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OBTENÇÃO, FRACIONAMENTO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
CITOTÓXICA DOS EXTRATOS DAS FOLHAS DE Piptocarpha rotundifolia
(Asteraceae) EM LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS E Artemia salina Leach
Tamires dos Santos Vieira1, Antônio Carlos Severo Menezes2, Plínio Lázaro Faleiro Naves2,
Elisângela de Paula Silveira Lacerda3, Manoel Odorico de Moraes4, Renato Gomes Santos5.
1
Discente do Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde,
bolsista da FAPEG. Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade
Estadual de Goiás (UEG). Anápolis, GO. [email protected]
2
Docentes da Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade
Estadual de Goiás (UEG), Anápolis, GO.
3
Docente da Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiânia, GO.
4
Docente da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE.
5
Discente do Programa de Pós-graduação em Ciências Moleculares, bolsista UEG. Unidade
Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade Estadual de Goiás (UEG).
Anápolis, GO.
INTRODUÇÃO
Deste os tempos remotos, as plantas e seus derivados são empregados na medicina
popular para tratar doenças, sendo por muito tempo a única alternativa disponível (HORST,
2012). Fitoterapia é uma palavra de origem grega que significa tratamento utilizando plantas,
e foi criada para nomear a utilização de espécies vegetais como medicamento (BUENO,
2005).
Pirenópolis – Goiás – Brasil
20 a 22 de outubro de 2015
O conhecimento popular a respeito da eficiência de plantas medicinais foi passado de
geração em geração não permitindo que as informações se perdessem ao longo dos anos,
sendo ainda hoje possível nortear estudos das áreas de botânica, farmacologia e fitoquímica,
cujo objetivo é conhecer as substâncias químicas presentes nas plantas (MACIEL; PINTO e
VEIGAS JR, 2002).
As diversas aplicações para uso de plantas tais como: tratar doenças, uso como
inseticidas, corantes e agentes tóxicos dentre outras, foi fundamental para desenvolvimento de
produtos naturais e medicamentos. As pesquisas realizadas nessas plantas visam a elucidação
da estrutura química dos compostos e da relação entre a estrutura e a atividade biológica
desempenhada (VIEGAS JR; BOLZANI e BARREIRO, 2006).
Atualmente, cerca de 25% dos fármacos industrializados sintéticos ou semissintéticos
são derivados, direta ou indiretamente de produtos naturais, especialmente de plantas podendo
ser citados fármacos para diversas indicações como:
morfina, pilocarpina, digitálicos,
atropina, escopolamina. Além desses há os aplicados ao tratamento do câncer como taxol,
vincristina, campotequinas, vimblastina, as estatinas usadas no tratamento das dislipemias,
vários imunossupressores, antibióticos dentre outros (BUENO, 2005).
O Brasil possui grande parte da biodiversidade vegetal do mundo, sendo assim
considerado um país cuja flora é uma fonte inesgotável de substâncias com potencial
farmacológico. O avanço tecnológico na parte química possibilita a extração dos constituintes
químicos das plantas e posterior avaliação dos efeitos biológicos (HORST, 2012).
O cerrado brasileiro é um dos biomas que mais contribui para a grande biodiversidade
vegetal do país, representando 23% da vegetação total. É composto por uma grande
heterogeneidade no que diz respeito às espécies, sendo facilmente encontradas em um mesmo
local diferentes formações vegetacionais (AMARAL e MUNHOZ, 2008). Compreende cinco
tipos fisionômicos distintos com manifestações campestres até arborescentes mais densas,
aspecto florestal, e fitotipias ecotonais intermediárias (RITTER; RIBEIRO e MORO, 2010).
Dentre as diversas espécies vegetais que compõe o cerrado, é possível encontrar a
família Asteraceae, que é o grupo mais numeroso dentre as Angiospermas compreendendo
1.100 gêneros e cerca de 25.000 espécies com diferentes aspectos físicos e químicos. Essas
plantas são comumente encontradas em todos os tipos de habitats, mas preferencialmente nas
regiões montanhosas e de clima tropical como o cerrado (VERDI; BRIGHENTE e
PIZZOLATTI, 2005).
Extratos e óleos essenciais de diversas espécies da família Asteraceae demonstraram
algumas
propriedades
biológicas
incluindo
atividade
antimicrobiana,
antivirais,
anticancerígena, analgésica e antirreumática (NENAAH, 2014). Atividade inseticida,
antiparasitária, larvicida e moluscicida, antioxidante, acaricida e anti-inflamatória também
foram testadas e evidenciadas em alguns gêneros dessa família.
As asteraceas têm sido alvo de diversos estudos científicos, levando ao
desenvolvimento de novos fármacos e inseticidas, isso é possível devido a grande variedade
de metabólitos secundários produzidos pelos vegetais dessa família. Os principais marcadores
quimiotaxonômicos são os flavonoides (NENAAH, 2014). Também são encontrados
terpenóides, diterpenos e sesquiterpenos com manifestação de uma ampla variedade de
estrutura química (GONZALEZ-COLOMA, et al., 2005).
