcR), receptores de complemento,
manose, proteína surfactante, CD14 e CD43 (PETERSON et al., 1995; ZIMMERLI;
EDWARDS; ERNST, 1996; ADEREM; UNDERHILL, 1999; RANDHAWA et al., 2005).
Entretanto, o mais importante destes PRRs são os Receptores Toll Like (TLRs),
especialmente, o TLR-2, TLR-4, TLR-9 por serem os maiores envolvidos no
reconhecimento do Mtb (KLEINNIJENHUIS et al., 2011). O TLR-2 forma heterodímero
com TLR-1 ou TLR-6. Estes heterodímeros tem sido implicados no reconhecimento de
glicolipídios da parede celular micobacteriana. O TLR-2 é um importante na ativação da
imunidade inata através de feitos estimuladores para produção de Fator de Necrose
Tumoral Alfa (TNF-α) e interleucina-12 (IL-12) em macrófagos (UNDERHILL et al.,
1999; POMPEI et al., 2007). O TLR-4 é ativado pela proteína de choque térmico 60/65
(Hsp60/65), secretada por uma variedade de espécies de Mtb. Macrófagos de animais
deficientes de TLR-4 apresentaram baixa produção de TNF-α (REILING et al., 2002).
TLR-9 induz o aumento de IL-12 por CDs e em células infectadas por Mtb in vitro e in
19
vivo. Ademais, animais deficientes de TLR-9 mostraram-se suscetíveis a infecção pelo Mtb
(BAFICA et al., 2005).
Após à infecção inicial pelo Mtb e a fagocitose, inicia a produção de citocinas próinflamatórias, como a interleucina 1α (IL-1α) e a interleucina 1β (IL-1β) (ERNST, 2012;
OTTENHOFF, 2012). Em consequência à produção destas citocinas, novos macrófagos
começam a ser recrutados para o sítio de infecção durante a atividade da resposta imune
inata em resposta ao gradiente de quimiocinas liberadas pelas células infectadas ou por
células do sistema imune ativadas, formando um infiltrado celular que se desenvolve em
um granuloma primário. Os granulomas constituem agregados celulares organizados
contendo macrófagos maduros que surgem com a persistência do antígeno a partir das
quais células hospedeiras podem rapidamente influir e efluir de dentro deles
(RAMAKRISHNAN, 2012).
A imunidade celular adaptativa tem sido conhecida como tendo um papel chave no
controle de infecções micobacterianas (OTTENHOFF; KAUFMANN, 2012), envolvendo
uma atividade coordenada de células apresentando antígeno (APCs) com linfócitos T
helper (CD4+) (OTTENHOFF, 2012). As DCs presentes na região de infecção apresentam
capacidade de fagocitar bacilos e de migrar para os linfonodos, onde apresentam estes
antígenos e ativam linfócitos T “näive” que por sua vez, de maneira dependente tanto da
presentação do antígeno pelas APCs quanto do microambiente de citocinas no qual estas
células encontram-se inseridas, podem se diferenciar em células T helper 1 (Th1),
produtoras de interferon-gama (IFN-γ), células T helper 17 (Th17), secretoras de
interleucina-17 (IL-17) e em linfócitos T citotóxicos (T CD8) efetores, capazes de induzir
apoptose nas células infectadas (EHLERS; SCHAIBLE, 2012). O IFN-γ e o TNF-α, são as
principais citocinas envolvidas na resposta imune celular adaptativa, a primeiro sendo a
citocina produzida por uma robusta resposta Th1 mediada por células, que por sua vez
exige a ação de IL-12 para a sua geração em camundongos e seres humanos; e a segunda,
produzida por macrófagos em resposta ao IFN-γ e apresenta capacidade de induzir ativação
de macrófagos e potencializar seus mecanismos microbicidas (CHAN et al., 1992).
Indivíduos que apresentam defeitos nos genes que codificam IFN-γ e IL-12 ou que se
encontram em tratamento com bloqueadores de TNF-α estão mais suscetíveis a
desenvolverem TB ou a reativarem LTBI (ALTARE et al., 1998; KEANE et al., 2001;
KAMPMANN et al., 2005). Esta resposta é regulada pela produção de interleucina 4 (IL-4)
20
e Fator de Crescimento Transformador (TGF-β) produzidas à medida que a infecção vai
sendo controlada gradativamente (HERNANDEZ-PANDO et al., 2006; ROY et al., 2008).
As células T ativadas migram para a região da infecção e são capazes de infiltrar no
granuloma, levando a formação de um granuloma maior e melhor organizado, onde os
bacilos e os macrófagos localizam-se no centro, circundados por células T na periferia.
Neste ambiente, estas células podem liberar citocinas que irão ativar os macrófagos e
potencializar sua capacidade antimicrobiana, cerceando assim o desenvolvimento da
infecção (EHLERS; SCHAIBLE, 2012). Células B também são capazes de infiltrar o
pulmão de camundongos infectados com Mtb e humanos
(TSAI et al., 2006), e se
organizam em folículos de células B na periferia do granuloma (ULRICHS et al., 2004;
KAHNERT et al., 2007; MAGLIONE; XU; CHAN, 2007). Ao lado das células T, células
B modulam a formação e a função do granuloma através da interação com os componentes
celulares envolvidos na formação destes (LUGO-VILLARINO et al., 2012). Camundongos
deficientes de células B exibiram uma suscetibilidade para infecção pelo Mtb,
acompanhado pelo aumento de níveis de interleucina-10 (IL-10) (JUNQUEIRA-KIPNIS et
al., 2005; RUSSO; MARIANO, 2010), favorecendo polarização de macrófagos para um
perfil regulador (M2). Outras subpopulações de células B podem ser fonte de IL-10 in vivo,
conhecidos
como
células
B
reguladoras
(Breg)
(O'GARRA
et
al.,
1990;
LAMPROPOULOU et al., 2008). Outro mecanismo de modulação in vivo, é a produção de
imunoglobulinas do tipo G (IgG) pela sua interação com o FcR (ANDREU et al., 2010).
Durante muito tempo o papel das células B na TB foi pouco explorado, devido ao
relato de que camundongos deficientes de IgM, após a infecção por Mtb, apresentarem
carga bacilar aumentada, porém mantiveram resposta Th1 semelhante a animais selvagens
e quando imunizados com a BCG ambos os animais diminuiram a carga bacilar
(VORDERMEIER et al., 1996). Estabeleceu-se, então, que os principais mecanismos de
defesa da resposta imune a patógenos intracelulares, como o Mtb, são principalmente
caracterizados pela ativação de mecanismos microbicidas dos macrófagos (FLYNN;
CHAN, 2001). Neste contexto, a resposta imune de proteção para TB seria principalmente
conferida pelos linfócitos T que apresentam capacidade de estimular mecanismos
antimicobacterianos em fagócitos mononucleares (COLLINS; KAUFMANN, 2001).
21
A produção de anticorpos foi inicialmente considerada menos relevante na TB
devido a sua incapacidade de interagir diretamente com o Mtb uma vez que este reside em
fagócitos mononucleares e/ou outras células do hospedeiro (KAUFMANN; HUSSEY;
LAMBERT, 2010). Porém, recentemente, a contribuição dos anticorpos e das células B
para a proteção na TB está sendo reconsiderada (ACHKAR; CASADEVALL, 2013;
KOZAKIEWICZ et al., 2013b). Estudo recente demonstrou a existência de resposta celular
(células TCD4+ e TCD8+) e humoral (células B) de longa vida (memória) específica para
antígenos do Mtb em indivíduos saudáveis vacinados com BCG, devido a presença de
células B de memória em sangue periférico nestes indivíduos (SEBINA et al., 2012),
sugerindo que a diferença na resposta imune humoral pode refletir a apresentação clínica
de indivíduos infectados (HERNANDEZ et al., 2010; SUTHERLAND et al., 2011;
ASHENAFI et al., 2013).
A produção de anticorpos específicos pode mediar a formação de complexos
imunes que podem modular a função de células efetoras bem como CDs e macrófagos
(KAUFMANN; HUSSEY; LAMBERT, 2010). Os efeitos protetores dos anticorpos contra
micobactérias se manifestam ou com a diminuição na carga bacteriana em tecidos ou na
alteração da resposta inflamatória (GLATMAN-FREEDMAN, 2006). Guirado e
colaboradores (2006) utilizando camundongos imunodeficientes (SCID) demonstraram
a contribuição de anticorpos policlonais na proteção contra o Mtb após o tratamento com
fármacos anti-TB. Outro estudo, utilizando anticorpos monoclonais específicos para
componentes da parede de micobactérias, tais como, arabinomanana, lipoarabinomanana,
hemaglutinina de ligação à heparina de 16 kDa e α-cristalina, também apresentaram
proteção de camundongos infectados por Mtb (HAMASUR et al., 2004; PETHE et al.,
2001; RELJIC et al., 2006). Ademais, uma vacina contendo um conjugado proteicoarabinomannan de Mtb foi capaz de gerar uma resposta de anticorpos superior à induzida
por BCG em camundongos, e apresentou-se eficaz na melhoria da sobrevivência de
animais desafiados (HAMASUR et al., 2003). Entretanto, a resposta imune humoral pode
sofrer influência de vários fatores, que podem abranger desde a multifuncionalidade das
células B e ir até ao fato de que camundognos não são a espécie mais apropriada para estes
estudos, devido ao fato de que a resposta anti-TB em camundongos é excessivamente mais
forte que o necessário para o controle eficaz da infecção, e assim poderia mascarar o
significado de certos fatores imunológicos que contribuem substancialmente para a defesa
22
contra este patógeno. Ademais, é importante considerar a resposta de anticorpos naturais
produzidos por células B de zona marginal e B1, uma vez que lípidos complexos e
polissacáridos são componentes do envelope celular do Mtb (KOZAKIEWICZ et al.,
2013b).
Além da produção de anticorpos, células B podem formar uma resposta imune pela
modulação de células T via um número de mecanismos baseados na apresentação de
antígeno e na produção de anticorpos e citocinas (MAGLIONE; CHAN, 2009; LUND;
RANDALL, 2010). As células B também podem atuar como células APCs e influenciar a
ativação de células T, polarização destas células, função efetora e no desenvolvimento de
células T de memória (LINTON; HARBERTSON; BRADLEY, 2000; LUND et al., 2006;
WHITMIRE et al., 2009) (Figura 2). Além disso, células B podem modular a função de
células imunes granulomatosas. Evidências como a presença de células B em pulmões de
camundongos e em granulomas de cobaias, ambos infectados com Mtb, sugerem um papel
importante para as células B na imunopatologia da TB (RAMAKRISHNAN, 2012).
Em conjunto, as funções de células B dependentes ou independentes de anticorpos
apresentam um papel importante na determinação da progressão da doença, no que diz
respeito à eliminação e controle de patógenos intracelulares, bem como no
desenvolvimento da imunopatologia que poderia causar dano tecidual e promover a
disseminação (KOZAKIEWICZ et al., 2013b).
23
Figura 2: Modulação da resposta imune ao M. tuberculosis pelas células B. Células B
específicas para antígenos de Mtb após ativação podem se diferenciar em plasmócitos
produtores de anticorpos específicos que podem mediar a formação do imunocomplexos
que podem modular as funções das células efectoras, tais como as células dendríticas e
macrófagos. As células B podem ainda apresentar características de célula apresentadora
de antigeno e influenciar a activação de células T e suas funções efectoras. As células B
também pode modular as funções das células imunes granulomatosas . Associadas, estas
células B funcionais dependente ou não de anticorpos desempenham um papel importante
na determinação da evolução da doença, controlo de crescimento bacteriano, bem como o
desenvolvimento de imunopatologia que poderia causar dano aos tecidos e promover a
disseminação do bacilo.
Adaptado de (KOZAKIEWICZ et al., 2013b)
1.3.
Bacilo Calmette-Guérin – BCG
Na tentativa de desenvolver uma vacina, Albert Calmete e Camille Guérin
atenuaram um isolado de M. bovis através de múltiplas passagens. A vacina para
tuberculose M. bovis bacille Camette-Guérin (BCG) foi primeiramente testado em
humanos em 1921 e a primeira campanha de imunização em massa de indivíduos
24
negativos ao Teste de Sensibilidade a Tuberculina (TST) foi realizada na Polônia em 1948
(ROWLAND; MCSHANE, 2011). A BCG tem feito parte do Programa de Imunização da
OMS desde 1974 e é administrada logo após o nascimento em países com alta prevalência
de TB, em lactantes de grupos de alto risco ou crianças TST negativas em países com
baixa incidência da doença (BCG vaccine. WHO position paper, 2004).
O BCG originalmente distribuído a nível mundial para a produção da vacina contra
a TB evoluiu de forma diferente em todo o mundo, devido às condições específicas de
fabricação, resultando na geração de mais de 49 subcepas já relatadas (CORBEL et al.,
2004) A genealogia de vacinas BCG foi determinada por meio da identificação de
marcadores genéticos que claramente caracteriza os seus pontos de divergência
(KRYSZTOPA-GRZYBOWSKA et al., 2013).
Estima-se que 5% da produção mundial de BCG é baseada na utilização da subcepa
Moreau que foi originalmente enviada da França para o Brasil em 1925 pelo Dr. Julio
Elvio e chegou o país em 1954, através das mãos do Dr. Van Deinse. A produção da vacina
BCG utilizando o M. bovis subcepa BCG Moreau começou em 1951, depois de vários
estudos confirmando sua eficácia (KRYSZTOPA-GRZYBOWSKA et al., 2013).
A BCG é a única vacina aprovada para uso humano contra a TB, devido sua
eficácia na proteção das formas mais graves da doença em crianças (COLDITZ et al.,
1994; BONIFACHICH et al., 2006; TRUNZ; FINE; DYE, 2006), e o fato de que as
complicações pela vacinação com a BCG são extremamente raras (BCG vaccine. WHO
position paper, 2004). A BCG também apresenta um importante efeito benéfico não
específico na mortalidade infantil (SHANN, 2004; ROTH, A. et al., 2006). Em um estudo
randomizado na Guiné-Bissau, a revacinação com BCG foi associada a um aumento
significativo de sobrevivência em crianças que receberam vacinas contra difteria-tétanopertussis (DTP)-booster antes da inscrição (RODRIGUES et al., 2007; ROTH, A. E. et al.,
2010) e em crianças que não receberam suplementação de micronutrientes (BENN et al.,
2009), especialmente crianças do gênero feminino (ROTH, A. E. et al., 2010). Além disso,
apesar do principal objetivo da vacina BCG ser prevenir a TB, é bem estabelecido que uma
única dose de BCG confere algum grau de proteção significativa contra a hanseníase, que
variam de 20 a 80% (ABEL et al , 1990; ZODPEY et al , 2005). Estudos de coorte
(CUNHA et al., 2004; MATOS et al., 1999) e de caso-controle (LOMBARDI et al ., 1995)
25
ambos realizados no Brasil, demonstraram que a administração rotineira de BCG a
neonatos para prevenir a TB tem um impacto importante e muitas vezes esquecido na
ocorrência e transmissão da hanseníase (DUPPRE et al., 2008)
No entanto, a proteção do BCG contra a TBP, especialmente em adultos, é muito
variável e em sua maioria insuficiente (FINE, 1995). Outra desvantagem atribuída a BCG
é a contra-indicação para indivíduos apresentando condições de imunocomprometimento,
demonstrada a partir da observação da disseminação do bacilo em crianças infectadas pelo
HIV (HESSELING et al., 2007; ROWLAND; MCSHANE, 2011).
