“PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO E
Propaganda
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE MARIA CRISTINA GONÇALVES DE SOUZA “PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO E AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES PRÓ E ANTI-OXIDANTES EM MODELO ANIMAL” CRICIÚMA (SC), 2007. 1 MARIA CRISTINA GONÇALVES DE SOUZA “PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO E AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES PRÓ E ANTI-OXIDANTES EM MODELO ANIMAL” Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense, para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Marcos Marques da Silva Paula Co-orientador: prof. Dr. Felipe Dal -Pizzol CRICIÚMA (SC), 2007 2 Ao meu querido marido Vanderlei, que me incentivou a realizar mais esta conquista e esteve ao meu lado em todos os momentos com muita dedicação e compreensão mesmo nas horas que o desânimo e cansaço inundavam o meu ser. Ao Nicolas, meu filho amado, que soube entender a ausência da mãe nestes dois últimos anos e nos momentos mais cansativos e estressantes, oferecia carinho e palavras de conforto e esperança. 3 AGRADECIMENTOS A DEUS Por estar sempre comigo. Agradeço ao Professor Dr. Marcos Marques da Silva Paula, pelos ensinamentos, pela amizade, confiança e pela oportunidade de trabalhar sob sua orientação. Ao professor Dr. Felipe Dal Pizzol, pelo auxílio na co-orientação. Aos meus pais, Erci e Carlos, pelo amor, carinho e incentivo para a realização de mais este sonho. Aos dois amores da minha vida, meu marido Vanderlei e o meu filho Nicolas, por todo carinho e compreensão neste período de ausência. Ao meu sogro Maurino e a minha sogra Aura, pela amizade, confiança e auxílio para que eu pudesse chegar até o final deste trabalho. Aos bolsistas Angeles Meller, Danon Cardoso e Maykon Passos, pela dedicação, paciência e auxílio para a realização deste trabalho, vocês são pessoas muito especiais e iluminadas e se tornaram grandes amigos. Aos bolsistas e professores dos laboratórios do LASICOM, LABIFE e Neurociências, que contribuíram para a realização deste trabalho. 4 A vida tem duas faces: Positiva e negativa O passado foi duro Mas deixou o seu legado Saber viver é a grande sabedoria Que eu possa dignificar Minha condição de mulher, Aceitar suas limitações E me fazer pedra de segurança Dos valores que vão desmoronando. Nasci em tempos rudes Aceitei contradições Lutas e pedras Como lições de vida E delas me sirvo Aprendi a viver. Cora Coralina 5 RESUMO Este trabalho relata a síntese e caracterização dos complexos de coordenação biologicamente ativos: trans-[RuCl2(dinic)4] (complexo A) e trans- [RuCl2(i-dinic)4]Cl (complexo B) , onde dinic = ácido piridina-3,5-dicarboxílico e i-dinic = ácido piridina3,4-dicarboxílico. Os complexos foram sintetizados utilizando solução de azul de rutênio como precursor, com bons rendimentos. Resultados da análise elementar de CHN mostraram-se compatíveis com as fórmulas propostas. Para a caracterização utilizaram-se as técnicas espectroscópicas de UV–vis, FT-IR, Raman ressonante, RMN 1H. Para avaliação de danos lipídicos em órgãos e estruturas do SNC, utilizouse a medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e danos a proteínas (CARBONIL). Danos em lipídios foram observados após o tratamento, em ambos os complexos, nas estruturas de órgãos (fígado, pulmão, coração, rim e quadríceps) e SNC (cerebelo, pré-frontal, hipocampo, estriado e córtex) em várias concentrações aplicadas (0,08; 13,6; 45,2 e 180,7 mol/kg). Após a análise verificouse que para o complexo (B) o dano foi maior. O complexo A não causou dano em proteína, enquanto para o complexo B a significância de dano em relação à salina foi observada nos seguintes órgãos: coração, rim e quadríceps, na concentração de 180,7 mol/kg. Nas estruturas do SNC o cerebelo e o hipocampo apresentaram dano nas concentrações de 45,2 e 180,7 mol/kg. Palavras-chave: Complexos de Rutênio; Defesas Antioxidantes; Danos Oxidativos; TBARS; Proteína Carbonil. 6 ABSTRACT This work report the synthesis and characterization of the biological active coordenation complexs: trans–[RuCl2(dinic)4] (A complex) and trans-[RuCl2 (idinic)4]Cl (B complex), where dinic = 3,5-pyridinedicarboxylic acid and i-dinic = 3,4pyridinedicarboxylic acid. The complexes were synthesized using a blue solution of ruthenium with precursor of good income. Results of the elementary analyzes of CHN have shown compatible with the proposed formulare. For the characterization was used the follow techniques: UV-vis spectroscopy, FT-IR, renishaw Raman, RMN 1H. For evaluation of lipids damages, in NCS organs and structures, was use the measurement of thiobarbituric reactive species and carbonyl for protein damages. Lipids damage were observed after tratament with both complexs, in organ structures (Liver, lungs, heart, kidney, quadriceps) and NCS (cerebellum, pre-frontal, hippocampus, striatum e cortex) in various concentracions applied (0.08, 13.6, 45.2 e 180.7 mol/kg). After the analisys, examined that at the B complexes the damage was bigger. The A complex have not caused damage in protein, while for the B complex the damage significance when comparing with the saline were observed in the following organs: heart, kidney and quadriceps on the concentration of 180.7 mol/kg/kg. In NCS structures, the cerebellum and hippocampus have presented damage in the concentration of 45.2 and 180.7 mol/kg. Key- words: Complexs of Ruthenium; Antioxidant defenses; oxidative damages; TBARS; Carbonyl protein. 7 LISTA DE FIGURAS Figura 01: Estrutura química proposta para o trans-[RuCl2 (dinic)4] (Complexo A).............................................................................................................16 Figura 02: Estrutura química proposta para o trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl (Complexo B) .....................................................................................................................................................................................................16 Figura 03: Espectros eletrônicos em sistema binário água-acetona 1:1 v/v do complexo A em meio neutro e após adição de H2O2 .........................................................................35 Figura 04: Espectros eletrônicos para o complexo B em água, antes e após a adição de NaBH4 e diferentes pHs.........................................................................................36 Figura 05: Espectro de Raman para o complexo trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl excitado em 632,8 nm...............................................................................................................37 Figura 06: Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em diferentes estruturas de órgãos após a administração do complexo A. Resultados em nmol de MDA/mg de proteínas.....................................................................................................................40 Figura 07: Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em diferentes estruturas de órgãos após a administração do complexo B. Resultados em nmol de MDA/mg de proteínas.............................................................................41 Figura 08: Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em diferentes estruturas do SNC após a administração do complexo A. Resultados em nmol de MDA/mg de proteínas.......................……………………….................... 42 Figura 09: Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em diferentes estruturas do SNC após a administração do complexo B. Resultados em nmol de MDA/mg de proteínas................………………………........................... 43 Figura 10: Determinação de proteína carbonil em diferentes estruturas de órgãos após a administração do complexo A. Resultados em nmol/mg de proteínas.....................................................................................................................44 Figura 11: Determinação de proteína carbonil em diferentes estruturas de órgãos após a administração do complexo B. Resultados em nmol/mg de proteínas.....................................................................................................................45 Figura 12: Determinação de proteína carbonil em diferentes estruturas do SNC após a administração do complexo A. Resultados em nmol/mg de proteínas.....................................................................................................................46 Figura 13: Determinação de proteína carbonil em diferentes estruturas do SNC após a administração do complexo B. Resultados em nmol/mg de proteínas....................................................................................................................47 8 LISTA DE TABELAS Tabela 01: Análise elementar de CHN para os complexos A e B.............................34 Tabela 02: Números de onda do espectro vibracional para o complexo B e prováveis atribuições. Abreviações: w = fraca, m = media, s = forte, vw = muito fraca, br = larga............................................................................................................................37 Tabela 03: Logaritmos das constantes de protonação para o complexo trans[RuCl2(i-dinic)4]Cl a 25,0 ± 0.05 0C e = 0.100 M (KCl) ..........................................38 9 LISTA DE ABREVIATURAS ADP – adenosina difosfato ATP – adenosina trifosfato CAT – catalase CuZnSOD – cobre/zinco superóxido dismutase DINIC - ácido piridina-3,5-dicarboxílico DNA – ácido desoxirribonucléico EAO/ERO – espécies