Universidade do Extremo Sul Catarinense Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais Calendula officinalis L. (ASTERACEAE): CARACTERIZAÇÃO DA PRODUÇÃO ORGÂNICA E ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DE INSETOS SOBRE A ATIVIDADE FARMACOLÓGICA Elder Tschoseck Borba Criciúma, SC 2010 Elder Tschoseck Borba Calendula officinalis L. (ASTERACEAE): CARACTERIZAÇÃO DA PRODUÇÃO ORGÂNICA E ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DE INSETOS SOBRE A ATIVIDADE FARMACOLÓGICA Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Ambientais da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais. Área de Concentração: Ecologia e Gestão de Ambientes Alterados Orientadora: Profª. Drª. Vanilde Citadini Zanette Criciúma, SC 2010 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação B726c Borba, Elder Tschoseck. Calendula officinalis L. (asteraceae) : caracterização da produção orgânica e análise da influência de insetos sobre a atividade farmacológica. / Elder Tschoseck ; orientadora: Vanilde Citadini Zanette. – Criciúma : Ed. do Autor, 2010. 71 f. : il. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Criciúma, 2010. 1. Plantas medicinais. 2. Agricultura familiar. 3.Calendula officinalis - Cultivo. I. Título. CDD. 21ª ed. 633.88399 Bibliotecária Eliziane de Lucca – CRB 1101/14ª Biblioteca Central Prof. Eurico Back - UNESC Dedico... À minha esposa, Flávia Trento Gomes Borba, por estar ao meu lado de forma incondicional, incansável e por compreender minha ausência durante este trabalho. AGRADECIMENTOS A Deus, o grande guia e mestre, por me conceder a vida e me proporcionar um caminho iluminado para que pudesse vencer as dificuldades e alcançar minhas vitórias. Aos meus pais, que por um motivo ou por outro me ajudaram durante este período. À minha esposa, que sempre me deu forças para superar os momentos de dificuldades, dando-me estímulo e acompanhando-me na conclusão de mais uma fase. À minha orientadora, Professora Dra. Vanilde Citadini-Zanette, pela sua atenção, empenho e dedicação ao corrigir com paciência minhas deficiências, e por não ter medido esforços para que este trabalho fosse concluído. Ao Professor M.Sc. Marcelo Soares Fernandes, pelo incentivo, críticas e ricas sugestões durante todas as etapas da pesquisa. À Professora Dra. Raquel Rejane Bonato Negrelle, pelas valiosas sugestões para a conclusão deste trabalho. Ao grupo de pesquisa da Etnofarmacologia, em destaque Sumaya, Tamara, Douglas e Gean, por auxiliarem nos experimentos em laboratório. Às demais pessoas que por ventura não foram citadas, mas que de alguma forma contribuíram para a realização deste estudo. Muito obrigado! “Enquanto ensino continuo buscando, reprocurando. Ensino porque busco, porque indaguei, porque indago e me indago. Pesquiso para conhecer o que ainda não conheço e comunicar e anunciar a novidade”. Paulo Freire LISTA DE FIGURAS Figura 1.1: Calendula officinalis L.: detalhe da inflorescência (GRÃO-PARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba, out. 2008. ........................................................................................................14 Figura 2.1: Mapa de Santa Catarina, com destaque para o Município de Grão-Pará (28º13’58,7” S e 49º 17’58,9” W – sede). Fonte: Darolt (2009)..............................................24 Figura 2.2: Sistema de policultivo em área de produção de plantas medicinais (GRÃOPARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba, out. 2008). .........................................................................29 Figura 2.3: Parte externa da estufa de secagem de plantas medicinais construída pelo produtor (GRÃO-PARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba – out. 2008). .........................................................32 Figura 2.4: Parte interna da estufa de secagem de plantas medicinais construída pelo produtor (GRÃO-PARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba – out. 2008) ..........................................................32 Figura 2.5: Armazenamento de plantas medicinais prontas para a comercialização (GRÃOPARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba – out. 2008). .......................................................................33 Figura 3.1: Detalhe da área de estudo utilizada para o cultivo de plantas medicinais protegidas e expostas a agentes agressores, na propriedade rural de Grão-Pará, SC (Foto: Elder T. Borba – out. 2008)...............................................................................................................................45 Figura 3.2: Resultado da Fase I do teste de formalina. Efeito causado pela administração, por via oral, do extrato metanólico de C. officinalis, diluído em diferentes concentrações, de plantas exposta ao ambiente e protegidas, em relação à 1ª fase da dor induzida pela injeção de formalina em grupos (n=6) de camundongos. * = Diferença significativa p< 0,05 e ** = Diferença significativa p< 0,01 em relação ao grupo controle salina. .....................................49 Figura 3.3: Resultado da Fase II do teste de formalina. Efeito causado pela administração, por via oral, do extrato metanólico de C. officinalis, diluído em diferentes concentrações, de plantas exposta ao ambiente e protegidas, em relação à 2ª fase da dor induzida pela injeção de formalina em grupos (n=6) de camundongos. * = Diferença significativa p< 0,05 e **= Diferença significativa p< 0,01 em relação ao grupo controle salina. # = Diferença significativa p< 0,05 entre grupos que receberam extrato de plantas protegidas em relação ao grupo expostas com a mesma concentração. ............................................................................50 Figura 3.4: Perfil cromatográfico dos extratos expostos e protegidos de insetos polinizadores e/ou fitófagos. Eluente: Hex/AcOEt (8:2); revelador: Anisal. Sulfúrico; solvente CHCl3. .....51 Figura 3.5: Perfil cromatográfico dos extratos expostos e protegidos de insetos polinizadores e/ou fitófagos. Eluente: CHCl3/MeOH (9:1); revelador: Anisal. Sulfúrico; solvente AcOEt. 