A necessidade do desenvolvimento de uma vacina capaz de prevenir a TB em todas
as faixas etárias é particularmente importante devido ao aumento da incidência de casos
resistentes aos antibióticos utilizados no tratamento da doença (MDR ou XDR) (WHO
publishes Global tuberculosis report 2013, 2013). A disponibilidade da sequência completa
do genoma de Mtb e M. bovis, permitiu a identificação de proteínas conservadas entre as
duas espécies, tornando esta uma potencial ferramenta para a identificação de componentes
de novas vacinas (DIETRICH; WELDINGH; ANDERSEN, 2006). Alguns estudos apóiam
o papel de alguns componentes da parede celular micobacteriana para o desenvolvimento
da patogênese da TB (SMITH; ARMITIGE; WANGER, 2003). Neste contexto, alguns dos
componentes da parede celular de micobactérias têm sido sugeridos como sendo potenciais
alvos para o desenvolvimento de novas formulações de vacina contra a TB (REYES et al.,
2013).
1.3.1.
Resposta imune ao BCG
Por muitos anos, em seres humanos, os únicos parâmetros utilizados para avaliar a
imunidade protetora induzida pelo BCG foram: a presença e o tamanho de uma cicatriz
induzida pela imunização, hipersensibilidade de tipo tardio (DTH), e prospectivo caso
constatação de TBP (KAUFMANN, 2005; FLETCHER, 2007). Avanços no entendimento
imunobiológico da TB, associado ao desenvolvimento de novas vacinas, proporcionaram
uma série de potenciais imunológicos associados com a proteção além de um maior
26
interesse na compreenção da resposta imune protetora induzida pela BCG (RITZ et al.,
2008).
O controle imunológico da infecção por Mtb é conhecido por depender de TNF-α
(KEANE et al., 2001), e IFN-γ, (COOPER et al., 1993; FLYNN et al., 1993). O IFN-γ é
essencial para a proteção contra a TB e, embora não seja um correlato de proteção, se
correlaciona bem com outras funções Th1, além de ser a citocina que possibilita a medida
mais robusta de resposta à vacina (KAGINA et al., 2010). Similarmente, em humanos,
deficiência do receptor de IFN-γ está associado com o aumento da suscetibilidade para
infecção micobacteriana (DORMAN et al., 2004; FERNANDO; BRITTON, 2006).
Portanto, é de grande importância para a compreensão dos mecanismos pelos quais as
diferentes vacinas induzem esta resposta imune, assim como a compreensão da base de
uma resposta imune protetora às doenças para as quais as vacinas estão sendo testadas
(MARSAY et al., 2013).
No entanto, embora a produção de IFN-γ seja essencial para a proteção contra a TB,
existem evidências de que outros fatores imunológicos e reguladores desempenham um
papel importante nesta proteção (OLSEN et al., 2000; ELIAS; AKUFFO; BRITTON,
2005), incluindo TNF-α (FLYNN et al., 1995), IL-12 (COOPER et al., 1997), IL-17
(CRUZ et al., 2006), interleucina-23 (IL-23) (WOZNIAK et al., 2006), células Tγδ (HOFT
et al., 2002), células NKT (JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2003), células T reguladoras
(HANEKOM, 2005) e células B (TORRADO et al., 2013). Porém, como reflexo da
complexidade dos mecanismos e interações envolvidas na proteção contra a TB, até o
momento, nenhum marcador imunológico único foi demonstrado para prever a eficácia da
vacina BCG (VINEY; RILEY; BUCHANAN, 2005). Neste contexto, o papel de qualquer
citocina individual é totalmente dependente do contexto proporcionado por outras citocinas
e fatores reguladores, assim, uma combinação de parâmetros imunológicos ou um padrão
de secreção de citocinas é mais aceitável como correlato de forte imunidade protetora
(RITZ et al., 2008).
Na imunização com a BCG, células Th17 populam o pulmão de camundongos
imunizados (KHADER et al., 2007), onde produzem IL-17 que apresenta um importante
papel no recrutamento de neutrófilos para o ambiente infectado (KORN et al., 2009;
TORRADO; COOPER, 2010) e este fenômeno tem sido associado com excessiva
27
patologia pulmonar e com baixo controle bacilar em camundongos geneticamente
suscetíveis (KELLER et al., 2006). Além disso, a IL-17 pode regular a produção de IL-10
e consequentemente direcionar a uma resposta Th1 (GOPAL et al., 2012). Entretanto,
resultados obtidos a partir de um modelo de camundongos com imunodeficiência ligada ao
X (xid), deficientes de células B, sugerem que a neutrofilia pode afetar negativamente a
eficácia da vacina BCG (KONDRATIEVA et al., 2010).
Por outro lado, estudos envolvendo depleção de células B tem revelado que estas
células podem aumentar ou diminuir a resposta Th17 (HU et al., 2007; HAMEL et al.,
2008; MARINO et al., 2009). Um estudo realizado utilizando camundongos deficientes de
células B demonstrou que células B podem regular a neutrofilia durante a infecção pelo
Mtb e na imunização por BCG. E que possivelmente a neutrofilia no local de imunização
afeta negativamente o desenvolvimento da resposta Th1 induzida por BCG, diminuindo a
migração de CDs para os gânglios linfáticos de drenagem, atenuando assim a imunidade de
células T contra o Mtb. Neste contexto, células B poderiam otimizar a resposta Th1
induzida pela BCG pela regulação de IL-17 e consequentemente a resposta de neutrófilos.
Finalmente, a neutrofilia pulmonar e o aumento da resposta Th17 observada nos
camundongos deficientes de células B infectados por Mtb pode ser recuperada por
soroterapia, sugerindo que as imunoglobulinas podem contribuir para a regulação deste
fenótipo (KOZAKIEWICZ et al., 2013a).
A imunidade humoral de vida longa é resultado da geração de plasmócitos de vida
longa, que secretam anticorpos, e também de células B de memória (TANGYE et al., 2003;
TANGYE; TARLINTON, 2009). Em caso de reencontro com o antígeno, as células B de
memória são capazes de responder de maneira rápida e específica, de maneira a contribuir,
juntamente com plasmócitos de vida longa e plasmócitos de vida curta, para o aumento o
níveis de anticorpos específicos (BERNASCONI; TRAGGIAI; LANZAVECCHIA, 2002;
YOON et al., 2009). Além disso, células B de memória podem persistir por toda a vida,
contribuindo assim para uma rápida eliminação de patógenos após reexposição ao longo da
vida do hospedeiro (KELLY; POLLARD; MOXON, 2005; BLANCHARD ROHNER et
al., 2008; BLANCHARD-ROHNER et al., 2009). Estudo realizado por Sebina et al., 2012
demonstrou, em humanos, a presença de células B de memória específica a antígenos de
micobactérias no sangue periférico de indivíduos saudáveis que vivem em áreas de baixa
endemicidade para a TB, e que estas respostas duram até 45 anos após a vacinação por
28
BCG. Além disso, este mesmo estudo levantou a hipótese de que a presença de
plasmoblastos específicos para o antígenos presentes na circulação periférica pode refletir
na progressão da infecção, enquanto que células B de memória antígeno-específicas na
ausência de plasmoblastos pode refletir uma infecção resolvida ou subclínica (SEBINA et
al., 2012).
1.4.
Linfócitos B
A reatividade aumentada para antígenos anteriormente já vistos constitui uma
característica primordial da imunidade adaptativa (GEMEROY; KOFFLER, 1949). Em
1957 foi postulado que as células do sistema imunitário seriam capazes de produzir
anticorpos e que estes constituíam a unidade fundamental de seleção para a resposta imune
(TALMAGE, 1957). A identificação de células que produziam anticorpos e a
especificidade do anticorpo produzido pelas células individuais (NOSSAL, 1959; RAFF;
FELDMANN; DE PETRIS, 1973) conferiram suporte experimental para a seleção clonal,
como a força motriz na imunidade adaptativa (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.;
MCHEYZER-WILLIAMS, 2005).
Em meados da década de 60, estudos de timectomia neonatal identificaram um
papel essencial do timo para uma imunidade adaptativa eficiente (MILLER, 1961), e a
transferência de células da medula óssea e tímicas misturadas sugeriram que estas células
trabalham juntas (CLAMAN; CHAPERON; TRIPLETT, 1966). Posteriormente, estudos
de transferências celulares puderam estabelecer que possivelmente as células da medula
óssea geravam células precursoras produtoras de anticorpos e que as células derivadas do
timo seriam capazes de intensificar a resposta de células B (MILLER; MITCHELL, 1967).
Subsequentemente, estudos do efeito hapteno-carreador começaram a comprovar os
mecanismos da colaboração existente entre as células T e B (PAUL; SISKIND;
BENACERRAF, 1966; KATZ et al., 1970; MITCHISON, 1971). Desta forma, a seleção
clonal de células B e a diferenciação em plasmócitos seriam controlados de maneira
antígeno-específica por células T helper (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZERWILLIAMS, 2005). Estes estudos celulares clássicos conferem a fundamentação para
29
nossa compreensão da regulação cognata na imunidade adaptativa (MCHEYZERWILLIAMS, L. J.; MCHEYZER-WILLIAMS, 2005).
A imunidade mediada por anticorpos após infecção primária ou vacinação depende
do desenvolvimento e persistência de células B de memória específicas e plasmócitos
secretores de anticorpos (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZER-WILLIAMS,
2005; TARLINTON, 2008). Plasmócitos secretam anticorpos constitutivamente, e assim,
fornecem o primeiro nível de proteção contra o microrganismo anteriormente visto. Porém,
os plasmócitos aparentemente não respondem em infecções secundárias devido a sua baixa
expressão de imunoglobulinas, como receptor de célula B (BCR), em sua superfície
(MANZ et al., 1998). No entanto, células B de memória mantêm a expressão de BCR e são
capazes de diferenciar em células secretoras de anticorpos após encontrarem o antígeno
pela segunda vez (DOGAN et al., 2009; PAPE et al., 2011).
1.4.1. Desenvolvimento dos linfócitos B
Em mamíferos adultos saudáveis, o número de linfócitos B maduros permanece
constante, e esta característica é conhecida como homeostasia da célula B (AGENES;
ROSADO; FREITAS, 2000). Para alcançar esta homeostasia é importante considerar a
natureza complexa do desenvolvimento de células B e sua maturação (MACKAY;
SCHNEIDER, 2009; KUROSAKI; SHINOHARA; BABA, 2010), que não só deve
permitir a sobrevivência e constante produção de células B, mas também garantir a
eliminação ativa de células B emergentes com especificidade a antígenos próprios
(SHLOMCHIK, 2008). Os linfócitos B desenvolvem-se na medula óssea (MO) a partir de
células precursoras hematopoiética, no entanto, durante o período embrionário, a MO é
povoada por células-tronco hematopoiéticas desenvolvidas no fígado fetal. Estas células
precursoras originam-se da região mesodérmica (MULLER et al., 1994; MEDVINSKY;
DZIERZAK, 1996).
O monitoramento contínuo da expressão e adequada sinalização do BCR constitui o
mecanismo principal do desenvolvimento destas células (LAM; KUHN; RAJEWSKY,
1997). Esta regulação ocorre inicialmente quando a célula precursora de linfócito B (célula
30
pró-B) necessita da expressão de um pré-BCR funcional para avançar no seu processo de
desenvolvimento (ALLMAN et al., 1993; CARSETTI; KOHLER; LAMERS, 1995). Para
isto, células pró-B rearranjam primeiramente os segmentos D e J da cadeia pesada (H),
seguidamente ocorre o segundo rearranjo juntando a região V ao segmento DJ rearranjado
(PIEPER; GRIMBACHER; EIBEL, 2013). O pré-BCR tem basicamente duas funções: A
primeira delas é a de encerrar as atividades e expressão da maquinaria enzimática que
catalisa o rearranjo dos segmentos de gene de cadeia H, processo denominado exclusão
alélica (TEN BOEKEL; MELCHERS; ROLINK, 1998). Isto evita a expressão de duas
cadeias pesadas, com especificidades diferentes em uma mesma célula. A segunda tarefa é
iniciar o rearranjo dos genes de cadeia leve (PIEPER; GRIMBACHER; EIBEL, 2013).
O rearranjo funcional dos segmentos gênicos da cadeia pesada µ abre a entrada para
o próximo estágio, o estágio de células pré-B, quando a célula é chamada de pré-B
(PIEPER; GRIMBACHER; EIBEL, 2013). Estas células pré-B submetem-se a uma ou
duas divisões celulares e rearranjam os segmentos gênicos que codificam as cadeias κ e λ
(VAN ZELM et al., 2007), que combinadas com a cadeia µ, formam uma molécula de
imunoglobulina M (IgM) que é expressa na superfície da célula. A célula espressando esta
molécula é então denominada célula B imatura (PIEPER; GRIMBACHER; EIBEL, 2013).
Após a expressão do BCR os eventos posteriores de seleção positiva e negativa ocorrem na
(IgM) expressa em linfócitos B imaturos, por meio da afinidade a auto-antígenos, que leva
à formação de células B de transição que regulam a expressão da imunoglobulina (IgD)
para saída destas células para a periferia (ALLMAN et al., 1993; CARSETTI; KOHLER;
LAMERS, 1995). Células B imaturas deixam a MO e migram para o baço, onde eles
finalizam o desenvolvimento precoce pela diferenciação em células B naive, folicular ou
de zona marginal (PIEPER; GRIMBACHER; EIBEL, 2013).
Células B maduras circulam pelo corpo através da corrente sanguínea e da linfa
visitando órgãos linfóides secundários, tais como baço, linfonodos, tonsilas, placas de
Peyer e tecidos mucosos. A recirculação de células B para folículos, formação de Centros
Germinativos (CGs), e saída a partir de tecidos de volta a circulação são processos
regulados por moléculas de adesão e pela ação recíproca entre diferentes receptores
acoplados a proteína G. Embora os receptores de quimiocinas respondam a um gradiente
de quimiocinas produzidas por células do estroma tecidual, receptores de esfingosina-1fosfato (S1P) reagem contra S1P, que em altas concentrações no sangue e na linfa atraem
31
células B e induzem a saída dos tecidos linfóides (SCHWAB et al., 2005; PIEPER;
GRIMBACHER; EIBEL, 2013).
Embora o BCR seja o principal receptor para a diferenciação das células B, também
é necessária a integração de sinais fornecidos pelas moléculas de co-receptor (por exemplo,
CD19, CD21, CD22, CD72 e FcɣRIIB), modulando o reconhecimento de antígenos (Ag) e
de transdução de sinal através da BCR, fornecendo informações quanto à natureza do Ag,
bem como, o contexto em que este foi encontrado (OTERO; ANZELON; RICKERT,
2003). De modo particular, esta capacidade é característica da proteína de superfície CD19,
que é uma proteína transmembranar de 95 kDa, expressa exclusivamente pelas células B
(STAMENKOVIC; SEED, 1988; TEDDER; ISAACS, 1989). O início da expressão de
CD19 ocorre nos primeiros estágios de desenvolvimento das células B antes mesmo da
expressão do pré-BCR. Em células B maduras, CD19 é encontrado em um complexo com
o receptor de complemento (CD21), o alvo de anticorpo anti-proliferativo (TAPA; também
chamado de CD81) e Leu 13 (MATSUMOTO, A. K. et al., 1991; BRADBURY et al.,
1992). O CD19 associado com o complexo BCR é rapidamente fosforilado quando o BCR
interage com o Ag (CHALUPNY et al., 1993; UCKUN et al., 1993), aumentando o
gradiente de ativação da células B (CARTER; FEARON, 1992), supostamente através do
reforçado recrutamento ou ativação de quinases associadas e moléculas adaptadoras
(OTERO; ANZELON; RICKERT, 2003).
Outras moléculas também apresentam este perfil de expressão, o CD38,
semelhantemente ao B220, inicia sua expressão em células da medula óssea (MO) de
camundongos e continua sendo expresso através de todos os estágios de diferenciação
tanto na MO quanto no baço (VENCES-CATALAN; SANTOS-ARGUMEDO, 2011).
