“PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO E

UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MARIA CRISTINA GONÇALVES DE SOUZA
“PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO E AVALIAÇÃO DAS
PROPRIEDADES PRÓ E ANTI-OXIDANTES EM MODELO ANIMAL”
CRICIÚMA (SC), 2007.
1
MARIA CRISTINA GONÇALVES DE SOUZA
“PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO E AVALIAÇÃO DAS
PROPRIEDADES PRÓ E ANTI-OXIDANTES EM MODELO ANIMAL”
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde da Universidade do Extremo Sul
Catarinense, para obtenção do Título de Mestre
em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Marques da Silva
Paula
Co-orientador: prof. Dr. Felipe Dal -Pizzol
CRICIÚMA (SC), 2007
2
Ao meu querido marido Vanderlei, que me incentivou a realizar mais esta
conquista e esteve ao meu lado em todos os momentos com muita dedicação e
compreensão mesmo nas horas que o desânimo e cansaço inundavam o meu ser.
Ao Nicolas, meu filho amado, que soube entender a ausência da mãe nestes
dois últimos anos e nos momentos mais cansativos e estressantes, oferecia carinho
e palavras de conforto e esperança.
3
AGRADECIMENTOS
A DEUS
Por estar sempre comigo.
Agradeço ao Professor Dr. Marcos Marques da Silva Paula, pelos
ensinamentos, pela amizade, confiança e pela oportunidade de trabalhar sob sua
orientação.
Ao professor Dr. Felipe Dal Pizzol, pelo auxílio na co-orientação.
Aos meus pais, Erci e Carlos, pelo amor, carinho e incentivo para a
realização de mais este sonho.
Aos dois amores da minha vida, meu marido Vanderlei e o meu filho Nicolas,
por todo carinho e compreensão neste período de ausência.
Ao meu sogro Maurino e a minha sogra Aura, pela amizade, confiança e
auxílio para que eu pudesse chegar até o final deste trabalho.
Aos bolsistas Angeles Meller, Danon Cardoso e Maykon Passos, pela
dedicação, paciência e auxílio para a realização deste trabalho, vocês são pessoas
muito especiais e iluminadas e se tornaram grandes amigos.
Aos bolsistas e professores dos laboratórios do LASICOM, LABIFE e
Neurociências, que contribuíram para a realização deste trabalho.
4
A vida tem duas faces:
Positiva e negativa
O passado foi duro
Mas deixou o seu legado
Saber viver é a grande sabedoria
Que eu possa dignificar
Minha condição de mulher,
Aceitar suas limitações
E me fazer pedra de segurança
Dos valores que vão desmoronando.
Nasci em tempos rudes
Aceitei contradições
Lutas e pedras
Como lições de vida
E delas me sirvo
Aprendi a viver.
Cora Coralina
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RESUMO
Este trabalho relata a síntese e caracterização dos complexos de coordenação
biologicamente ativos: trans-[RuCl2(dinic)4] (complexo A) e trans- [RuCl2(i-dinic)4]Cl
(complexo B) , onde dinic = ácido piridina-3,5-dicarboxílico e i-dinic = ácido piridina3,4-dicarboxílico. Os complexos foram sintetizados utilizando solução de azul de
rutênio como precursor, com bons rendimentos. Resultados da análise elementar de
CHN mostraram-se compatíveis com as fórmulas propostas. Para a caracterização
utilizaram-se as técnicas espectroscópicas de UV–vis, FT-IR, Raman ressonante,
RMN 1H. Para avaliação de danos lipídicos em órgãos e estruturas do SNC, utilizouse a medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e danos a
proteínas (CARBONIL). Danos em lipídios foram observados após o tratamento, em
ambos os complexos, nas estruturas de órgãos (fígado, pulmão, coração, rim e
quadríceps) e SNC (cerebelo, pré-frontal, hipocampo, estriado e córtex) em várias
concentrações aplicadas (0,08; 13,6; 45,2 e 180,7 mol/kg). Após a análise verificouse que para o complexo (B) o dano foi maior. O complexo A não causou dano em
proteína, enquanto para o complexo B a significância de dano em relação à salina foi
observada nos seguintes órgãos: coração, rim e quadríceps, na concentração de
180,7 mol/kg. Nas estruturas do SNC o cerebelo e o hipocampo apresentaram
dano nas concentrações de 45,2 e 180,7 mol/kg.
Palavras-chave: Complexos de Rutênio; Defesas Antioxidantes; Danos Oxidativos;
TBARS; Proteína Carbonil.
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ABSTRACT
This work report the synthesis and characterization of the biological active
coordenation complexs: trans–[RuCl2(dinic)4] (A complex) and trans-[RuCl2 (idinic)4]Cl (B complex), where dinic = 3,5-pyridinedicarboxylic acid and i-dinic = 3,4pyridinedicarboxylic acid. The complexes were synthesized using a blue solution of
ruthenium with precursor of good income. Results of the elementary analyzes of CHN
have shown compatible with the proposed formulare. For the characterization was
used the follow techniques: UV-vis spectroscopy, FT-IR, renishaw Raman, RMN 1H.
For evaluation of lipids damages, in NCS organs and structures, was use the
measurement of thiobarbituric reactive species and carbonyl for protein damages.
Lipids damage were observed after tratament with both complexs, in organ structures
(Liver, lungs, heart, kidney, quadriceps) and NCS (cerebellum, pre-frontal,
hippocampus, striatum e cortex) in various concentracions applied (0.08, 13.6, 45.2 e
180.7 mol/kg). After the analisys, examined that at the B complexes the damage
was bigger. The A complex have not caused damage in protein, while for the B
complex the damage significance when comparing with the saline were observed in
the following organs: heart, kidney and quadriceps on the concentration of 180.7
mol/kg/kg. In NCS structures, the cerebellum and hippocampus have presented
damage in the concentration of 45.2 and 180.7 mol/kg.
Key- words: Complexs of Ruthenium; Antioxidant defenses; oxidative damages;
TBARS; Carbonyl protein.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Estrutura química proposta para o trans-[RuCl2 (dinic)4]
(Complexo A).............................................................................................................16
Figura 02: Estrutura química proposta para o trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl (Complexo B)
.....................................................................................................................................................................................................16
Figura 03: Espectros eletrônicos em sistema binário água-acetona 1:1 v/v do
complexo A em meio neutro e após adição de H2O2 .........................................................................35
Figura 04: Espectros eletrônicos para o complexo B em água, antes e após a adição
de NaBH4 e diferentes pHs.........................................................................................36
Figura 05: Espectro de Raman para o complexo trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl excitado
em 632,8 nm...............................................................................................................37
Figura 06: Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
em diferentes estruturas de órgãos após a administração do complexo A. Resultados
em
nmol
de
MDA/mg
de
proteínas.....................................................................................................................40
Figura 07: Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
em diferentes estruturas de órgãos após a administração do complexo B. Resultados
em nmol de MDA/mg de proteínas.............................................................................41
Figura 08: Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
em diferentes estruturas do SNC após a administração do complexo A. Resultados
em nmol de MDA/mg de proteínas.......................……………………….................... 42
Figura 09: Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
em diferentes estruturas do SNC após a administração do complexo B. Resultados
em nmol de MDA/mg de proteínas................………………………........................... 43
Figura 10: Determinação de proteína carbonil em diferentes estruturas de órgãos
após a administração do complexo A. Resultados em nmol/mg de
proteínas.....................................................................................................................44
Figura 11: Determinação de proteína carbonil em diferentes estruturas de órgãos
após a administração do complexo B. Resultados em nmol/mg de
proteínas.....................................................................................................................45
Figura 12: Determinação de proteína carbonil em diferentes estruturas do SNC após
a
administração
do
complexo
A.
Resultados
em
nmol/mg
de
proteínas.....................................................................................................................46
Figura 13: Determinação de proteína carbonil em diferentes estruturas do SNC após
a
administração
do
complexo
B.