A validação farmacológica de extratos de plantas e substâncias isoladas é essencial no
processo de descoberta de um fármaco. Bioensaios preliminares, por exemplo, são ensaios
que podem ser rapidamente aplicados a um grande número de amostras para determinar se
alguma bioatividade do tipo desejada está presente, direcionando para testes mais específicos
(RAHMAN et al., 2005). Dentre este grupo de testes ganha destaque o bioensaio de letalidade
de Artemia salina.
Mesmo com a grande quantidade de estudos fitoquímicos que já foram desenvolvidos,
ainda existem inúmeras espécies vegetais pouco conhecidas do ponto de vista científico, como
é o caso da Piptocarpha rotundifolia. A falta de estudos com interesse principal nessa espécie
e o fato de ter presença de compostos bioativos capazes de inibir o crescimento de células
cancerígenas em espécies pertencentes à mesma família, nortearam a escolha dessa planta
como alvo dessa pesquisa. Nesse sentido, objetiva-se com o presente trabalho o estudo
fitoquímico das folhas de Piptocarpha rotundifolia e a partir deste, a avaliação da atividade
citotóxica dos extratos bruto e fracionados frente a linhagens de células tumorais e Artemia
salina Leach.
OBJETIVO(S)
Pirenópolis – Goiás – Brasil
20 a 22 de outubro de 2015

Obter, fracionar e avaliar as atividades citotóxicas dos extratos das folhas de
Piptocarpha rotundifolia (Asteraceae) em linhagens de células tumorais e Artemia salina
Leach.
METODOLOGIA
MATERIAIS:
Células Sarcoma180; Células sadias; Placas microtiter de 96 poços; Dimetilsulfóxido;
Microscópio invertido; Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI); Soro fetal
bovino; Estufa de incubação; Provetas; Béqueres; Quimioterápico controle (taxol);
MÉTODOS:
Coleta e Identificação do Material Botânico
As folhas da planta Piptocarpha rotundifolia (Asteraceae) serão coletadas no
campo da UEG em Anápolis-GO, e identificadas pela Profa Dra Mirley Luciene dos Santos,
bióloga que já detêm conhecimento sobre as espécies de plantas presentes nessa reserva
ambiental. As exsicatas serão depositadas no herbário do departamento de Ciências
Biológicas da Universidade Estadual de Goiás. Posteriormente será realizado o fracionamento
do extrato bruto etanólico das folhas da referida planta, tal fracionamento se dará através de
filtração à vácuo, usando-se celulose microcristalina D como fase estacionária, obtendo-se as
frações de hexânica, diclorometano, acetato de etila e metanol.
Citotoxicidade frente à Artemia salina Leach
Neste ensaio, será empregado o meio de água marinha sintética preparado com a
dissolução em água destilada de sal marinho (40 g/L) suplementado com extrato de leveduras
(6 mg/L) e esterilizado em autoclave. O pH será ajustado a 8,5 com solução de Na2CO3 0,1
mol/L. Oitenta miligramas dos cistos serão incubados por 36 horas em 1 L do meio com
iluminação natural, com temperatura ambiente e oxigenação constantes.
Após a eclosão, os náuplios serão atraídos por fonte de luz, pipetados e transferidos
para uma placa de Petri com 5 mL de meio fresco. O bioensaio será realizado em microplaca
de poliestireno estéril de 96 poços na qual serão adicionados diferentes concentrações
do extrato bruto, extrato fracionado e substâncias isoladas de Piptocarpha rotundifolia.
Os náuplios serão distribuídos na placa, padronizando um total de 10±1 de indivíduos
em cada poço. Serão incluídos nos ensaios controles negativos, de viabilidade e de letalidade
utilizando diluições de 100 µg/ml de K2Cr2O7. Os resultados permitirão o cálculo da
DL50 pelo método gráfico para dose-resposta – Próbito, no programa Statplus 2009
professional (AnalystSoft). Todos os ensaios realizados serão feitos em triplicata e de maneira
independente (MOLINA e SAID, 2006).
Ressalta-se que este ensaio é utilizado em estudos de novas moléculas bioativas, na
determinação preliminar da bioatividade de compostos durante o isolamento de produtos
naturais com o objetivo de verificar a citotoxicidade. Essa metodologia demonstra a evidência
de toxicidade dos compostos frente as larvas, sendo que o resultado encontrado nesse teste
exemplifica os efeitos das substâncias em células humanas sadias. O resultado da
citotoxicidade apresentada é expressa em dose letal para 50% da população, conhecida como
DL50 (RAHMAN, et al., 2005; NASCIMENTO, et al., 2008).