ativas de oxigênio EAN/ERN – espécies ativas de nitrogênio FADH2 – flavina adenina dinucleotídeo GPX – glutationa peroxidase GSH – glutationa reduzida GTP – guanosina trifosfato I-DINIC - ácido piridina-3-4-dicarboxílico LPO – lipoperoxidação MnSOD – manganês superóxido dismutase NAC – N-acetilcisteína NADH – nicotinamida adenina dinucleotídeo NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida) OH – radical hidroxil SOD – superóxido dismutase TBA – ácido tiobarbitúrico TBARS – substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico 10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 12 1.1 Complexos de Rutênio....................................................................................12 1.1.1 Visão geral..................................................................................................12 1.2 Complexos de Rutênio e ação biológica........................................................17 1.3 Radicais livres ...............................................................................................19 1.4 Espécies Ativas de Oxigênio (EAO).............................................................21 1.5 Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN) .......................................................23 1.6 Defesas antioxidantes e enzimáticas ............................................................24 1.7 Estresse oxidativo .........................................................................................25 1.8 OBJETIVOS.................................................................................................... 27 1.8.1 Objetivo geral................................................................................................27 1.8.1 Objetivos específicos....................................................................................27 2.0 MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................28 2.1 Reagentes.....................................................................................................28 2.2 Equipamentos. ..............................................................................................28 2.3 Sínteses. .......................................................................................................30 2.3.1 Preparação de trans-[RuCl2(dinic)4 ] (Complexo A) .........................30 2.3.2 Preparação de trans-RuCl2(i-dinic)4]Cl (Complexo B) .........................30 2.4 Atividade biológica. .......................................................................................31 2.4.1 Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) Peroxidação Lipídica ..............................................................................31 2.4.2 Determinação do dano oxidativo em proteínas (CARBONIL) - Oxidação de proteínas....................................................................................................32 11 2.5 Animais e protocolo........................................................................................32 2.6 Análise estatística..........................................................................................33 3 RESULTADOS...................................................................................................34 3.1 Síntese e caracterização físico-química..........................................................34 3.2 Atividade biológica............................................................................................40 4 DISCUSSÃO........................................................................................................48 4.1 Síntese e caracterização físico-química.........................................................48 4.2 Atividade biológica..........................................................................................49 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................53 12 1. INTRODUÇÃO 1.1 Complexos de Rutênio 1.1.1 Visão geral: Íons metálicos apresentam as mais variadas atividades biológicas, o que têm estimulado o desenvolvimento de produtos terapêuticos baseados em metais. Cisplatina, uma das principais drogas metálicas tem sido amplamente utilizada no tratamento de câncer. Entretanto, efeitos colaterais e resistência à droga têm limitado suas aplicações clínicas (Cohen e Lippard, 2001; Hall e Hambley, 2002; Zhang e Lippard, 2003). Complexos de rutênio e de ouro com atividade anti-tumoral, e outros compostos metálicos têm sido investigados por apresentarem potencial aplicação medicinal, incluindo capacidade para modular as propriedades do ânion superóxido e óxido nítrico (Zhang e Lippard, 2003). Pode-se afirmar que a indústria farmacêutica vem se beneficiando com o uso de drogas e agentes diagnosticantes baseados em compostos de coordenação (compostos inorgânicos) (Zehulova et al., 2001). O rutênio destaca-se na química de coordenação por possuir a habilidade de formar complexos extremamente estáveis com ligantes piridínicos. Compostos de coordenação de rutênio são de grande interesse para a indústria farmacêutica, devido às propriedades das moléculas que podem ser alteradas em função do ligante empregado, conferindo ao complexo, potencialidades múltiplas de aplicação. Gilbert, 1970 e neste mesmo ano, Wilkinson e colaboradores, relataram a utilização de soluções de azul de rutênio para a preparação de complexos de geometria trans com ligantes aminas, nitrilas e fosfinas. Embora as soluções de azul de rutênio já 13 fossem conhecidas desde 1804 por Fourcroy, só a partir deste período seu valor como precursor sintético foi devidamente reconhecido. Os complexos de rutênio apresentam uma química bem desenvolvida, particularmente com os ligantes do tipo amina e imina, e fornecem para muitos, semelhanças a outros metalofármacos, devido à forte estabilização do campo ligante para os estados mais comuns de oxidação Ru(II), Ru(III), e Ru(IV) (Paula et al.,1999; Clark, 2003). Observa-se que as características terapêuticas dos complexos estão relacionadas principalmente aos ligantes coordenados. Ainda, tem-se verificado que muitos complexos são capazes de interagir com o DNA. Isto é interessante do ponto de vista do desenvolvimento de agentes anti-tumorais. Em solução aquosa tais complexos encontram-se normalmente na forma octaédrica, sendo bastante inertes as substituições dos ligantes, isto é, são estáveis em solução (Beirith et al.,1999; Clarke, 2003). As vantagens de se usar complexos de rutênio com ligantes piridínicos no desenvolvimento de metalofármacos incluem: (1) métodos seguros de sintetizar complexos estáveis com previsibilidade de estruturas; (2) a habilidade de modular a cinética de transferência de elétrons e os potenciais de oxi-redução, e (3) um conhecimento crescente sobre os efeitos biológicos destes complexos (Clarke, 2003). Contudo, a limitada solubilidade em água apresentada pela maioria dos complexos, inviabiliza ou dificulta estudos biológicos em condições fisiológicas. Em virtude das interessantes propriedades biológicas apresentadas por diversos complexos de rutênio, nosso grupo vem se destacando na preparação e caracterização de novos compostos de coordenação de rutênio com fórmula geral trans-[RuCl2(L)4] (L = ligante piridínico). Tem-se adotado como estratégia o uso de 14 ligantes piridínicos contendo grupos carboxílicos substituintes, o que confere solubilidade considerável em água aos produtos. Destacam-se os seguintes: trans[RuCl2(nic)4], trans-[RuCl2(inic)4], trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl. Além disso, estes ligantes também foram selecionados por corresponderem a dois pares isoméricos, o que permite correlacionar o efeito de pequenas mudanças nos ligantes, como por exemplo, posição dos grupos substituintes no anel piridínico e a respectiva atividade biológica. Em decorrência, pode-se vislumbrar num futuro próximo, a possibilidade de síntese de complexos com propriedades préestabelecidas a partir da escolha de um ligante adequado. Em tempo, ressalta-se que não somente a natureza do ligante L afeta as propriedades finais do complexo, mas também, a natureza dos ligantes axiais e do estado de oxidação do rutênio (Bottomley e Mukaida, 1982; Nagao et al., 1989; Paula, 1999). Em colaboração com diversos grupos de pesquisa do Programa de PósGraduação em Ciências da Saúde tem-se investigado a atividade biológica destes complexos, tanto in vitro quanto in vivo, gerando novos conhecimentos acerca da atividade pró ou antioxidante, efeito comportamental e memória, genotoxicidade, ação em complexos da cadeia respiratória, entre outros (Seifriz et al., 1999; Zanette et al., 2006; Pich t et al., 2007). Apesar de todos os esforços e do crescente conhecimento do efeito in vivo e in vitro, a compreensão e elucidação dos mecanismos de ação destes complexos ainda é pouco conhecida, merecendo maior atenção. Os resultados indicam a existência de uma correlação entre a estrutura do complexo e sua atividade. Em estudos anteriores os complexos trans-[RuCl2(nic)4] (nic = ácido piridina-3carboxílico) e trans-[RuCl2(i-nic)4] (i-nic = ácido piridina-4-carboxílico) mostraram ação analgésica em camundongos machos ¨swiss¨ (25-35g). O complexo trans- 15 [RuCl2(i-nic)4] inibiu consideravelmente a enzima NO sintase, tanto a neuronal quanto a induzida, sendo cerca de duas vezes mais efetivo na inibição da NO sintase neuronal. Entretanto, o complexo isomérico trans-[RuCl2(nic)4] mostrou-se inativo. Fica assim evidenciado, que apesar de diferirem somente pela posição do grupo-COOH no anel piridínico, mostram atividades distintas. Adicionalmente, ambos