Resultados
em
nmol/mg
de
proteínas....................................................................................................................47
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Análise elementar de CHN para os complexos A e B.............................34
Tabela 02: Números de onda do espectro vibracional para o complexo B e prováveis
atribuições. Abreviações: w = fraca, m = media, s = forte, vw = muito fraca, br =
larga............................................................................................................................37
Tabela 03: Logaritmos das constantes de protonação para o complexo trans[RuCl2(i-dinic)4]Cl a 25,0 ± 0.05 0C e = 0.100 M (KCl) ..........................................38
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LISTA DE ABREVIATURAS
ADP – adenosina difosfato
ATP – adenosina trifosfato
CAT – catalase
CuZnSOD – cobre/zinco superóxido dismutase
DINIC - ácido piridina-3,5-dicarboxílico
DNA – ácido desoxirribonucléico
EAO/ERO – espécies ativas de oxigênio
EAN/ERN – espécies ativas de nitrogênio
FADH2 – flavina adenina dinucleotídeo
GPX – glutationa peroxidase
GSH – glutationa reduzida
GTP – guanosina trifosfato
I-DINIC - ácido piridina-3-4-dicarboxílico
LPO – lipoperoxidação
MnSOD – manganês superóxido dismutase
NAC – N-acetilcisteína
NADH – nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)
OH – radical hidroxil
SOD – superóxido dismutase
TBA – ácido tiobarbitúrico
TBARS – substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
10
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 12
1.1 Complexos de Rutênio....................................................................................12
1.1.1 Visão geral..................................................................................................12
1.2 Complexos de Rutênio e ação biológica........................................................17
1.3 Radicais livres ...............................................................................................19
1.4 Espécies Ativas de Oxigênio (EAO).............................................................21
1.5 Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN) .......................................................23
1.6 Defesas antioxidantes e enzimáticas ............................................................24
1.7 Estresse oxidativo .........................................................................................25
1.8 OBJETIVOS.................................................................................................... 27
1.8.1 Objetivo geral................................................................................................27
1.8.1 Objetivos específicos....................................................................................27
2.0 MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................28
2.1 Reagentes.....................................................................................................28
2.2 Equipamentos. ..............................................................................................28
2.3 Sínteses. .......................................................................................................30
2.3.1 Preparação de trans-[RuCl2(dinic)4 ] (Complexo A)
.........................30
2.3.2 Preparação de trans-RuCl2(i-dinic)4]Cl (Complexo B) .........................30
2.4 Atividade biológica. .......................................................................................31
2.4.1 Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) Peroxidação Lipídica
..............................................................................31
2.4.2 Determinação do dano oxidativo em proteínas (CARBONIL) - Oxidação
de proteínas....................................................................................................32
11
2.5 Animais e protocolo........................................................................................32
2.6 Análise estatística..........................................................................................33
3 RESULTADOS...................................................................................................34
3.1 Síntese e caracterização físico-química..........................................................34
3.2 Atividade biológica............................................................................................40
4 DISCUSSÃO........................................................................................................48
4.1 Síntese e caracterização físico-química.........................................................48
4.2 Atividade biológica..........................................................................................49
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................53
12
1. INTRODUÇÃO
1.1 Complexos de Rutênio
1.1.1 Visão geral:
Íons metálicos apresentam as mais variadas atividades biológicas, o que têm
estimulado o desenvolvimento de produtos terapêuticos baseados em metais.
Cisplatina, uma das principais drogas metálicas tem sido amplamente utilizada no
tratamento de câncer. Entretanto, efeitos colaterais e resistência à droga têm
limitado suas aplicações clínicas (Cohen e Lippard, 2001; Hall e Hambley, 2002;
Zhang e Lippard, 2003).
Complexos de rutênio e de ouro com atividade anti-tumoral, e outros
compostos metálicos têm sido investigados por apresentarem potencial aplicação
medicinal, incluindo capacidade para modular as propriedades do ânion superóxido
e óxido nítrico (Zhang e Lippard, 2003). Pode-se afirmar que a indústria farmacêutica
vem se beneficiando com o uso de drogas e agentes diagnosticantes baseados em
compostos de coordenação (compostos inorgânicos) (Zehulova et al., 2001).
O rutênio destaca-se na química de coordenação por possuir a habilidade de
formar complexos extremamente estáveis com ligantes piridínicos. Compostos de
coordenação de rutênio são de grande interesse para a indústria farmacêutica,
devido às propriedades das moléculas que podem ser alteradas em função do
ligante empregado, conferindo ao complexo, potencialidades múltiplas de aplicação.
Gilbert, 1970 e neste mesmo ano, Wilkinson e colaboradores, relataram a utilização
de soluções de azul de rutênio para a preparação de complexos de geometria trans
com ligantes aminas, nitrilas e fosfinas. Embora as soluções de azul de rutênio já
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fossem conhecidas desde 1804 por Fourcroy, só a partir deste período seu valor
como precursor sintético foi devidamente reconhecido.
Os complexos de rutênio apresentam uma química bem desenvolvida,
particularmente com os ligantes do tipo amina e imina, e fornecem para muitos,
semelhanças a outros metalofármacos, devido à forte estabilização do campo ligante
para os estados mais comuns de oxidação Ru(II),
Ru(III), e
Ru(IV) (Paula et
al.,1999; Clark, 2003).
Observa-se
que
as
características
terapêuticas
dos
complexos
estão
relacionadas principalmente aos ligantes coordenados. Ainda, tem-se verificado que
muitos complexos são capazes de interagir com o DNA. Isto é interessante do ponto
de vista do desenvolvimento de agentes anti-tumorais. Em solução aquosa tais
complexos encontram-se normalmente na forma octaédrica, sendo bastante inertes
as substituições dos ligantes, isto é, são estáveis em solução (Beirith et al.,1999;
Clarke, 2003).
As vantagens de se usar complexos de rutênio com ligantes piridínicos no
desenvolvimento de metalofármacos incluem: (1) métodos seguros de sintetizar
complexos estáveis com previsibilidade de estruturas; (2) a habilidade de modular a
cinética de transferência de elétrons e os potenciais de oxi-redução, e (3) um
conhecimento crescente sobre os efeitos biológicos destes complexos (Clarke,
2003). Contudo, a limitada solubilidade em água apresentada pela maioria dos
complexos, inviabiliza ou dificulta estudos biológicos em condições fisiológicas.
Em virtude das interessantes propriedades biológicas apresentadas por
diversos complexos de rutênio, nosso grupo vem se destacando na preparação e
caracterização de novos compostos de coordenação de rutênio com fórmula geral
trans-[RuCl2(L)4] (L = ligante piridínico). Tem-se adotado como estratégia o uso de
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ligantes piridínicos contendo grupos carboxílicos substituintes, o que confere
solubilidade considerável em água aos produtos. Destacam-se os seguintes: trans[RuCl2(nic)4], trans-[RuCl2(inic)4], trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl.
Além disso, estes ligantes também foram selecionados por corresponderem a dois
pares isoméricos, o que permite correlacionar o efeito de pequenas mudanças nos
ligantes, como por exemplo, posição dos grupos substituintes no anel piridínico e a
respectiva atividade biológica. Em decorrência, pode-se vislumbrar num futuro
próximo, a possibilidade de síntese de complexos com propriedades préestabelecidas a partir da escolha de um ligante adequado. Em tempo, ressalta-se
que não somente a natureza do ligante L afeta as propriedades finais do complexo,
mas também, a natureza dos ligantes axiais e do estado de oxidação do rutênio
(Bottomley e Mukaida, 1982; Nagao et al., 1989; Paula, 1999).
Em colaboração com diversos grupos de pesquisa do Programa de PósGraduação em Ciências da Saúde tem-se investigado a atividade biológica destes
complexos, tanto in vitro quanto in vivo, gerando novos conhecimentos acerca da
atividade pró ou antioxidante, efeito comportamental e memória, genotoxicidade,
ação em complexos da cadeia respiratória, entre outros (Seifriz et al., 1999; Zanette
et al., 2006; Pich t et al., 2007).
Apesar de todos os esforços e do crescente conhecimento do efeito in vivo e
in vitro, a compreensão e elucidação dos mecanismos de ação destes complexos
ainda é pouco conhecida, merecendo maior atenção. Os resultados indicam a
existência de uma correlação entre a estrutura do complexo e sua atividade.
Em estudos anteriores os complexos trans-[RuCl2(nic)4] (nic = ácido piridina-3carboxílico) e trans-[RuCl2(i-nic)4] (i-nic = ácido piridina-4-carboxílico) mostraram
ação analgésica em camundongos machos ¨swiss¨ (25-35g). O complexo trans-
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[RuCl2(i-nic)4] inibiu consideravelmente a enzima NO sintase, tanto a neuronal
quanto a induzida, sendo cerca de duas vezes mais efetivo na inibição da NO
sintase neuronal. Entretanto, o complexo isomérico trans-[RuCl2(nic)4] mostrou-se
inativo. Fica assim evidenciado, que apesar de diferirem somente pela posição do
grupo-COOH no anel piridínico, mostram atividades distintas. Adicionalmente,
ambos atuam como seqüestradores do ânion superóxido, radicais hidroxila e
monóxido de nitrogênio (óxido nítrico) (Beirith et al., 1999).
