Caracterização Farmacobotânica de Folhas Adultas de
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Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 Caracterização Farmacobotânica de Folhas Adultas de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker – Asteraceae (Coração-de-negro) Raquel Pinheiro Reis Souza Ramalho (PBIC), Vanessa Bernardes (PVIC), Adda Daniela Lima Figueiredo (Orientadora). Universidade Estadual de Goiás, 75.132-903, Brasil [email protected]; [email protected]; [email protected] Palavras-Chave: Cerrado, anatomia, bioprospecção. 1 INTRODUÇÃO O Cerrado ocupa mais de 2 milhões de Km 2 do Brasil central e amazônico, representando cerca de 22% do território nacional. Este bioma é uma das áreas de grande abundância em espécies, em especial plantas endêmicas, sendo conseqüentemente detentora de uma grande diversidade biológica. No entanto, o desmatamento desordenado para práticas agrícolas abre espaços sobre este bioma extinguindo de recursos naturais, estima-se que 67% das áreas do Cerrado são consideradas como “altamente modificadas” e apenas 20% encontramse em seu estado original (MITERMIER et al., 1999 apud SILVA et al., 2002). Neste contexto, há carência de estudos voltados para a identificação e caracterização de plantas do Cerrado, além do ponto de vista químico. O desconhecimento de sua riqueza e possibilidades se agrava quando grande parte deste bioma já foi devastada, considerando que os recursos oferecidos por este bioma, uma vez extintos, não estará disponível às futuras gerações (NETO & MORAIS, 2003). Para obter sucesso ao suportar as condições hostis do cerrado, devido à disponibilidade restrita de água, sua vegetação apresenta adaptações na anatomia foliar e na fisiologia. Como em respostas às alterações ambientais, a lâmina foliar é 1 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 a primeira a sofrer modificações. Neste sentido, a anatomia foliar vem sendo muito estudada, e apresenta grande importância para identificações de espécies (EAMES & MCDANIELS, 1947; FAHN & CUTLER, 1992 apud ELIAS, 2006). Além disso, muitas espécies deste bioma são utilizadas popularmente para o preparo de medicamentos (fitoterápicos), sem se ter a noção precisa do que estas substâncias podem causar no organismo. Além de um caráter terapêutico as plantas medicinais também têm um caráter econômico para a população que a utiliza (FALKENBERG et al., 2003). Segundo FALKENBERG et al. (2003), a pesquisa fitoquímica tem por objetivos conhecer os constituintes químicos de espécies vegetais ou avaliar a sua presença. Existem plantas de diversos grupos de princípios ativos, cada qual com características diferentes. A fitoquímica estuda desde a estrutura molecular até as propriedades biológicas de cada um dos grupos. A análise fitoquímica preliminar pode indicar os grupos metabólitos secundários relevantes na mesma. Tais substâncias apresentam atividades biológicas e são restritas em sua distribuição, tanto entre espécies diferentes quanto dentro da própria espécie. Dentre as plantas comumente encontradas no cerrado, a família Asteraceae constitui a maior família de Eudicotiledôneas com aproximadamente 1600 gêneros e 23000 espécies entre ervas, arbusto e árvores e possui distribuição cosmopolita. No Brasil, há ocorrência de aproximadamente 300 gêneros e 2000 espécies (GROKOVISKI, 2009). O gênero Piptocarpha compreende cerca de 30 espécies da América tropical, desde o México até o norte da Argentina, incluindo arbustos, arvoretas, lianas e árvores (FERRIANI, 2006). As principais características que denomina Piptocarpha como um gênero distinto são as inflorescências axilares, tricomas estrelados na superfície abaxial das folhas e ramos, brácteas involucrais internas caducas e a base da cauda da antera estéril (SMITH, 1982 apud GROKOVISKI et al., 2009). O sul e leste do Brasil são centros de distribuição de Piptocarpha, mas centros secundários são as florestas do norte e centro da América do. As espécies arbóreas são distribuídas nos planaltos do sul do Brasil, mas Piptocarpha 2 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 