Durante os estágios iniciais de diferenciação, a expressão de CD38 aparece mais
heterogênea, porém em estágios mais tardios, a expressão desta molécula apresenta-se
mais homogêneo (DONIS-HERNANDEZ; PARKHOUSE; SANTOS-ARGUMEDO,
2001). Células B foliculares naives após a ativação apresentam alta regulação da expressão
de CD38 e por este motivo tem sido usado como um marcador de ativação (OLIVER;
MARTIN; KEARNEY, 1997). Entretanto, estudos em camundongos indicam que o CD38
apresenta baixa expressão em células B de memória que sofreram maturação em CGs
(OLIVER; MARTIN; KEARNEY, 1997; SEIFERT et al., 2012).
32
Nos ambientes de CGs, as células B ativadas apresentam a expressão de CD27
como marcador do processo de ativação, proliferação e mudança de isotipo (WORTIS;
BERLAND, 2001; VODJGANI et al., 2007).
Assim, fenótipo de expressão de
CD19+CD27+ caracteriza as células B como linfócitos B de memória (KLEIN;
RAJEWSKY; KUPPERS, 1998; AGEMATSU et al., 2000; SHI, Y. et al., 2003; AVERY
et al., 2005; PIEPER; GRIMBACHER; EIBEL, 2013; DAIEN et al., 2014).
O processo de desenvolvimento da resposta imune de células B de memória
específicas para antígenos pode ser regulado pelas células T helper (Th) e ocorre num
processo constituído por três fases (Figura 3): I – desenvolvimento de resposta de células B
efetoras; II desenvolvimento de células Th efetoras específicas; III – desenvolvimento de
células B de memória (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZER-WILLIAMS,
2005).
A interação de antígenos solúveis nativos com o BCR na célula B promove a
internalização destes antígenos para subsequente processamento e apresentação de
pepitídeos, derivados da quebra do antígeno, para células T (Figura 3A, Fase I)
(BATISTA; IBER; NEUBERGER, 2001). Quando antígenos são expostos para células B,
o reconhecimento é realizado pelo BCR e promove a sinalização de intermediários
intracelulares nas células B. Moléculas de adesão de anéis periféricos, bem como,
reguladores negativos, tais como CD45 e CD22, são excluídos da interface celular. Esta
sinapse imune entre células B e APC diminui limiares de ativação de células B e promove
a captação e o processamento de antígeno associado às células (BATISTA; IBER;
NEUBERGER, 2001). Além disso, a produção de IL-4 por células mielóides in vivo
condiciona a célula B naive a receber sinais através da interação com moléculas de
histocompatibilidade de classe II (MHC-II). Embora estes sinais tenham efeitos globais
sobre as células B virgens, como consequência de certos adjuvantes imunológicos, eles não
parecem influenciar a produção de IgG1 específica ao antígeno (JORDAN et al., 2004).
33
Figura 3: Processo de desenvolvimento da resposta imune de células B de memória
específicas para antígenos
Adaptado de (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZER-WILLIAMS, 2005)
Como demonstrado na figura 3A (Fase I), células Th naive após interagirem com a
CD ativada (APC), sofrem expansão clonal e se diferenciam em células Th efetoras (Th1,
Th2) (MOSMANN; COFFMAN, 1989). Além disso, esta interação celular (Sinapse I) tem
uma grande importância devido ao aumento da expressão de moléculas de superfície,
chamada Ligante de CD40 (CD40L) conhecidas por terem um importante papel no
segundo sinal de ativação, importante no desenvolvimento das células B (BISHOP;
HOSTAGER, 2001).
34
A resposta imune de células B contra antígenos timo-dependentes, necessita ser
apresentados via MHC ao linfócito T, requerendo assim a interação de células T
previamente ativadas com as células B para promover a ativação de células B específicas
ao antígeno (MATSUMOTO, M. et al., 1996a). Esta sinapse imune (Sinapse II) entre
células Th efetoras e células B antígeno específicas é quantitativa e qualitativamente
distinta das sinapses imune I (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZERWILLIAMS, 2005). A interação do receptor CD40, expresso constitutivamente pelas
células B, com seu ligante CD40L tem um papel essencial na recombinação, mudança de
classe e formação do CG (ARMITAGE et al., 1992; BANCHEREAU et al., 1994). A falta
de OX40 (CD134) e/ou seu ligante OX40L (CD134L) interfere com a recombinação, mas
mantêm intacta a formação do CG (BISHOP; HOSTAGER, 2001). A interação de CD27CD70 parece promover a formação de plasmócitos, enquanto que a interação CD30CD153 tem um efeito inibidor na recombinação e limita a produção de anticorpos in vivo
(BISHOP; HOSTAGER, 2001). Outras moléculas coestimuladoras têm sido sugeridas
como favorecedoras da interação CD40-CD40L, entre elas, o Ligante de Coestimulador
Induzível (ICOSL) expresso constitutivamente nas células B, e seu receptor (ICOS)
expresso em células Th ativadas (DONG et al., 2001; MCADAM et al., 2001; TAFURI et
al., 2001). Embora os sinais de CD28 nas células Th naives através de CD80 e CD86,
expresso em CDs ativadas tenham impacto substancial na ativação e expansão clonal das
células Th (SHARPE; FREEMAN, 2002), sua influência na segunda sinapse imune não é
bem estabelecida. O antígeno associado ao linfócitos T citotóxico 4 (CTLA-4) é uma
molécula que regula a ativação imune e a expansão clonal (WATERHOUSE et al., 1995;
SHARPE; FREEMAN, 2002). Este controle de moléculas tem impacto substancial no
resultado da resposta imune adaptativa determinando a qualidade e quantidade da resposta
de células B primária e de memória (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZERWILLIAMS, 2005).
Os CGs constituem o sítio primário de maturação da afinidade de células B e as
células T helper foliculares (ThF) são importantes nesse processo de geração de células B
com maior afinidade para o antígeno, bem como, de evitar a geração de células B
autoreativas
geradas
pelo
processo
de
hipermutação
somática
(VICTORA,
NUSSENZWEIG, 2012). As ThF regulam o tamanho do CG, restringindo a entrada de
células B de baixa afinidade e selecionando células B de alta afinidade durante a maturação
35
da afinidade (SCHWICKERT et al., 2011; VICTORA et al., 2010). A maioria das células
B de GC não podem ativar a sinalização por BCR, de maneira que estas céulas dependem
de sinais auxiliares fornecidos pelas células ThF para discriminar quais as células B de CG
devem proliferar. Assim, células ThF selectivamente fornecem ajuda às células B com
maioria dos antígenos peptídicos (CROTTY, 2014). Os sinais auxiliares fornecidos por
células ThF às células B de CG consistem na secreção de citocinas (IL-21 e IL-4) e
interação entre receptores de superfície celular (CD40–CD40L) (CROTTY, 2011). Em
adição, células ThF induzem indiscriminadamente ambas as células B de alta e baixa
afinidade à produção de anticorpos de baixa afinidade ao longo do tempo (VICTORIA et
al., 2010) .
A magnitude e o espectro de isotipo de anticorpo expresso e secretado pela célula B
especifica é dependente de sinais fornecidos pela interação destas células com o linfócito T
helper folicular (THF) (CD40-CD40L; BAFF-BAFFR, entre outras). Entretanto, a
produção de citocinas pela célula T, no momento da interação destas células, é considerada
o mais influente regulador para a troca de isotipo in vivo (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.;
MCHEYZER-WILLIAMS, 2005; CROTTY, 2014). A produção de IL-4 direciona a
produção de IgG1 e de maneira gradual através de IgG1 para IgE (YOSHIDA et al., 1990),
diferentemente, no caso da produção de IFN-γ onde ocorre a troca de isotipo para a
subclasse IgG2a (YOSHIDA et al., 1990). A indução do isotipo IgA pode suceder a
produção de TGF-β (CAZAC; ROES, 2000). Assim, a indução da recombinação e troca de
isotipo, a propagação e sobrevivência de células B recombinadas, podem ser conferida pelo
contato entre estas células B recombinadas com células Th efetoras específicas para o
antígeno (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZER-WILLIAMS, 2005). Além disso,
desta mesma interação celular, pode ocorrer o desenvolvimento de células secretoras de
anticorpos que independem da formação do CG, nos folículos linfóides secundários,
chamadas plasmócitos de vida curta (Figura 3A – Fase II) (HO et al., 1986). Estes
plamócitos expressam e secretam anticorpos específicos para o antígeno codificado pela
linhagem
germinativa
(JACOB;
KELSOE,
1992)
e
apresenta
meia-vida
de
aproximadamente 3-5 dias in vivo (HO et al., 1986).
Células B que sofreram estímulo para a troca de isotipo durante a segunda sinapse
imune (Figura 3A – Fase II), caso não se diferenciem em plasmócito de vida curta, sofrem
expansão clonal rápida e maciça deslocando células B foliculares em repouso e criando
36
assim um dos fundamentos da dinâmica celular na reação do CG (MACLENNAN, 1994).
A polarização de folículos secundários, em uma zona proximal de célula T (zona escura)
de expansão ativa dos centroblastos e uma zona distal de células T (zona clara) de
centrócitos não ativos, marcam o início da reação do GC (Figura 3B – Fase III)
(MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZER-WILLIAMS, 2005). A reação do CG é
um ciclo de atividade celular e mudanças moleculares que regulam a evolução clonal
antígeno-específica durante o desenvolvimento da célula B de memória (MCHEYZERWILLIAMS, M. G.; AHMED, 1999; MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; DRIVER;
MCHEYZER-WILLIAMS, 2001; WOLNIAK; SHINALL; WALDSCHMIDT, 2004), no
qual a expansão clonal seguida pela diversificação do BCR e seleção baseada na afinidade
deste pelo antígeno, resultam na retenção ou re-entrada em um segundo ciclo de eventos do
CG, ou na saída do CG e entrada no compartimento de células B de memória de longa
duração (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZER-WILLIAMS, 2005).
Células B antígeno específicas que, inicialmente, entram no CG, se expandem
rapidamente e diminuem a expressão do BCR (MACLENNAN, 1994), permitindo a
diversificação do BCR através da Mutação Somática (MS). A MS é vista através da
introdução de substituições únicas de pares de bases, com raras inserções e deleções nas
regiões variáveis de segmentos gênicos dos anticorpos (BEREK; BERGER; APEL, 1991;
JACOB et al., 1991), mediada pela enzima Desaminase Induzida pela Ativação (AID)
(MURAMATSU et al., 2000; REVY et al., 2000). Aproximadamente uma mutação é
introduzida no BCR em cada divisão celular. O BCR variante é então expresso na
superfície de centrócitos que são selecionados de acordo com a afinidade do BCR se ligar
ao antígeno (RAJEWSKY, 1996) apresentado por CDs foliculares que por sua vez foram
capazes de reconhecer antígenos ligados a moléculas do complemento (imunocomplexos)
por meio de seus receptores FcγR (Figura 3B) (SZAKAL; KOSCO; TEW, 1988;
BARRINGTON et al., 2002).
As células B após sofrerem processo de expansão, diversificação, maturação da
afinidade e seleção deixam o CG e entram no compartimento de células B de memória de
longa vida (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZER-WILLIAMS, 2005). Existe um
consenso geral de que existe pelo menos uma outra maior subdivisão no compartimento de
células de memória. Onde um subtipo de célula B de memória com afinidade maturada
persiste como células não secretoras de anticorpos que seriam as precursoras da resposta
37
celular imediata a uma nova reação ao mesmo antígeno; e o outro, seriam plasmócitos de
longa vida que são diferenciados, sofreram maturação da afinidade e residem MO e
também podem ser considerados um subtipo de célula B de memória que contribui para a
memória sorológica e humoral (MCHEYZER-WILLIAMS, L. J.; MCHEYZERWILLIAMS, 2005).
1.5.
Novas vacinas para tuberculose (BCG recombinantes)
As principais estratégias utilizadas para o desenvolvimento de novas vacinas para
tuberculose são baseadas na formulação de vacinas de subunidade e na construção de BCG
recombinantes que podem conferir proteção similar a promovida pela BCG, além destas,
tem se desenvolvidos vacinas de vetores virais não recombinantes com aplicação como
reforço para a vacina BCG (DA COSTA et al., 2014). Assim, a maioria das novas
estratégias de vacinação tem sido desenvolvida com o objetivo de melhorar a proteção e/ou
a resposta imune de memória de longa vida induzida pela BCG. Seja substituindo a BCG
ou utilizando esquema de administração de doses de reforço com proteínas heterólogas
após dose única de BCG. Em ambos os casos, a vacinação está sendo realizada para
promover proteção contra a TBP, a principal forma da doença, em todas as faixas etárias
(KAUFMANN, 2014).
Diversas destas novas candidatas a vacina tem apresentado melhor desempenho que
a BCG, no diz respeito à eficácia e segurança protecional (KAUFMANN, 2014).
Atualmente 12 novas candidatas a vacinas para TB encontram-se em estágio de ensaios
clínicos: cinco delas são vacinas de subunidade protéica (H1, H4, H56, M72 e ID93); cinco
são vacinas de vetores virais expressando proteínas do Mtb administradas como reforço
para
a
BCG
(MVA85A,
Crucell
Ad35/Aeras
402,
Crucell
Ad5-MVA85A,
P85A±MVA85A, e Ad5HUAg85A); e 2 são vacinas vivas, sendo uma delas uma rBCG
(VPM1002) e a outra uma cepa de Mtb mutante (MTBVAC) (KAUFMANN, 2014).
A vacina VPM1002 (rBCGΔureC::hly) é uma BCG recombinante desenvolvida a
partir da subcepa Pasteur, e é caracterizada pela deleção do gene da urease (ureC) e
expressando gene da listeriolisina de Listeria monocytogenes (GRODE et al., 2005;
38
GRODE et al., 2013). Em estudos de ensaios clínicos de fase I a VPM1002 demonstrou ser
bem tolerada e imunogênica tanto em adultos vacinados com BCG quanto em adultos que
não receberam a dose da BCG na infância (GRODE et al., 2013). Mais recente em ensaios
clínicos de fase IIa realizados na África do Sul a VPM1002 não tem apresentado eventos
adversos quando administrada em crianças (KAUFMANN, 2014).
Na última década, diversas vacinas BCG recombinantes foram produzidas e
relatadas quanto a sua capacidade de induzir resposta imune de tipo Th1 específica para
antígenos do Mtb, bem como sua capacidade de proteger contra infecção pelo Mtb em
diferentes modelos animais (Quadro 1). A subcepa de BCG mais utilizadas para o
desenvolvimento de BCGs recombinantes foi a Danish, seguida pelas subcepas Pasteur,
China e Tokyo. Não há relatos do desenvolvimento de rBCG a partir da subcepa Moreau.
Em estágios de análises pré-clinicas a maioria das vacinas rBCG desenvolvidas a partir da
subcepa Danish, Pasteur e Tokyo apresentaram maior proteção para desafio com H37RV
do que as suas respectivas subcepas de BCG. Enquanto que das 4 rBCG desenvolvidas a
partir da subcepa China, apenas uma apresentou proteção superior a BCG (Quadro 1). A
maioria dos relatos de vacinas rBCG apresentam o uso de eletroporação como método para
a inserção de plasmídios contendo suas proteínas alvo de estudo e não apresentam dados
quanto à avaliação da resposta imune humoral ou de células B. Apenas alguns estudos
relatam a detecção de anticorpos específicos para antígenos.