Em outro estudo, verificou-se que complexo trans-[RuCl2(dinic)4] não
apresenta citotoxicidade em macrófagos, nem afeta de maneira significativa a
resposta motora de animais. Quando administrado intraperitonialmente em
camundongos, revelou ação analgésica e antiinflamatória (Seifriz et al.; 1999).
No sentido de dar continuidade a esta linha de pesquisa, dois complexos
serão objetos deste estudo: trans-[RuCl2(dinic)4] (A) e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl (B)
onde dinic = ácido piridina-3,5-dicarboxílico e i-dinic = ácido piridina-3,4
dicarboxílico. O complexo (A) foi sintetizado e caracterizado anteriormente, e tem
sido alvo de diversos estudos incluindo as propriedades biológicas (Seifriz et al.,
1999; Zanette et al., 2006). Já o complexo (B) foi preparado recentemente pelo
nosso grupo. Um artigo foi submetido recentemente pelo grupo (Pich et al., 2007),
reportando sua síntese e caracterização. A figura 1 corresponde a estrutura proposta
para o complexos A e a figura 2 corresponde a estrutura proposta para o complexo
B.
16
COOH
HOOC
N
HOOC
N
COOH
Cl
N
COOH
Ru
HOOC
COOH
N
Cl
COOH
Figura 1: Estrutura química proposta para o trans-[RuCl2(dinic)4] (Complexo A).
Figura 2: Estrutura química proposta para o trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl (Complexo B).
17
1.2 Complexos de Rutênio e ação biológica
Conforme relatado anteriormente, a química sintética de complexos de metais
de transição tem sido foco principal de diversos grupos de pesquisa. Várias
propriedades biológicas têm sido verificadas em alguns complexos de rutênio,
destacando-se: a atividade anti-tumoral (Bergamo et al., 2003; Bergamo et al. 2004),
a redução de tumores sólidos de metástase de pulmão (Sava et al., 1999),
importantes atividades anticarcinogênicas associadas a uma alta seletividade pelas
células cancerígenas (Carballo et al., 1997), a inibição da proliferação de linhas de
células cancerígenas no câncer de colo retal (Galeano et al., 1992), habilidade de
interagir com proteínas, tais como, a albumina (González-Vílchez et al., 1998;
Trynda-Lemiesz et al., 1999) e apotransferina (González-Vílchez et al., 1998) e as
ligações covalentes de biomoléculas tais como a histidina e o DNA (Zhao e Clarke,
1999; Deng et al., 2003). Atenção especial ao potencial terapêutico e ações
biológicas
dos
complexos
trans-[RuCl2(nic)4],
trans-[RuCl2(i-nic)4]
e
trans–
[RuCl2(dinic)4] (Beirith et al., 1999; Seifriz et al., 1999).
A atividade anti-tumoral está principalmente presente em compostos com
ligantes aminos (Clarke, 2003). Compostos ativos de rutênio em estado de oxidação
II exibem atividade substancial a diversas linhas de tumor. As razões possíveis para
isto são variadas e podem ser as seguintes: a) diminuição na taxa de hidratação
devido ao efeito dos pares do receptor dos ligantes do grupo imina ou elevadas
buscas de interações com o DNA, que podem facilitar a ligação covalente e os
efeitos geométricos exercidos pelos ligantes, que podem facilitar ou inibir as
proteínas que se ligam ao DNA e b) em solução aquosa são geralmente octaédricos
e frequentemente inertes à substituição de ligantes, o que garante a eles uma boa
estabilidade química (Clarke et al., 1999).
18
Os complexos de rutênio possuem algumas propriedades terapêuticas, como
a regulação da pressão arterial; habilidade de interagir com proteínas e
principalmente a capacidade de interagir na trajetória do NO (Óxido Nítrico) em
sistemas biológicos (Fricker et al., 1997; Beirith, 1999). Além disso, podem agir
direta ou indiretamente sobre o DNA, sendo drogas em potencial para patologias
gênicas (Clarke, 2003).
O NO é um agente que exibe numerosas propriedades biológicas, fisiológicas
e bioquímicas (Ignarro, 1990; Wink et al., 1996). Ele é um importante segundo
mensageiro celular, tendo a habilidade para controlar o ambiente onde é produzido.
O NO controla a pressão arterial e age em muitos processos patológicos tais como:
diabetes mellitus, impotência sexual e processos inflamatórios (Koshland, 1992;
Gutteridge, 1994; Barreto e Correia, 2005).
O NO pode ser caracterizado como uma molécula gasosa originada de Larginina, que reage com oxigênio e forma dióxido de nitrogênio (NO2). Através de
reações diretas ou indiretas podem formar peroxinitritos (ONOO-), quando associado
ao radical superóxido (O-2). Essa associação ao radical superóxido permite que o
NO seja apresentado como um potente varredor de radicais livres em condições
fisiológicas. A forma de nitrito (NO2) pode reagir com várias espécies ativas,
resultando em nitratos (NO3) produto final estável e medida no plasma (Szabo et al.,
1995; Wiest et al.; 2002).
Mesmo sendo uma molécula simples, sua síntese enzimática é bastante
complexa. As NO sintases (NOS) pertencem à família enzimática que sintetiza o NO
e são enzimas que utilizam como substratos a forma reduzida da nicotinamida
adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) e moléculas de oxigênio. São classificados
19
em função de sua atividade em constitutivas (cNOS) e induzidas (iNOS) (Yunes et
al., 2001).
Estudos com o complexo A não demonstraram citotoxicidade, pelo menos em
macrófagos, e não afetou significativamente a resposta motora de animais quando
avaliados em teste de rota-rod, nem aumentou a latência da resposta em ensaio de
placa quente (hot-plate). Não foi apresentada ação considerável sobre a óxido nítrico
sintetase induzida (iNOS) ou sobre a óxido nítrico sintetase neuronal (nNOS), porém
foi capaz de capturar radicais hidroxila, importante propriedade, pois esta espécie
reativa de oxigênio é uma das mais agressivas em processos biológicos. Este
radical é o principal produto da alta energia de ionização da água, e sua mais
importante fonte é a reação de Haber-Weiss envolvendo o ânion O2- e H2O2. Estas
propriedades tornam o complexo um possível agente antioxidante com provável
ação protetora do DNA (Seifriz, 1999).
1.3 Radicais livres
Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de
existir
de
forma
independente
e
que
contenha
um
ou
mais
elétrons
desemparelhados (Horton, 2003). São muito reativos e reagem com moléculas
como, lipídeos, proteínas e DNA. Dentre os radicais livres, podem-se destacar dois
grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as espécies reativas de nitrogênio
(ERN). As ERO mais importantes são o ânion superóxido, radical hidroxila, peróxido
de hidrogênio, ânion hipoclorito e o oxigênio “singlet” (Urso & Clarkson, 2003). O
óxido nítrico e o peroxinitrito constituem as principais ERN (Halliwell e Gutteridge,
1999).
20
Os radicais livres podem ser gerados no citoplasma, nas mitocôndrias ou na
membrana e o seu alvo celular (proteínas, lipídios, carboidratos e DNA) está
relacionado com o seu sítio de formação (Anderson, 1996). Nas mitocôndrias as
células produzem energia a partir da glicose e do O2. É neste processo que os
radicais livres são formados e imediatamente neutralizados pelas enzimas existentes
dentro das mitocôndrias. Os radicais livres podem ser preservados dentro do
organismo para que, com seu poder de destruição, colaborar com neutrófilos e
macrófagos na destruição de vírus, bactérias e partícula de pó (Anderson, 1996;
Evans, 2000).
Complexos
de
rutênio
trans–[RuCl2(nic)4]
e
trans–[RuCl2(i-nic)4],
demonstraram habilidade em atuarem como seqüestradores de radicais livres
(Creczynski-Pasa
et
al.,
2001).
Ambos
compostos
parecem
atuar
como
seqüestradores do radical ânion superóxido e do radical hidroxila (Paula et al.,
2005). Estes complexos demonstraram potencial antioxidante a partir de baixas
concentrações (0,1-10 M). Os resultados ainda sugerem que o complexo trans–
[RuCl2(nic)4] tem um poder antioxidante mais acentuado, quando comparado ao
complexo trans–[RuCl2(i-nic)4] e ambos, em altas doses (acima de 200 M) são
genotóxicos (Paula et al., 2005).