atuam como seqüestradores do ânion superóxido, radicais hidroxila e monóxido de nitrogênio (óxido nítrico) (Beirith et al., 1999). Em outro estudo, verificou-se que complexo trans-[RuCl2(dinic)4] não apresenta citotoxicidade em macrófagos, nem afeta de maneira significativa a resposta motora de animais. Quando administrado intraperitonialmente em camundongos, revelou ação analgésica e antiinflamatória (Seifriz et al.; 1999). No sentido de dar continuidade a esta linha de pesquisa, dois complexos serão objetos deste estudo: trans-[RuCl2(dinic)4] (A) e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl (B) onde dinic = ácido piridina-3,5-dicarboxílico e i-dinic = ácido piridina-3,4 dicarboxílico. O complexo (A) foi sintetizado e caracterizado anteriormente, e tem sido alvo de diversos estudos incluindo as propriedades biológicas (Seifriz et al., 1999; Zanette et al., 2006). Já o complexo (B) foi preparado recentemente pelo nosso grupo. Um artigo foi submetido recentemente pelo grupo (Pich et al., 2007), reportando sua síntese e caracterização. A figura 1 corresponde a estrutura proposta para o complexos A e a figura 2 corresponde a estrutura proposta para o complexo B. 16 COOH HOOC N HOOC N COOH Cl N COOH Ru HOOC COOH N Cl COOH Figura 1: Estrutura química proposta para o trans-[RuCl2(dinic)4] (Complexo A). Figura 2: Estrutura química proposta para o trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl (Complexo B). 17 1.2 Complexos de Rutênio e ação biológica Conforme relatado anteriormente, a química sintética de complexos de metais de transição tem sido foco principal de diversos grupos de pesquisa. Várias propriedades biológicas têm sido verificadas em alguns complexos de rutênio, destacando-se: a atividade anti-tumoral (Bergamo et al., 2003; Bergamo et al. 2004), a redução de tumores sólidos de metástase de pulmão (Sava et al., 1999), importantes atividades anticarcinogênicas associadas a uma alta seletividade pelas células cancerígenas (Carballo et al., 1997), a inibição da proliferação de linhas de células cancerígenas no câncer de colo retal (Galeano et al., 1992), habilidade de interagir com proteínas, tais como, a albumina (González-Vílchez et al., 1998; Trynda-Lemiesz et al., 1999) e apotransferina (González-Vílchez et al., 1998) e as ligações covalentes de biomoléculas tais como a histidina e o DNA (Zhao e Clarke, 1999; Deng et al., 2003). Atenção especial ao potencial terapêutico e ações biológicas dos complexos trans-[RuCl2(nic)4], trans-[RuCl2(i-nic)4] e trans– [RuCl2(dinic)4] (Beirith et al., 1999; Seifriz et al., 1999). A atividade anti-tumoral está principalmente presente em compostos com ligantes aminos (Clarke, 2003). Compostos ativos de rutênio em estado de oxidação II exibem atividade substancial a diversas linhas de tumor. As razões possíveis para isto são variadas e podem ser as seguintes: a) diminuição na taxa de hidratação devido ao efeito dos pares do receptor dos ligantes do grupo imina ou elevadas buscas de interações com o DNA, que podem facilitar a ligação covalente e os efeitos geométricos exercidos pelos ligantes, que podem facilitar ou inibir as proteínas que se ligam ao DNA e b) em solução aquosa são geralmente octaédricos e frequentemente inertes à substituição de ligantes, o que garante a eles uma boa estabilidade química (Clarke et al., 1999). 18 Os complexos de rutênio possuem algumas propriedades terapêuticas, como a regulação da pressão arterial; habilidade de interagir com proteínas e principalmente a capacidade de interagir na trajetória do NO (Óxido Nítrico) em sistemas biológicos (Fricker et al., 1997; Beirith, 1999). Além disso, podem agir direta ou indiretamente sobre o DNA, sendo drogas em potencial para patologias gênicas (Clarke, 2003). O NO é um agente que exibe numerosas propriedades biológicas, fisiológicas e bioquímicas (Ignarro, 1990; Wink et al., 1996). Ele é um importante segundo mensageiro celular, tendo a habilidade para controlar o ambiente onde é produzido. O NO controla a pressão arterial e age em muitos processos patológicos tais como: diabetes mellitus, impotência sexual e processos inflamatórios (Koshland, 1992; Gutteridge, 1994; Barreto e Correia, 2005). O NO pode ser caracterizado como uma molécula gasosa originada de Larginina, que reage com oxigênio e forma dióxido de nitrogênio (NO2). Através de reações diretas ou indiretas podem formar peroxinitritos (ONOO-), quando associado ao radical superóxido (O-2). Essa associação ao radical superóxido permite que o NO seja apresentado como um potente varredor de radicais livres em condições fisiológicas. A forma de nitrito (NO2) pode reagir com várias espécies ativas, resultando em nitratos (NO3) produto final estável e medida no plasma (Szabo et al., 1995; Wiest et al.; 2002). Mesmo sendo uma molécula simples, sua síntese enzimática é bastante complexa. As NO sintases (NOS) pertencem à família enzimática que sintetiza o NO e são enzimas que utilizam como substratos a forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) e moléculas de oxigênio. São classificados 19 em função de sua atividade em constitutivas (cNOS) e induzidas (iNOS) (Yunes et al., 2001). Estudos com o complexo A não demonstraram citotoxicidade, pelo menos em macrófagos, e não afetou significativamente a resposta motora de animais quando avaliados em teste de rota-rod, nem aumentou a latência da resposta em ensaio de placa quente (hot-plate). Não foi apresentada ação considerável sobre a óxido nítrico sintetase induzida (iNOS) ou sobre a óxido nítrico sintetase neuronal (nNOS), porém foi capaz de capturar radicais hidroxila, importante propriedade, pois esta espécie reativa de oxigênio é uma das mais agressivas em processos biológicos. Este radical é o principal produto da alta energia de ionização da água, e sua mais importante fonte é a reação de Haber-Weiss envolvendo o ânion O2- e H2O2. Estas propriedades tornam o complexo um possível agente antioxidante com provável ação protetora do DNA (Seifriz, 1999). 1.3 Radicais livres Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existir de forma independente e que contenha um ou mais elétrons desemparelhados (Horton, 2003). São muito reativos e reagem com moléculas como, lipídeos, proteínas e DNA. Dentre os radicais livres, podem-se destacar dois grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as espécies reativas de nitrogênio (ERN). As ERO mais importantes são o ânion superóxido, radical hidroxila, peróxido de hidrogênio, ânion hipoclorito e o oxigênio “singlet” (Urso & Clarkson, 2003). O óxido nítrico e o peroxinitrito constituem as principais ERN (Halliwell e Gutteridge, 1999). 20 Os radicais livres podem ser gerados no citoplasma, nas mitocôndrias ou na membrana e o seu alvo celular (proteínas, lipídios, carboidratos e DNA) está relacionado com o seu sítio de formação (Anderson, 1996). Nas mitocôndrias as células produzem energia a partir da glicose e do O2. É neste processo que os radicais livres são formados e imediatamente neutralizados pelas enzimas existentes dentro das mitocôndrias. Os radicais livres podem ser preservados dentro do organismo para que, com seu poder de destruição, colaborar com neutrófilos e macrófagos na destruição de vírus, bactérias e partícula de pó (Anderson, 1996; Evans, 2000). Complexos de rutênio trans–[RuCl2(nic)4] e trans–[RuCl2(i-nic)4], demonstraram habilidade em atuarem como seqüestradores de radicais livres (Creczynski-Pasa et al., 2001). Ambos compostos parecem atuar como seqüestradores do radical ânion superóxido e do radical hidroxila (Paula et al., 2005). Estes complexos demonstraram potencial antioxidante a partir de baixas concentrações (0,1-10 M). Os resultados ainda sugerem que o complexo trans– [RuCl2(nic)4] tem um poder antioxidante mais acentuado, quando comparado ao complexo trans–[RuCl2(i-nic)4] e ambos, em altas doses (acima de 200 M) são genotóxicos (Paula et al., 2005). Em testes de genotoxidade observou-se que os complexos trans[RuCl2(nic)4] e trans–[RuCl2(inic)4] apresentam atividade genotóxica em altas concentrações (375 a 1500µM), demonstrando um notável efeito de concentraçãoresposta. Estes resultados levam a crer que esta substância tem influência sobre o metabolismo do DNA nas células, provavelmente de maneira indireta, através da formação de radicais livres ou da ação sobre proteínas que tenham função de proteção ou reparação do DNA (Amboni, 2003). 21 1.4 Espécies Ativas de Oxigênio (EAO) Através da cadeia de transporte de elétrons (cadeia respiratória), o oxigênio é reduzido à água por ação da citocromo oxidase mitocondrial (Marks et al., 1996). Quando o oxigênio molecular é reduzido por um, dois ou três elétrons formam-se o radical ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila, respectivamente (Bergendi et al, 1999). O radical ânion superóxido, produzido pela cadeia de transporte de elétrons, é considerado um radical altamente reativo, porém possui solubilidade limitada em lipídios (Marks et al., 1996,). Este radical é formado pela redução do oxigênio molecular por apenas um elétron, mediante aporte de energia. Por ser um radical livre e, por conseguinte, muito reativo, deve ser removido rapidamente dos tecidos pela reação de dismutação, realizada pela enzima superóxido dismutase, em que dois ânions superóxido reagem entre si, um é oxidado a oxigênio e o outro reduzido a peróxido de hidrogênio (H2O2) (Halliwell e Gutteridge, 1984; Bowler e Crapo, 2002; Forman e Torres, 2002). A adição de um segundo elétron ao O2- leva à formação do íon peróxido (O22-), o qual não possui elétron desemparelhado e por definição não é um radical, mas um agente oxidante. O O22- formado em pH fisiológico é imediatamente protonado a H2O2. Em solução aquosa, o H2O2 é formado a partir da reação de dismutação do O2- (Halliwell e Gutteridge, 1984). O H2O2, por ser um agente oxidante, na presença de Fe2+ ou de outro metal de transição, ou através da reação com O2-, gera o radical hidroxila (OH ). Por esse motivo, as enzimas catalase e glutationa peroxidase têm como função remover rapidamente o H2O2 (Halliwell e Gutteridge, 1989; Marks et al., 1996). 