Preparação de Microesferas de PLGA para Vetorização do Ácido

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROJETO
Preparação de Microesferas de PLGA para Vetorização do
Ácido Úsnico e Estudo In Vitro e In Vivo
da Atividade Terapêutica
Roseane Maria Ribeiro Costa
Recife, 2002
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROJETO
Preparação de Microesferas de PLGA para Vetorização do
Ácido Úsnico e Estudo In Vitro e In Vivo
da Atividade Terapêutica
Orientanda: Roseane Maria Ribeiro Costa
Orientadora:Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães
Recife, 2002
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1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, numerosos estudos demonstraram que a distribuição de um fármaco no
organismo pode ser modificada pelo uso de vetores medicamentosos coloidais ou partículas
poliméricas. Estes carreadores protegem certos princípios ativos lábeis da degradação e/ou
inativação pelo suco gástrico; melhoram a biodisponibilidade por aumento da penetração celular
de substâncias hidrofílicas e proporcionam a liberação do fármaco no sítio de ação desejado
(órgão, tecido ou célula), eliminando ou minimizando os efeitos colaterais que normalmente
acompanham a terapêutica convencional (Puisieux & Roblot, 1989).
Microesferas são micropartículas porosas que promovem a liberação controlada de fármacos.
Elas são constituídas de um sistema matriz contendo o fármaco uniformemente distribuído
através da matriz polimérica. Ambos polímeros naturais e sintéticos têm sido utilizados na sua
preparação. As micropartículas têm sido utilizadas com sucesso para grande variedade de
fármacos e substâncias bioativas, incluindo proteínas, enzimas, hormônios, e vacinas. A
microencapsulação oferece vantagens no processo da encapsulação a estabilidade e a atividade
biológica da droga não são afetadas durante o processo de fabricação; apresentando alta
eficiência de encapsulação da droga (Rajeev, 2000). .
O copolímero de ácido láctico e glicólico (PLGA) tem sido estudado nas formulações de
microesferas biodegradáveis que contém fármacos anticancerígenos, hormônios esteroidais e
peptídeos (Wang, 1997).
As micropartículas de PLGA fabricadas por diferentes técnicas são versáteis em termos de
encapsular várias classes de drogas e em particular são sistemas importantes onde vários perfis
de liberação da droga podem ser alcançados pelo ajuste da composição de PLGA, peso
molecular, droga encapsulada, tamanho da micropartícula, porosidade e outros fatores (Rajeev,
2000).
Com o crescente número de casos de câncer, a medicina atual vem desenvolvendo esforços para
sua cura, recorrendo a quimioterápicos cada vez mais eficientes, contando também com os
adjuvantes. O problema, na maioria das vezes, é a ação tóxica dos medicamentos sobre os
pacientes. Em poucas instâncias, as drogas atualmente conhecidas, são dirigidas somente contra
as células neoplásicas; na maioria dos casos, células normais são atingidas por efeitos colaterais
desses compostos. Por isso, a busca por antineoplásicos com menor toxicidade e maior eficácia
contra o câncer é objeto de incansável estudo dos pesquisadores da atualidade (Wallerstein Jr.,
1991).
Substâncias liquênicas de natureza fenólica e/ou polissacarídeos apresentam comprovada
eficiência contra tumores e células cancerígenas. Algumas delas com pouco efeito tóxico, outras
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com alta toxicidade (Nishikawa et al. 1969; Pereira et al., 1994; Santos et al., 1997). Este é um
dos problemas a serem minorados, a partir do uso de novas formas de administração de
medicamentos que possam melhorar a biodisponibilidade e diminuir a toxicidade de fármacos.
O ácido úsnico é um metabólitio secundário produzido por diversas espécies de liquens e seus
derivados (Cochietto, 2002). O ácido Úsnico apresenta atividade terapêutica contra
microorganismos gram-positivos e gram-negativos sendo conhecido também pelo seu potencial
antituberculostático, antitumoral e agente enibidor de enzima. Tem apresentado também efeito
contra a Mycobacterium lufo in vitro e é considerado um agente quimioterápico promissor contra
vários tipos de doenças como tuberculose, certos tipos de tumores e possivelmente para lepra
(Krishna, 1992).
O interesse principal do trabalho é a encapsulação do ácido úsnico, da espécie Cladonia
substellata, em forma microparticulada para estudar sua atividade in vitro e in vivo, visando
aumento na eficácia e diminuição da citotoxicidade para uma possível aplicação terapêutica.
OBJETIVO
O objetivo principal deste projeto consiste em obter sistemas de liberação controlada na forma de
microesferas de copolímero de ácido láctico e glicólico (PLGA) para vetorização da substância
de origem liquênica, o ácido úsnico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Fabricar microesferas de PLGA contendo ácido úsnico;
2. Caracterizar físico-quimicamente as micropartículas;
3. Avaliar o perfil da cinética de liberação in vitro do fármaco encapsulados nos sistemas
obtidos;
4. Determinar a atividade citotóxica in vitro e interação com células;
5. Determinar in vivo a atividade antitumoral do ácido úsnico microencapsulado;
6. Avaliar a histopatologia de tecidos e tumores após tratamento com micropartículas contendo
ácido úsnico.