Em testes de genotoxidade observou-se que os complexos trans[RuCl2(nic)4] e trans–[RuCl2(inic)4] apresentam atividade genotóxica em altas
concentrações (375 a 1500µM), demonstrando um notável efeito de concentraçãoresposta. Estes resultados levam a crer que esta substância tem influência sobre o
metabolismo do DNA nas células, provavelmente de maneira indireta, através da
formação de radicais livres ou da ação sobre proteínas que tenham função de
proteção ou reparação do DNA (Amboni, 2003).
21
1.4 Espécies Ativas de Oxigênio (EAO)
Através da cadeia de transporte de elétrons (cadeia respiratória), o oxigênio é
reduzido à água por ação da citocromo oxidase mitocondrial (Marks et al., 1996).
Quando o oxigênio molecular é reduzido por um, dois ou três elétrons formam-se o
radical ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila,
respectivamente (Bergendi et al, 1999).
O radical ânion superóxido, produzido pela cadeia de transporte de elétrons, é
considerado um radical altamente reativo, porém possui solubilidade limitada em
lipídios (Marks et al., 1996,). Este radical é formado pela redução do oxigênio
molecular por apenas um elétron, mediante aporte de energia. Por ser um radical
livre e, por conseguinte, muito reativo, deve ser removido rapidamente dos tecidos
pela reação de dismutação, realizada pela enzima superóxido dismutase, em que
dois ânions superóxido reagem entre si, um é oxidado a oxigênio e o outro reduzido
a peróxido de hidrogênio (H2O2) (Halliwell e Gutteridge, 1984; Bowler e Crapo, 2002;
Forman e Torres, 2002).
A adição de um segundo elétron ao O2- leva à formação do íon peróxido
(O22-), o qual não possui elétron desemparelhado e por definição não é um radical,
mas um agente oxidante. O O22- formado em pH fisiológico é imediatamente
protonado a H2O2. Em solução aquosa, o H2O2 é formado a partir da reação de
dismutação do O2- (Halliwell e Gutteridge, 1984).
O H2O2, por ser um agente oxidante, na presença de Fe2+ ou de outro metal
de transição, ou através da reação com O2-, gera o radical hidroxila (OH ). Por esse
motivo, as enzimas catalase e glutationa peroxidase têm como função remover
rapidamente o H2O2 (Halliwell e Gutteridge, 1989; Marks et al., 1996).
22
A adição de um elétron ao H2O2 leva à formação do OH , considerado um
oxidante extremamente poderoso e capaz de reagir com quase todos os substratos
biológicos ( Halliwell e Gutteridge, 1984). O OH , pode ser gerado, pelo menos, por
dois mecanismos (Halliwell e Gutteridge, 1984; Marshall e Bangert, 1995):
- o primeiro é pela desintegração homolítica do H2O2 por radiação:
H2O2
2 OH-
Equação da desintegração homolítica do peróxido de hidrogênio.
- o segundo é através da reação com metais de transição (Reação de Fenton):
Fe2+ + H2O2
Fe3+ + OH + OH-
Produção do radical hidroxila através da reação de Fenton.
Na presença de pequenas quantidades de ferro, o O2- é capaz de reduzir o
Fe3+ a Fe2+.
Fe3+ + O2-
Fe2+ + O2
Reação de redução do íon ferro.
O OH também pode se formar pela reação do H2O2 com o O2-, denominada
reação de Haber – Weiss (Halliwel e Gutteridge, 1984).
O2- + H2O2
O2 + OH + OH-
Produção do radical hidroxila através da Reação de Haber-Weiss.
Outra EAO é o oxigênio singlet, o qual existe em dois estados: o oxigênio singlet que possui elétrons pareados, com spins opostos, que se encontram em
apenas um orbital, ficando o outro orbital desocupado; e o oxigênio
-sinlet que
possui dois elétrons, que se encontram em diferentes orbitais, como no estado
fundamental, mas com spins opostos (Bergendi et al., 1999).
23
1.5 Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN)
O termo espécies reativas de nitrogênio engloba o radical óxido nítrico (NO), o
ânion peroxinitrito (ONOO-) e os íons nitrosônio (NO+) e nitroxila (NO-) (Bergenti et
al., 1999).
O NO é um radical livre presente em muitos sistemas biológicos. Possui
tempo de meia-vida curto, devido à sua reatividade com outros constituintes
intracelulares, como o O2- (Beckman et al., 1993). A reação entre o NO e o O2resulta na formação do ânion peroxinitrito (ONOO-). Esta reação é extremamente
favorável, uma vez que o NO compete efetivamente com a enzima superóxido
dismutase pelo O2_ (Beckman et al, 1993; Lipton et al., 1993).
A formação do ONOO- a partir de NO e O2- é três vezes mais rápida que a
reação catalisada pela superóxido dismutase, enzima responsável pela dismutação
do O2- em H2O2 (Radi et al., 1991). O ONOO- é formado em meio ácido e
posteriormente protonado a ácido peroxinítrico que, espontaneamente, forma o OH
, é um radical extremamente citotóxico. Os produtos finais desta reação são os
nitratos (Bergendi et al., 1999).
24
1.6 Defesas antioxidantes e enzimáticas
A prevenção do estresse oxidativo é um processo essencial em todo o
organismo aeróbico, pois pode causar dano ao DNA. O aumento da peroxidação de
lipídeos associado à baixa proteção antioxidante pode levar a citotoxicidade, alergia
alimentar, mutagenicidade e/ou carcinogenicidade (Mates, 2000). Para manter a
produção de radicais livres em níveis que não tragam prejuízo para a homeostasia
celular, o organismo lança mão de alguns sistemas de defesa, isto é, antioxidantes.
Os antioxidantes podem ser definidos como “qualquer substância que,
quando presente em baixas concentrações em relação ao substrato oxidável,
significamente retarda ou previne a oxidação desse substrato” (Atoui et al., 2005).
As células também possuem sistemas de defesa que reparam danos em
biomoléculas como: proteínas, lipídios, ácidos nucléicos (Llesuy et al., 2002).
Entre as defesas enzimáticas nas células encontram-se: a superóxido
dimutase (SOD), a catalase e a glutationa peroxidase (Halliwell & Gutteridge, 1999).
A SOD constitui a primeira linha de defesa enzimática contra a produção
intracelular de radicais livre, catalisando a dismutação do ânion superóxido
(Hollander et al., 2000). Existem três tipos de SOD de acordo com os metais
localizados no sítio ativo: as que contêm cobre e zinco (CuZn-SOD), manganês (MnSOD) e ferro (Fe-SOD) como reguladores alostéricos (Halliwell e Gutteridge, 1999).
A catalase (CAT) promove a decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2)
em duas moléculas de água e uma de oxigênio. É constituída por quatro
subunidades protéicas, contendo um grupo-férrico-heme ligado ao sítio ativo e
localiza-se principalmente nos peroxissomas, e em menor quantidade no citosol e
25
retículo endoplasmático vesiculado da célula (Aebi, 1984; Marks et al., 1996;
Halliwell e Gutteridge, 1999).
2H2O2
CAT
2H2O + O2
Reação de decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2) a oxigênio no
estado fundamental (O2) pela enzima catalase. Adaptado de Forman e Torres
(2002).
A GPX (Glutationa Peroxidase) é uma enzima selênio-dependente que
catalisa a redução do peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos para água
e álcool, usando a GSH (Glutationa Reduzida) como doadora de elétrons e está
localizada tanto no citosol quanto na matriz mitocondrial (Halliwell e Gutteridge,
1999).
1.7 Estresse oxidativo
Em condições normais (organismos saudáveis), a produção de espécies
reativas é em maior parte balanceada pelos sistemas de defesa antioxidante no
organismo. Quando um desequilíbrio ocorre entre a produção de oxidantes e defesa
antioxidante, cria-se um estado que se denomina-se estresse oxidativo (Cross et al,
2002).
Em princípio, o estresse oxidativo pode resultar de uma diminuição dos
antioxidantes e/ou da produção aumentada de ERO/ERN. A diminuição dos
antioxidantes pode ser causada pela redução da atividade das enzimas de defesa
antioxidante (CuZnSOD), (MnSOD), (CAT) ou (GPX) ou pela deficiência nutricional
de antioxidantes e/ou outros constituintes dietéticos essenciais (alfa-tocoferol, ácido
26
ascórbico, aminoácidos contendo enxofre necessário para a síntese de glutationa,
ou riboflavina, necessária para a produção de FAD, um cofator da glutationa
redutase). A produção aumentada de ERO/ERN pode ser causada pela exposição
elevada de oxigênio, pela presença de toxinas que são metabolizadas para produzir
ERO/ERN, ou pela excessiva ativação de sistemas ¨naturais¨ de produção de
ERO/ERN (ativação inapropriada de células fagocíticas em doenças inflamatórias
crônicas, como na artrite reumatóide e colite ulcerativa) (Halliwell e Gutteridge,
1999).
