Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Instituto de Ciências Exatas
Depto. de Química
QUI 070 – Química Analítica V
Análise Instrumental
Aula 11 – Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Julio C. J. Silva
Juiz de Fora, 2014
Introdução
•
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o tipo mais versátil e
mais amplamente empregado de cromatografia por eluição.
•
Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual
contém a amostra na forma de uma mistura de solutos.
•
O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente definido
pelo mecanismo de separação ou pelo tipo de fase estacionária:
(1) partição ou cromatografia líquido-líquido;
(2) adsorção ou cromatografia líquido-sólido;
(3) troca iônica ou cromatografia de íons;
(4) cromatografia por exclusão;
(5) cromatografia por afinidade;
(6) cromatografia quiral.
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A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tornou-se uma
ferramenta analítica indispensável. Os laboratórios
criminais e os programas de televisão policiais e forenses, como CSI,
CSI Miami, Crossing Jordan e Law and Order, freqüentemente
empregam a CLAE no processo de obtenção de evidências criminais.
Introdução
• Nos anos de 1960 que se desenvolveu a tecnologia para
produzir e utilizar recheios com diâmetros de partículas tão
pequenos como 3 a 10 µm.
• O termo cromatografia líquida de alta eficiência é sempre
empregado para distinguir essa tecnologia dos procedimentos
cromatográficos realizados em colunas simples que os
precederam.
• A cromatografia de coluna simples, contudo, ainda encontra
considerável uso para propósitos preparativos.
Instrumentação
• Cromatografia líquida moderna:
– Altas pressões de bombeamento  velocidades
razoáveis por recheios de partículas muito
pequenas (3 – 10 µm)
– Equipamentos mais complexos
– Equipamentos mais caros
Instrumentação
Instrumentação
Instrumentação
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Reservatório de fase móvel
Sistemas de tratamento de solventes
– Gases dissolvidos e material particulado  devem ser retirados
– Desgaseificadores  vácuo, sistemas de destilação,
aquecimento e agitação e sistema de “sparging”
– Sparging  sistema pelo qual os gases dissolvidos são
arrastados para fora de um solvente por pequenas bolhas de um
gás inerte e solúvel
•
Sistema de Eluição:
– Isocrático  constituição do solvente permanece constante
– Gradiente  composição do solvente é alterada
Instrumentação
Instrumentação
Sistema de Bombeamento
• Requisitos:
– Habilidade de gerar pressões altas (até 6.000 psi)
– Saída livre de pulsação
– Vazões na faixa 0,1 – 10 mL/min
– Reprodutibilidade relativa da vazão de 0,5% ou melhor
– Resistência a corrosão
• Tipos de bomba:
– De seringa
– Bomba recíproca
– Bomba pneumática de pressão
Instrumentação
Sistema de Bombeamento
• Bomba de seringa (rosca):
– Saída livre de pulsação
– Pequena capacidade de volume ( ± 250 mL)
– Troca de solventes  difícil
• Bomba recíproca:
–
–
–
–
–
Fluxo pulsado que deve ser atenuado
Pequeno volume interno
Alta pressão de saída (10.000 spi)
Eluição por gradiente
Vazões constantes
• Bomba pneumática de pressão
–
–
–
–
Barata
Simples
Livres de pulsação
Eluição por gradiente  não permite
Instrumentação
Instrumentação
Sistema de Injeção da Amostra
• Alça de amostragem
– Permite a escolha do volume (5 a 500 µL)
– Boa precisão
– Auto-amostradores
Instrumentação
Colunas para cromatografia
•
Aço inoxidável
•
Comprimento  10 a 30 cm
•
Diâmetro  2 a 5 mm
•
Recheio  partículas de 3 – 10 µm
•
Microcolunas  d.i = 0,1-5 mm, l = 3 – 8 cm, recheio = 3 – 5 µm
•
Vantagens:
– Maior eficiência da coluna
– Menor consumo de solventes
– Maior velocidade de eluição
Instrumentação
Colunas para cromatografia
•
Microcolunas  exemplo:
Instrumentação
Colunas para cromatografia
•
Recheio
– Sílica (suporte)  partículas com diâmetros altamente uniformes
– Fase estacionário  composto orgânico química ou fisicamente ligados a
superfície do suporte.