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METODOLOGIA
1. Estudo Farmacotécnico
1.1. Obtenção das microesferas contendo fenóis liquênicos
Preparação de microesferas de PLGA pelo método de emulsão múltipla seguida da
evaporação do solvente (Rajeev, 2000). Etapas da fabricação de microesferas:
a) Formação de uma emulsão primária água /óleo (w/o)
b) Formação de uma emulsão múltipla água /óleo/água (w/o/w)
c) Evaporação do solvente
d) Centrifugação e lavagem das micropartículas
e) Filtração ou liofilização
1.2. Caracterização físico-química de micropartículas de PLGA contendo ácido úsnico
Aspecto macroscópico
As microesferas serão examinadas a olho nu, para verificar alguma alteração no seu estado
físico.
Caracterização microscópica das micropartículas
Além da análise simples feita através da microscopia óptica, a morfologia das
micropartículas e as características da parede polimérica serão analisadas por microscopia
eletrônica de varredura (SEM), após metalização com ouro coloidal (Hamilton-Attwell,
1987).
Desenvolvimento do método de dosagem do fármaco
A análise quantitativa da substância encapsulada será determinada por cromatografia de alta
eficiência (CLAE) (Krishna, 1992). A quantidade total será obtida pela extração do princípio
ativo das microesferas utilizando solvente orgânico adequado. O resultado será avaliado em
termos de área do pico do ácido úsnico em relação a uma curva de calibração do ácido.
Estudo Farmacocinético in vitro
A cinética de liberação in vitro será estudada pela incubação das microesferas de ácido
úsnico em tampão fosfato pH 7,4 colocadas sob agitação de 180 stokes/min a 37°C, para
manter as condições “sink”. A cada intervalo de coleta as microesferas serão centrifugadas e
a quantidade do produto liberada será determinada pela análise em CLAE. (Rafati, 1997;
Rajeev, 2000).
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Estudo in vitro de Citotoxicidade
O estudo da citotoxicidade das microesferas de PLGA contendo ácido úsnico será realizado
pelo método de cultura de tecidos com células do tipo linhagem Hep-2 (carcinoma
epidermóide de laringe). As células são mantidas em meio mínimo essencial (MME), diluído
em água deionizada estéril na proporção 1:10 (v/v), suplementado com 10% de soro fetal
bovino, 1% de L-glutamina e 1% de solução de antibióticos, segundo Eagle (1959).
As amostras purificadas serão utilizadas nos ensaios de citotoxidade de acordo com o
protocolo para triagem de agentes químicos e produtos naturais (Protocol for Screening
Agents and Natural Products-NCI) (Geran et al., 1972). As microesferas serão acrescentadas
ao meio contendo células, em concentrações variadas. Em seguida, as placas serão incubadas
por 72h em atmosfera de 5% de CO2.
A atividade citotóxica será avaliada pela percentagem de inibição do crescimento da amostra
em relação ao grupo controle. A proliferação celular será mensurada pela concentração de
proteínas (Oyama & Eagle, 1956).
Estudo in vivo atividade antitumoral
Nos testes de atividade anti-tumoral são utilizados tumores experimentais do tipo sarcoma180 em camundongos. O líquido ascítico contendo as células tumorais crescidas durante 7
dias, será aspirado e centrifugado a 70 g durante 5 minutos a 4C. Uma alíquota do sedimento
celular será utilizada para contagem e teste de viabilidade celular com azul de tripan. A
concentração será ajustada com solução de NaCl 10 mM estéril para 5,0 10+7 células/ml. O
volume de 0,1 ml será inoculado via subcutânea na região dorsal direita de cada
camundongo. Cada grupo controle será constituido de 15 animais e os grupos teste de no
mínimo 10 animais. Após 24 h de implantação do tumor, os camundongos serão tratados por
via intra-peritonial com o fármaco em solução e encapsulado em micropartículas. O grupo
controle recebe NaCl 150 mM por via intraperitonial. O acompanhamento e avaliação do
efeito do fármaco nos animais tratados serão efetuados segundo metodologia de Bradner e
colaboradores (1958), através da medida dos raios perpendiculares para cálculo do volume
médio dos tumores e da porcentagem de inibição.
Ao término do tratamento, os animais dos dois grupos serão sacrificados e os tumores
dissecados para avaliação da inibição anti-tumoral e estudos histopatólogicos.
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Estudo Histopatológico de Tecidos e Tumores
Ao final dos testes de atividade antineoplásica, os animais serão sacrificados com éter
sulfúrico. Órgãos como baço, rins, fígado, intestino e fragmento de tumor serão dissecados,
lavados rapidamente em PBS 0,01 M (pH 7,2). As espécimes teciduais retiradas serão
fixadas com formalina 10% (v/v) tamponada. Após 5 dias, a solução fixadora será trocada.
Após fixação, as amostras serão submetidas a lavagens consecutivas com álcool a 70%, 80%
e 90%, álcool absoluto I, II, III, Alcool/xilol (1/2), xilol I, xilol II, xilol III e parafina a 56°C.
Em seguida, o material será processado em histotécnico automático (Sakura, Japão), incluído
em emblocador Tissue-Tec (Miles Scientific, E.U.A.) e cortes de 4 µm serão obtidos em
micrótomo horizontal (Yamato Kohki, Japão). Após coradas com hematoxina e tricromio de
Masson, as amostras serão analisadas em microscópio ótico Olympus BH-2 (Olympus
Optical, Japão).
Financiamento: CAPES-COFECUB 269/99; BNB; CNPq
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