39
Quadro 1: BCGs recombinantes produzidas nos últimos 10 anos
Identificação
Referência
Nome
(TSUKAMOTO et al.,
2014)
BCG-dHCM
(MUKAI et al., 2014)
BCG-DHTM
(MUKAI et al., 2008)
rBCG-ΔUT
Cepa
original
rBCGΔUT-11
(Tokyo)
Dados de recombinação
Antígenos
Tecnologia de
inseridos
recombinação
Ensaios pré-clíncos
Modelo
Via de
RI Humoral
imunização
HSP70-CysOMMPII
Eletroporação
(pMV-261)
C57BL/6
Humano
SC
(103)
NA
rBCGΔUT-11
(Tokyo)
HSP70-MMPII
Eletroporação
(pMV-261)
C57BL/6
Humano
SC
(103 e 104)
NA
Tokyo
Deleção do gene
ureC
Recombinação
homologa
(fago)
C57BL/6
ID
(102 e 103)
NA
rBCG::Ag85B(YANG, E. et al., 2014)
ESAT6-Rv3620c
Danish
Ag85B-ESAT6Rv3620c
Eletroporação
(pMV261)
C57BL/6
SC
(4x106)
(LU et al., 2012)
rBCG::Ag85BESAT6-Rv2608
Danish
Ag85B-ESAT6Rv2608
Eletroporação
pMV261
C57BL/6
SC
(4x106)
(WANG et al., 2009)
2
(WANG, J. et al.,
2012)
rBCG::Ag85BRv3425
Danish
Ag85B e Rv3425
Eletroporação
pMV261
C57BL/6
SC
(5x106)
S
(IgG1/IgG2a)
Ag85B ou
Rv3425
(XU et al., 2010)
(XU et al., 2009)
(XU et al., 2007)
rBCG-AN-E-AC
NI
Ag85B e ESAT-6
(quimera)
Eletroporação
pMV261
C57BL/6
Humano
SC
(5x106)
S
(IgG1/IgG2a)
Ag85B
(XU et al., 2009)
(XU et al., 2007)
rBCG-A-E
NI
Ag85B-ESAT6
(fusão)
Eletroporação
pMV261
C57BL/6
SC
(5x106)
S
(IgG1/IgG2a)
Ag85B
1
S
(IgG1/gG2a)
Ag85B e
PPD
S
(IgG1/IgG2a)
Ag85B
RI Celular
S
(MMPII, CsyO,
HSP70 e M.tb
S
(BCG-DHTM,
MMPII, Hsp70 e
H37Rv)
S
IFN-ɣ
Proteínas de
BCG e
M. leprae)
S
IFN-ɣ, TNF-α,
IL12 e IL10
(Ag85B e PPD)
S
TNF-α
(PPD e Ag85B)
S
IFN-ɣ
1
PPD e Rv3425
2
Ag85B e
Rv3425
S
IFN-ɣ
Ag85B e ESAT6
S
IFN-ɣ
Ag85B, ESAT-6
e PPD
Via de
desafio
Proteção
Dano
Tecidual
Aerosol
100 CFU
>BCG
NA
Aerosol
100 CFU
>BCG
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
EV
(106)
>BCG
<BCG
NA
NA
NA
EV
(1.8x106)
>BCG
NA
40
(QIE et al., 2009)
(XU et al., 2007)
rBCG-A
Danish
Ag85B
Eletroporação
pMV261
C57BL/6
SC
(5x106)
S
(IgG1/IgG2a)
Ag85B
(XU et al., 2007)
rBCG-A-E-I
NI
Ag85B-ESAT6IFNɣ
Eletroporação
pMV261
C57BL/6
SC
(5x106)
S
(IgG2a)
ESAT-6
Danish
Ag85B-Mpt64190–198Mtb8.4
Eletroporação
pMV261
C57BL/6
SC
(5x106)
S
(IgG1 e
IgG2b)
Ag85B
(QIE et al., 2009)
(QIE et al., 2008)
rBCG-AMM
(GRODE et al., 2005)
(DESEL et al., 2011)
2
(FARINACCI;
WEBER;
KAUFMANN, 2012)
3
(GRODE et al., 2013)
(TCHILIAN et al.,
2009)
BCG
ΔureC::hly
HmR –
VPM1002
rBCG
ΔureC:aph
(Paster)
Listeriolisina
Eletroporação
(pMV306)
BALB/c
2
C57BL/6
3
Humano
(RAO et al., 2013)
BCGΔureC::hly_
hlL7
BCGΔureC::hly_
hlL18
rBCG
ΔureC::hly
IL7 humana
IL18 humana
Eletroporação
(pMV306)
Mice
Humano
(REECE et al., 2011)
rBCG_ureC::hly
(pMPIIB01)
rBCG
ΔureC::hly
Rv2659c, Rv1733c
e Rv3407
Eletroporação
pMV262
BALB/c
(SZABO et al., 2013)
BCG +
pMV262(icl)
NI
Isocitrato liase
Eletroporação
(pMV262)
S
IFN-ɣ
Ag85B e PPD
S
IFN-ɣ
Ag85B e ESAT6
S
IFN-ɣ
PPD, Ag85B,
MPT64
Mpt64190–198 e
AMM
EV
(106)
>BCG
=BCG
EV
(1.8x106)
>BCG
NA
EV
(106)
=BCG
<BCG
1
4
(SHABAN; AMOUDY;
MUSTAFA, 2013)
4
rBCG-pDE22PE35
rBCG-pDE22CFP10
rBCG-pDE22ESAT6
NI
1e 4
PE35, CFP10 e
ESAT6
Eletroporação
(pDE22)
1
ApoB100only LDLR/-
BALB/c
EV
4
SC
(106)
NA
S
IFN-ɣ, IL-17,
GM-CSF, IL-6,
IL-2 e IL-22.
TB-PPD
SC
(106)
NA
S
IFN-ɣ e TNF-α
Mtb
Aerosol
200 CFU
ID e EV
(106)
NA
S
IFN-ɣ
Aerosol
102
Beijin/W
IP
(106)
NA
NA
NA
S
IFN-ɣ
rBCG-pDE22PE35
1,2e3
IP
(5x107)
Aerosol
100-200
CFU
2
200-400
CFU
1
1e4
>BCG
>BCG
1
NA
NA
>BCG
<BCG
NA
NA
NA
NA
NA
NA
41
(DENG, Y. H.; HE;
ZHANG, 2013)
rBCG-IA
(DENG, Y. H.; HE;
ZHANG, 2014)
rBCG-AE
(DENG, Y.; BAO;
YANG, 2011)
rBCG-IE
(YANG, X.; BAO;
DENG, 2011)
rBCG:GE
(FLORES-VALDEZ et Pasteur+Rv1357
al., 2012)
c
1e2
(SUN et al., 2009)
2
(RAHMAN et al.,
2012)
S
(IgG1 e IgG2a)
IL12p70 ou
Ag85A
S
IL12p70 e
Ag85A
EV
(106)
H37Rv
<BCG
>controle
>BCG
<controle
BALB/c
SC
(5x106)
NA
NA
EV
(106)
<BCG
>BCG
BALB/c
SC
(5x106)
GMCSF-ESAT6
Eletroporação
pMV361
BALB/c
IC
(5x106)
Rv1357c
Eletroporação
pMV261
BALB/c
ID
(8x103)
ΔureC::ΩpfoAG1
37Q
2
Ag85A, Ag85B
and TB10.4
Eletroporação
pAF102
pAF105
Ag85A e Ag85B
China
Eletroporação
pMV361
China
Ag85A-ESAT6
Eletroporação
pMV361
China
IL12p70humanaESAT6
Eletroporação
pMV361
China
Pasteur
1
1
rBCG AERA
401
2
rBCG Afro-1
Danish
(WANG, C. et al., 2012)
rBCG::AB
China
(SINGH, V. K. et al.,
2011)
BCG[pMV361::
rv3097c]
Pasteur
(CHRISTY et al., 2012)
BCG::CFP
BCG::FBP
BCG::PPE
BCG::INV
(DEY et al., 2009)
(RAO et al., 2013)
BALB/c
SC
(5x105)
IL12p70humanaAg85A
rBCGE6
Pasteur
Danish
Lipase
(Rv3097c)
CFP 1071–85
Ag85c/FBP201–
215
PPE68122–136
INV201–215
ESAT-6
S
(IgG1 e
IgG2a)
TB-PPD
S
(IgG1 e
IgG2a)
TB-PPD
S
IFN-ɣ
TB-PPD
EV
(106)
<BCG
>controle
>BCG
<controle
S
IFN-ɣ e GMCSF
TB-PPD
NA
NA
NA
NA
NA
IT
2.5x105
>BCG
NA
Instilação
500 CFU
>BCG
<BCG
1e2
C57BL/6
BALB/c
1e2
Guinea Pig
2
Primata
SC
(5x105)
NA
S
IFN-ɣ
(Ag85A, Ag85B
e TB10.4)
Eletroporação
(pMV261)
C57BL/6
SC
(106)
S
IgG
Ag85A ou
Ag85B
S
IFN-ɣ
(Ag85A, Ag85B)
EV
(106)
>BCG
<BCG
Eletroporação
(pMV361)
BALB/c
EV
(106)
NA
N
EV
(106)
<BCG
>BCG
2
2
1e2
1
1
Eletroporação
(pMV361)
1
BALB/c
Guinea Pig
SC
(106)
Eletroporação
pSD5
BALB/c
Guinea Pig
EV
(105)
1
S
S
(IgG1/IgG2b)
IFN-ɣ
CFP 10,
CFP 10,
Ag85c/FBP e
Ag85c/FBP,
PPE68
PPE68 e INV
S
(IgG1/IgG2b)
S
BCG e
IFN-ɣ
ESAT6
(BCG e ESAT-6)
<BCG
Aerosol
20 CFU
H37Rv
Aerosol
50-100
CFU
=BCG
>BCG
(pulmão)
=BCG
(baço)
42
=BCG
NA
(JAIN et al., 2008)
rBCG85C
Danish
Ag85C
Eletroporação
(pSD5.pro)
(LIN et al., 2012)
rBCG::Ag85B–
CFP10+IL12
Tokyo
Ag85B-CFP10 +
IL-12 humana
Eletroporação
(pMV261 e
pVV16)
Guinea Pig
ID
(5x105)
NA
C57BL/6
C3H
SC
(5x106)
S
(IgG1/IgG2b)
Ag85B
iNOS
Aerosol
(~500
CFU)
>BCG
(pulmão)
>BCG
(baço)
<BCG
S
IFN-ɣ
(CD4+ e CD8+)
NA
NA
NA
1
(MOHAMUD et al.,
2013)
(KONG et al., 2011)
(SPERANZA et al.,
2010)
1
rBCG018
2
rBCG032
BCG:PhspXAg85B
r-BCG-Rv1767
NI
Pasteur
Pasteur
Epítopos para
Células T de
Ag85B-MTB8.4
2
Epítopos para
células B de
ESAT6, CFP-10 e
MTP-40
Expressão de
Ag85B controlado
por promotor
HspX
2
Eletroporação
1
pNMN018 e
2
pNMN032
Eletroporação
pMV261
Rv1767
Eletroporação
pMIP12
(SHI, C. et al., 2010)
rBCG::X
Danish
HspX
Eletroporação
pMV261
(NOLAN;
LAMICHHANE, 2010)
BCG-LdtMt2
Danish
L,D-transpeptidase
Eletroporação
pGS400H
BALB/c
IP
(2 x 106)
C57BL/6
SC
(5x105)
S
(IgG1, IgG2a
e IgG3)
ESAT-6,
MPT40
S
IFN-ɣ e IL-12
(CD4+ e CD8+)
NA
NA
NA
NA
S
IFN-ɣ
(Ag85B)
Aerosol
(100
CFU)
=BCG
(pulmão)
>BCG
(baço)
NA
Aerosol
(200
CFU)
=BCG
(pulmão)
>BCG
(baço)
NA
EV
(106)
>BCG
(baço e
pulmão)
<BCG
Aerosol
(300
CFU)
=BCG
<BCG
BALB/c
ID
(106)
S
Ig?
Rv1767
BALB/c
C57BL/6
SC
(106)
S
(IgG)
HspX e
Ag85B
C57BL/6
EV
(107)
NA
1e2
S
CD4+IFN-ɣ+
CD8+IFN-ɣ+
(Rv1767)
=BCG
(Lisado de BCG
e PPD)
S
IFN-ɣ
(HspX, Ag85B e
PPD)
S
IFN-ɣ, TNF-α,
IL-12
Abreviações: EV – endovenosa; IC – intracutânea; ID – intradérmica; IP – intraperitoneal; N – não; NA – não avaliado; NI – não informado; S – sim;
SC – subcutâneo
43
1.6.
Proteína de fusão recombinante – CMX
Com o sequenciamento gênico do Mtb foi possível identificar genes que codificam
proteínas envolvidas na patogenicidade e virulência desta micobactéria (COLE et a3l.,
1998) e após caracterização imunológica observou-se o potencial imunogênico e/ou
antigênico de diversas proteínas tanto em modelo humano quanto em modelo animal (DE
ARAUJO-FILHO et al., 2008; MELO CARDOSO ALMEIDA et al., 2008; REIS et al.,
2009; SILVA et al., 2009; TRENTINI et al., 2014). Devido ao alto nível de complexidade
envolvido na interação entre o Mtb e seu hospedeiro, o entendimento do repertório
imunogênico da bactéria é de extrema importância para o desenvolvimento de uma vacina
eficaz (JUNQUEIRA-KIPNIS; MARQUES NETO; KIPNIS, 2014).
O antígeno MPT51 (Rv3803c) é uma proteína conhecida como pertencente à
família α/β hidrolases (WILSON et al., 2004), cuja função biológica tem relação análoga à
também não catalítica acetilcolina esterase, que se liga a fibronectina e a outros
carboidratos (RINKE DE WIT et al., 1993; WILSON et al., 2004), e, portanto está
envolvida na adesão bacteriana a matriz extracelular (KITAURA et al., 2000). Este
antígeno teve seu potencial como marcador para diagnóstico da TB demonstrado
(ARAUJO-FILHO et al., 2008a), bem como em pacientes co-infectados com HIV
(SINGH, K. K. et al., 2005). Trabalhos anteriores do nosso grupo demonstraram a
capacidade imunogênica desta proteína como vacina de subunidade protéica, que ao
imunizar camundongos BALB/c com adjuvantes apresentou uma relativa proteção contra a
infecção, a estimulação de células T IFN-γ+, além de diminuir a inflamação presente nos
pulmões dos camundongos (SILVA et al., 2009).
A proteína HspX, também conhecida como proteína α-cristalina, é expressa,
preferencialmente, durante a fase de latência da infecção por Mtb (YUAN; CRANE;
BARRY, 1996), e também tem sido demonstrada em bacilos que estão confinados sob
condições com fontes de energia limitadas e privação de oxigênio, ambiente comum dentro
de granulomas e/ou macrófagos. Além disso, epítopos de HspX também são reconhecidos
por células T CD4+ e CD8+ de pacientes com TB ativa (SHI, C. et al., 2010). Entretanto,
apesar do HspX ser expresso pelo BCG, a imunização por esta vacina por si só não é capaz
44
de induzir respostas das células T contra o antígeno HspX em humanos (GELUK et al.,
2007).
As proteínas do Complexo Antígeno 85 (Ag85) constituem uma família de
proteínas de 30–32 kDa (Ag85A, Ag85B, Ag85C) secretadas por micobactérias que
apresentam capacidade de se ligar à fibronectina, e dessa forma participam da aderência
bacteriana à superfície de mucosas, permitindo a invasão e disseminação para tecidos do
hospedeiro (KUO et al., 2012; FORRELLAD et al., 2013). Além disso, estão envolvidas
na formação da parede celular por catalisar a transferência de ácidos micólicos, levando à
síntese de dimicolato de trealose (TDM), que é um importante fator de virulência
micobacteriana (BACKUS et al., 2011). Particularmente, o Ag85C apresenta uma
atividade micoliltransferase específica durante a biosíntese da parede celular distinta dos
antígenos Ag85A e Ag85B (PUECH et al., 2002) e demonstrou-se altamente imunogênico,
induzindo células T CD4+ e CD8+ específica a vários de seus epítopos em cobaias (LEE;
HORWITZ, 1999) e em camundongos (D'SOUZA et al., 2003). Portanto, o papel do
Ag85C na célula bacteriana e sua capacidade imunogênica tornam esse antígeno um alvo
atrativo para estudos de desenvolvimento de vacinas para tuberculose.