Estudos biológicos foram realizados recentemente com os complexos A e B
para verificar possíveis atividades antioxidantes, via TBARS e genotoxicidade, via
teste cometa na presença e ausência de H2O2 (Pich et al., 2007). Ambos os
complexos mostraram-se genotóxicos, porém o trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl apresentou
atividade intensa no intervalo de 8,0 à 1000,0
mol.L-1. Para o trans-[RuCl2(dinic)4]
resultados significantes só foram verificados no intervalo de 200,0 a 1000,0
mol.L-
1
. A atividade antioxidante foi demonstrada pela captura de radicais livres, conforme
verificado no teste TBARS. A atividade do trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl independe das
concentrações testadas. Para o trans-[RuCl2(dinic)4], a atividade antioxidante é
reduzida na concentração 0,1
10,0
mol.L-1 (Pich et al., 2007).
mol.L-1, porém intensa para as concentrações 1,0 e
27
1.8 OBJETIVOS
1.8.1 Objetivo geral
Sintetizar, caracterizar os complexos trans-[RuCl2(dinic)4] (A) e trans-[RuCl2(idinic)4]Cl (B) e avaliar suas atividades biológicas in vivo e in vitro.
1.8.2 Objetivos específicos
•
Sintetizar e caracterizar os complexo trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(idinic)4]Cl.
•
Caracterizar os complexos trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl
empregando técnicas espectroscópicas e eletroquímicas.
•
Investigar a atividade pró e antioxidante dos complexos trans-[RuCl2(dinic)4] e
trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl empregando método de formação de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e dano oxidativo das proteínas via
análise do grupo carbonil.
28
2. MATERIAIS E MÉTODOS
A metodologia empregada para a execução deste trabalho constituiu-se de
duas etapas, a saber: na primeira etapa, os complexos A e B foram sintetizados,
purificados e caracterizados. Na segunda, efetuaram-se estudos da atividade
biológica in vivo e in vitro para avaliar a ação de dano oxidativo destes complexos.
2.1 Reagentes:
O RuCl3.3H2O (Aldrich, EUA.) e ligantes (Aldrich, 99%) foram usados sem
purificação prévia. Solventes comercialmente disponíveis (F. Maia, Quimex) de grau
analítico
também
espectroscópicas
foram
e
empregados
análises
ao
longo
eletroquímicas
deste
usaram
trabalho.
solventes
Análises
de
grau
espectroscópicos e cromatográficos, respectivamente. O perclorato de lítio (Aldrich)
também foi usado sem purificação prévia. O argônio ultra puro (White Martins)
forneceu uma atmosfera inerte para as experiências. Nas medidas bioquímicas, a
maioria das substâncias usadas foram adquiridas da Sigma Companhia Química (St.
Louis, MO, E.U.A.), com exceção dos sais, sacarose, H2O2 e solventes que foram
todos comprados da Merck, AG, Darmstadt, Alemanha.
2.2 Equipamentos:
A composição química dos complexos químicos foi estimada através das
medidas de análise elementar de CHN (Carbono, Hidrogênio e Nitrogênio) e foram
realizadas em um Analisador Elementar da Perkin-Elmer, modelo 2400. Os
espectros vibracionais foram obtidos em pastilhas de brometo de potássio (KBr) em
29
um espectrofotômetro Perkin-Elmer, modelo 1GPC FTR-IR. Os espectros eletrônicos
foram registrados num espectrofotômetro UV-Vis da Carl Zeiss, modelo M500.
Espectros de RMN 1H foram obtidos em um equipamento da Brucker AC200F,
sendo as amostras dissolvidas em solvente deuterado apropriado. Espectros de
Raman Ressonante foram obtidos em um Javel-Ash 25-300, equipado com duplo
monocromador. As amostras foram preparadas em sulfato de potássio e excitadas
com um laser de argônio. As análises foram feitas no Instituto de Química da USP,
pelo professor Norberto Sanches.
A
técnica
de
voltametria
cíclica
foi
empregada
na
caracterização
eletroquímica dos compostos, sendo realizadas, em um Potenciostato/Galvanostato
da Princeton Applied Research (PARC), modelo 283, interfaceado a um
microcomputador PC, via cartão de interface GPIB da National Instruments Co. Os
dados obtidos foram tratados com o “software Analysis M270”, versão 4.0, também
da PARC. Uma célula eletroquímica convencional, com capacidade máxima para
20cm3, consistindo de três eletrodos, a saber: o eletrodo de trabalho de platina (área
geométrica de 0,115cm2); o eletrodo auxiliar, que consistiu de um fio de platina e,
finalmente, o eletrodo de referência, um fio de prata imerso em uma solução
0,10mol. dm-3 de AgNO3/CH3CN isolado por uma membrana de Vycor. As medidas
foram conduzidas à temperatura ambiente.
30
2.3 Sínteses:
2.3.1 Preparação de trans-[RuCl2(dinic)4 ] (Complexo A)
O complexo foi preparado conforme descrito por Paula, 1994. A solução de
azul de rutênio foi preparada a partir da dissolução de 0,5 g de RuCl3.3H2O em 15 ml
de etanol e 10 ml de água. A solução foi refluxada suavemente, sob agitação
constante em atmosfera inerte de argônio por aproximadamente 4 horas.
Inicialmente apresentou coloração amarelada, passando para verde até atingir uma
coloração azul intensa, indicativo de que a reação foi finalizada. Em virtude da
geração de “clusters” e óxidos de rutênio formou-se um espelho nas paredes do
balão, outro indicativo de término da reação (Paula, 1994). A seguir foi adicionado
1,5
g de
ácido
piridina
3,5-dicarboxílico,
permanecendo em refluxo por
aproximadamente uma hora. A solução foi resfriada por 12 horas e posteriormente
filtrada a vácuo para remoção do excesso de ligante. Ao filtrado, foi adicionado éter
etílico e o complexo extraído na fase etérea, com o auxílio de um funil de separação.
O processo foi repetido por mais três vezes, até remoção do composto. A solução
etérea foi concentrada e o produto final, coletado na forma de um sólido (Paula,
1994).
2.3.2 Preparação de trans –[RuCl2(i-dinic)4]Cl (Complexo B)
O complexo B foi preparado e purificado de modo semelhante ao complexo A,
porém, empregando-se como ligante o ácido piridina-3,4-dicarboxílico.
Entretanto, este complexo mostrou-se mais hidrofílico que o complexo A. A
secagem fez-se em estufa a vácuo para remoção total de moléculas de hidratação.
Contudo, a maior solubilidade facilitou a preparação das doses, nas
concentrações supracitadas para os testes biológicos.
31
2.4 Atividade biológica:
Foram utilizados os seguintes métodos para avaliar os possíveis danos
oxidativos causados pelos complexos A e B: método de formação de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e dano oxidativo das proteínas via análise
do grupo carbonil. Reagentes utilizados foram da marca Sigma St. Louis, MO.
Glycine fornecido pela Nuclear, Diadema, SP, Brasil.
2.4.1 Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) Peroxidação Lipídica
Método utilizado para a avaliação do estado de oxidação dos ácidos graxos
em sistemas biológicos.
A peroxidação de lipídios (lipoperoxidação) é um processo fisiológico contínuo
que ocorre nas membranas celulares decorrente da ação dos radicais livres
(Blokhina et al., 2003).
Um produto de lipoperoxidação ou peroxidação lipídica bem conhecido é o
malondialdeído (MDA) (Alexandrova e Bochev, 2005; Cherubin et al, 2005), o qual é
o produto final da degradação não enzimática de ácidos graxos poliinsaturados
(Kashyap et al.,2005).
Como indício de peroxidação lipídica foi medido o nível de ácido tiobarbitúrico
(TBARS) plasmático durante uma reação ácida aquecida como previamente descrito
(Lowry et al., 1951). As amostras obtidas foram homogeneizadas com 1 ml de ácido
tricloroacético 10 % (TCA) e 1 ml de ácido tiobarbitúrico e fervidas por 15 minutos.
Após verificou-se a quantidade de TBARS em leitura de
535 nm.
32
2.4.2 Medida do dano oxidativo em proteínas (CARBONIL) - Oxidação de
proteínas:
As proteínas também sofrem reações oxidativas iniciadas pelas EAO/EAN,
que levam a alterações nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais
(Aldred e Griffiths, 2004).