22 A adição de um elétron ao H2O2 leva à formação do OH , considerado um oxidante extremamente poderoso e capaz de reagir com quase todos os substratos biológicos ( Halliwell e Gutteridge, 1984). O OH , pode ser gerado, pelo menos, por dois mecanismos (Halliwell e Gutteridge, 1984; Marshall e Bangert, 1995): - o primeiro é pela desintegração homolítica do H2O2 por radiação: H2O2 2 OH- Equação da desintegração homolítica do peróxido de hidrogênio. - o segundo é através da reação com metais de transição (Reação de Fenton): Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH- Produção do radical hidroxila através da reação de Fenton. Na presença de pequenas quantidades de ferro, o O2- é capaz de reduzir o Fe3+ a Fe2+. Fe3+ + O2- Fe2+ + O2 Reação de redução do íon ferro. O OH também pode se formar pela reação do H2O2 com o O2-, denominada reação de Haber – Weiss (Halliwel e Gutteridge, 1984). O2- + H2O2 O2 + OH + OH- Produção do radical hidroxila através da Reação de Haber-Weiss. Outra EAO é o oxigênio singlet, o qual existe em dois estados: o oxigênio singlet que possui elétrons pareados, com spins opostos, que se encontram em apenas um orbital, ficando o outro orbital desocupado; e o oxigênio -sinlet que possui dois elétrons, que se encontram em diferentes orbitais, como no estado fundamental, mas com spins opostos (Bergendi et al., 1999). 23 1.5 Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN) O termo espécies reativas de nitrogênio engloba o radical óxido nítrico (NO), o ânion peroxinitrito (ONOO-) e os íons nitrosônio (NO+) e nitroxila (NO-) (Bergenti et al., 1999). O NO é um radical livre presente em muitos sistemas biológicos. Possui tempo de meia-vida curto, devido à sua reatividade com outros constituintes intracelulares, como o O2- (Beckman et al., 1993). A reação entre o NO e o O2resulta na formação do ânion peroxinitrito (ONOO-). Esta reação é extremamente favorável, uma vez que o NO compete efetivamente com a enzima superóxido dismutase pelo O2_ (Beckman et al, 1993; Lipton et al., 1993). A formação do ONOO- a partir de NO e O2- é três vezes mais rápida que a reação catalisada pela superóxido dismutase, enzima responsável pela dismutação do O2- em H2O2 (Radi et al., 1991). O ONOO- é formado em meio ácido e posteriormente protonado a ácido peroxinítrico que, espontaneamente, forma o OH , é um radical extremamente citotóxico. Os produtos finais desta reação são os nitratos (Bergendi et al., 1999). 24 1.6 Defesas antioxidantes e enzimáticas A prevenção do estresse oxidativo é um processo essencial em todo o organismo aeróbico, pois pode causar dano ao DNA. O aumento da peroxidação de lipídeos associado à baixa proteção antioxidante pode levar a citotoxicidade, alergia alimentar, mutagenicidade e/ou carcinogenicidade (Mates, 2000). Para manter a produção de radicais livres em níveis que não tragam prejuízo para a homeostasia celular, o organismo lança mão de alguns sistemas de defesa, isto é, antioxidantes. Os antioxidantes podem ser definidos como “qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações em relação ao substrato oxidável, significamente retarda ou previne a oxidação desse substrato” (Atoui et al., 2005). As células também possuem sistemas de defesa que reparam danos em biomoléculas como: proteínas, lipídios, ácidos nucléicos (Llesuy et al., 2002). Entre as defesas enzimáticas nas células encontram-se: a superóxido dimutase (SOD), a catalase e a glutationa peroxidase (Halliwell & Gutteridge, 1999). A SOD constitui a primeira linha de defesa enzimática contra a produção intracelular de radicais livre, catalisando a dismutação do ânion superóxido (Hollander et al., 2000). Existem três tipos de SOD de acordo com os metais localizados no sítio ativo: as que contêm cobre e zinco (CuZn-SOD), manganês (MnSOD) e ferro (Fe-SOD) como reguladores alostéricos (Halliwell e Gutteridge, 1999). A catalase (CAT) promove a decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2) em duas moléculas de água e uma de oxigênio. É constituída por quatro subunidades protéicas, contendo um grupo-férrico-heme ligado ao sítio ativo e localiza-se principalmente nos peroxissomas, e em menor quantidade no citosol e 25 retículo endoplasmático vesiculado da célula (Aebi, 1984; Marks et al., 1996; Halliwell e Gutteridge, 1999). 2H2O2 CAT 2H2O + O2 Reação de decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2) a oxigênio no estado fundamental (O2) pela enzima catalase. Adaptado de Forman e Torres (2002). A GPX (Glutationa Peroxidase) é uma enzima selênio-dependente que catalisa a redução do peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos para água e álcool, usando a GSH (Glutationa Reduzida) como doadora de elétrons e está localizada tanto no citosol quanto na matriz mitocondrial (Halliwell e Gutteridge, 1999). 1.7 Estresse oxidativo Em condições normais (organismos saudáveis), a produção de espécies reativas é em maior parte balanceada pelos sistemas de defesa antioxidante no organismo. Quando um desequilíbrio ocorre entre a produção de oxidantes e defesa antioxidante, cria-se um estado que se denomina-se estresse oxidativo (Cross et al, 2002). Em princípio, o estresse oxidativo pode resultar de uma diminuição dos antioxidantes e/ou da produção aumentada de ERO/ERN. A diminuição dos antioxidantes pode ser causada pela redução da atividade das enzimas de defesa antioxidante (CuZnSOD), (MnSOD), (CAT) ou (GPX) ou pela deficiência nutricional de antioxidantes e/ou outros constituintes dietéticos essenciais (alfa-tocoferol, ácido 26 ascórbico, aminoácidos contendo enxofre necessário para a síntese de glutationa, ou riboflavina, necessária para a produção de FAD, um cofator da glutationa redutase). A produção aumentada de ERO/ERN pode ser causada pela exposição elevada de oxigênio, pela presença de toxinas que são metabolizadas para produzir ERO/ERN, ou pela excessiva ativação de sistemas ¨naturais¨ de produção de ERO/ERN (ativação inapropriada de células fagocíticas em doenças inflamatórias crônicas, como na artrite reumatóide e colite ulcerativa) (Halliwell e Gutteridge, 1999). Estudos biológicos foram realizados recentemente com os complexos A e B para verificar possíveis atividades antioxidantes, via TBARS e genotoxicidade, via teste cometa na presença e ausência de H2O2 (Pich et al., 2007). Ambos os complexos mostraram-se genotóxicos, porém o trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl apresentou atividade intensa no intervalo de 8,0 à 1000,0 mol.L-1. Para o trans-[RuCl2(dinic)4] resultados significantes só foram verificados no intervalo de 200,0 a 1000,0 mol.L- 1 . A atividade antioxidante foi demonstrada pela captura de radicais livres, conforme verificado no teste TBARS. A atividade do trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl independe das concentrações testadas. Para o trans-[RuCl2(dinic)4], a atividade antioxidante é reduzida na concentração 0,1 10,0 mol.L-1 (Pich et al., 2007). mol.L-1, porém intensa para as concentrações 1,0 e 27 1.8 OBJETIVOS 1.8.1 Objetivo geral Sintetizar, caracterizar os complexos trans-[RuCl2(dinic)4] (A) e trans-[RuCl2(idinic)4]Cl (B) e avaliar suas atividades biológicas in vivo e in vitro. 1.8.2 Objetivos específicos • Sintetizar e caracterizar os complexo trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(idinic)4]Cl. • Caracterizar os complexos trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl empregando técnicas espectroscópicas e eletroquímicas. • Investigar a atividade pró e antioxidante dos complexos trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl empregando método de formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e dano oxidativo das proteínas via análise do grupo carbonil. 28 2. MATERIAIS E MÉTODOS A metodologia empregada para a execução deste trabalho constituiu-se de duas etapas, a saber: na primeira etapa, os complexos A e B foram sintetizados, purificados e caracterizados. Na segunda, efetuaram-se estudos da atividade biológica in vivo e in vitro para avaliar a ação de dano oxidativo destes complexos. 2.1 Reagentes: O RuCl3.3H2O (Aldrich, EUA.) e ligantes (Aldrich, 99%) foram usados sem purificação prévia. Solventes comercialmente disponíveis (F. Maia, Quimex) de grau analítico também espectroscópicas foram e empregados análises ao longo eletroquímicas deste usaram trabalho. solventes Análises de grau espectroscópicos e cromatográficos, respectivamente. O perclorato de lítio (Aldrich) também foi usado sem purificação prévia. O argônio ultra puro (White Martins) forneceu uma atmosfera inerte para as experiências. Nas medidas bioquímicas, a maioria das substâncias usadas foram adquiridas da Sigma Companhia Química (St. Louis, MO, E.U.A.), com exceção dos sais, sacarose, H2O2 e solventes que foram todos comprados da Merck, AG, Darmstadt, Alemanha. 