A escolha de antígenos capazes de serem reconhecidos por células do hospedeiro
durante a TB ativa, estágio de replicação do bacilo, e/ou durante a infecção latente, bem
como aqueles envolvidos nos mecanismos de evasão imunológicos ou indução de células T
específicas CD4+ e CD8+ são alvos potenciais para controle imunológico da infecção
(ORME, 2013). Neste contexto, De Sousa et al. 2012, a partir do genoma de Mtb
construíram uma proteína de fusão, denominada CMX, constituída pelos epítopos Ag85c85159, MPT-5191-112
e a proteína HspX inteira (Figura 4).
45
Figura 4: Representação do processo de construção da proteína recombinante CMX.
A partir do genoma do Mtb foi realizada a amplificação de genes codificadores para os
epítopos Ag85C85-159, MPT5191-112 e a proteína HspX inteira, contendo sítios de restrição
específicos para endonucleases. O produto das amplificações foram clonadas
separadamente em plasmídio vetor pGEM-T, e cada plasmídio foi digerido com a enzima
de restrição apropriada para a geração de um mix de ligação contendo os três amplicons. O
mix de ligação contendo os três genes de interesse foi amplificado usando primers externos
(Ag85C amino terminal e HspX carboxi terminal. O amplicon resultante desta
amplificação foi então inserido no vetor pGEM-T, digerido com as enzimas BamHI e
HindIII, purificado e ligado a vetor de expressão de interesse.
Adaptado de: (DE SOUSA et al., 2012)
A proteína recombinante CMX teve sua imunogenicidade demonstrada, com uma
capacidade de induzir resposta imune celular e humoral quando inoculada associada a
adjuvantes, sugerindo que esta proteína poderia ser usada no desenvolvimento de uma
nova vacina para TB. Ademais, neste mesmo estudo, também foi avaliada sua
antigenicidade em humanos, no qual foi observada sua capacidade de discrimar população
com TB de controles saudáveis (DE SOUSA et al., 2012).
Ao ser inserida no M.
smegmatis (mc2-CMX), foi observada a indução de resposta imune humoral específica,
bem como também celular do tipo Th1 e Th17 específicas. Além disso, animais vacinados
com mc2-CMX apresentaram menor carga bacilar pulmonar após serem infectados por Mtb
do que animais vacinados com a BCG e o grupo controle (JUNQUEIRA-KIPNIS et al.,
2013).
46
2. JUSTIFICATIVA
A TB constitui um problema de saúde pública mundial. Apesar da recente redução
da incidência de novos casos e de mortes por TB registrada em todo mundo pela OMS,
ainda há países em desenvolvimento onde estes índices ainda não são tão otimistas. Esse
quadro se apresenta devido à capacidade que o Mtb apresenta de co-evoluir com o
hospedeiro, uma prova disso, são seus mecanismos de evasão da resposta imune, bem
como, a eminência de casos de resistência a drogas em todo o mundo. Somado a este fato,
os métodos de diagnósticos empregados apresentam-se por vezes inespecíficos e/ou pouco
acessíveis, dificultando o diagnóstico e o tratamento precoce da TB. Além disso, um outro
fator preponderante para o agravamento deste panorama é o fato de que os indivíduos
infectados não costumam procurar o serviço médico, na maioria das vezes devido aos
sinais e sintomas se apresentarem inespecíficos.
A única vacina indicada pela OMS contra a TB é a BCG que embora eficiente
contra as formas graves de TB na infância, no cenário científico mundial tem apresentado
uma eficácia questionável para a TBP em adultos. Assim, é necessário não apenas o
desenvolvimento de novas drogas para os casos de cepas resistentes, mas também novos
métodos de diagnóstico mais específico e acessível para a TB, mas, sobretudo o
desenvolvimento de uma vacina ainda mais eficaz que a BCG é particularmente importante
devido ao número de casos e mortes ocorridos em todo o mundo.
A utilização de proteínas de fusão apresenta-se bastante promissora no
desenvolvimento de vacinas contra a TB, devido ao fato de que esta tecnologia torna
possível a associação de antígenos expressos em diferentes estágios da infecção por Mtb, e
assim, permite induzir resposta imune específica para os diferentes momentos da relação
parasita-hospedeiro. A CMX têm apresentado forte indução de resposta imune humoral
em modelo murino. No momento em que sua imunogenicidade foi relatada por de Sousa e
colaboradores (2012) foi observada uma robusta produção de anticorpos em animais que
receberam a CMX associada a adjuvantes. Um comportamento semelhante foi observado
por Junqueira-kipnis (2013) quando a CMX foi inserida em vetores vivos (M. smegmatis).
47
Além disso, a carga bacilar foi reduzida em animais que receberam as vacinas vivas
expressando a CMX quando comparado a grupos controles.
Estudos recentes têm demonstrado que, ao contrário do que se acreditava, as células
B e os anticorpos apresentam-se importantes na resposta imune a TB, seja pela capacidade
dos anticorpos, após infecção primária ou vacinação, interagirem com antígenos de
superfície do Mtb, ou pela função das células B como APC e secreção de citocinas. A
importância destas células na TB ganhou maior evidência a partir do estudo utilizando
animais deficientes de células B, o qual demonstrou que estes animais apresentam
sucetibilidade a infecção pelo Mtb (TORRADO et al., 2013). Além disso, Sebina e
colaboradores (2012) apresentaram a existência de células B de memória de vida longa
específicas para antígenos do Mtb no sangue periférico de indivíduos saudáveis vacinados
com a BCG. Estas evidências demonstram que possivelmente as células B de memória
podem contribuir significantemente para a resposta imune ao Mtb e na proteção conferida
pela BCG.
Na tentativa de contribuir para o melhoramento molecular da BCG e possibilitar
assim o aprimoramento de um método de profilaxia amplamente utilizado, este projeto
propõe a produção de uma vacina BCG expressando proteína recombinante composta pela
fusão dos epítopos imunodominantes do Ag85C, MPT51 e a proteína HspX inteira
(denominada, CMX), que possa vir a ser mais eficaz na indução de proteção contra a TB e
no desenvolvimento de uma resposta de memória mais robusta e eficaz na idade adulta.
48
3. OBJETIVOS
Construir uma vacina BCG recombinante expressando proteína de fusão (CMX) e
avaliar a resposta imune humoral e de células B de memória, bem como a proteção contra
infecção pelo Mtb induzida por esta vacina em modelo murino em esquema de dose única.
3.1.
Objetivos específicos
 Transformar o BCG-Moreau utilizando três diferentes construções plasmideais
(pLA71, pLA73 e pMIP12);
 Determinar a expressão da proteína recombinante nos diferentes recombinantes
produzidos;
 Avaliar a produção de anticorpos anti-CMX por animais imunizados com vacina
rBCG expressando CMX, comparando com a BCG Moreau;
 Comparar a indução de células B de memória pela vacinação com a BCG
recombinante comparando com a BCG Moreau, antes do desafio com Mtb;
 Determinar a carga bacilar após o desafio com Mtb no pulmão de animais
imunizados e o nível de inflamação tecidual decorrente da infecção.
49
4. MÉTODOS
4.1.
Construção dos plasmídios recombinantes.
A partir das sequências de DNAs correspondentes aos epítopos imunodominantes
dos Ag85C e MPT-51, e o gene inteiro do HspX, descritos por de Sousa et al. (2012),
oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados permitindo a amplificação das regiões e ao
mesmo tempo a síntese de sítios para enzimas de restrição para posterior clonagem. O
produto desta amplificação foi clonado no vetor pGEM-T easy (Promega) através de um
sistema de ligação. Posteriormente, o vetor de clonagem pGEM-T easy contendo o gene de
fusão (CMX) foi digerido com as enzimas KpnI e NotI para eluição do gene CMX, para
posterior inserção deste nos plasmídeos pLA71 e pLA73. O produto da eluição foi também
preparado para clonagem no plasmídeo pMIP12 utilizando as enzimas BamHI e KpnI para
digerir o plasmídeo pGEM-T easy/CMX. Após a digestão, o gene CMX foi eluído e
inserido nos plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12 previamente digeridos com as enzimas
anteriormente mencionadas. Posteriormente, os plasmídeos recombinantes pLA71-CMX,
pLA73-CMX e pMIP12-CMX, foram sequenciados para verificar a integridade das
sequências clonadas.
Os plasmídios utilizamos neste estudo (pLA71, pLA73 e pMIP12) foram
gentilmente cedidos pela Dra. Brigitte Glicqueil, Institute Pasteur, França, ambos contendo
origem de replicação para E. coli/micobactéria, tendo como marcador de seleção um gene
de resistência à Canamicina obtido do Tn903 (LIM et al., 1995). Estes plasmídios
apresentam gene promotor de β-lactamase de Mycobacterium fortuitum – pBlaF*, códon
de iniciação ATG, e um sítio de multiclonagem onde foi inserida a sequência codificadora
da CMX precedida por: apenas a sequência sinal mais de 5 aminoácidos da β-lactamase
madura (pLA71); sequencia sinal mais o gene codificador da β-lactamase inteira (pLA73);
sequencia de iniciação conservada de Shine-Dalgarno (pMIP12) (TIMM; LIM; GICQUEL,
1994).
50
4.2.
Obtenção das vacinas BCG recombinantes (rBCGs)
Os plasmídeos recombinantes contendo a proteína de fusão CMX (Ag85C-MPT51-HspX), pLA71-CMX, pLA73-CMX e pMIP12-CMX, foram inseridos no BCG-Moreau
por eletroporação usando o eletroporador de pulsação (Bio-Rad®) a 4°C. Cada sistema de
transformação consistiu em 10 μL (contendo 100 a 500 ɳg de DNA plasmidial) do
plasmídeo em 200 μL de células eletrocompetentes, com posterior incubação no gelo por 1
hora. Logo após, condições padrões de pulsação 2,5KV, 25μF e 1000Ω foram aplicadas
numa cuveta de 2 mm (Bio-Rad®). Posteriormente, foi adicionado ao sistema 1 mL de
meio SOB (extrato de levedura 0,5%, triptona 2%, NaCl 10 mM e KCL 2,5 mM)
(HANAHAN, 1983), o qual juntamente com as células eletroporadas foi transferido para
um tubo de ensaio e incubado por 3 dias (~36 h) sob agitação a 37°C. Então, foi realizada a
adição de meio 7H9 com Canamicina (40 μg/mL) e mantida em incubação nas mesmas
condições por 1 semana (~7 dias). Os plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12 que
correspondem aos plasmídeos originais sem insertos gênicos, também receberam
tratamento semelhante aos plasmídeos recombinantes para produção de controles de BCG
recombinantes sem gene para a CMX.
Os transformantes foram selecionados a partir do plaqueamento e incubação dos
mesmos em meio Middlebrook 7H11 (Himedia®) com Canamicina (20 μg/mL) numa
estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após ~ 30 dias de incubação, colônias
representativas de micobactérias recombinantes foram selecionadas e transferidas para um
tubo contendo 5 mL de meio Middlebrook 7H9 caldo com Tween 80 a 0,05% com
Canamicina (20 μg/mL), que foi incubado a 37°C sob agitação por ~ 45 dias.
Posteriormente, 2,5 mL da cultura foram transferidos para um volume de 250 mL de meio
Middlebrook 7H9 caldo com Tween 80 a 0,05% contendo Canamicina (20 μg/mL) e
incubados sob agitação a 37°C até atingir a fase exponencial (cerca de 21 dias). Ao
atingirem a fase exponencial de crescimento, as culturas foram transferidas para tubos de
fundo cônico de 50 mL, centrifugadas a 6.000 rpm por 20 minutos a 10°C e depois lavadas
em igual volume de PBS com Tween 80 a 0,05% por três vezes. Feito isso, o sedimento foi
ressuspendido em ~15 mL de glicerol a 20% e alíquotas de 100 μL foram congeladas a 80°C em criotubos.
51
4.3.
Determinação das concentrações das vacinas recombinantes
A determinação da concentração das vacinas foi realizada através da contagem de
Unidades Formadoras de Colônias (UFC) em meio Middlebrook 7H11 ágar contendo
Canamicina (20 μg/mL). Portanto, algumas alíquotas congeladas a -80ºC das vacinas
recombinantes com e sem a sequência para a CMX, foram selecionadas aleatoriamente e
50 μL destas foram diluídas seriadamente 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Foram
plaqueados 50 μL de cada diluição em meio Middlebrook 7H11 com Canamicina (20
μg/mL) e posteriormente incubados por ~ 30 dias a 37°C em estufa com atmosfera úmida
contendo 5% de CO2. Depois disso, o plaqueamento da diluição que resultou em colônias
isoladas, foi utilizado para determinar a concentração do estoque das vacinas em UFC/mL.
4.4.
Preparo da BCG-Moreau
A cepa de BCG-Moreau, gentilmente cedida pelo instituto Butantan, foi crescida
em 5 ml de meio de cultura líquido 7H9 suplementado com 10% de ácido oléico, dextrose
e catalase (OADC), 0,5% de piruvato e Tween 80 a 0,05%, incubadas a 37ºC em atmosfera
úmida com CO2 a 5% por aproximadamente 21 dias. Depois, para realizar o isolamento de
colônias, procedemos com o plaqueamento de 100µL da cultura celular em meio sólido
7H11 suplementado (OADC e piruvato) e, após incubação de ~21 dias em estufa de
atmosfera úmida a 37ºC, foi produzido pré-inóculo com colônia isolada que após atingir
OD de 0.5 na escala de Mc’Faland foi adicionada a 600mL de meio 7H9 suplementado
(OADC, piruvato e canamicina) e incubada a 37ºC em atmosfera úmida com CO2 a 5% por
aproximadamente 21 dias. Após este período foi realizada a centrifugação da cultura e
armazenamento em alíquotas no freezer a -80ºC.
A concentração das alíquotas de BCG-Moreau foi determinada de maneira
semelhante aos recombinantes descrita no item anterior.
52
4.5.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada em dois momentos
diferentes, primeiramente para amplificar a sequência gênica da CMX após a realização da
eletroporação para confirmação da inserção dos plasmídios nos recombinantes e para
confirmar a presença do plasmídeo in vivo, em condições sem a presença do antibiótico de
seleção.
Para a confirmação da recombinação da cepa BCG-Moreau com os diferentes
plasmídios foram transferidos 500µL de suspensão de culturas de bactérias recombinantes
(rBCGs) e de BCG (controle) em crescimento para tubos de 15 mL que foram
centrifugados a 10.000 rpm a 10ºC por 10 minutos. Após o descarte do sobrenadante, e
posterior ressuspensão em 100µL de água (H2O), as amostras foram fervidas em banhomaria por 10 minutos e centrifugadas a 10.000 rpm a 10ºC por 5 minutos e o
sobrenandante foi coletado. O tratamento das amostras para realização da PCR para
confirmar a presença do plasmídeo in vivo esta descrito no item de estabilidade do
plasmidio in vivo.
A reação de amplificação, em ambas as situações, foram feitas em uma reação de
volume final igual a 30 µL, contendo: 20 ηg DNA genômico de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv; 1,5 U Taq DNA polimerase (Invitrogen®); Tampão GoTaq
(Promega®)1.5 mM de MgCl2; 250 µM de cada dNTP; 50nM dos oligonucleotídeos
iniciadores
Ag85
foward
(acggggatccggtctgcgggcccaggatg)
e
HspX
reverse
(catgcggccgcgttggtggaccggatctgaatgtg). A reação foi feita em termociclador, seguindo os
seguintes parâmetros: (a) 1 ciclo de 3 minutos a 94ºC; (b) 35 ciclos de 50 segundos a 92ºC,
1 minuto a 65ºC e 1minuto a 72ºC; (c) 1 ciclo de 5 minutos a 7ºC; (d) 1 ciclo permanente
de 10ºC.