O dano oxidativo em proteínas plasmáticas foi determinado pela medida de
grupos carbonil baseado na reação com dinitrofenilhidrazina (DNPH), (descrito por
Levine et al., 1990). Proteínas foram precipitadas após adição de ácido
tricloroacético 20% e redissolvidas em DNPH, após foram mantidas em banho-maria
a 60ºC por 30 minutos. Após, centrifugadas durante 3 minutos a 14000 RPM e em
seguida, feita leitura em
370 nm.
2.5 Animais e protocolo:
Para avaliar os possíveis danos oxidativos causados pelos complexos
trans-[RuCl2(dinic)4] e trans–[RuCl2(i-dinic)4]Cl foram utilizados ratos Wistar
adultos machos (pesando entre 250–350 g) do biotério da Universidade do
Extremo Sul Catarinense–UNESC, dispostos em caixas plásticas contendo 5
ratos em cada uma, tendo assoalho recoberto por serragem com comida e água
ad libitum, mantidos em um ciclo de luz/escuro de 12 horas, a uma temperatura
de 23ºC. Antes do procedimento os animais foram deixados no local onde foram
realizados os experimentos, para ambientação.
Foram estabelecidos 4 grupos, com n = 5 para cada complexo de rutênio com
as seguintes concentrações: 0,08 , 13,6 , 45,2 e 180,7 mol/L e 1 grupo salina.
Após 30 minutos da administração intra peritonial das doses dos complexos A
e B, os ratos foram eutanasiados com fenobarbital, posteriormente guilhotinados e
seus órgãos (fígado, rim, quadríceps, pulmão e coração) e as estruturas do SNC
33
(hipocampo, córtex, estriado, cerebelo e pré-frontal) foram removidas e isoladas
para dosagem dos parâmetros de dano oxidativo.
As estruturas foram mantidas à – 80ºC até a mensuração dos parâmetros de
dano oxidativo.
Os procedimentos efetuados estiveram de acordo com um protocolo
previamente aprovado pelo CEP da Universidade do Extremo Sul Catarinense, sob
nº 394/2006.
2.6 Análise estatística
A diferença entre os grupos foi avaliada pela análise de variância de uma via
(ANOVA). Para os valores de F significativos, comparações foram feitas pelo teste
de Newman-Keuls (LSD). A significância estatística foi dada para p < 0,05.
34
3. RESULTADOS
Os resultados obtidos neste trabalho serão apresentados a seguir:
3.1 Síntese e caracterização físico-química:
As análises elementares de CHN para os complexos A e B foram compatíveis
com
as
fórmulas
moleculares
propostas,
isto
é,
RuCl2C28H20N4O16
e
RuCl3C28H20N4O16, respectivamente. Estes resultados são sumarizados na Tabela 1.
Os rendimentos, com base no RuCl3.3H2O de partida, foram de 56,5% e 48,7%,
respectivamente.
Complexo
A
Fórmula
Molecular
RuCl2C28H20N4O16
C
H
N
teórico % (experimental %)
40,00 (39,80)
2,38 (2,96) 6,66 (6,18)
B
RuCl3C28H20N4O16
38,36 (38,88)
2,28 (2,39)
6,39 (6,21)
Tabela 1: Análise elementar de CHN para os complexos A e B.
Os espectros eletrônicos do complexo A, registrados em sistema binário
água/acetona 1:1, mostram uma banda de transferência de carga metal-ligante
(MLCT) com λmax de 415,0 nm em pH 3,00. À medida que o pH sobe, esta banda
desloca-se gradativamente para a região de maior energia. Em pH 6,00 o λmax é de
404,5 nm. Finalmente, o λmax em pH’s superiores a 7,00 atinge valor de 401,5 nm.
Desvios hipsocrômicos semelhantes, decorrentes de variações no pH, foram
verificados anteriormente para complexos análogos (Paula, 1994; Beirith et al.,
2001). Todavia, o espectro eletrônico é afetado substancialmente pela adição de
H2O2, um agente oxidante. Verifica-se que a MLCT é suprimida e deslocada
gradativamente em direção a região UV do espectro. A adição de borohidreto de
35
sódio (NaBH4) conduz ao pronto restabelecimento do espectro correspondente a
forma reduzida (Ru II). A Figura 3 mostra os espectros eletrônicos do complexo A
antes e após a adição de H2O2.
1,1
1,0
0,9
Complexo
Complexo
I eAH2O2
Complexo
A e H2O2
Complexo I Neutro
0,8
Absorbância
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
-0,1
300
400
500
600
700
800
λnm
Figura 3. Espectros eletrônicos em sistema binário água-acetona 1:1 v/v. do
complexo A em meio neutro e após adição de H2O2.
O espectro eletrônico do complexo B, registrado em H2O apresenta λmax em
325 nm, (Figura 4). O espectro não é afetado de maneira significativa pelo pH nem
pela adição de H2O2. Contudo, a adição NaBH4 conduz ao desaparecimento desta
banda. Verifica-se o pronto surgimento de uma outra banda em 410 nm. Esta nova
banda, por sua vez, é dependente do pH. Para
pH´s ácidos, λmax é de
aproximadamente 420 nm. À medida que o pH se eleva, esta banda sofre um desvio
batocrômico, com λmax situando-se em 440 nm. Finalmente, a adição de H2O2 ao
meio, restaura o espectro inicial, isto é, de forma oxidada. A Figura 4 corresponde
aos espectros eletrônicos do complexo B antes e após a adição de NaBH4.
36
Figura 4. Espectros eletrônicos para o complexo B em água, antes e após a adição
de NaBH4 e diferentes pH’s.
Os espectros vibracionais foram obtidos em pastilhas de KBr e as principais
bandas que caracterizam a presença dos ligantes são descritas a seguir:
O espectro de infravermelho do complexo A apresenta banda correspondente
a deformação angular fora do plano C-H em 750 cm-1 e deformação axial de C-H
aromática em 3090 cm-1. A deformação axial das ligações C-C e C-N do anel
piridínico está situada em 1600 cm-1. A deformação angular fora do plano para o OH, aparece em 928 cm-1.A banda situada em 1408 cm-1 é característica de
deformação angular no plano do C-O-H. A deformação axial correspondente ao
grupamento carbonílico está situada em 1716 cm-1. Finalmente, a deformação axial
O-H aparece na região de 3448 cm-1.
Os resultados dos espectros vibracionais de FT-IR e Raman ressonante são
apresentados na Tabela 2. A Figura 5 corresponde ao espectro de Raman
Ressonante para o complexo B. Verifica-se que os principais modos vibracionais do
ligante são preservados após a coordenação ao centro metálico de rutênio.
37
Figura 5. Espectro de Raman para o complexo trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl excitado em
632,8 nm.
Número de onda (cm-1)
Atribuição
270 (m)
1011(vw)
1063 (m)
1181 (w)
1287 (m,br)
1487 (w)
1553 (m)
1597 (s)
1725 (w)
(Ru-N)
12
(CH)
(CH)
(CH)
19
8
8
(C=O)
Tabela 2: Números de onda do espectro vibracional para o complexo B e prováveis
atribuições. Abreviações: w = fraca, m = média, s = forte, vw = muito fraca, br =
larga.
O espectro de RMN
1
H do complexo A apresenta os seguintes picos
característicos: a integração relativa dos picos revela a presença de um próton na
posição
do anel piridínico, com
posições 1 e 6. Finalmente, em
8,8 (1H,t); um pico em
9,3 (2H,d) referente as
12,0 (2H) os prótons das carboxilas, conforme
38
esperado. O espectro de 1H para o complexo B, não apresenta resolução adequada,
revelando picos abalroados. Este tipo de espectro é característico de complexos
contendo centro metálico de Ru3+.
A titulação potenciométrica do complexo trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl foi conduzida
em sistema binário etanol/água 70/30%(v/v) usando uma solução de KOH 0.100
mol.L-1 isenta de CO2. O cálculo das constantes de equilíbrio (LogKnH) foram
efetuadas com auxílio do algoritmo computacional BEST7. Estas constantes são
definidas pelas equações 1 e 2, onde C representa o complexo trans-[RuCl2(idinic)4]Cl completamente deprotonado. Os valores das constantes do complexo B
são mostrados na tabela 3 e comparadas com os valores publicados na literatura
anteriormente para o complexo trans-[RuCl2(dinic)4].