rotundifolia (Less.) Baker é uma exceção, pois é uma árvore comum do cerrado do Brasil Central (SMITH, 1981 apud GROKOVISKI et al., 2009). A espécie Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker, é arvoreta de até 4 metros, hermafrodita com folhas alternadas, ovaldas, e apresenta duas colorações: verde-acinzentado a parte adaxial e a parte abaxial é acizentada ou amarelada. As inflorescências saem entre a folha e o ramo (axilar) e contém pequenas flores de cor creme agrupadas (Ferri 1968).Os frutos são secos (tipo aquênio) pequenos, com muitos pêlos rígidos de cor cinza-amarelado e a floração ocorre de julho a maio e a frutificação de novembro a maio (OLIVEIRA & PAULA, 2001). As folhas de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker possui valores medicinais, tais como: no tratamento contra a sífilis, diarréia, fraqueza e meteorismo. Devido a espécie P. rotundifolia não apresentar dados farmacobotânicos e fitoquímicos, faz-se necessários estudos sobre as características anatômicas foliares da espécie, possibilitando a sua identificação no ambiente cerrado; e de prospecção fitoquímica das folhas adultas desta espécie, com intuito de controle da droga vegetal e para se obter dados base para futuros estudos de cunho interdisciplinar. 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Material vegetal Folhas adultas de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker foram coletadas, em uma região de Cerrado sensu stricto no Campus da Unidade Universitária de Ciências e Tecnologia (UnUCET), localizado em Anápolis, UEG. No laboratório, o material vegetal foi lavado em água corrente, e parte deste ainda fresco foi utilizado para a realização do estudo anatômico, sendo o restante dessecado em estufa com circulação forçada de ar (modelo FABBE – PRIMAR) a 40ºC, para em seguida ser moído em moinho de facas (modelo Tipo WILLYE TE-650 TECNAL) a forma de pó, utilizados na prospecção fitoquímica. 3 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 2.2 Caracterização anatômica Após a lavagem do material fresco, fragmentos com cerca de 1cm de comprimento para pecíolo e de 1 cm de comprimento por 0,5cm de largura para a lâmina foliar, foram retirados com auxílio de lâmina ou bisturi e colocados em frasco, previamente identificados, contendo formaldeído ácido propiônico e álcool (FPA) 70% (v/v) como fixador. Após três dias o FPA foi substituído por etanol 70% (v/v). Os cortes histológicos foram submetidos à dupla coloração, azul de alcian/safranina, baseada na metodologia adaptada de Kraus & Arduin (1997) e com Etzold (ETZOLD, 1993). Os melhores cortes foram colocados entre lâmina e lamínula contendo uma gota de glicerina/água a 50% (v/v), sendo vedados com esmalte incolor nas bordas da lamínula. 2.3 Prospecção fitoquímica A pesquisa fitoquímica teve por finalidade conhecer os constituintes químicos de espécies vegetais ou avaliar a sua presença, indicando os grupos de metabólicos secundários relevantes no material de estudo. A seguir as reações e metodologias utilizadas descritas por Costa (2001) e Matos (1988): Heterosídeos antraquinônicos: Reação de Bornträger. Esteróides e triterpenóides: Reação de Liebermann-Burchard, reação de Keller-Killiani e reação do Núcleo Esteroidal. Heterosídeos flavonóides: Reação de Shinoda ou reação da Cianidina, reação Oxalo-bórica, reação com ácido sulfúrico concentrado, reação com os hidróxidos alcalinos, reação com o cloreto de alumínio, reação com cloreto férrico. Heterosídeos saponínicos: Índice de espuma após a agitação da solução neutralizada com carbonato de sódio. 4 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 Taninos: Reação com gelatina, reação com os alcalóides, reação com sais metálicos, reação com hidróxidos alcalinos. Alcalóides: Reação com Reativo de Mayer (tetra-iodomercurato de potássio), reação com reativo de Dragendorff (iodo-bismutato de potássio), reação com reativo de Bouchardat (solução aquosa de iodo em iodeto de potássio), reação com reativo de Bertrand (ácido sílicotungstico a 5% p/v), reação com reativo de Hager (ácido pícrico a 2% p/v), reação com Ácido Tânico a 1% (p/v). Cumarinas: Teste da fluorescência, sob luz UV, com uma gota de hidróxido de sódio, após acidificação e extração em fase etérea. Resina: Avaliada a presença de turvação no extrato etanólico 2.4 Testes de pureza A amostra vegetal moída foi utilizada para a determinação dos teores de cinzas totais, insolúveis em ácido, e a umidade. Os ensaios para a determinação desses parâmetros de qualidade foram realizados conforme técnica adaptada da Farmacopéia Brasileira (2003). 