Os produtos da amplificação foram analisados aplicando-se 8µL da reação mais
2µL de tampão de amostra, assim como um marcador de 10000 pb (Invitrogen®), em gel
de agarose a 1,5% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídeo, em tampão TBE (0,89 M de
tris base, 0,89 M de ácido bórico e 0,01 M de EDTA), o qual foi submetido a separação
eletroforética em uma tensão de 80 Volts por 60 minutos.O gel então foi visualizado por
53
incidência de ultravioleta através do Fotodocumentador Gel Doc System (ByoRad®),
documentado e analisado através do programa Quantity One (ByoRad®).
4.6.
Análise da expressão da CMX pelos recombinantes (rBCGs) por western
blotting.
Culturas de BCGs recombinante foram crescidas em meios Middlebrook 7H9
contendo Canamicina (20 μg/mL) por aproximadamente 30 dias, e então foram
centrifugadas. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em tampão
fosfato salina (PBS) e sonicado em 5 ciclos de 1 minuto de duração cada, com intervalos
curtos entre os ciclos, para realizar a ruptura das células. O lisado celular foi então
centrifugado a 10.000 rpm 10ºC por 10 minutos e o sobrenadante (fração intracelular
solúvel) transferido para um novo tubo, no qual foi adicionado 0,5 μL de inibidores de
proteases (Ditiotreitol, Fluoreto fenilmetilsulfonil, Aproptin, Leupeptin e Pepstatin). O
sedimento do lisado foi ressuspendido em tampão PBS contendo os inibidores de protease
citados acima (fração intracelular insolúvel).
As frações obtidas foram analisadas quanto à presença da proteína CMX através da
técnica de western blotting. Os extratos protéicos das duas frações descritas acima foram
aplicados em gel de poliacrilamida e duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Após
separação eletroforética, os extratos protéicos foram eletrotransferidos para uma membrana
de nitrocelulose, seguida de bloqueio com PBS a 4-8ºC por aproximadamente 18 horas, e
então incubados com uma diluição 1:100.000
de anticorpos policlonais previamente
adsorvidos com proteínas de E. coli, obtidos do soro de camundongos BALB/c após uma
imunizações com a rCMX e adjuvante Freund’s completo, seguido de duas imunizações
com a rCMX e adjuvante Freund’s incompleto. Após incubação de 1 hora a 37ºC, seguida
de lavagem com PBS com Tween 20 a 0,05% foi adicionado o anticorpo anti-IgG de
camundongo biotinilado e incubado por 2 horas a 37ºC. Posteriormente a lavagem, foi
adicionada avidina-peroxidase (Sigma-Aldrich®) e incubação de 1 hora a 37ºC. A
presença da proteína CMX foi revelada pela incubação com o substrato diaminobenzidina
(DAB) (Roche, Germany®).
54
4.7.
Animais
Foram utilizados 39 camundongos BALB/c fêmeas, com idade entre 6-8 semanas
provenientes do biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás que foram mantidos em micro isoladores acoplados à
estante ventilada contendo filtros HEPA para entrada e saída de ar, com água e dieta ad
libitum. A temperatura ambiente foi mantida entre 20-24ºC, com umidade relativa entre
40-70% com ciclos de luz/escuro de 12 h. Todos os animais foram mantidos de acordo
com as orientações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
(SBCAL/COBEA). O protocolo para este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Animal da Universidade Federal de Goiás (Número de Protocolo: 229/11)
(Anexo). Os ensaios experimentais utilizando camundongos foram repetidos no mínimo 2
vezes, a fim de avaliar a reprodutibilidade dos resultados.
4.8.
Preparo dos inóculos vacinais e imunização
Alíquotas das vacinas BCG, rBCG-CMX e rBCG-pLA71 (utilizado apenas no
ensaio de teste de estabilidade do plasmídeo) foram retiradas do freezer -80ºC e
imediatamente diluídas em PBS Tween 80 a 0,05% na concentração de 1x107 UFC/mL.
A imunização dos animais foi realizada utilizando 100 µL das suspensões celulares
acima
descritas,
de
maneira
que
foram
inoculados
subcutaneamente
1x106
UFC/camundongo na região cervico-dorsal. Os grupos controles foram imunizados com
100 µL de PBS Tween 80 a 0,05%.
4.9.
Estabilidade plasmidial in vivo
Para avaliar a estabilidade do plasmídeo in vivo foi realizado esquema experimental
contendo 9 camundongos BALB/c distribuídos em 3 grupos: BCG, rBCG-CMX e rBCG-
55
vazio (BCG transformada com plasmídio sem a sequência codificadora para CMX). 10
dias após a imunização por via subcutânea com dose única (106 CFU/animal) foi
recuperada a região cervico-dorsal dos animais que após ser macerado, homogeneizado e
plaqueado em meio 7H11 suplementado com 10% de ácido oléico, dextrose e catalase
(OADC), 0,5% de glicerol, e incubadas a 37ºC em atmosfera úmida com CO2 a 5% por
aproximadamente 30 dias. Foram realizadas placas com e sem a adição de canamicina a
20µg/mL como controles do ensaio. Após a contagem das unidades formadoras de colônias
(UFC) a presença do gene codificador para proteína CMX foi confirmado por PCR. Para o
PCR, três colônias foram selecionadas aleatoriamente das placas com e sem canamicina e
transferidas para tubos contendo 100 μL de água miliQ que foram fervidos por 10 minutos
e posteriormente centrifugados a 10.000 rpm por 5 minutos a 10°C. O sobrenadante foi
coletado para realização da PCR usando iniciadores específicos para as sequências
codificadoras da proteína CMX, como descrito no item 4.5.
4.10. Desenho experimental in vivo
Os camundongos foram agrupados em 6 gaiolas, correspondendo a 3 grupos,
contendo 10 animais cada grupo que receberam dose única de imunizações, conforme
descrito abaixo (Quadro 2):
Quadro 2: Distribuição dos animais em grupos experimentais
Grupo
1
2
3
Tratamento
100 µL de PBS Tween 80 a 0,05% via subcutânea
1x106 CFU de BCG-Moreau via subcutânea
1x106 CFU de rBCG-pLA71/CMX via subcutânea
Nº de
animais
10
10
10
 Grupo 1 – PBS (Controle): camundongos foram imunizados com dose única de
100µL de solução PBS com Tween 80 a 0,05% por via subcutânea (sc);
 Grupo 2 – BCG: camundongos foram imunizados com dose única de BCG-Moreau
na concentração de 1x106 UFC por camundongo, via subcutânea (sc);
56
 Grupo 3 – rBCG-CMX: camundongos foram imunizados com dose única de BCGpLA71/-CMX na concentração de 1x106 UFC por camundongo, via subcutânea
(sc);
A imunização foi realizada em dose única (dia 0), para avaliação da produção de
anticorpos específicos induzidos pela imunização foi realizada coleta de sangue periférico
e obtenção de soro nos dias 30, 60 e 90 do desenho experimental (Figura 5). A avaliação
da resposta de células B induzida pela imunização foi realizada pela eutanásia de 03 (três)
camundongos por ponto experimental (30 e 60 dias após a imunização) e coleta de células
do baço com posterior marcação com anticorpos específicos. O desafio dos animais foi
realizado com cepa de Mtb (H37Rv) 90 dias após a imunização. No dia seguinte ao
desafio, foi realizada a eutanásia de 01 (um) animal de cada grupo, para realização do
controle da carga bacilar infectante. Quarenta e cinco dias após o desafio foi realizada a
eutanásia de 03 (três) animais, obtenção do tecido pulmonar para determinação da proteção
por UFC e avaliação do nível de inflamação tecidual induzido nos animais imunizados
após a infecção por meio da técnica de histologia (Figura 5).
4.11. M. tuberculosis (H37Rv) e inóculo para desafio de animais
A cepa de Mtb H37Rv fornecida pelo Laboratório Central de Goiás (LACEN-GO)
foi cultivada em meio 7H9 suplementado com OADC, contendo Tween 80 a 0,05% até a
fase Log de crescimento, e em seguida foram alíquotadas e mantidas no freezer -80ºC. O
estoque foi plaqueado e quantificado um mês após o congelamento. Diluições centesimais
do estoque foram plaqueadas em meio 7H11 suplementado com OADC e as unidades
formadoras de colônias foram contadas. No dia da infecção, o inóculo foi diluído em PBS,
Tween 80 a 0,05% na concentração de 106 UFC/mL, então foi administrado 100 μL deste
pela via endovenosa (via plexo retro-orbital), sendo inoculado, portanto 105
UFC/camundongo.
57
135
Figura 5: Desenho experimental in vivo.
4.12. Ensaio Imuno-enzimático (ELISA)
A resposta imune humoral anti-CMX foi avaliada por ensaio imunoenzimático
utilizando soros obtidos de acordo com o esquema experimenta (Figura 5). Para este
ensaio, placas de poliestireno de 96 orifícios (Santa Cruz) foram adsorvidas com rCMX ou
rHspX, rMPT-51 (10 µg/mL) ou extrato de BCG Moreau obtido por meio de sonicação,
todos diluídos em tampão carbonato/bicarbonato de sódio 0,05M (pH 9,6) e incubadas por
18 horas a 4°C. Após este período, as placas foram bloqueadas por 2 horas a 37°C com
tampão carbonato/bicarbonato de sódio contendo gelatina a 0,5%. As amostras de soros
foram diluídas a 1:80 e 1:160 e adicionadas nos orifícios, com posterior incubação por 2 h
a 37°C. Depois as placas foram lavadas seis vezes com Tampão Sódio- Fosfato (PBS)
Tween 20 0,05%. Os anticorpos conjugados a biotina (anti-mouse IgG1 e IgG2a
Pharmingen) foram diluídos a 1:5000 em PBS contendo gelatina a 0,05% (PBSL) e
adicionados aos orifícios da placa. Após incubação por 1 h a 37°C, as placas foram lavadas
por seis vezes com PBS Tween 20 0,05%. Estreptoavidina-peroxidade (BD Biosciences)
diluída em PBS a 1:10.000 foi adicionada aos orifícios e as placas foram incubadas por 1 h
a 37°C. Novamente as placas foram lavadas. A reação foi revelada com o tampão citratofosfato pH 4,5 contendo OPD (ortho-phenylenediamine - Merck) e água oxigenada a 20 V.
A reação enzimática foi finalizada com a adição de ácido sulfúrico 4 N. As placas foram
lidas a 492 ηm na leitora de ELISA (Labsystems Multiskan Thermo).
Não foi realizada avaliação da resposta imune humoral específica para o antígeno
rAg85C devido a resultados prévios do nosso grupo demonstrando que os antígenos que
58
compoem o complexo Ag85 não induzem produção significante de anticorpos em modelos
bovino e murino (DA SILVA et al, 2014; DE SOUSA et al., 2013).
4.13. Obtenção das células do baço
O baço foi assepticamente removido dos camundongos e as células esplênicas
foram obtidas após passagem do mesmo em filtro de 70 µm para células (BD Biosciences,
Lincoln Park, NJ). Posteriormente as células foram ressuspendidas em meio RPMI (RPMI
médium 1640 GIBCO). Os eritrócitos foram lisados com solução tampão de lise (0,15 M
NH4Cl, 10 mM KHCO3), depois as células foram lavadas e ressuspendidas em meio RPMI
completo (cRPMI) de 10% de soro bovino fetal, 0.15% de bicabornato de sódio, 1% de Lglutamina (200 mM SIGMA), 1% de penicilina-estreptomicina (200 mM SIGMA), 1% de
piruvato de sódio (SIGMA), 1% de aminoácidos não essenciais 100X (SIGMA).
Posteriormente, as células foram contadas utilizando a câmara de Neubauer e ajustadas
para 1x106/mL.
4.14. Citometria de fluxo
Foram distribuídos 200 µL de suspensão celular de baço e pulmão em placa de
cultura celular de 96 orifícios (Corning). As células foram marcadas com anticorpos
extracelulares por 30 minutos, lavadas com PBS contendo 0,1% de azida sódica e fixadas
com PBS azida sódica com paraformaldeido a 0.05%. A avaliação das células B foi
realizada utilizando os anticorpos anti: PE-CD27 (clone: LG.7F9, eBiosciense), APCCD19 (clone: eBio1D3, eBiosciense) e FITC-IgG1 (Lote: M070432, BD PharMigen Co.)
ou FITIC-CD38 (clone: 90, eBiosciense), para avaliar células B de memória e efetoras,
respectivamente. Todas as análises foram realizadas com aquisição de 100.000 eventos no
Citomêtro de Fluxo BD Biosciences FACSVerse (Instituto de Biologia da Universidade de
Brasília) e os dados foram analisados com o software FlowJo. Os linfócitos foram
selecionados de acordo com as características de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC).
59
4.15. Determinação da carga bacilar no pulmão
A avaliação da homogeneidade e eficiência da infecção foi realizada pela
determinação das UFC obtidas do pulmão de animais no dia seguinte a infecção pelo Mtb.
Foram eutanasiados 03 animais, sendo um de cada grupo experimental (Quadro 2), e
coletado os pulmões, os quais foram homogeneizados e plaqueados em meio Middlebrook
7H11 suplementado com OADC para determinação da carga bacilar a partir da contagem
de UFC, após 21 dias de incubação a 37ºC.
4.16. Avaliação da inflamação pulmonar induzida após desafio
Para análise histopatológica do pulmão, quarenta e cinco dias após a infecção
endovenosa, foram coletados os lóbulos pulmonares caudais direitos e fixados com formol
tamponado. Os espécimes foram processados em histotécnico automático, incluídos em
parafina e seccionados em micrótomo (Leica RM2165®). Obteve-se de cada bloco, cortes
consecutivos de 5μm, os quais foram colocados sobre lâminas histológicas e corados pelo
método de hematoxilina e eosina (HE) para análise em microscopia de luz (Axio
scope.A1_Carl Zeiss), utilizando o programa AxioVision 4.7.
Todos o procedimento
foram realizados no Laboratório de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia – UFG.
Os eventos microscópicos avaliados nestes cortes histológicos foram classificados
afim de estimar o nível de comprometimento tecidual, baseando-se no número de focos
inflamatórios induzidos pela infecção. Para isto, foi realizada análise duplo-cega com a
varredura de todo o espécime para contagem do número de focos de inflamação utilizando
a objetiva de 20x.
4.17. Análise Estatística
Os resultados obtidos foram tabulados usando o Microsoft Office Excel 2011 e
analisados em Software Prism (versão 6.0c, GraphPad), expressos como Média e Desvio
60
Padrão. A comparação entre os grupos foi dada pela análise de variância (ANOVA) e/ou
análise múltipla (Kruskal Wallis seguido de teste de Tukey’s) utilizada para avaliar as
possíveis diferenças entre os grupos. Valores de p<0,05 foram considerados
estatisticamente significativos.
61
5. RESULTADOS
5.1.
Transformação e expressão da proteína de fusão CMX pelos recombinantes
Na tentativa de se obter a expressão da proteína CMX pela BCG Moreau, três
construções plasmidiais contendo a proteína de fusão foram testadas: pLA71-CMX,
pLA73-CMX e pMIP12-CMX. Todas as construções plasmidiais foram capazes de
transformar a cepa BCG Moreau (Figura 6), pois apresentaram PCR positiva com uma
banda de tamanho correspondente ao da sequência codificadora da proteína CMX (860
pares de bases).
Figura 6: Produto de amplificação para a sequência codificadora da proteína de fusão
CMX. A cepa de BCG-Moreau foi transformada utilizando três diferentes plasmídeos de
expressão contendo a sequência codificadora para CMX (pLA71-CMX, pLA73-CMX e
pMIP12-CMX). Controles foram produzidos pela eletroporação contendo apenas o
plasmídio vazio (pLA71-vazio, pLA73-vazio e pMIP12-vazio). Como esperado, apenas os
transformantes contendo gene da CMX apresentaram amplificação positiva na PCR.