2.2 Equipamentos: A composição química dos complexos químicos foi estimada através das medidas de análise elementar de CHN (Carbono, Hidrogênio e Nitrogênio) e foram realizadas em um Analisador Elementar da Perkin-Elmer, modelo 2400. Os espectros vibracionais foram obtidos em pastilhas de brometo de potássio (KBr) em 29 um espectrofotômetro Perkin-Elmer, modelo 1GPC FTR-IR. Os espectros eletrônicos foram registrados num espectrofotômetro UV-Vis da Carl Zeiss, modelo M500. Espectros de RMN 1H foram obtidos em um equipamento da Brucker AC200F, sendo as amostras dissolvidas em solvente deuterado apropriado. Espectros de Raman Ressonante foram obtidos em um Javel-Ash 25-300, equipado com duplo monocromador. As amostras foram preparadas em sulfato de potássio e excitadas com um laser de argônio. As análises foram feitas no Instituto de Química da USP, pelo professor Norberto Sanches. A técnica de voltametria cíclica foi empregada na caracterização eletroquímica dos compostos, sendo realizadas, em um Potenciostato/Galvanostato da Princeton Applied Research (PARC), modelo 283, interfaceado a um microcomputador PC, via cartão de interface GPIB da National Instruments Co. Os dados obtidos foram tratados com o “software Analysis M270”, versão 4.0, também da PARC. Uma célula eletroquímica convencional, com capacidade máxima para 20cm3, consistindo de três eletrodos, a saber: o eletrodo de trabalho de platina (área geométrica de 0,115cm2); o eletrodo auxiliar, que consistiu de um fio de platina e, finalmente, o eletrodo de referência, um fio de prata imerso em uma solução 0,10mol. dm-3 de AgNO3/CH3CN isolado por uma membrana de Vycor. As medidas foram conduzidas à temperatura ambiente. 30 2.3 Sínteses: 2.3.1 Preparação de trans-[RuCl2(dinic)4 ] (Complexo A) O complexo foi preparado conforme descrito por Paula, 1994. A solução de azul de rutênio foi preparada a partir da dissolução de 0,5 g de RuCl3.3H2O em 15 ml de etanol e 10 ml de água. A solução foi refluxada suavemente, sob agitação constante em atmosfera inerte de argônio por aproximadamente 4 horas. Inicialmente apresentou coloração amarelada, passando para verde até atingir uma coloração azul intensa, indicativo de que a reação foi finalizada. Em virtude da geração de “clusters” e óxidos de rutênio formou-se um espelho nas paredes do balão, outro indicativo de término da reação (Paula, 1994). A seguir foi adicionado 1,5 g de ácido piridina 3,5-dicarboxílico, permanecendo em refluxo por aproximadamente uma hora. A solução foi resfriada por 12 horas e posteriormente filtrada a vácuo para remoção do excesso de ligante. Ao filtrado, foi adicionado éter etílico e o complexo extraído na fase etérea, com o auxílio de um funil de separação. O processo foi repetido por mais três vezes, até remoção do composto. A solução etérea foi concentrada e o produto final, coletado na forma de um sólido (Paula, 1994). 2.3.2 Preparação de trans –[RuCl2(i-dinic)4]Cl (Complexo B) O complexo B foi preparado e purificado de modo semelhante ao complexo A, porém, empregando-se como ligante o ácido piridina-3,4-dicarboxílico. Entretanto, este complexo mostrou-se mais hidrofílico que o complexo A. A secagem fez-se em estufa a vácuo para remoção total de moléculas de hidratação. Contudo, a maior solubilidade facilitou a preparação das doses, nas concentrações supracitadas para os testes biológicos. 31 2.4 Atividade biológica: Foram utilizados os seguintes métodos para avaliar os possíveis danos oxidativos causados pelos complexos A e B: método de formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e dano oxidativo das proteínas via análise do grupo carbonil. Reagentes utilizados foram da marca Sigma St. Louis, MO. Glycine fornecido pela Nuclear, Diadema, SP, Brasil. 2.4.1 Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) Peroxidação Lipídica Método utilizado para a avaliação do estado de oxidação dos ácidos graxos em sistemas biológicos. A peroxidação de lipídios (lipoperoxidação) é um processo fisiológico contínuo que ocorre nas membranas celulares decorrente da ação dos radicais livres (Blokhina et al., 2003). Um produto de lipoperoxidação ou peroxidação lipídica bem conhecido é o malondialdeído (MDA) (Alexandrova e Bochev, 2005; Cherubin et al, 2005), o qual é o produto final da degradação não enzimática de ácidos graxos poliinsaturados (Kashyap et al.,2005). Como indício de peroxidação lipídica foi medido o nível de ácido tiobarbitúrico (TBARS) plasmático durante uma reação ácida aquecida como previamente descrito (Lowry et al., 1951). As amostras obtidas foram homogeneizadas com 1 ml de ácido tricloroacético 10 % (TCA) e 1 ml de ácido tiobarbitúrico e fervidas por 15 minutos. Após verificou-se a quantidade de TBARS em leitura de 535 nm. 32 2.4.2 Medida do dano oxidativo em proteínas (CARBONIL) - Oxidação de proteínas: As proteínas também sofrem reações oxidativas iniciadas pelas EAO/EAN, que levam a alterações nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais (Aldred e Griffiths, 2004). O dano oxidativo em proteínas plasmáticas foi determinado pela medida de grupos carbonil baseado na reação com dinitrofenilhidrazina (DNPH), (descrito por Levine et al., 1990). Proteínas foram precipitadas após adição de ácido tricloroacético 20% e redissolvidas em DNPH, após foram mantidas em banho-maria a 60ºC por 30 minutos. Após, centrifugadas durante 3 minutos a 14000 RPM e em seguida, feita leitura em 370 nm. 2.5 Animais e protocolo: Para avaliar os possíveis danos oxidativos causados pelos complexos trans-[RuCl2(dinic)4] e trans–[RuCl2(i-dinic)4]Cl foram utilizados ratos Wistar adultos machos (pesando entre 250–350 g) do biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense–UNESC, dispostos em caixas plásticas contendo 5 ratos em cada uma, tendo assoalho recoberto por serragem com comida e água ad libitum, mantidos em um ciclo de luz/escuro de 12 horas, a uma temperatura de 23ºC. Antes do procedimento os animais foram deixados no local onde foram realizados os experimentos, para ambientação. Foram estabelecidos 4 grupos, com n = 5 para cada complexo de rutênio com as seguintes concentrações: 0,08 , 13,6 , 45,2 e 180,7 mol/L e 1 grupo salina. Após 30 minutos da administração intra peritonial das doses dos complexos A e B, os ratos foram eutanasiados com fenobarbital, posteriormente guilhotinados e seus órgãos (fígado, rim, quadríceps, pulmão e coração) e as estruturas do SNC 33 (hipocampo, córtex, estriado, cerebelo e pré-frontal) foram removidas e isoladas para dosagem dos parâmetros de dano oxidativo. As estruturas foram mantidas à – 80ºC até a mensuração dos parâmetros de dano oxidativo. Os procedimentos efetuados estiveram de acordo com um protocolo previamente aprovado pelo CEP da Universidade do Extremo Sul Catarinense, sob nº 394/2006. 2.6 Análise estatística A diferença entre os grupos foi avaliada pela análise de variância de uma via (ANOVA). Para os valores de F significativos, comparações foram feitas pelo teste de Newman-Keuls (LSD). A significância estatística foi dada para p < 0,05. 34 3. RESULTADOS Os resultados obtidos neste trabalho serão apresentados a seguir: 3.1 Síntese e caracterização físico-química: As análises elementares de CHN para os complexos A e B foram compatíveis com as fórmulas moleculares propostas, isto é, RuCl2C28H20N4O16 e RuCl3C28H20N4O16, respectivamente. Estes resultados são sumarizados na Tabela 1. Os rendimentos, com base no RuCl3.3H2O de partida, foram de 56,5% e 48,7%, respectivamente. Complexo A Fórmula Molecular RuCl2C28H20N4O16 C H N teórico % (experimental %) 40,00 (39,80) 2,38 (2,96) 6,66 (6,18) B RuCl3C28H20N4O16 38,36 (38,88) 2,28 (2,39) 6,39 (6,21) Tabela 1: Análise elementar de CHN para os complexos A e B. Os espectros eletrônicos do complexo A, registrados em sistema binário água/acetona 1:1, mostram uma banda de transferência de carga metal-ligante (MLCT) com λmax de 415,0 nm em pH 3,00. À medida que o pH sobe, esta banda desloca-se gradativamente para a região de maior energia. Em pH 6,00 o λmax é de 404,5 nm. Finalmente, o λmax em pH’s superiores a 7,00 atinge valor de 401,5 nm. Desvios hipsocrômicos semelhantes, decorrentes de variações no pH, foram verificados anteriormente para complexos análogos (Paula, 1994; Beirith et al., 2001). Todavia, o espectro eletrônico é afetado substancialmente pela adição de H2O2, um agente oxidante. Verifica-se que a MLCT é suprimida e deslocada gradativamente em direção a região UV do espectro. A adição de borohidreto de 35 sódio (NaBH4) conduz ao pronto restabelecimento do espectro correspondente a forma reduzida (Ru II). A Figura 3 mostra os espectros eletrônicos do complexo A antes e após a adição de H2O2. 1,1 1,0 0,9 Complexo Complexo I eAH2O2 Complexo A e H2O2 Complexo I Neutro 0,8 Absorbância 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1 300 400 500 600 700 800 λnm Figura 3. Espectros eletrônicos em sistema binário água-acetona 1:1 v/v. do complexo A em meio neutro e após adição de H2O2. O espectro eletrônico do complexo B, registrado em H2O apresenta λmax em 325 nm, (Figura 4). O espectro não é afetado de maneira significativa pelo pH nem pela adição de H2O2. Contudo, a adição NaBH4 conduz ao desaparecimento desta banda. Verifica-se o pronto surgimento de uma outra banda em 410 nm. Esta nova banda, por sua vez, é dependente do pH. Para pH´s ácidos, λmax é de aproximadamente 420 nm. À medida que o pH se eleva, esta banda sofre um desvio batocrômico, com λmax situando-se em 440 nm. Finalmente, a adição de H2O2 ao meio, restaura o espectro inicial, isto é, de forma oxidada. A Figura 4 corresponde aos espectros eletrônicos do complexo B antes e após a adição de NaBH4. 