1) H+ + (Hn-1C)(n-9)
2) KnH
(HnC)(n-8)
[(HnL)(n-8)]
=_____________
[ H+] [H(n-1)L)(n-9)]
Quociente de equilíbrio1
1
equação 1
equação 2
[HC]/[C][H]
LogK nH
7.18 (2)
LogK nH
6.31
[H2C]/[HC][H]
5.90 (9)
5.07
[H3C]/[H2C][H]
5.58 (5)
5.13
[H4C] /[H3C][H]
4.93 (7)
4.78
[H5C]/[H4C][H]
4.46 (9)
4.40
[H6C]/[H5C][H]
3.60 (8)
4.28
[H7C]/[H6C][H
3.10 (3)
3.77
[H8C]/[H7C][H]
3.02 (4)
3.62
Cargas omitidas para melhor clareza.
Tabela 3: Logaritmos das constantes de protonação para o complexo B a 25,0 ±
0.05 0C e = 0.100 M (KCl).
39
A
completa
caracterização
eletroquímica
e
espectroeletroquímica
do
complexo trans-[RuCl2(dinic)4] condizem com dados descritos em literatura(Seifriz et
al.,1999).
Para o complexo trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl, as medidas eletroquímicas foram
conduzidas em sistema binário acetona/água 1:1 v/v, empregando LiClO4 0,10
mol.dm-3 como eletrólito. Meio ácido foi preparado usando HClO4, enquanto que
para o meio básico, empregou-se KOH. Os valores de pH foram lidos diretamente a
partir de um eletrodo calibrado e inserido na célula eletroquímica. Voltamogramas
típicos registrados a uma velocidade de varredura de 250 mV.s-1 em vários valores
de pH, revelaram a presença de um processo redox simples, centrado no átomo de
rutênio e associado ao trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl0/+. O pH afetou o valor de E1/2. Em pH
2,40, o potencial redox (E1/2) é próximo de 206,0 mV, diminuindo para 172,0 mV,
105,0 mV e 30 mV em pH’s 3,25, 6,20 e 7,40, respectivamente. Além do mais,
Ep
aumentou de 87 mV em pH 2,40 para próximo de 100 mV em pH 7,40. Finalmente, a
razão ipa/ipc é próxima da unidade em toda a faixa de pH e velocidade de variação de
potencial estudada. Um estudo detalhado das propriedades redox deste complexo
está em curso e poderá auxiliar na compreensão dos mecanismos de ação em
sistemas biológicos.
40
3.2 Atividade Biológica:
A determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi
utilizada para avaliar possíveis danos em lipídios. Peroxidação lipídica é um
indicativo de ação pró ou antioxidante. Estudou-se a ação destes complexos em
diferentes concentrações em 5 órgãos diferentes, a saber: fígado, pulmão, coração,
rim e quadríceps. Resultados apresentados nas figuras 6 e 7. Danos nas seguintes
estruturas do SNC (Sistema Nervoso Central) também foram investigados, a saber:
cerebelo, pré-frontal, hipocampo, estriado e córtex. Resultados apresentados nas
figuras 8 e 9.
Salina
TBA Dinic
0,08 mmol/kg
13,6 mmol/kg
TBARS
[ nmol/ mg protein]
3,50E-03
*
3,00E-03
2,50E-03
2,00E-03
1,50E-03
*
*
*
*
* *
*
*
1,00E-03
*
5,00E-04
**
45,2 mmol/kg
*
180,7 mmol/kg
*
*
0,00E+00
Figado
Pulmão
Coração
Rim
Quadriceps
Figura 6. Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) em estruturas de órgãos após a administração do complexo A. Resultados
em nmol de MDA/mg de proteínas.
*- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p<
0,05).
41
Em comparação ao grupo controle, verificou-se dano oxidativo em lipídios no
fígado, coração e rim em todas as concentrações de complexo A administradas. No
pulmão verificou-se dano apenas na concentração de 180,7µmol/kg e no quadríceps
nas concentrações de 0,08µmol/kg e 45,2µmol/kg.
TBA I-Dinic
Salina
0,08 mmol/kg
3,50E-03
13,6 mmol/kg
TBARS
[nmol/ mg protein]
45,2 mmol/kg
*
3,00E-03
180,7 mmol/kg
*
2,50E-03
2,00E-03
* *
1,50E-03
*
*
*
**
1,00E-03
**
5,00E-04
*
*
* * *
0,00E+00
Figado
Pulmão
Coração
Rim
Quadriceps
Figura 7. Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em
estruturas de órgãos após a administração do complexo B. Resultados em nmol de
MDA/mg de proteínas.
*- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p<
0,05).
Em comparação ao grupo controle, verificou-se dano oxidativo em lipídios no
fígado, coração e rim em todas as concentrações de complexo B administradas. No
pulmão verificou-se dano apenas na concentração de 45,2µmol/kg e no quadríceps
nas concentrações de 0,08µmol/kg, 45,2µmol/kg e 180,7µmol/kg.
42
Salina
TBA Dinic
0,08 mmol/kg
13,6 mmol/kg
4,00E-04
TBARS
[ nmol/mg protein]
3,50E-04
3,00E-04
2,50E-04
*
*
* *
45,2 mmol/kg
*
2,00E-04
1,50E-04
*
*
*
1,00E-04
180,7 mmol/kg
*
**
*
**
* *
5,00E-05
0,00E+00
Cerebelo
Pré-Frontal
Hipocampo
Estriado
Cortex
Figura 8. Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em
estruturas do SNC após a administração do complexo A. Resultados em nmol de
MDA/mg de proteínas.
*- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p<
0,05).
Em comparação ao grupo controle, verificou-se dano oxidativo em lipídios no
cerebelo e hipocampo em todas as concentrações de complexo A administradas. No
pré-frontal verificou-se dano nas concentrações de 13,6µmol/kg e 180,7µmol/kg, no
estriado nas concentrações de 0,08µmol/kg, 13,6µmol/kg e 45,2µmol/kg e no córtex
nas concentrações de 0,08µmol/kg, 13,6µmol/kg e 45,2µmol/kg.
43
Salina
TBA I-dinic
1,40E-03
1,20E-03
*
0,08 mmol/kg
13,6 mmol/kg
45,2 mmol/kg
*
180,7 mmol/kg
TBARS
[ nmol/mg protein]
1,00E-03
8,00E-04
*
*
6,00E-04
*
4,00E-04
*
* *
**
*
2,00E-04
*
**
**
0,00E+00
Cerebelo
Pré-Frontal Hipocampo
Estriado
Cortex
Figura 9. Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em
estruturas do SNC após a administração do complexo B. Resultados em nmol de
MDA/mg de proteínas.
*- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p<
0,05).
Em comparação ao grupo salina, verificou-se dano oxidativo em lipídios no
estriado e córtex em todas as concentrações de complexo B administradas. No
cerebelo nas concentrações de 0,08µmol/kg e 45,2µmol/kg, no pré-frontal nas
concentrações de 0,08µmol/kg, 13,6µmol/kg e 45,2µmol/kg e no hipocampo nas
concentrações de 0,08µmol/kg, 13,6µmol/kg e 45,2µmol/kg.
O dano oxidativo em proteínas foi avaliado pela medida de grupos carbonil.
Para o complexo A não foi verificado dano oxidativo em órgãos e estruturas do SNC,
conforme resultados mostrados nas figuras 10 e 12. Em comparação ao grupo
controle (salina), verifica-se um efeito protetor, tanto nos órgãos quanto nas
estruturas do SNC. Para o complexo B (Figuras 11 e 13) observa-se dano
44
significativo apenas no coração, rim e quadríceps na concentração de 180,7
mol/kg. Já nas estruturas do SNC, o cerebelo e o hipocampo apresentaram
significância em relação à salina nas concentrações maiores (45,2 e 180,7 mol/kg).
Carbonil Dinic
Salina
0,08 mmol/kg
3,50E-10
13,6 mmol/kg
45,2 mmol/kg
Protein Carbonyl
[nmol/ mg protein]
3,00E-10
180,7 mmol/kg
2,50E-10
2,00E-10
1,50E-10
1,00E-10
5,00E-11
0,00E+00
*
Figado
*
* * *
Pulmão
* ** *
Coração
Rim
****
Quadriceps
Figura 10. Determinação de proteína carbonil em estruturas de órgãos após a
administração do complexo A. Resultados em nmol/mg de proteínas.
*- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p<
0,05).
Para o complexo A não foi verificado dano oxidativo nos órgãos analisados
(fígado, pulmão, coração, rim e quadríceps) em comparação ao grupo controle e sim
efeito protetor.