51 Figura 3.6: Perfil cromatográfico dos extratos expostos e protegidos de insetos polinizadores e/ou fitófagos. Eluente: CHCl3/MeOH (1:1); Revelador: UV longo; solvente MeOH. ..........51 SUMÁRIO APRESENTAÇÃO ...................................................................................................................9 Capítulo 1 : Calendula officinalis L. (ASTERACEAE): ASPECTOS BOTÂNICOS, ECOLÓGICOS E USOS........................................................................................................11 Resumo .....................................................................................................................................11 Abstract.....................................................................................................................................11 1.1 Introdução .........................................................................................................................11 1.2 Calendula officinalis L......................................................................................................12 1.2.1 Classificação botânica .....................................................................................................12 1.2.2 Origem, distribuição e cultivo .........................................................................................13 1.2.3 Descrição botânica...........................................................................................................13 1.2.4 Descrição detalhada da inflorescência.............................................................................14 1.2.5 Exigências ambientais .....................................................................................................15 1.2.6 Fenologia .........................................................................................................................16 1.2.7 Usos terapêuticos e outros ...............................................................................................16 1.3 Conclusão ..........................................................................................................................18 Referências ..............................................................................................................................19 Capítulo 2 : PRODUÇÃO ORGÂNICA DE Calendula officinalis L. (ASTERACEAE): UM ESTUDO DE CASO .......................................................................................................22 Resumo .....................................................................................................................................22 Abstract.....................................................................................................................................22 2.1 Introdução .........................................................................................................................23 2.2 Materiais e Métodos .........................................................................................................24 2.3 Resultados e Discussão .....................................................................................................25 2.3.1 Histórico do início da produção de plantas medicinais ...................................................25 2.3.2 Utilização de Calendula officinalis L. pela família.........................................................27 2.3.3 Sistema de plantio de Calendula officinalis L.................................................................28 2.3.4 Cultivo, colheita, secagem e armazenamento de Calendula officinalis L.......................30 2.3.5 Controle de pragas ...........................................................................................................33 2.3.6 Produção e comercialização da Calendula officinalis L. ................................................35 2.3.7 Da renda do produtor.......................................................................................................35 2.3.8 Incentivos governamentais ..............................................................................................36 2.4 Conclusão/Recomendação ...............................................................................................36 Referências ..............................................................................................................................38 Capítulo 3 : Calendula officinalis L. (ASTERACEAE): EFEITO DA INTERAÇÃO INSETO/PLANTA SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE FARMACOLÓGICA .............................................................................................................41 Resumo .....................................................................................................................................41 Abstract.....................................................................................................................................41 3.1 Introdução .........................................................................................................................42 3.2 Materiais e Métodos .........................................................................................................44 