Linhas: Marcador de peso molecular (PM); Controle negativo da reação (CN); BCGMoreau (BCG); rBCG transformada com pLA71, pLA73 e pMIP12, ambos contendo
(CMX) ou não (vazio) gene para CMX; e Controle positivo da reação (CP).
62
Ao avaliar a expressão da proteína CMX nas três construções recombinantes por
Western blot, foi observado que somente a construção composta pelo plasmídio pLA71CMX apresentou banda correspondente a proteína CMX (≈38Kda, Figura 7A). Os demais
plasmídios não apresentaram expressão detectável (Figura 7B e C). Portanto, a construção
rBCG-pLA71-CMX foi escolhida para a realização dos ensaios, sendo denominada rBCGCMX.
Figura 7: Expressão de CMX pelos transformantes: Lisado de células transformadas
com os plasmídios pLA71 (A), pLA73 (B) e pMIP12 (C), contendo ou não gene da CMX,
foi aplicado em gel de SDS-PAGE e posteriormente transferido para membrana de
nitrocelulose para realização de Western blot utilizando anticorpos policlonais anti-CMX.
Apenas a construção composta pelo plasmídio pLA71-CMX apresentou banda
correspondente a proteína CMX (≈38Kda). Linhas: A – Marcador de peso molecular (PM);
Controle positivo (CMX purificada); rBCG transformada com pLA71 contendo (CMX) ou
não (vazio) gene para CMX; e BCG. B – Linhas: Marcador de peso molecular (M);
Controle positivo (CMX purificada); rBCG transformada com pLA73 contendo (CMX) ou
não (vazio) gene para CMX; e BCG. C – Linhas: Marcador de peso molecular (M);
Controle positivo (CMX purificada); rBCG transformada com pMIP12 contendo (CMX)
ou não (vazio) gene para CMX; e BCG.
63
5.2.
Teste de estabilidade plasmidial de rBCG-CMX in vivo
Para verificar se o recombinante (rBCG-CMX) mantêm o plasmídeo in vivo, onde
não existe a presença do antibiótico de seleção, bactérias foram recuperadas da região
cervico-dorsal, 10 dias após a imunização de animais com BCG, rBCG-vazio e rBCGCMX e plaqueadas em meio contendo ou não canamicina (Figura 8A). O transformante
contendo o plasmídio vazio (rBCG-vazio) apresentou maior número de Unidades
Formadoras de Colônias (UFC) do que o observado para o recombinante contendo CMX
(rBCG-CMX), porém a cepa selvagem (BCG-Moreau), que por sua vez, não apresentou
diferença significante (Figura 8B).
64
Figura 8: Estabilidade plasmidial de rBCG-CMX in vivo. Animais foram imunizados
com BCG-Moreau, rBCG-vazio e rBCG-CMX. Após 10 dias, bactérias foram recuperadas
da região cervico-dorsal (região da imunização) e plaqueadas em meio contendo ou não
canamicina. (A) Unidades formadoras de colônias (UFC) recuperadas em meio com e sem
canamicina. (B) Representação gráfica da contagem de UFC.
65
Para confirmar a presença do plasmídio pelo rBCG-CMX, colônias isoladas foram
coletadas das placas referentes aos animais imunizados com o rBCG-CMX, contendo ou
não canamicina, e avaliadas por PCR quanto à permanência da sequência codificadora para
CMX. Todas as colônias analisadas apresentaram-se positivas na PCR (Figura 9),
demonstrando que o plasmídio contendo gene da CMX permanece na bactéria mesmo em
condições in vivo.
Figura 9: Produto de amplificação para sequência codificadora da CMX de colônias
recuperadas de animais imunizados com rBCG-CMX. PCR de Colônias isoladas de
plaqueamento de amostra obtidas da região cervico-dorsal de animais 10 dias após
imunização com rBCG-CMX. Todas as colônias coletadas de placas contendo ou não
canamicina apresentaram banda de tamanho correspondente ao da sequência codificadora
da proteína CMX (860 pb). Linhas: (1) Marcador de Peso Molecular; (2, 4 e 5) colônias de
placas contendo canamicina; (3, 6 e 7) colônias sem a adição de canamicina.
66
5.3.
Detecção de anticorpos específicos para CMX
A resposta imune humoral foi avaliada utilizando ensaio imuno-enzimático
(ELISA) com detecção de anticorpos anti-proteína de fusão (CMX) da classe IgG1 e IgG2a
no soro de camundongos BALB/c imunizados com dose única de BCG-Moreau, rBCGCMX e PBS (controle). Amostras de sangue periférico foram coletados 30, 60 e 90 dias
após a imunização (Figura 10). Animais imunizados com rBCG-CMX apresentaram níveis
séricos de anticorpos anti-CMX semelhantes aos grupos controles (BCG-Moreau e PBS),
tanto da classe IgG1 quanto IgG2a (Figura 10A e B, respectivamente).
Figura 10: Anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para CMX. Soro de animais (4/grupo)
foram obtidos 30, 60 e 90 dias após a imunização e avaliados por ELISA. Em A, IgG1 e
em B, IgG2a.
Para avaliar a indução de anticorpos específicos para os antígenos separadamente
foi realizado ensaio imuno-enzimático (ELISA), com as amostras de soro obtidas 30 dias
após a imunização, para detecção de anticorpos, anti-HspX, anti-MPT51 e anti-CMX. Os
níveis séricos de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para MP-T51 e HspX foram
semelhantes aos anti-CMX para todos os grupos avaliados (Figura 11).
67
Figura 11: Anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para HspX, MPT51 e CMX. Amostras
de soro obtidos 30 dias após a imunização fora avaliados por ELISA (n= 4/grupo). Em A,
IgG1 e em B, IgG2a.
Devido não ter sido observada produção de anticorpos específicos para os antígenos
proteícos recombinantes, e na tentativa de observar o perfil de resposta imune humoral
apresentado em estudos prévios utilizando a CMXs, realizamos ensaio utilizando extrato
de BCG Moreau, obtido por ultra-som. Para determinar a diluição de soro mais adequada
foi realizado ensaio de padronização, no qual soro de animais obtidos 30, 60 e 90 dias após
a imunização foram diluídos seriadamente a partir de 1:160 com fator de diluição igual a 2
até a diluição de 1:2560 (Figura 12A). A partir dos resultados apresentados pela
padronização, na qual observamos início da diferença entre os grupos na diluíção de
1:2560, procedemos com ensaio utilizando amostras de soro diluídas 1:5000 na tentativa
de melhor discriminar os grupos. Como esperado, os animais do grupo controle não
apresentaram níveis de anticorpos detectáveis em nenhum dos pontos avaliados (Figuras
12B e C). Aos 30 dias após a imunização animais vacinados com a rBCG-CMx
apresentaram níveis de IgG1 e IgG2a superiores aos animais vacinados com a BCG
(Figura 12B e C), sendo que neste último grupo não foi observado níveis de IgG2a aos 30
dias (Figura 12C). Os níveis de IgG1 séricos detectados nos animais imunizados com a
rBCG-CMX, aos 60 dias, foram maioresdo que os obtidos dos animais imunizados com a
BCG (Figura 12B – p<0.05). No entanto, essa diferença não foi observada entre estes dois
grupos no que diz respeito a IgG2a (Figura 12C). Aos 90 dias, os níveis séricos de IgG1
observados nos dois grupos foram semelhantes (Figura 12B), entretanto, os níveis de
68
IgG2a detectados nos animais que receberam a rBCG-CMX foram superiores aos
detectados nos animais que receberam a BCG (Figura 12C – p<0.05).
Figura 12: Anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para extrato de BCG. Soro de animais
(n= 4/grupo) foram obtidos 30, 60 e 90 dias após a imunização e avaliados por ELISA.
Em A, padronização para determinação a diluição adequada para melhor discriminação dos
grupos. Níveis séricos de IgG1 (B) e IgG2a (C) foram detectados. *Diferença estatística foi
considerada significante quando p<0,05.
69
5.4.
Células B de memória induzidas pela imunização com rBCG-CMX
A avaliação do perfil de células B de memória de vida longa (CD19+CD27+IgG1+)
e plasmócito de vida longa (CD19+CD27+CD38-) induzida pela imunização, foi realizada
30 e 90 dias após a imunização. Para tal, células do baço de camundongos foram obtidas,
processadas, marcadas com anticorpos específicos e adquiridas em citômetro de fluxo. A
contagem celular foi realizada logo após a obtenção das células esplênicas e apresentou,
aos 30 dias, diferença significante no número de células dos animais vacinados com a BCG
quando comparado com animais dos demais grupos vacinados com rBCG-CMX e PBS
(controle) (Figura 13A). Aos 90 dias, os animais imunizados com a rBCG-CMX
apresentaram contagem celular superior quando comparado aos animais dos grupo BCG e
PBS (controle) (Figura 13D). Houve uma diferença significante também entre os animais
vacinados com BCG quando comparado ao grupo que recebeu PBS (controle) (Figura
13D).
Apesar disso, não houve diferença significativa na porcentagem de linfócitos
adquiridos de cada grupo em ambos os pontos experimentais (Figura 13B e 13E).
O número absoluto de linfócitos foi obtido a partir dos valores relativos
(multiplicação do valor relativo pela contagem celular). No qual observamos que animais
que receberam BCG, aos 30 dias, apresentaram maior número absoluto de linfócitos do
que os animais do grupo controle (PBS) (Figura 13C). No entanto, aos 90 dias, o número
absoluto de linfócitos induzido nestes dois grupos não foi estatisticamente significativo
(Figura 13F). Perfil contrário foi observado quando comparado os animais vacinados com
a rBCG-CMX com os animais do grupo controle, de maneira que, aos 30 dias, não foi
observado diferença significativa entre o número absoluto de linfócitos induzido nos
animais vacinados com a rBCG-CMX quando comparado ao grupo controle (Figura 13C),
entretanto, aos 90 dias, o número total de linfócitos induzido nos animais do grupo rBCGCMX foi superior ao induzido no baço dos animais que receberam PBS (controle) (Figura
13F). Não foi observada diferença significante no número absoluto de linfócitos entre os
animais vacinados com a BCG e a rBCG-CMX em ambos os pontos experimentais
(Figuras 13C e 13F).
70
Figura 13: Avaliação de esplenócitos 30 e 90 dias após a imunização. Representação
gráfica da contagem celular realizada logo após a obtenção das células do baço e antes da
marcação celular das células, 30 (A) e 90 (D) dias. Em B e E, número relativo de linfócitos
adquiridos em citômetro aos 30 e 60 dias respectivamente. Em C e F, conversão do valor
relativo em número absoluto de linfócitos em 30 e 90 dias respectivamente. *Diferença
estatística foi considerada significante quando P<0,05.
71
A figura 14 demonstra os resultados encontrados no baço dos animais vacinados.
Exemplos de dot plots representando as populações de linfócitos B avaliadas são
demonstrados na figura 14A (painel superior memória vida longa e painel inferior memória
de vida curta). Observamos que 30 dias após a imunização com a BCG-Moreau,
diferentemente da rBCG-CMX, foi induzido no baço maior número de células B que o
grupo controle que recebeu apenas PBS (Figura 14B). Além disso, animais imunizados
com a BCG-Moreau apresentaram maior número de células B de memória (CD19+CD27+)
que os animais que receberam rBCG-CMX e PBS (controle) (Figura 14A e C, p>0,05).
Avaliando a subpopulação de células B de memória de vida longa (CD19+CD27+IgG1+)
observamos um aumento significante no número absoluto destas células em animais que
receberam BCG quando comparada aos demais grupo (Figura 14D). Não foi observada
diferença significativa na avaliação da subpopulação de plasmócitos de vida longa
(CD19+CD27+CD38-) (Figura 14E).
72
Figura 14: Avaliação de células B de memória, no baço, 30 dias após a imunização.
Células do baço de animais imunizados com BCG-Moreau, rBCG-CMX e PBS (controle)
foram obtidas e avaliadas quanto a positividade para anti-CD27 e anti-IgG1 ou anti-CD27
e anti-CD38. (A) Gates representativos de cada grupo avaliado. (B) Aumento no número
de linfócitos B induzidos em resposta a BCG-Moreau comparado ao grupo controle. (C)
Aumento do número de linfócitos B de CG (CD19+CD27+) induzido pela BCG-Moreau,
quando comparado aos demais grupos. (D e E) Representação gráfica do número de células
das subpopulações de linfócitos B de memória de vida longa (CD19+CD27+IgG1+) e
plasmócitos de vida longa (CD19+CD27+CD38-), respectivamente. *Diferença estatística
foi considerada significante quando P<0,05.
73
Noventa dias após a imunização, foi observado que a imunização com a rBCGCMX induziu, no baço, número significantemente maior de células B (CD19+) do que a
BCG-Moreau (Figura 15A e B). Esta característica também foi observada no número de
linfócitos B de memória (CD19+CD27+) (Figura 15C e D). Quando avaliada a
subpopulação de células B de memória de vida longa (CD19+CD27+IgG1+) observamos
que o número destas células no grupo imunizado com a BCG-CMX foi significantemente
maior que a BCG e o grupo controle (controle) (Figura 15E e F). Não foi observada
diferença significante na subpopulação de plasmócitos de vida longa (CD19+CD27+CD38-)
entre os diferentes grupos avaliados (Figura 15G e H).
74
Figura 15: Avaliação de células B de memória, no baço, 90 dias após a imunização.
Células do baço de animais imunizados com BCG-Moreau, rBCG-CMX e PBS (controle)
foram obtidas e avaliadas quanto a positividade para anti-CD27e anti-IgG1 ou anti-CD27 e
anti-CD38. Representação gráfica da avaliação de células B totais induzida pela
imunização, valor relativo (A) e absoluto (B); células B de memória (CD19+CD27+), valor
relativo (C) e absoluto (D); linfócitos B de memória de vida longa (CD19+CD27+IgG1+),
valor relativo (E) e absoluto (F); e plasmócitos de vida longa (CD19+CD27+CD38-), valor
relativo (G) e absoluto (H). *Diferença estatística foi considerada significante quando
P<0,05.
75
Comparando o número absoluto de células das subpopulações, com 30 e 90 dias,
foi observado que apesar da BCG-Moreau ter induzido inicialmente (30 dias) maior
número de células CD19+CD27+IgG1+, com o passar do tempo, esta subpopulação celular
apresentou-se em número semelhante ao grupo controle. Entretanto, a rBCG-CMX,
mostrou-se capaz de induzir aumento significante desta subpopulação celular a medida do
tempo (Figura 16A). Não foi observada mudança no número de células da subpopulação
CD19+CD27+CD38- (Figura 16B).
Figura 16: Cinética do número de células das subpopulações de linfócitos B de
memória. Comparação entre o número de células B de memória de vida longa
(CD19+CD27+IgG1+) e plasmócito de vida longa (CD19+CD27+CD38-) induzidas em
animais imunizados com BCG-Moreau, rBCG-CMX e PBS (controle) com 30 e 90 dias.
*Diferença estatística foi considerada significante quando P<0,05.
76
5.5.
Proteção induzida pela vacina BCG-CMX
Camundongos foram desafiados com 105 UFC/camundongo de Mtb 90 dias após a
imunização com BCG-Moreau, rBCG-CMX ou PBS (controle) (Figura 17). A avaliação da
carga bacilar no pulmão dos animais foi realizada em dois momentos: um camundongo por
grupo, no dia seguinte ao desafio para avaliar a eficácia e homogeneidade do desafio; e 3
animais por grupo, quarenta e cinco dias após o desafio (Figura 5).