36 Figura 4. Espectros eletrônicos para o complexo B em água, antes e após a adição de NaBH4 e diferentes pH’s. Os espectros vibracionais foram obtidos em pastilhas de KBr e as principais bandas que caracterizam a presença dos ligantes são descritas a seguir: O espectro de infravermelho do complexo A apresenta banda correspondente a deformação angular fora do plano C-H em 750 cm-1 e deformação axial de C-H aromática em 3090 cm-1. A deformação axial das ligações C-C e C-N do anel piridínico está situada em 1600 cm-1. A deformação angular fora do plano para o OH, aparece em 928 cm-1.A banda situada em 1408 cm-1 é característica de deformação angular no plano do C-O-H. A deformação axial correspondente ao grupamento carbonílico está situada em 1716 cm-1. Finalmente, a deformação axial O-H aparece na região de 3448 cm-1. Os resultados dos espectros vibracionais de FT-IR e Raman ressonante são apresentados na Tabela 2. A Figura 5 corresponde ao espectro de Raman Ressonante para o complexo B. Verifica-se que os principais modos vibracionais do ligante são preservados após a coordenação ao centro metálico de rutênio. 37 Figura 5. Espectro de Raman para o complexo trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl excitado em 632,8 nm. Número de onda (cm-1) Atribuição 270 (m) 1011(vw) 1063 (m) 1181 (w) 1287 (m,br) 1487 (w) 1553 (m) 1597 (s) 1725 (w) (Ru-N) 12 (CH) (CH) (CH) 19 8 8 (C=O) Tabela 2: Números de onda do espectro vibracional para o complexo B e prováveis atribuições. Abreviações: w = fraca, m = média, s = forte, vw = muito fraca, br = larga. O espectro de RMN 1 H do complexo A apresenta os seguintes picos característicos: a integração relativa dos picos revela a presença de um próton na posição do anel piridínico, com posições 1 e 6. Finalmente, em 8,8 (1H,t); um pico em 9,3 (2H,d) referente as 12,0 (2H) os prótons das carboxilas, conforme 38 esperado. O espectro de 1H para o complexo B, não apresenta resolução adequada, revelando picos abalroados. Este tipo de espectro é característico de complexos contendo centro metálico de Ru3+. A titulação potenciométrica do complexo trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl foi conduzida em sistema binário etanol/água 70/30%(v/v) usando uma solução de KOH 0.100 mol.L-1 isenta de CO2. O cálculo das constantes de equilíbrio (LogKnH) foram efetuadas com auxílio do algoritmo computacional BEST7. Estas constantes são definidas pelas equações 1 e 2, onde C representa o complexo trans-[RuCl2(idinic)4]Cl completamente deprotonado. Os valores das constantes do complexo B são mostrados na tabela 3 e comparadas com os valores publicados na literatura anteriormente para o complexo trans-[RuCl2(dinic)4]. 1) H+ + (Hn-1C)(n-9) 2) KnH (HnC)(n-8) [(HnL)(n-8)] =_____________ [ H+] [H(n-1)L)(n-9)] Quociente de equilíbrio1 1 equação 1 equação 2 [HC]/[C][H] LogK nH 7.18 (2) LogK nH 6.31 [H2C]/[HC][H] 5.90 (9) 5.07 [H3C]/[H2C][H] 5.58 (5) 5.13 [H4C] /[H3C][H] 4.93 (7) 4.78 [H5C]/[H4C][H] 4.46 (9) 4.40 [H6C]/[H5C][H] 3.60 (8) 4.28 [H7C]/[H6C][H 3.10 (3) 3.77 [H8C]/[H7C][H] 3.02 (4) 3.62 Cargas omitidas para melhor clareza. Tabela 3: Logaritmos das constantes de protonação para o complexo B a 25,0 ± 0.05 0C e = 0.100 M (KCl). 39 A completa caracterização eletroquímica e espectroeletroquímica do complexo trans-[RuCl2(dinic)4] condizem com dados descritos em literatura(Seifriz et al.,1999). Para o complexo trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl, as medidas eletroquímicas foram conduzidas em sistema binário acetona/água 1:1 v/v, empregando LiClO4 0,10 mol.dm-3 como eletrólito. Meio ácido foi preparado usando HClO4, enquanto que para o meio básico, empregou-se KOH. Os valores de pH foram lidos diretamente a partir de um eletrodo calibrado e inserido na célula eletroquímica. Voltamogramas típicos registrados a uma velocidade de varredura de 250 mV.s-1 em vários valores de pH, revelaram a presença de um processo redox simples, centrado no átomo de rutênio e associado ao trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl0/+. O pH afetou o valor de E1/2. Em pH 2,40, o potencial redox (E1/2) é próximo de 206,0 mV, diminuindo para 172,0 mV, 105,0 mV e 30 mV em pH’s 3,25, 6,20 e 7,40, respectivamente. Além do mais, Ep aumentou de 87 mV em pH 2,40 para próximo de 100 mV em pH 7,40. Finalmente, a razão ipa/ipc é próxima da unidade em toda a faixa de pH e velocidade de variação de potencial estudada. Um estudo detalhado das propriedades redox deste complexo está em curso e poderá auxiliar na compreensão dos mecanismos de ação em sistemas biológicos. 40 3.2 Atividade Biológica: A determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi utilizada para avaliar possíveis danos em lipídios. Peroxidação lipídica é um indicativo de ação pró ou antioxidante. Estudou-se a ação destes complexos em diferentes concentrações em 5 órgãos diferentes, a saber: fígado, pulmão, coração, rim e quadríceps. Resultados apresentados nas figuras 6 e 7. Danos nas seguintes estruturas do SNC (Sistema Nervoso Central) também foram investigados, a saber: cerebelo, pré-frontal, hipocampo, estriado e córtex. Resultados apresentados nas figuras 8 e 9. Salina TBA Dinic 0,08 mmol/kg 13,6 mmol/kg TBARS [ nmol/ mg protein] 3,50E-03 * 3,00E-03 2,50E-03 2,00E-03 1,50E-03 * * * * * * * * 1,00E-03 * 5,00E-04 ** 45,2 mmol/kg * 180,7 mmol/kg * * 0,00E+00 Figado Pulmão Coração Rim Quadriceps Figura 6. Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em estruturas de órgãos após a administração do complexo A. Resultados em nmol de MDA/mg de proteínas. *- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p< 0,05). 41 Em comparação ao grupo controle, verificou-se dano oxidativo em lipídios no fígado, coração e rim em todas as concentrações de complexo A administradas. No pulmão verificou-se dano apenas na concentração de 180,7µmol/kg e no quadríceps nas concentrações de 0,08µmol/kg e 45,2µmol/kg. TBA I-Dinic Salina 0,08 mmol/kg 3,50E-03 13,6 mmol/kg TBARS [nmol/ mg protein] 45,2 mmol/kg * 3,00E-03 180,7 mmol/kg * 2,50E-03 2,00E-03 * * 1,50E-03 * * * ** 1,00E-03 ** 5,00E-04 * * * * * 0,00E+00 Figado Pulmão Coração Rim Quadriceps Figura 7. Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em estruturas de órgãos após a administração do complexo B. Resultados em nmol de MDA/mg de proteínas. *- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p< 0,05). Em comparação ao grupo controle, verificou-se dano oxidativo em lipídios no fígado, coração e rim em todas as concentrações de complexo B administradas. No pulmão verificou-se dano apenas na concentração de 45,2µmol/kg e no quadríceps nas concentrações de 0,08µmol/kg, 45,2µmol/kg e 180,7µmol/kg. 42 Salina TBA Dinic 0,08 mmol/kg 13,6 mmol/kg 4,00E-04 TBARS [ nmol/mg protein] 3,50E-04 3,00E-04 2,50E-04 * * * * 45,2 mmol/kg * 2,00E-04 1,50E-04 * * * 1,00E-04 180,7 mmol/kg * ** * ** * * 5,00E-05 0,00E+00 Cerebelo Pré-Frontal Hipocampo Estriado Cortex Figura 8. Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em estruturas do SNC após a administração do complexo A. Resultados em nmol de MDA/mg de proteínas. *- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p< 0,05). Em comparação ao grupo controle, verificou-se dano oxidativo em lipídios no cerebelo e hipocampo em todas as concentrações de complexo A administradas. No pré-frontal verificou-se dano nas concentrações de 13,6µmol/kg e 180,7µmol/kg, no estriado nas concentrações de 0,08µmol/kg, 13,6µmol/kg e 45,2µmol/kg e no córtex nas concentrações de 0,08µmol/kg, 13,6µmol/kg e 45,2µmol/kg. 43 Salina TBA I-dinic 1,40E-03 1,20E-03 * 0,08 mmol/kg 13,6 mmol/kg 45,2 mmol/kg * 180,7 mmol/kg TBARS [ nmol/mg protein] 1,00E-03 8,00E-04 * * 6,00E-04 * 4,00E-04 * * * ** * 2,00E-04 * ** ** 0,00E+00 Cerebelo Pré-Frontal Hipocampo Estriado Cortex Figura 9. Determinação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em estruturas do SNC após a administração do complexo B. Resultados em nmol de MDA/mg de proteínas. *- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p< 0,05). Em comparação ao grupo salina, verificou-se dano oxidativo em lipídios no estriado e córtex em todas as concentrações de complexo B administradas. No cerebelo nas concentrações de 0,08µmol/kg e 45,2µmol/kg, no pré-frontal nas concentrações de 0,08µmol/kg, 13,6µmol/kg e 45,2µmol/kg e no hipocampo nas concentrações de 0,08µmol/kg, 13,6µmol/kg e 45,2µmol/kg. O dano oxidativo em proteínas foi avaliado pela medida de grupos carbonil. Para o complexo A não foi verificado dano oxidativo em órgãos e estruturas do SNC, conforme resultados mostrados nas figuras 10 e 12. Em comparação ao grupo controle (salina), verifica-se um efeito protetor, tanto nos órgãos quanto nas estruturas do SNC. Para o complexo B (Figuras 11 e 13) observa-se dano 44 significativo apenas no coração, rim e quadríceps na concentração de 180,7 mol/kg. Já nas estruturas do SNC, o cerebelo e o hipocampo apresentaram significância em relação à salina nas concentrações maiores (45,2 e 180,7 mol/kg). Carbonil Dinic Salina 0,08 mmol/kg 3,50E-10 13,6 mmol/kg 45,2 mmol/kg Protein Carbonyl [nmol/ mg protein] 3,00E-10 180,7 mmol/kg 2,50E-10 2,00E-10 1,50E-10 1,00E-10 5,00E-11 0,00E+00 * Figado * * * * Pulmão * ** * Coração Rim **** Quadriceps Figura 10. Determinação de proteína carbonil em estruturas de órgãos após a administração do complexo A. Resultados em nmol/mg de proteínas. *- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p< 0,05). Para o complexo A não foi verificado dano oxidativo nos órgãos analisados (fígado, pulmão, coração, rim e quadríceps) em comparação ao grupo controle e sim efeito protetor. 