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Caracterização Anatômica O estudo anatômico da folha adulta de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker (Asteraceae) verificou a presença de epidermes, superior e inferior, unisseriadas com células poliédricas de paredes retas (Figura 3). A epiderme superior é recoberta por uma cutícula espessa, que de acordo com MELO-DEPINNA (2004), funciona como mecanismo para evitar a perda excessiva de água. Assim como observado pelo mesmo autor para Richterago hatschbachii (Asteraceae). A cutícula relativamente espessa da folha constitui uma adaptação à dissecação (LEITE & SCATENA 2001). 5 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 A folha adulta de P. rotundifolia, em secção paradérmica, evidenciou a presença de estômatos anomocíticos somente na face abaxial, caracterizando a folha como hipoestomática. Metcalfe & Chalk (1950) apud Lolis & Milaneze-Gutierre (2003) comprovam a existência de estômatos geralmente anomocíticos, para a família Asteraceae. Como foi observado por Handro et al.(1970) apud Mussury (2007), a família Asteraceae apresentam representantes hipoestomáticos, além de também possuírem folhas com padrão anfiestomática (NAPP-ZINN, 1973 apud MUSSURY, 2007), A folha adulta de Coração-de-Negro apresenta mesófilo dorsiventral com a presença de duas camadas de parênquima paliçádico e parênquima lacunoso condensado (Figura 1B). A presença de duas camadas de parênquima paliçádico, conforme Esau (2002), é uma característica marcante de xerófitas, onde folhas desenvolvidas sob a ação de luz solar apresentam tecido paliçádico mais fortemente diferenciado do que em folhas que se desenvolveram na sombra. Há grandes quantidades de tricomas tectores e glandulares em maior abundância na epiderme inferior (Figura 1A), apresentando em grande quantidade o tricoma de formato estrelado (Figura 1C). Plantas de ambientes secos apresentam grandes quantidades de tricomas tectores. Segundo Mauro (2007), abundantes tricomas tectores na face dorsal do limbo foliar mostram adaptações a ambiente xerofítico. Pois, de acordo com Oliveira & Akisue (1989) apud Aoyama & Mazzoni-Viveiros (2006), os tricomas tectores evitam a transpiração excessiva, portanto possuem função protetora a ambientes hostis. A presença abundante de tricomas estrelados, principalmente na superfície inferior, vai de acordo com o que afirma Grokoviski et al. (2009); o qual descreveu que a ocorrência de tricomas estrelados na superfície abaxial das folhas e ramos é umas das principais características que delimitam Piptocarpha como um gênero distinto. 6 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 Figura 1 – Aspecto geral da epiderme de folhas adultas de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker (Asteraceae). A – Secção paradérmica da epiderme adaxial. B- Secção transversal do mesofilo, evidenciando o parênquima paliçádico. C – Detalhe do tricoma estrelado. Cr – cristais; Ga – grãos de amido; Eps – epiderme superior; Epi epiderme inferior; Pp - parênquima paliçádico; Pl – parênquima lacunoso; Tr - tricoma O feixe vascular dispõe-se colateralmente, formando as unidades vasculares, as quais se encontram na posição mediana do mesófilo (Figura 2A). A posição das unidades vasculares também foram verificadas em Richterago hatschbachii (Asteraceae), as quais são características geralmente comuns na família (MELO-DE-PINNA, 2004). Os feixes vasculares de P. rotundifolia são envolvidos por uma bainha que inicialmente é parenquimática, seguido por bainha esclerenquimática, corroborando com o estudo de Achutti (1978) apud