A carga bacilar recuperada do pulmão de camundongos eutanasiados no dia
seguinte ao desafio foi a mesma em todos os animais avaliados (Figura 17A),
demonstrando uma homogeneidade na realização do desafio. Como demonstrado na figura
17B, a carga bacilar (Mtb) recuperada do pulmão de camundongos imunizados com BCGMoreau (6Log10) e rBCG-CMX (6Log10) foram igualmente menores que a dos
camundongos que receberam apenas PBS (controle 7Log10). Não foi observada diferença
significativa entre a carga bacilar recuperada do pulmão de animais vacinados com a BCG
e a rBCG-CMX.
Figura 17: Carga bacilar recuperada de pulmão de camundongos infectados com
Mtb. A carga bacilar foi determinada pela contagem de UFC recuperadas de lobos
pulmonares superior e mediano direitos de camundongos imunizados com BCG-Moreau,
rBCG-CMX e PBS (controle) que foram desafiados com 105 UFC/camundongo de Mtb, no
dia seguinte ao desafio (A) e 45 dias após (B). *Diferença estatística foi considerada
significante quando p<0,05.
77
5.6.
Inflamação Pulmonar após infecção por Mtb
Para avaliar o nível de inflamação induzido pela infecção por Mtb, o pulmão dos
camundongos foi coletado e as lesões induzidas pelo Mtb foram observadas por
microscopia ótica. Todos os grupos de animais avaliados apresentaram infiltrados
inflamatórios mononucleares (Figura 18A). Entretanto, no grupo infecção (PBS+Mtb), foi
observado inflamação pulmonar difusa, acompanhada de grandes aglomerados
inflamatórios mononucleares (Figura 18B). Quando observado os pulmões dos
camundongos imunizados com as vacinas BCG-Moreau e rBCG-CMX, estes apresentaram
uma significante redução da lesão pulmonar em comparação ao grupo infecção (Figuras
18ª e B). Nas áreas de infiltrado inflamatório mononuclear observou-se no grupo infecção
(PBS+Mtb) a presença de macrófagos xantomatosos que não estavam presentes nos grupos
dos animais que receberam as vacinas BCG e rBCG-CMX (Figura 18C). A contagem do
número de focos inflamatórios demonstrou que o grupo infecção (PBS+Mtb) apresentou-se
significativamente maior (média de 21 à 30 focos) em comparação aos grupos imunizados
com as vacinas BCG+Mtb e rBCG-CMX+Mtb. Ao comparar esses dois últimos grupos
observamos que a rBCG-CMX apresentou menor quantidade de focos inflamatórios
(média de 1 a 5 focos) que a BCG (média de 11 a 20 focos) (Figura 18D).
78
Figura 18: Avaliação da inflamação pulmonar após infecção por Mtb. Pulmão de
camundongos imunizados e desafiados foram obtidos 45 dias após a infecção e avaliados
pelo H&E. Animais do grupo controle (PBS+Mtb) apresentaram maior comprometimento
tecidual que os grupos BCG+Mtb e rBCG-CMX+Mtb em aumento de 10X (A). Os
macrófagos xantomatosos observados apenas no grupo infecção, no aumento de 20X (B),
foram confirmados nos aumentos de 40X e 100X (C). Representação gráfica da contagem
de focos inflamatórios nos diferentes grupos experimentais (D).
79
6.
DISCUSSÃO
Uma vacina rBCG expressando a proteína de fusão CMX (rBCG-CMX) foi
construída utilizando 3 diferentes plasmídios de expressão, entretanto, apenas um deles
apresentou a expressão da CMX em nossas condições laboratoriais. Embora, não tenha
demonstrado forte indução de anticorpos específicos, a vacina rBCG-CMX mostrou-se
capaz de induzir tardiamente (90 dias) células B de memória de vida longa. Embora ambas
as vacinas BCG e rBCG-CMX tenham sido igualmente capazes de reduzir a carga bacilar
no pulmão de camundongos infectados com Mtb (H37Rv), a rBCG-CMX induziu menor
dano tecidual no pulmão dos animais infectados. Apesar de na literatura haver diversos
estudos demonstrando a construção de recombinantes a partir de diferentes subcepas de
BCG (Quadro 1), nenhuma delas teve sua construção baseada na subcepa BCG Moreau.
Apesar de ser a única vacina contra a TB aprovada pela OMS, devido ser eficiente
contra as formas mais graves de TB na infância, a BCG tem apresentado uma eficácia
questionável para a TB em adultos. Possivelmente, o processo de atenuação das subcepas
de BCG podem ter contribuído para a perda de regiões codificadores de diferentes
antígenos que por sua vez podem ter impactado a resposta imune protetora induzida pelas
diferentes subcepas (KAUFMANN, 2010). Assim, o desenvolvimento de uma vacina mais
eficaz e segura tem sido alvo de diversos estudos (ANDERSEN; DOHERTY, 2005).
Deste modo, na tentativa de desenvolver uma vacina BCG recombinante, três
transformantes foram obtidos utilizando diferentes construções plasmidiais (pLA71,
pLA73 e pMIP12). Entretanto, apenas o transformante contendo gene codificador de
pepitídio sinal da β-lactamase antecendendo a proteína CMX (rBCG-pLA71-CMX) foi o
único que demonstrou capacidade de expressar a CMX e por este motivo foi utilizado em
todos os testes posteriores. Diferentemente, no estudo realizado por VARALDO et al. 2004
a proteína Sm14 de Schistosoma mansoni, apenas apresentou sua expressão utilizando
plasmídio contendo a sequência codificadora da proteína da β-lactamase inteira (pLA73)
antecedendo a proteína de interesse. Entretanto, NASCIMENTO et al. 2000 obtiveram a
expressão da subunidade S1 da toxina pertussis utilizando tanto o plasmídio pLA71 quanto
o pLA73, sendo o segundo em maior quantidade que o primeiro. Estes resultados reforçam
80
a hipótese de que a expressão de proteínas heterólogas em micobactérias, especialmente o
BCG, apresenta-se complexa e que algumas proteínas heterólogas necessitam de um local
de início da transcrição ou tradução de proteína micobacteriana a fim de ser expresso em
BCG (VARALDO et al., 2004).
Os plasmídios são considerados promotores de altos níveis de expressão de
proteínas que, entretanto, apresentam baixa estabilidade in vivo (NASCIMENTO et al.,
2000). Neste contexto, ao avaliamos a estabilidade do plasmídio (pLA71-CMX) pelo BCG
in vivo, observamos que a rBCG-CMX é capaz de manter o plasmídio estável mesmo na
ausência de antibiótico, corroborando com outros resultados previamente realizados
(NASCIMENTO et al., 2000)
Anticorpos são importantes na resposta imune a microrganismos pela sua
capacidade de interagir e reconhecer antígenos de superfície de membrana de patógenos,
facilitando assim a eliminação destes microrganismos pela ação de fagócitos (MANZ et al.,
1998). Deste modo, a indução de anticorpos específicos após a imunização atuaria numa
resposta imediata em caso de infecção pelo Mtb (KAUFMANN; HUSSEY; LAMBERT,
2010). Ambas as vacinas BCG e rBCG-CMX apresentam indução de anticorpos das
classes IgG1 e IgG2a. Entretanto, vale ressaltar que a vacina rBCG-CMX apresenta
capacidade de induzir resposta imune humoral específica para extrato de BCG significante
quando comparada a BCG, corroborando com resultados apresentados anteriormente em
estudos utilizando a CMX como vacina de subunidade proteíca (DE SOUSA et al., 2012) e
vetores vivos expressando CMX
(JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2013). A demais,
aparentemente a BCG induziu níveis de IgG1 e não de IgG2a detectáveis nos primeiros 30
dias após a imunização. Este fenômeno pode explicar o maior número de células B de
memória observada aos 30 dias em animais vacinados com a BCG quando comparado a
rBCG-CMX. De acordo com CROTTY (2011), a IL-4 juntamente com a IL-21 produzidas
por células T foliculares são importantes na manutenção de células B em centros
germinativos e induzem a proliferação destas células. Possivelmente, a forte resposta de
IgG2a, induzida pela produção de IL-12 que por sua vez diminui a secreção de IL-4
(referencia), pode ter interferido na manutenção de células B de CG e assim ter dimunido a
indução de células B de memória nos animais vacinados com a rBCG-CMX.
81
Em contrapartida, aos 90 dias, observamos que os níveis de IgG2a são superiores
no grupo de animais vacinados com a rBCG-CMX do que BCG, o que nos levaria a
esperar que de acordo com CROTTY (2011) a rBCG-CMX não apresentaria número
diferente de células B de memória neste ponto experimental. Surpreendentemente o
contrário foi observado, o número de células B de memória induzida em animais vacinados
com a rBCG-CMX, aos 90 dias, foi superior ao induzido pela BCG. Possivelmente os
níveis de anticorpos tanto IgG1 quanto IgG2a observado no grupo de animais vacinados
com a rBCG-CMX, ao longo de todos os pontos experimentais, pode ter contribuído na
manutenção e geração de células B de memória nestes animais, deste modo, pode-se
sugerir que a rBCG-CMX apresenta uma capacidade de gerar células B de memória
capazes de reconhecer antígenos do Mtb, que são compartilhados pela BCG, e associada
as células com perfil Th1 que também são geradas durante esta resposta, possivelmente
contribuem para a proteção em caso de infecção.
O desenvolvimento de vacinas para a TB tem utilizado como parâmetro de
avaliação de proteção a redução da carga bacilar (UFC) no pulmão de animais infectados.
Diversos estudos têm demonstrado que camundongos imunizados com diferentes subcepas
de BCG apresentam capacidade de reduzir a carga bacilar em aproximadamente 1 log
quando comparado a animais não vacinados (XU et al., 2007; WANG et al., 2009;
FLORES-VALDEZ et al., 2012; MUKAI et al., 2014).
Este fenômeno também foi
observado neste estudo utilizando a BCG Moreau, não demonstrada anteriormente.
Entretanto, a rBCG-CMX apresentou a redução da carga bacilar semelhante a induzida
pela subcepa BCG
Moreau. O recombinante VPM1002, construído por GRODE e
colaboradores (2005), que atualmente se encontra em ensaios clínicos, demonstrou, desde
seus ensaios pré-clínicos, capacidade de reduzir a carga bacilar no pulmão em diferentes
modelos animais. Entretanto, alguns transformantes desenvolvidos na última década
apresentaram carga bacilar semelhante a sua respectiva subcepa de BCG ou nem mesmo
isso (Quadro 1), algumas rBCGs desenvolvidas apresentaram perfil contrário, com carga
bacilar maior que a apresentada por animais que receberam BCG. Deste modo,
possivelmente, o processo de recombinação ao qual foi submetida a subcepa BCG Moreau
não tornou a rBCG-CMX mais atenuada.
Associada a carga bacteriana pulmonar, a manutenção da arquitetura tecidual
também é uma característica importante na avaliação de uma vacina viável para a TB
82
(TAYLOR et al., 2005). Apesar disso, nem todos os estudos realizados para o
desenvolvimento de vacinas para TB avaliam este fenômeno (Quadro 1). O menor dano
tecidual observado no pulmão de animais imunizados com a rBCG-CMX é semelhante a
outros transformantes descrito na literatura (DENG, Y.; BAO; YANG, 2011; SINGH, V.
K. et fal., 2011; DENG, Y. H.; HE; ZHANG, 2013). Além disso, macrófagos espumosos
foram observados no grupo de animais que receberam PBS (controle) no momento da
imunização e posteriormente receberam desafio com Mtb, não tendo sido observados nos
grupos de animais que receberam BCG ou rBCG-CMX. De acordo com RUSSELL e
colaboradores (2009) estes macrófagos espumosos são gerados na presença de citocinas
pro inflamatórias como o TNF-α e IFN-γ com o objetivo de conter a infecção (RUSSELL
et al., 2009).
Os macrófagos espumosos, também conhecidos como xantomatosos ou histiócitos,
são caracterizados pela formação de múltiplos vacúolos ricos em gordura e considerados
reservatórios de bacilos, resultantes a partir do acúmulo de colesterol no citoplasma destas
células devido a uma forte interferência dos ácidos micólicos do Mtb na síntese de
colesterol por macrófagos levando a um aumento no tamanho destas células (Figura 18A)
(ORDWAY et al., 2005; HUNTER, JAGANNATH, ACTOR et al., 2007). Estas
populações já foram bem descritas na infecção por Mtb em modelo murino e em humanos
e constituem um importante traço do granuloma tuberculoso e da multiplicação do bacilo e
assim contribuem para a progressão da infecção (PEYRON et al., 2008).
Estes achados, demonstram que possivelmente, a resposta inflamatória induzida nos
animais que receberam as vacinas foi menos intensa do que a promovida pela infecção no
grupo de animais não immunizados (controle). Esta resposta pode estar relacionada com a
capacidade dos linfócitos B de memória de produzirem citocinas reguladoras (IL-10 e
TGF-β) enquanto apresentam antígenos fagocitados (KOZAKIEWICZ et al., 2013a).
83
7. CONCLUSÃO
Uma vacina BCG recombinante expressando proteína de fusão do Mtb (rBCGCMX) foi desenvolvida e mostrou-se capaz de induzir produção de anticorpos específicos
e células B de memória de vida longa quando comparada a BCG Moreau. Embora tenha
apresentado proteção contra infecção pelo Mtb semelhante a conferida pela BCG, a vacina
rBCG-CMX foi capaz de diminuir a inflamação no pulmão dos animais vacinados superior
a congerida pela BCG.
A vacina rBCG-CMX foi obtida a partir da eletroporação da subcepa de BCG
Moreau utilizando os plasmídios pLA71, pLA73 e pMIP12, todos contendo a sequência
gênica codificadora da proteína de fusão CMX. Entretanto apenas o transformante com o
plasmídio pLA71-CMX apresentou expressão da CMX.
A estabilidade do plasmídio no transformante após a inoculação em animais foi
confirmada, demonstrando que a vacina apresentava-se viáveis para a realização dos
ensaios in vivo.
A resposta imune humoral específica para extrato de BCG demonstrou que os
níveis séricos de anticorpos IgG1 e IgG2a induzidos pela rBCG-CMX foram superiores a
induzida pela BCG Moreau.
Embora o número absoluto de células B de memória, aos 30 dias, induzida pela
BCG Moreau apresentou-se superior a induzida pela rBCG-CMX, aos 90 dias, a vacina
rBCG-CMX apresentou maior número absoluto deste perfil celular.
A vacina rBCG-CMX apresentou redução significativa das lesões pulmonares
induzidas pela infecção por Mtb do que a BCG, apesar de ambas as vacinas apresentare
proteção semelhante.
84
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A vacina rBCG-CMX foi capaz de induzir uma resposta imune humoral específica
para antígenos do BCG mais robusta que a própria BCG e além disso, induziu maior
número de células B de memória de vida longa com a progressão do tempo. A geração
destas respostas poderem contribuir para a proteção contra a infecção pelo Mtb, seja pela
capacidade dos anticorpos de opsonizarem o bacilo, ou pela capacidade das células B de
memória de reconhecer antígenos do Mtb, que são compartilhados pela BCG, e serem
capazes de gerar plasmócitos secretores de anticorpos com alta afinidade e especificidade
para os antígenos do Mtb. Entretanto, a proteção conferida pela rBCG-CMX foi
semelhante a apresentada pela BCG. Além disso, células B de memória podem apresentar
perfil regulador (células B reguladoras) e serem capazes de apresentar antígeno e secretar
IL-10, de maneira que este mecanismo explica a redução do dano tecidual apresentada pelo
grupo de animais vacinados com a rBCG-CMX. É importante ressaltar que novos estudos
devem ser realizados a fim de esclarecer melhor estes resultados, uma vez que devido ao
curto tempo disponível para realização do mestrado não tenha sido possível a realização de
repetições suficientes para elucidação do potencial de proteção da vacina rBCG-CMX.
85
9. REFERÊNCIAS
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10. ANEXO
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