45
Salina
Carbonil I-dinic
0,08 mmol/kg
13,6 mmol/kg
1,00E-09
45,2 mmol/kg
9,00E-10
*
Protein Carbonyl
[nmol/ mg protein]
8,00E-10
180,7 mmol/kg
7,00E-10
6,00E-10
5,00E-10
4,00E-10
3,00E-10
*
2,00E-10
*
1,00E-10
0,00E+00
Figado
Pulmão
Coração
Rim
Quadriceps
Figura 11. Determinação de proteína carbonil em estruturas de órgãos após a
administração do complexo B. Resultados em nmol/mg de proteínas.
*- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p<
0,05).
Para o complexo B observou-se dano oxidativo apenas no coração, rim e
quadríceps na concentração de 180,7 mol/kg em comparação ao grupo controle.
46
Salina
Carbonil Dinic
0,08 mmol/kg
13,6 mmol/kg
3,00E-10
45,2 mmol/kg
180,7 mmol/kg
Protein carbonyl
[units/mg protein]
2,50E-10
2,00E-10
1,50E-10
1,00E-10
5,00E-11
0,00E+00
* * *
Cerebelo
****
****
****
****
Pré-Frontal
Hipocampo
Estriado
Cortex
Figura 12. Determinação de proteína carbonil em estruturas do SNC após a
administração do complexo A. Resultados em nmol/mg de proteínas.
*- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p<
0,05).
Para o complexo A não foi observado dano oxidativo nas estruturas do SNC
(cerebelo, pré-frontal, hipocampo, estriado e córtex) em comparação ao grupo
controle.
47
Salina
Carbonil Idinic
0,08 mmol/kg
13,6 mmol/kg
3,00E-10
45,2 mmol/kg
180,7 mmol/kg
Protein carbonyl
[units/mg protein]
2,50E-10
2,00E-10
1,50E-10
1,00E-10
5,00E-11
*
**
0,00E+00
Cerebelo
Pré-Frontal
Hipocampo
Estriado
Cortex
Figura 13. Determinação de proteína carbonil em estruturas do SNC após a
administração do complexo B. Resultados em nmol/mg de proteínas.
*- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p<
0,05).
Para o complexo B foi observado dano oxidativo no cerebelo na concentração
de 180 mol/kg e no hipocampo nas concentrações de 45,2 mol/kg e 180,7 mol/kg
em comparação ao grupo controle.
48
4. DISCUSSÃO:
4.1 Síntese e caracterização físico-química:
A rota do azul de rutênio mostrou-se eficiente, possibilitando a síntese dos
complexos trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl com bons rendimentos. Os
resultados das análises elementares de CHN mostraram-se compatíveis com as
fórmulas propostas. Contudo, no complexo A, o centro metálico de rutênio encontrase no estado de oxidação (II), Já, para o complexo B, o centro metálico de rutênio
encontra-se no estado de oxidação (III), conforme sugerem os espectros de UV-vis
que serão discutidos adiante.
Observações análogas foram encontradas anteriormente por Wilkinson e
colaboradores (Gilbert e Wilkinson, 1970) ao sintetizar um complexo correlato,
empregando
como
ligante
o
ácido
picolínico
(ácido
piridina-2-carboxílico).
Provavelmente, a oxidação do rutênio, produzindo um complexo de Ru3+ seja
causada pelo próprio ligante.
O desvio hipsocrômico nos espectros eletrônicos do complexo A com o
aumento de pH pode ser racionalizado em função da deprotonação dos grupos
carboxílicos ligados ao anel piridínico. Isto afeta a intensidade do campo ligante e
conseqüentemente, a energia da ligação entre Ru-N. Ainda, a supressão destas
bandas pela adição equimolar de H2O2, deve-se ao fato deste ser um bom agente
oxidante. A nova banda que surge na região do UV é característica de complexos de
Ru3+ (Paula e Franco, 1995). Finalmente, a adição de NaBH4 restaura o espectro
original. Isto mostra de forma inequívoca que o complexo é estável tanto na forma
reduzida, quanto na forma oxidada. O espectro eletrônico do complexo B é
característico de complexos de Ru3+ (Paula e Franco, 1995), apresentando banda
em 325 nm. Esta banda, embora não seja afetada significativamente pelo pH, sob
49
adição de quantidade equimolar de NaBH4 desaparece e uma nova surge em 440
nm, característica de Ru(II). Esta banda é dependente do pH, a exemplo dos demais
compostos desta família (Pich et al., 2007). Em meio ácido, desloca-se para 420 nm.
Neste complexo, verifica-se um efeito contrário em relação aos demais. Isto se deve
a diferença na posição dos grupos-COOH, que conduzem a diferentes formas de
ressonância.
Os espectros de FTIR revelaram a manutenção dos principais modos
vibracionais dos ligantes após a coordenação ao centro metálico, tanto para o
complexo A, quanto para o complexo B. Para este último, a presença de poucas
bandas Raman na região de baixa freqüência é indicativo de simetria 4h, típica de
estereoquímica trans. Outro forte indicativo da geometria trans, é a banda
proeminente próxima a 270 cm-1, atribuída ao estiramento totalmente simétrico
(Ru-N).
Os espectros de RMN 1H do complexo A também revelam poucas alterações
em relação aos ligantes não coordenados. Contudo, os espectros para o complexo B
apresentam picos abalroados, o que é um forte indicativo da presença de espécie
paramagnética. Convém ressaltar que Ru3+ pertence ao sistema d5, com 1 elétron
desemparelhado, o que afeta o espectro de maneira substancial.
4.2 Atividade Biológica:
Segundo Vanucchi et al. (1998), acredita-se que mesmo em presença de
grande número de mecanismos potentes de defesa antioxidantes dentro das células,
muitas vezes, estes podem ser superados pelos fatores oxidantes, resultando em
lesões teciduais por meio da peroxidação das membranas lipídicas de células e
organelas, a desnaturação funcional (enzimas) de proteínas estruturais, lesões
50
mutagênicas ou letais dos ácidos nucléicos e a desnaturação de componentes
polissacarídeos de componentes do interstício de membranas basais.
Verificou-se danos em lipídios em ambos os complexos nas estruturas de
órgãos e SNC, nas concentrações 0,08, 13,6, 45,2 e 180,7 mol/kg. Contudo, para o
complexo B, o dano parece ser mais intenso. Possivelmente, o fato de o centro
metálico estar no estado de oxidação (III) deva ser relevante. É razoável supor que
Ru3+ possa exercer uma ação pró-oxidante nos sistemas estudados. Um outro fator
a ser considerado está associado a maior ou menor solubilidade decorrente do
estado redox. Uma maior liposolubilidade para a forma oxidada (Ru3+) facilitaria uma
maior absorção e conseqüentemente, alteração no nível da membrana celular, que é
de natureza lipídica. Estes resultados podem evidenciar que os complexos A e B são
lipossolúveis, e que desta forma pode ocorrer uma diminuição da fluidez da
membrana que são formadas em grande parte por lipídios insaturados e proteínas e
se tornam vulneráveis ao ataque oxidativo, podendo haver modificação em suas
propriedades, como alterações na estrutura e na permeabilidade.
Todos os componentes celulares são suscetíveis à ação de ERO, porém a
membrana plasmática é um dos mais atingidos em decorrência da peroxidação
lipídica, o que provoca alterações na permeabilidade das membranas celulares.
Com isto, há perda da seletividade na troca iônica e na liberação do conteúdo de
organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomos e a formação de produtos
citotóxicos, culminando com a morte celular. O OH é frequentemente reconhecido
como a espécie iniciadora e a mais importante da lipoperoxidação (Ferreira e
Matsubara, 1997).
51
A determinação de grupos carbonil em proteínas oxidadas, tem-se tornado
um dos métodos bioquímicos mais utilizados na investigação do dano oxidativo
protéico (Pratico e Delanty, 2000).
O complexo A não causou dano oxidativo em proteínas nos órgãos e
estruturas do SNC estudadas, comparado ao grupo controle. Já para o complexo B
observou-se dano oxidativo significativo em proteínas no coração, rim e quadríceps
na maior concentração (180,7
mol/kg). Nas estruturas do SNC, o cerebelo e o
hipocampo apresentaram dano oxidativo comparado ao grupo controle nas
concentrações maiores (45,2 e 180,7
mol/kg). O cerebelo tem como função a
coordenação de movimentos responsáveis pelo equilíbrio e o hipocampo é
responsável pela memória. É possível supor que o dano oxidativo causado pelo
complexo B no cerebelo e hipocampo pode comprometer o equilíbrio e levar a
prejuízos na memória.
52
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