Mussury et al. (2007). Verificou-se abundância de esclerênquima e presença de bainha de fibras envolvendo cada unidade vascular. A presença de fibras ao redor dos feixes vasculares são caracteres freqüentes da família Asteraceae, referidas por Carlquist (1957), Anderson & Creech (1975) e Breitwieser (1993) apud Melo-de-Pina (2004). A bainha do feixe é constituída de células do mesófilo que se lignificaram, assim como foi verificado por Melo-de-Pinna (2004) nas duas espécies de Asteraceae - R. stenophylla e R. angustifóli. Tal lignificação das células do mesófilo pode iniciar-se em direção às duas superfícies ou apenas para uma, no caso em estudo iniciou-se apenas em direção a superfície adaxial; formando extensões com esclerênquima bem 7 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 desenvolvido, saindo dos feixes vasculares em direção a epiderme superior (Figura 2B). De acordo com Fahn & Cutler (1992), plantas xerófitas apresentam como característica adaptativa a ocorrência de extensões da bainha nos feixes vasculares, por serem as fibras, condutoras de água; demonstrando esta ser uma forma de adaptação ao cerrado. Esclerênquima abundante é comum em plantas de habitat continuamente seco ou em que ocorre seca periódica. Estas estruturas reduzem os efeitos danosos de murchamento, fornecendo reforços mecânicos ás folhas (ESAU, 2002). Figura 2 - Secção transversal da folha adulta de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker (Asteraceae). A – Aspecto geral. B – Aspecto geral da nervura principal. Ep – epiderme Co – colênquima; Pc – parênquima cortical; Pm – parênquima medular; Tr – Tricoma; B - Es – esclerênquima. 3.2 Prospecção Fitoquimica Nos testes qualitativos realizados com o pó das folhas adultas de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker (Asteraceae), verificou-se a presença total de resina e cumarina, parcial de tanino, heterosídeos flavonóides, alcalóides, esteróides e triterpenóides, e a ausência de heterosídeos antraquiônicos e heterosídeos saponínicos (Tabela 1). 8 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 Tabela 1 – Resultados obtidos nos ensaios qualitativos das folhas adultas de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker (Asteraceae). Classe de metabólito secundário Hererosídeos Saponínicos Resina Tanino Heterosídeos Antraquinônicos Heterosídeos Flavonóides Alcalóides Cumarina Esteróides e Triterpenóides Reagente/Reação Índice de espuma Resultados <100 Coloração turva no extrato Etanólico Reação com Gelatina Reação com Alcalóides – Sulfato de Quinino Reação com Alcalóides – Solução Alcoólica de Brucina Reação com Sais Metálicos – Acetato de Cobre Reação com Sais Metálicos – Cloreto de Ferro Reação com Hidróxidos Alcalinos + Reação de Bornträger - Reação de Shinoda Reação Oxalo-Bórica Reação com ácido Sulfúrico Concentrado Reação com Hidróxidos Alcalinos Reação com Cloreto de Alumínio Reação com Cloreto Férrico Reativo de Mayer Reativo de Dragendorff Reativo de Bouchardat Reativo de Bertrand Reativo de Hager Precipitação com Ácido Tânico Fluorescência após extração ácido/base de fase Etérea Liebermann-Burchard + + + + + + - Reação de Keller-Kiliani Reação do Núcleo Esteroidal + + + + + para Triterpenos + + Indica resultado positivo para o teste - Indica resultado negativo para o teste Os heterosídeos saponínicos foram ausentes. A altura de espuma em cada tubo de ensaio foi menor que 1cm, o índice de espuma foi então menor que 100 (OMS, 1998). As saponinas têm propriedades de redução da redução da tensão superficial da água e ações detergentes devido sua característica lipofílica e outra 9 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 hidrofílica (SIMÕES et al., 2007). O presente estudo observou ausência dessas características nas folhas da espécie estudada. Os resultados para os testes de resina foram positivos. Resinas têm ação contra a perda d’água e proteção de patógenos (OLIVEIRA, 2006). Dos seis testes realizados para tanino três foram positivos, o que nos leva a crer que a planta possui algumas propriedades tanínicas. Plantas ricas em taninos são