•
Colunas de proteção (guarda)
– Posicionada a frente da coluna analítica
– Função  aumentar a vida útil da coluna analítica
– Composição semelhante a composição da coluna analítica
• Termostato para coluna  manter a temperatura sob
controle.
Instrumentação
Detectores
• Pequeno volume morto
• Pequeno e compatível com a vazão de líquido
• Não existe detector universal
• Tipos de detectores:
Instrumentação
Detectores
Instrumentação
Tipos de CLAE (partição)
• Cromatografia por partição  a fase estacionária
é um líquido imiscível com a fase móvel
• Cromatografia por partição líquido-líquido FE é
um solvente que é imobilizado por adsorção
• Cromatografia por partição com fase ligada  FE
é um composto orgânico imobilizado por ligações
químicas
• Amplamente empregada
Tipos de CLAE (Partição)
Recheios com fase ligada
• FE  diferentes polaridades
• Características:
– Maior estabilidade
– Compatível com CLAE por gradiente
– Pequena capacidade de amostra
• Recheios de Fase Normal e Reversa
– Fase normal  A FE é polar e a fase móvel é apolar
– Fase reversa  A FE é apolar e a fase móvel é polar
Tipos de CLAE (Partição)
Escolha das Fases Móvel e Estacionária
• Regra geral:
 iguala-se a polaridade do analito com a da FE
 Usas-se uma FM com polaridade diferente da FE
 Analito e FM com polaridades semelhantes não é vantajoso...
 Analito e FE com polaridades muito parecidas também não é
vantajoso...
Tipos de CLAE (Partição)
• Aplicações:
Tipos de CLAE (Partição)
• Aplicações:
Tipos de CLAE (Adsorção)
• CLAE por adsorção  Os analitos são adsorvidos
sobre uma superfície de um sólido polar finamente
dividido (recheio)
• A FM é constituída por um solvente orgânico ou
por uma mistura de solventes orgânicos
• A FE é composta por partículas de sílica ou alumina
Tipos de CLAE (Troca Iônica)
• Existem dois tipos  Baseadas em supressores e coluna
única
• Cromatografia de íons baseadas no uso de supressores:
• Detector de condutividade  sensíveis, universais para
espécies carregadas, simples, baixo custo e fáceis de serem
miniaturizados
• Limitação  alta concentração de eletrólito para eluição da
maioria dos íons dos analitos
• Conseqüentemente
sensibilidade
• Porém, em 1975...

alta
condutividade
e
baixa
Tipos de CLAE (Troca Iônica)
• Porém, em 1975...
• Coluna supressora de eluente  coluna recheada com uma
resina trocadora de íons que converte os íons do solvente de
eluição para espécies moleculares de ionização limitada
• Na determinação de cátions:
• Na determinação de anions:
Tipos de CLAE (Troca Iônica)
Supressora
Coluna
Tipos de CLAE (Troca Iônica)
Coluna de guarda
Tipos de CLAE (Troca Iônica)
Fluoreto
Cloreto
Sulfato
Tipos de CLAE (troca iônica)
Tipos de CLAE (Exclusão)
• O fracionamento é baseado nos tamanhos
das moléculas
• Filtração em gel  recheio hidrofílico
(espécies polares)
• Permeação em gel  recheio hidrofóbico
(espécies apolares)
Tipos de CLAE (Exclusão)
• Aplicação:
CLAE versus CG
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Silva, L.L.R. Notas de Aula. FACET, UFVJM, 2008.
2. Cadore, S. Notas de Aula. IQ, UNICAMP, 2004.
3. SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios
de Análise Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman,
2006.
4. COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S.,
Fundamentos de Cromatografia, Editora Unicamp, 2006.