45 Salina Carbonil I-dinic 0,08 mmol/kg 13,6 mmol/kg 1,00E-09 45,2 mmol/kg 9,00E-10 * Protein Carbonyl [nmol/ mg protein] 8,00E-10 180,7 mmol/kg 7,00E-10 6,00E-10 5,00E-10 4,00E-10 3,00E-10 * 2,00E-10 * 1,00E-10 0,00E+00 Figado Pulmão Coração Rim Quadriceps Figura 11. Determinação de proteína carbonil em estruturas de órgãos após a administração do complexo B. Resultados em nmol/mg de proteínas. *- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p< 0,05). Para o complexo B observou-se dano oxidativo apenas no coração, rim e quadríceps na concentração de 180,7 mol/kg em comparação ao grupo controle. 46 Salina Carbonil Dinic 0,08 mmol/kg 13,6 mmol/kg 3,00E-10 45,2 mmol/kg 180,7 mmol/kg Protein carbonyl [units/mg protein] 2,50E-10 2,00E-10 1,50E-10 1,00E-10 5,00E-11 0,00E+00 * * * Cerebelo **** **** **** **** Pré-Frontal Hipocampo Estriado Cortex Figura 12. Determinação de proteína carbonil em estruturas do SNC após a administração do complexo A. Resultados em nmol/mg de proteínas. *- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p< 0,05). Para o complexo A não foi observado dano oxidativo nas estruturas do SNC (cerebelo, pré-frontal, hipocampo, estriado e córtex) em comparação ao grupo controle. 47 Salina Carbonil Idinic 0,08 mmol/kg 13,6 mmol/kg 3,00E-10 45,2 mmol/kg 180,7 mmol/kg Protein carbonyl [units/mg protein] 2,50E-10 2,00E-10 1,50E-10 1,00E-10 5,00E-11 * ** 0,00E+00 Cerebelo Pré-Frontal Hipocampo Estriado Cortex Figura 13. Determinação de proteína carbonil em estruturas do SNC após a administração do complexo B. Resultados em nmol/mg de proteínas. *- diferença significativa em relação ao controle (teste de Newman-Keus (LSD) p< 0,05). Para o complexo B foi observado dano oxidativo no cerebelo na concentração de 180 mol/kg e no hipocampo nas concentrações de 45,2 mol/kg e 180,7 mol/kg em comparação ao grupo controle. 48 4. DISCUSSÃO: 4.1 Síntese e caracterização físico-química: A rota do azul de rutênio mostrou-se eficiente, possibilitando a síntese dos complexos trans-[RuCl2(dinic)4] e trans-[RuCl2(i-dinic)4]Cl com bons rendimentos. Os resultados das análises elementares de CHN mostraram-se compatíveis com as fórmulas propostas. Contudo, no complexo A, o centro metálico de rutênio encontrase no estado de oxidação (II), Já, para o complexo B, o centro metálico de rutênio encontra-se no estado de oxidação (III), conforme sugerem os espectros de UV-vis que serão discutidos adiante. Observações análogas foram encontradas anteriormente por Wilkinson e colaboradores (Gilbert e Wilkinson, 1970) ao sintetizar um complexo correlato, empregando como ligante o ácido picolínico (ácido piridina-2-carboxílico). Provavelmente, a oxidação do rutênio, produzindo um complexo de Ru3+ seja causada pelo próprio ligante. O desvio hipsocrômico nos espectros eletrônicos do complexo A com o aumento de pH pode ser racionalizado em função da deprotonação dos grupos carboxílicos ligados ao anel piridínico. Isto afeta a intensidade do campo ligante e conseqüentemente, a energia da ligação entre Ru-N. Ainda, a supressão destas bandas pela adição equimolar de H2O2, deve-se ao fato deste ser um bom agente oxidante. A nova banda que surge na região do UV é característica de complexos de Ru3+ (Paula e Franco, 1995). Finalmente, a adição de NaBH4 restaura o espectro original. Isto mostra de forma inequívoca que o complexo é estável tanto na forma reduzida, quanto na forma oxidada. O espectro eletrônico do complexo B é característico de complexos de Ru3+ (Paula e Franco, 1995), apresentando banda em 325 nm. Esta banda, embora não seja afetada significativamente pelo pH, sob 49 adição de quantidade equimolar de NaBH4 desaparece e uma nova surge em 440 nm, característica de Ru(II). Esta banda é dependente do pH, a exemplo dos demais compostos desta família (Pich et al., 2007). Em meio ácido, desloca-se para 420 nm. Neste complexo, verifica-se um efeito contrário em relação aos demais. Isto se deve a diferença na posição dos grupos-COOH, que conduzem a diferentes formas de ressonância. Os espectros de FTIR revelaram a manutenção dos principais modos vibracionais dos ligantes após a coordenação ao centro metálico, tanto para o complexo A, quanto para o complexo B. Para este último, a presença de poucas bandas Raman na região de baixa freqüência é indicativo de simetria 4h, típica de estereoquímica trans. Outro forte indicativo da geometria trans, é a banda proeminente próxima a 270 cm-1, atribuída ao estiramento totalmente simétrico (Ru-N). Os espectros de RMN 1H do complexo A também revelam poucas alterações em relação aos ligantes não coordenados. Contudo, os espectros para o complexo B apresentam picos abalroados, o que é um forte indicativo da presença de espécie paramagnética. Convém ressaltar que Ru3+ pertence ao sistema d5, com 1 elétron desemparelhado, o que afeta o espectro de maneira substancial. 4.2 Atividade Biológica: Segundo Vanucchi et al. (1998), acredita-se que mesmo em presença de grande número de mecanismos potentes de defesa antioxidantes dentro das células, muitas vezes, estes podem ser superados pelos fatores oxidantes, resultando em lesões teciduais por meio da peroxidação das membranas lipídicas de células e organelas, a desnaturação funcional (enzimas) de proteínas estruturais, lesões 50 mutagênicas ou letais dos ácidos nucléicos e a desnaturação de componentes polissacarídeos de componentes do interstício de membranas basais. Verificou-se danos em lipídios em ambos os complexos nas estruturas de órgãos e SNC, nas concentrações 0,08, 13,6, 45,2 e 180,7 mol/kg. Contudo, para o complexo B, o dano parece ser mais intenso. Possivelmente, o fato de o centro metálico estar no estado de oxidação (III) deva ser relevante. É razoável supor que Ru3+ possa exercer uma ação pró-oxidante nos sistemas estudados. Um outro fator a ser considerado está associado a maior ou menor solubilidade decorrente do estado redox. Uma maior liposolubilidade para a forma oxidada (Ru3+) facilitaria uma maior absorção e conseqüentemente, alteração no nível da membrana celular, que é de natureza lipídica. Estes resultados podem evidenciar que os complexos A e B são lipossolúveis, e que desta forma pode ocorrer uma diminuição da fluidez da membrana que são formadas em grande parte por lipídios insaturados e proteínas e se tornam vulneráveis ao ataque oxidativo, podendo haver modificação em suas propriedades, como alterações na estrutura e na permeabilidade. Todos os componentes celulares são suscetíveis à ação de ERO, porém a membrana plasmática é um dos mais atingidos em decorrência da peroxidação lipídica, o que provoca alterações na permeabilidade das membranas celulares. Com isto, há perda da seletividade na troca iônica e na liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomos e a formação de produtos citotóxicos, culminando com a morte celular. O OH é frequentemente reconhecido como a espécie iniciadora e a mais importante da lipoperoxidação (Ferreira e Matsubara, 1997). 51 A determinação de grupos carbonil em proteínas oxidadas, tem-se tornado um dos métodos bioquímicos mais utilizados na investigação do dano oxidativo protéico (Pratico e Delanty, 2000). O complexo A não causou dano oxidativo em proteínas nos órgãos e estruturas do SNC estudadas, comparado ao grupo controle. Já para o complexo B observou-se dano oxidativo significativo em proteínas no coração, rim e quadríceps na maior concentração (180,7 mol/kg). Nas estruturas do SNC, o cerebelo e o hipocampo apresentaram dano oxidativo comparado ao grupo controle nas concentrações maiores (45,2 e 180,7 mol/kg). O cerebelo tem como função a coordenação de movimentos responsáveis pelo equilíbrio e o hipocampo é responsável pela memória. É possível supor que o dano oxidativo causado pelo complexo B no cerebelo e hipocampo pode comprometer o equilíbrio e levar a prejuízos na memória. 52 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: AEBI, H. Catalase in vitro. Methods Enzymology 105: 121-126. 1984. ALEXANDROVA, M.L.; BOCHEV, P.G. Oxidative stress during the chronic phase after stroke. Free Radical Biology and Medicine 39: 297-316. 2005. AMBONI,J.Allan. Avaliação dos efeitos Genéticos dos Complexos transDiclorotetraquis ácido-3-piridina carboxílico rutênio [RuCl2(nic)4] e transdicloro tetraquis ácido-4-piridina carboxílico rutênio [RuCl2(I-nic)4 que influenciam no metabolismo de NO. Monografia (trabalho de conclusão do Curso de Farmácia)-Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma. 2003. ANDERSON, D. Antioxidant defenses agaisnt reactive oxygen species causing genetic and other damage. Mutation Reserarch 350: 103 -108. 1996. ATOUI, A.K.; MANSOURI, A.; BOSKOU, G.; KEFALAS, P. Tea and herbal infusions: their antioxidant activity and phenolic profile. Food Chemistry 89: 27-36. 2005. BARRETO, R.L.; CORREIA, C.R. D.; MUSCARA, M. N. Óxido nítrico: propriedades e potenciais usos terapêuticos. Química nova, pp.1046-1054. 2005. BECKMAN, J. S.; CARSON, M.; SMITH, C.D.; KOPPENOL, W.H. ALS, SOD and peroxynitrite. Nature 364: 584.1993. BEIRITH A.; CRECZINSKY-PASA, T. B.; BONETTI, V.R.; KOZEN, M.; SEIFRIZ, I.; PAULA, M. M.S.; FRANCO, C. V.; CALIXTO, J.B.Antinociceptive properties and nitric oxide synthase inhibitory action of nem ruthenium complexes. Europe Journal Pharmacology 369: 289-297. 1999. BERGAMO, A.; STOCCO, G.; CASARCA, C.; COCCHIETTO, M.; ALESSIO, E.; SERLI, B.; ZORZET, S.; SAVA,G. Int. Journal Oncology 24: 373-379. 2004. 53 BERGAMO, A.; STOCCO, G.; GAVA, B.; COCHIETTO, M.; ALESSIO, E.; SERLI, B.; IENGO, E.; SAVA, G. J. Pharmacol. Exp. Ther 305: 725-732. 2003. BERGENDI, L.; BENES, L.; DURACKOVA, Z.; FERENCIK, M. Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life Sciences 65:1865-1874. 1999. BLOKHINA,O.;VIROLAINEN,E.;FAGERSTEDT,K.;FERENCIK, V.Antioxidants, Oxidative Damage and Oxygen Deprivation Stress: a Review. Annals of Botany 91:179-194. 2003. BOTTOMLEY, F.; MUKAIDA, M. Electrophilic of Nitrosyls: Preparation and Reactions of six-co-ordinate Ruthenium Tetra (pyridine) Nitrosyl Complexes. Journal Chem. Soc.Dalton Trans, pp. 1933-1937. 1982. BOWLER, R. P.; CRAPO, J.D.Oxidative Stress in Airways. American Journal of respiratory and Critical Care Medicine 166: s38-s43. 2002. CARBALLO, M.; VILAPLANA, R.; MÁRQUEZ, G.; CONDE, M.; BEDOYA, F.J.; GONZALEZ-VÍLCHEZ, F.; SOBRINO F. A newly sinthesized molecule derived from ruthenium cátion, with antitumor activity, activates NADPH oxidase in human neutrophils. Journal Biochem. 328: 559-64. 1997. CHERUBINI, A.et al. Potencial markers of oxidative stress in stroke. Free Radical Biology & Medicine 39: 841-852. 2005. CLARKE,M.J.;ZHU,F.;FRASCA,D.R. Non-platinum chemotherapeutic metallopharmaceuticals. Chem. Rew 99: 2511-2534. 1999. CLARKE, J. Michael. Ruthenium metallopharmaceuticals, Separata de: Coordeenation Chemistry Reviews 239: 209-233. 2003. COHEN,SM.; LIPPARD,S.J.Cisplatin:from DNA damage chemotherapy.Prog. Nucleic Acid Res Mol Bio 67: 93-130. 2001. to cancer 54 CRECZYNSKI-PASA.; BEIRITH, A.; T.B.; BONETTI, V.R.;KONZEN, M.; SEIFRIZ, I.;PAULA, M.M.S.; FRANCO,C.V.; CALIXTO, J.B. Complexes [RuCl2(nic)4] and trans-[RuCl2(i-nic)4] as free radical trans- scavengers. Journal of Inorganic Biochemistry 86: 587-594. 2001. CROSS,C.E.;VALACCHI,G.; SHOCK,B.; WILSON, M.; WEBER, S.; EISERICH,J.; VLIET A. Enviromental Oxidant Pollutant Effects on Biologic System. Am. J. Resoir. Crit. Care Med. 166: 44-50. 2002. DENG, H.; XU, H.; YANG, Y.; LI, H.; ZOU, H.; QU, L. H.; JI, L.N.J. Inorg. Biochem. 97: 207-201. 2003. EVANS, W,J. Vitamine E, vitamin C, and exercise. American Journal of Clinical Nutrition 72: 647-652. 2000. FERREIRA, A.L.A.; MATSUBARA, L.S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica Brasileira 43: 35-43. 1997. FORMAN, H.J.; TORRES, M. Reactive Oxigen Species and Cell Signaling. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 166: 54–58. 2002. FOUCROY, A. F.; VAUQUELIN, N. L., ANN. Chim, Franc, 49 e 50. 1804. FRICKER, S.P.; SLADE E.; POWELL, N.A.; VAUGHAN, O.J.; HENDERSON, G.R.; MURRER, B.A.; MEGSON, I.L.; BISLAND & S.K.; FLITNEY, F. W.B. Ruthenium complexes as nitric oxide scavengers: a potential therapeutic approach to nitric oxide-mediated diseases. British Journal of Pharmacology 122: 1441-1449. 1997. 55 FRICKER, S. P.; SLADE, E.; POWELL, N. A.; VAUGHAN, O. J.; HENDERSON, G. R.; MURRER, B. A.; MEGSON, L. L.; BISLAND, S. K.; FLITNEY, F. W. BR. Journal of Pharmacology 122: 1441-1449. 1997. GALEANO, A.; BERGER, M.R.; KEPPLER, B.K. Antitumor activity of some ruthenium derivatives in human colon cancer cell lines in vitro. Arzhenim.Fosch 42: 221-24. 1992. GILBERT, J. D.; ROSE, D.; WILKINSON, G. Journal of Chemistry Society. (A) 2765. 1970. GONZÁLEZ-VÍLCHEZ, F.; VILAPLANA, R.; BLASCO, G.; MESSORI L. Solution studies of the antitumor complex dichloro 1,2-propylendiaminetetraacetate ruthenium (III) and of its interactions with proteins. J. Biol. Biochem. 71: 45. 1998. HALL, M.D; HAMBLEY, T.W. Platinum (IV) antitumor compounds: their bionorganic chemistry. Coord Chem Rev. 232: 49-67. 2002. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem. J. 219 (1): 1-14. 1984. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxdford, London. 1999. HOLLANDER J.; BEJMA, J.; OOKAWANA, T.; OHNO, H.; JI, LL. Superoxide dismutase gene expression in skeletalmuscle: fiber-specific effect of age. Mechanisms of ageing and development 116 (1): 33-45. 2000. HORTON, J.W. Free radicals and lipid peroxidation mediated injury in burn trauma: the role of antioxidant therapy. Toxicology 189: 73-88. 2003. IGNARRO, L. J. Pharmacology .Toxicology 30: 353. 1990. 56 KASHYAP, M.K et al. Difterent antioxidant status, total antioxidant power and free radical in essential hypertension.Molecular and Cellur Biochemistry 277: 8999. 2005. KOSHLAND D. E. Jr. Science 258:1861. 1992. LEVINE, R.L.; GARLAND, D.; OLIVER C.N.; AMICI, A.; CLIMENT,I.; LENZ, A.G.; AHN, B.W.; SHATIELS, S.; STADTMAN, ER. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 186: 467-78. 1990. LLESUY, S.F. ¨Introducciõn y Espécies Activas de Oxigênio¨ In Marrón, N.P: Estresse Oxidativo e Antioxidantes. Canoas. 2002. LIPTON, S.; CHOI, Y.B.; PAN. Z.H.; LEI, S,Z.; CHEN, H.S.V.; SUCHER,N.J.; LOSCALZO, J.; SINGEL, D.J.; STANLER, J.S. A redox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive effects of nitric oxide and related nitroso compounds. Nature 364: 626-632. 1993. LOWRY, O,H.; ROSBROUGHT, N.J.; FARR, A.L.; RANDAL,R.J. Journal Biology Chem. 193: 193-265. 1951. MARKS, D. B.; MARKS, A. D.; SMITH, C. M. Basic Medial Biochemistry. A clinical Approach, Maryland: Williams & Wilkins. 1996. MARSHALL, W.J.; BANGERT,S.K. Clinical Chemistry. 1995. MATÉS,J.M. Effects of antioxidant anzymes in the molecular controlo f reactive species toxicology. Toxicology 153: 83-104. 2000. NAGAO, H.; NISHIMURA, H.; KITANAKA Y, HOWELL, F.S.;MUKAIDA M.; KAKIHANA, H. Selective Formation of Ruthenium (IV) Complexes with a Monooxygen Ligand: trans – [RuX(O)(py)4]4 (X = Cl2 ONO). Inorg. Chem. 29: 1693-1700. 1989. 57 PAULA, M. M, S. Síntese, caracterização e estudos eletroquímicos de complexos polipiridínicos de rutênio (II), metaloporfirinas e seus aductos moleculares. Dissertação de Mestrado. Florianópolis: UFSC, 99 p. 1994. PAULA, M.M.S.; FRANCO C.V. Electrochemical Studies of the Bimetallic Complex Formed by Ruthenium (II) Polypiridine and Manganese (III) Porphyrin. Journal Coord. Chemic. 36: 247-258. 1995. PAULA, M.M.S, MEIER M.M., SZPOGANICZ, B., and Franco C.V., Synthesis, eletrochemical, characterization and potentiometric titration of trans-[RuCl2(L)4] complexes (L = pyridine derived ligands: 3-pyridinecarboxylic acid and 4- pyridinecarboxilic acid). J. Coord. Chem. 46: 491-504.1999. PAULA, M. M. S.; PICH, C. T.; PETRONILHO, F.; DREI, L. B. RUDNICKI, M.; OLIVEIRA, M. R. de; MOREIRA, J. C. F.; HENRIQUES, J. A. P. FRANCO, C. V.; DAL PIZZOL, F; Antioxidant and antimutagenic activity of new ruthenium compounds. Revista Redox Report 10 (3): 139-43. 2005. PICH, C. T.; Franco C. V.; Szpoganic, B.; Silva, M. S.; Gonçalves, N. S.; Cristiano, M. P.; Cardoso, D. C.; Petronilho, F.; Rudnick, M.; Moreira, J. C. F.; Pizzol, F. D.; Almeida, W. B.; Mezzari, G. M.; Souza, M. C. G, Paula, M. M. S. Synthesis, characterization and biological studies of a complex trans – [RuCl2(i-dinic)4] (i-dinic=3,4- new pyridinedicarboxylic acid) And trans – [RuCl2 (dinic)4] (dinic=3,5- pyridinedicarboxylic acid). Artigo em submissão, 2007. PRATICO, D. & DELANTY, N. Oxidative injury in diseases of central nervous system; focus on Alzheimer´s disease. American Journal of Medicine 109: 577-585. 2000. 58 RADI R, THOMPSON, M.L, PRODANOV,E.Cytochrome c-catalysed oxidation of organic moleules by hidrogen peroxide. Arch Biochem. Biophys 288: 112– 117. 1991. SAVA, G.; CLERICI, K.; CAPOZZI, I.; COCHIETO, M.; GAGLIARDI, R.; ALESSIO, E.; MESTRONI, G.; PARBELINI A. Reduction of lung metastasis by ImH[transRuCl4(DMSO)Im]: mechanism of the selective action investigated on mouse tumors. Anticancer Drugs 10: 129-138. 1999. SEIFREZ,I.;KONZEN,M.;PAULA,M.M. S.; GONÇALVES, N. S.; SPOGANICKZ, B.; PASA-CRECZYNSKI, T. B.; BONETTI, V.R.; BEIRITH, A.; CALIXTO,J. B.;FRANCO,C.V. Synthesis, potentiometric titration, electrochemical investigation and biological properties of trans-[RuCl2(dinic)4] (dinic 3,5pyridinecarboxylic acid). Journal Inorganic. Biochemistry 76: 53-163. 1999. SZABO, C.; SOUTHAN, G.J.; THIEMERMANN, C.Beneficial effects and improved survival in rodent models of septic shock with somethylisothiourea sulfate a pontet and selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase. Proc. Nat. Acad. Science 91: 12472-12476. 1994. TRYNDA-LEMIEZ, L.; KEPPLER, B.K.; KOSTOWISKI H. Studies on the interactions between human serum albumin and imidazolium [trans-tetrachlorobis (imidazol) ruthenate (III)]. J. Inorg. Biochem. 73: 123-28. 1999. URSO, M.L; CLARKSON, P.M.Oxidative stress, exercise, and antioxidant supplementation. Toxicology 189: 41-54. 2003. VANNUCHI, H.; MOREIRA, E.AM.; CUNHA, D. F.; JUNQUEIRA-FRANCO, M,V.M.; BERNARDES, M.M.; JORDÃO-JÚNIOR, A.A. Papel dos nutrientes na peroxidação lipídica e no sistema de defesa antioxidante. Medicina, Ribeirão Preto, Simpósio de Nutrição Clínica 31: 31-44. 1998. 59 WIEST, R.; GROSZMANN, R. The paradox of nitric oxide in cirrhosis and portal hypertension: too much, not enough. Hepatology 35: 478- 491. 2002. WINK, D.A.; HANBAUER,I.; GRISHAM, M.B.; LAVAL, F.; COOK, J.; PACELLI, R.; LIEBMANN, J.; FORD, P.C.; MITCHELL, J.B.; Curr. Top. Cell. Regul. 34: 159 .1996. ZANETTE,F.; VICTOR, E.G.; SCAINI, G.; DI-PIETRO, P.B.; CARDOSO, D.C.; CRISTIANO, M.P.; DAL-PIZZOL, F.; PAULA, M.S.P.; STRECK, E.L. Modulation of creatine Kinase activity by ruthenium complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 2006. ZHAO, M.; CLARKE M.J. trans-pyridine tetraammine complexes of Ru (II) and Ru (III) with N7-coordinated purine nucleosides. J. Biol. Inorg. Chem. 4: 318-324. 1999. ZEHULOVA,J.; KASPARKOVA,J.; FARRELL, N.; BRABEC, V. Journal Biology Chemistry 276. 2001. ZHANG,C.X.;LIPPARD,S.J. New metal complexes as potential therapeutics.Current Opinion in Chemical Biology, 481-486. 2003. YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas medicinais: sob a ótica da química medicinal moderna, UNUESC. 2001.