empregadas no tratamento de diversas moléstias, como diarréia, hipertensão arterial, reumatismo, hemorragias, feridas, queimaduras, problemas estomacais e processos inflamatórios em geral (SIMÕES et al., 2007). Os testes para heterosídeos antraquinônicos foram negativos. Fármacos que possuem heterosídeos antraquinônicos são empregados como laxativos e purgativos (CECY, 1986). As propriedades antidiarréicas de Piptocarpha rotundifolia foi prevista por Almeida et al. ( 1998). Quatro das seis reações realizadas para Flavonóides deram positivas para a presença de em Piptocarpha rotundifolia. Flavonóides têm diversas funções entre elas: antitumoral, hormonal, antiinflamatória, antioxidante e antiviral (SIMÕES et al., 2007). Outras plantas da família Asteraceae também mostraram alto teor de flavonóides, dentre elas Baccharis trimera, que possui ações anti-hepatotóxicas, antiinflamatória e analgésica (BORELLA & FONTOURA, 2002). Apenas dois dos seis experimentos de alcalóides deram positivos. Os Reagentes de Bertrand e Dragendorff indicaram a presença de alcalóides. Esses metabólitos são considerados antifúngicos e antitumorais (AQUINO, 2006). A família Asteraceae está entre as mais citadas na ocorrência de cumarinas (SIMÕES et al., 2007). O presente estudo obteve resultado positivo para as mesmas. As cumarinas são heterosídeos que apresentam diversas propriedades como a ação anticoagulante, aromatizantes de alimentos, produtos de limpeza, além de possuir propriedades antibióticas, bronco dilatadora, fungicida e analgésica (RODRIGUES, 2005). Os testes para esteróides e triterpenóides foram parcialmente positivos. A reação com o reagente de Liebermann-Burchard mostrou a presença de 10 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 Triterpenos e a reação do Núcleo Esteroidal indicou a presença de um núcleo esteroidial. 3.3 Testes de Pureza O teor de umidade foi de 21, 733%. Os limites de umidade de drogas vegetais de acordo com a Farmacopéia Brasileira (1988) é de 8% a 14%. No caso de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker o índice de umidade foi superior aos padrões considerados normais. A quantidade de excessiva de água propicia o desenvolvimento de fungos, bactérias, insetos e hidrólise de constituintes da droga (OLIVEIRA, 2006) O teor de cinzas totais foi de 14, 433 %.A determinação do teor de cinzas totais permite a verificação de impurezas inorgânicas não-voláteis que podem estar presentes como contaminantes (FARIAS, 2003 apud SOARES et al., 2005). O teor de cinzas insolúveis em ácido foi de 11,566 %. As cinzas insolúveis em ácido verificam a presença de sílica e constituintes silicosos na droga vegetal de acordo com a Farmacopéia Brasileira (1988). O alto teor de cinzas insolúveis em ácido em P. rotundifolia propõe que a espécie tem alto teor de sílica em seu mesófilo foliar. 4 CONCLUSÕES O cerrado possui carência no estudo da identificação de suas espécies, das quais muitas possuem propriedades medicinais. O estudo anatômico das folhas de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker (Asteraceae) comprovou a presença de características xeromórficas da espécie típica deste bioma. Os dados deste estudo possibilitam a identificação e controle da droga vegetal da espécie P. rotundifolia no cerrado, além de fornecer subsídios para posteriores estudos multidisciplinares. 11 Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS 10 a 12 de novembro de 2010 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACHUTTI, M. H. C. Aspectos morfológicos e anatômicos dos sistemas aéreo e subterrâneo e o óleo essencial das folhas de Piptocarpha rotundifolia (Less.) Baker (Compositae). Tese (Doutorado) – Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, p.212. 1978. ALMEIDA S. P.; PROENÇA, C. E. B.; SANO, S. M.; RIBEIRO, J. F. Cerrado: espécies vegetais úteis. Planaltina: EMBRAPA-CPAC. 1998. ALMEIDA, A. M.; FONSECA, C.R.; PRADO, P. I.; ALMEIDA-NETO,M.; DINIZ, S.; KUBOTA, U.; BRAUN, M. R.; RAIMUNDO, R. L. G.; ANJOS, L. A.; MENDONÇA, T. G.; FUTADA, S. M.; LEWINSOHN, T. M. 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