estudo morfofuncional das micro-nanoesferas de

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ESTUDO MORFOFUNCIONAL DAS MICRO-NANOESFERAS DE PLGA
CONTENDO BSA ENCAPSULADA: ESTABILIDADE, LIBERAÇÃO E
DEGRADAÇÃO PÓS-PROCESSAMENTO
Antônio Carlos Melo Lima Filho (IC-PIBIC/UFPI), e Reginaldo Almeida da Trindade (Prof.
Adjunto de Biomedicina).
Introdução
Em países desenvolvidos, cerca de 20% da população sofre em decorrência de reações de
hipersensibilidade do tipo I. O único tratamento que previne novas reações mediadas por
imunoglobulina do tipo E (IgE) é a SIT (Imunoterapia
Alérgeno-Especifico), que consiste da
administração repetida de alérgenos específicos à pacientes com condições sistêmicas mediadas por
IgE específico (STEEN et al., 2005).
Neste sentido, propõe-se estudar as microesferas de PLGA (poliéster de ácido láctico-coglicólico) aplicando-as na modulação da resposta imunológica (mudança da resposta pela via Th2
para a Th1), visto que estes sistemas constituem uma importante ferramenta para a entrega de
proteínas antigênicas. Diferentemente das formas de convencionais de administração de fármacos,
estes sistemas tem como objetivo promover a liberação progressiva da droga, e com isso, diminuir
significativamente a toxicidade, possibilitando maior tempo na circulação e uma administração segura
e conveniente (redução do número de doses) (SCHAFFAZICK, 2003).
Para a encapsulação de proteínas terapêuticas, geralmente são utilizados polímeros
biodegradáveis (SANTOS, 2007), sendo o PLGA (poliéster de ácido láctico-co-glicólico) o polímero
sintético mais estudado (TALUJA, 2007; SILVA, 2003). Dentre os métodos para formação de
microesferas
de
PLGA
(PLGA-MS),
o
método
da
dupla
emulsão
(W1/O/W2)
com
evaporação/extração do solvente orgânico é um dos mais utilizados.
Neste contexto, o presente trabalho teve como finalidade realizar estudos estruturais e
funcionais através do uso de ferramentas bioquímicas, biofísicas e biológicas objetivando avaliar a
viabilidade da microencapsulação da albumina de soro bovino – BSA – (modelo de peptídeo
terapêutico) em sistemas poliméricos de liberação controlada (RIEUX, 2006; ROSAS, 2007).
Materiais E Métodos
Processo de encapsulação: Para a preparação das microesferas brancas, dissolveu-se 200
mg de PLGA em 2 ml de CH2Cl2 (Dicloro-metano), sob forte agitação, adicionando-se 125 µl de PBS
(tampão fosfato-salino). A mistura foi emulsificada no ULTRATURRAX®, a 24000 rpm durante 2
minutos, acrescentando-se 10 ml de solução de PVA – poli(vinil álcool). Com o agitador HEIDOLPH,
foi evaporado o solvente a 1000 rpm, durante 3 horas em temperatura ambiente. Foram feitas 3
lavagens com água. Em seguida, ressuspendeu-se as microesferas em 1 ml de solução PVA a 1%.
Por fim, foi feita a liofilização, durante 24 horas, e estoque à -20° C até a hora do uso. As
microesferas com proteína foram preparadas como o descrito anteriormente, modificando-se, então,
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pela adição de 5 mg proteína (ovalbumina - OVA), com azida sódica a 0,2% (substância preservante),
juntamente com 125 µl do tampão de uso (PBS).
Eficiencia da encapsulação: Foi feita a análise da eficiencia, através da adição de 10 mg de
microesfera vazia e com OVA em 0,2 ml de acetonitrila, incubando-se por 15 minutos no ultrassom.
Em seguida, adicionou-se 1 ml de PBS, centrifugação e leitura da absorbância a 280 nm.
Análise do perfil de liberação: A observação dos valores de proteína liberada pelas
microesferas de PLGA foram realizadas ao longo 10 dias. Dissolveu-se 10 mg de microesfera vazia e
com proteína em 1 ml de PBS de pH 7.2. Diariamente, foi feita a dosagem das proteínas (leitura a
280 nm).
Resultados e Discussão
A solução com ovalbumina foi solubilizada em PBS contendo azida sódica como preservante.
A figura 1 mostra o espectro de absortividade da ovalbumina preparada a 1 mg/ml em PBS, da azida
sódica em solução a 0,2% e da solução de OVA em azida sódica a 0,2%.
a)
b)
c)
Figura 1 – a) Espectro da ovalbumina, (b) da azida e (c) da proteína com 0,2% de azida de 190 a 350
nm.
Foi possível observar que a adição da Azida não alterou o perfil de absortividade da proteína,
podendo este parâmetro ser utilizado como um método quantificador de proteínas.
O perfil de degradação apresentou-se satisfatório, sendo encontrado 116 mg de proteína em
10 mg de PLGA-MS, representando uma eficiência de 93%, fato que condiz com a dosagem de
proteína não encapsulada, obtida nas lavagens (603 mg). No perfil de degradação in vitro das
microesferas contendo ovalbumina (figura 2), observou-se que ocorreu liberação de 18 mg (3.82%)
no segundo dia, ocorrendo um “burst” no quarto dia, 264 mg (56.05%), estabilizando-se a partir do
Concentração (mg/ml)
sexto dia em 470 mg (100%).
470
394
500
400
470
470
470
470
263
300
200
100
0 18
18
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Dias
Figura 2 – Perfil de degradação in vitro da ovalbumina ao longo de 10 dias.
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Conclusão
A eficiência de encapsulação apresentou-se dentro do esperado, uma que cerca de 93% da
proteína foi encapsulada, constatado através da presença de 116 mg de proteína em 10 mg de MSPLGA. O perfil de liberação alcançou o máximo no sexto dia, totalizando 470 mg de proteína liberada.
Apoio: CNPq, CAPES, FAPEPI
Referências bibliográficas
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Response Analysis. J Nanosci Nanotechnol, 6(8):2043-2047, 2006.
RIEUX, Anne dês et al. Nanoparticles as potencial oral delivery systems of proteins and vaccines: a
mechanistic approach. ScienceDirect, Journal of Controlled Release, 116, 2006.
ROSAS, Javier E. et al. Microesferas de PLGA: um sistema para la liberación controlada de
moléculas com actividad inmunogénica. Revista Colomb. Ciência, Química e Farmácia. Volume 36
(2), 134-153, 2007.
SCHAFFAZICK, Scheila Rezende et al. Caracterização e estabilidade físico química de sistemas
poliméricos: Nanoparticulados para administração de fármacos. Química Nova, Volume 26, Nº5,
página 726-737, 2003.
SILVA, Catarina et al. Administração oral de peptídeos e proteínas:III. Aplicação de métodos de
microencapsulação. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. Volume 39, Nº1, 2003.
STEEN et al.. Insect reactions to bees, wasps and ants. Int J Dermatol, 44: 91-94. 2004.
TALUJA, Ajay et al. Novel approaches in microparticulate PLGA delivery systems encapsulating
proteins. Journal of Materials Chemistry, 17, 4002-4014, 2007.
TRINDADE, Reginaldo Almeida da. Encapsulação das proteínas do veneno de abelha em
microesferas de PLGA (Poliéster de Ácido Láctico-Co-Glicólico) para imunoterapia. 2010.
Palavras-chave: Encapsulação. Alergia. Imunoterapia.