CITOTOXICIDADE FRENTE ÀS LINHAGENS CELULARES
Linhagens celulares e manutenção do cultivo celular
Para os ensaios biológicos serão utilizadas as linhagens tumorais S180 (Sarcoma 180
de camundongo e como células normais (controle) será utilizada a linhagem L919 fibroblastos
normais de camundongo). A linhagens celulares serão cultivadas em meio RPMI,
suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de
estreptomicina e mantidas em estufa à 37 ºC, 5% CO2 , segundo protocolo estabelecido pela
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA).
Ensaio de viabilidade celular pelo método de redução do MTT
“A análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa de
screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que testa mais de 10.000
amostras a cada ano. É um método rápido, sensível e barato.” (SKEHAN et al., 1990 apud
SANTOS et al., 2011).
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Para avaliar a atividade citotóxica e antitumoral dos extratos de Piptocarpha
rotundifolia será utilizado o método colorimétrico de redução do MTT 3-(4,5-Dimetiltiazol-2il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazolium). O princípio deste método descrito por Mosman
(1983) consiste em medir indiretamente a viabilidade celular pela atividade enzimática
mitocondrial das células vivas. Para o teste do MTT, 1 x 105 de células tumorais S180 e
normais L919 serão semeadas em microplacas de 96 poços na ausência ou presença dos
extratos e isolados da Piptocarpha rotundifolia (0.2 a 200 µM) ou taxol como controle
positivo (0.2 a 200 µM) e incubadas em estufa a 37ºC com atmosfera contendo 5% de CO 2.
Ao final do período de incubação, será adicionado aos poços de cultivo celular 10 μL de MTT
na concentração de 5 mg.mL-1, e após 3 horas de incubação com o MTT, serão acrescentados
50 μL de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) a 10% diluído em HCL/0,01N. A quantificação da
densidade óptica (DO) será medida em espectrofotômetro (Awareness Technology INE/ Stat
Fax 2100). A porcentagem de citotoxicidade será determinada a partir da seguinte fórmula: %
Citotoxicidade = 1-Absorbância do Tratamento/Absorbância do controle negativo*100. O
valor de IC50 (concentração em µM que inibe 50 % da viabilidade celular) será determinada
por meio da curva dose resposta utilizando o programa estatístico GraphPad Prism 4.02
(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). A partir dos valores de IC apresentados pelos
compostos sobre as células S180 e L919, serão selecionados os compostos com melhores
valores de IC50 para serem realizados os testes seguintes.
FONTES DE PESQUISA/MÉTODOS DE LEVANTAMENTO E TRATAMENTO DE
DADOS
Fontes de Pesquisa
O levantamento bibliográfico será realizado através de uma busca na internet nos
principais bancos de dados, tais como: Scopus, Web of Science e outros.
Tratamento de dados
Para verificar diferenças significativas entre os grupos estudados e controle serão
aplicados através de softwares (GraphPad Prism V4), os testes de análise de variância (ANOVA)
ou teste “t” de Student. Quando detectada diferença significativa entre os grupos, será aplicado o
teste de contraste de Tukey ou teste Dunnet´s para comparação entre o grupo controle.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A espécie vegetal alvo desse trabalho já foi coletada conforme cronograma préestabelecido, sendo obtido 3Kg de folhas frescas. A secagem foi realizada em estuda com
circulação de ar a 40º C por 48 horas, logo após, as folhas foram moídas em moinho de facas
e obteve-se 1,5 Kg de material vegetal seco e moído. Pode-se observar uma grande perda de
peso entre as folhas frescas e o material seco e moído, o que pode ser explicado pela grande
quantidade de água que compõe as folhas e que é perdida durante o processo de secagem.
O material vegetal foi extraído exaustivamente com etanol e obteve-se o extrato bruto
etanólico (128g). A partir desse extrato, foram obtidos os demais por filtração à vácuo com
celulose microcristalina D como fase estacionária. O fracionamento foi realizado por meio de
extração das substâncias conforme a sua polaridade, usando-se a série eluotrópica dos
solventes, o que resultou na obtenção do extrato hexânico (50g) , diclometano (3,6g), acetato
de etila (2,7g) e metanólico (45g).
Espera-se encontrar citotoxicidade dos extratos das folhas de Piptocarpha rotundifolia
contra linhagens de células S180 e viabilidade celular frente às linhagens normais L919 para
que se possa prosseguir com as triagens dos compostos frente a uma bateria de células
tumorais. Após testes com os extratos, pretende-se encontrar as mesmas atividades biológicas
ao testar as substâncias isoladas a fim de verificar qual delas é responsável pelo efeito
farmacológico ou se trata de uma interação sinérgica. Espera-se também desenvolver uma
patente para o produto descoberto para que o trabalho possa ser levado adiante.
AGRADECIMENTOS
A Universidade Estadual de Goiás pelo Programa de Bolsa e Incentivo à Pesquisa e
Produção Científica (PROBIP-UEG), a PrP-UEG e a FAPEG pela concessão de bolsa
mestrado.
REFERÊNCIAS
Pirenópolis – Goiás – Brasil
20 a 22 de outubro de 2015
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2008.
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