3.2.1 Plantio de Calendula officinalis L. e obtenção das amostras ..........................................44 3.2.2 Preparação do extrato metanólico de C. officinalis L......................................................46 3.2.3 Animais utilizados ...........................................................................................................46 3.2.4 Avaliação da resposta nociceptiva no teste de formalina em camundongos ...................46 8 3.2.5 Análise estatística ............................................................................................................47 3.2.6 Análise cromatográfica....................................................................................................48 3.3 Resultados .........................................................................................................................49 3.3.1 Teste de formalina ...........................................................................................................49 3.3.2 CCD e caracterização fitoquímica dos extratos das flores de C. officinalis L. ...............50 3.4 Discussão ...........................................................................................................................52 3.5 Conclusão ..........................................................................................................................56 Referências ..............................................................................................................................57 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................................61 REFERÊNCIAS .....................................................................................................................62 9 APRESENTAÇÃO Calendula officinalis L., pertencente à família Asteraceae, também conhecida como calêndula ou malmequer, é uma planta herbácea anual, cujos capítulos florais são comercializados no Brasil e utilizados principalmente pela indústria farmacêutica e cosmética, sendo amplamente utilizada pela medicina popular.e empregada como item de ornamentação (SILVA JUNIOR, 2006). Seu registro consta no rol de plantas medicinais publicado na Resolução-RE n.º 89, de 16 de março de 2004, da Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA (BRASIL, 2004). Sua composição química é rica e inclui óleo essencial, flavonóides, triterpenos, entre outras substâncias, as quais são responsáveis pela atividade antisséptica, cicatrizante e antiinflamatória, dentre outras propriedades biológicas, sendo indicada por estudos científicos, fazendo com que seu emprego seja significativo (SILVA JUNIOR, 2006). Com a utilização de técnicas diferenciadas das demais culturas, como todas as plantas medicinais, C. officinalis deve ser cultivada pelo método do sistema orgânico, pautado na conservação do meio ambiente por meio de exploração sustentável, voltada ao equilíbrio ecológico da produção, evitando a contaminação do solo com fertilizantes químicos, herbicidas e outros agroquímicos, os quais podem influenciar na composição de princípios ativos das plantas. O crescimento do mercado de plantas medicinais e a alteração do perfil de consumo da população voltada à aquisição de produtos naturais tem valorizado o comércio de fitoterápicos, representando oportunidade de negócio nas propriedades rurais baseadas na agricultura familiar. Na região sul do Brasil, devido às condições edafoclimáticas, favoráveis ao cultivo de C. officinalis, sua produção se torna promissora, sendo seu cultivo economicamente viável para os pequenos produtores rurais, como fonte de renda alternativa (OLTRAMARI, 2002). Pelo exposto e para a concretização do propósito apresentado neste estudo, inicialmente fez-se uma revisão bibliográfica sobre Calendula officinalis abordando aspectos botânicos, ecológicos e usos da planta (Capítulo 1). Após, foi realizada uma investigação etnobiológica com um produtor rural da localidade de Grão-Pará, Estado de Santa Catarina, que trabalha em regime de agricultura familiar voltada à produção de ervas medicinais, dando ênfase à C. officinalis (Capítulo 2). Nesta etapa o objetivo foi resgatar seu conhecimento e 10 percepção sobre as plantas medicinais e identificar a importância deste tipo de produção para a agricultura no contexto local, evidenciando erros e omissões que podem estar comprometendo a maximização de rendimento e a qualidade final do produto comercializado. Adicionalmente, pretendeu-se avaliar a interferência da visitação de insetos em C. officinalis com relação aos compostos químicos e atividade farmacológica, por meio de análise comparativa dos extratos de flores obtidas junto à propriedade rural estudada (Capítulo 3). A pesquisa realizada com Calendula officinalis integra o projeto “Interações de insetos com Calendula officinalis L. (Asteraceae) e sua influência na atividade antiinflamatória e analgésica da espécie” (CNPq- Processo nº 484193/2007-4). 11 Capítulo 1 : Calendula officinalis L. (ASTERACEAE): ASPECTOS BOTÂNICOS, ECOLÓGICOS E USOS Resumo Calendula officinalis L. (Asteraceae) é uma planta anual, de origem incerta e cultivada no Brasil como medicinal e ornamental, tendo sido objeto de vários estudos químicos e farmacológicos. Por sua importância terapêutica, este estudo objetivou realizar pesquisa exploratório-descritiva sobre a calêndula visando compilar dados sobre as características botânicas, ecológicas e uso dessa espécie para subsidiar pesquisas no sul de Santa Catarina. Palavras-chave: Calêndula; planta medicinal, sul de Santa Catarina. Abstract Calendula officinalis L. (Asteraceae) is an annual plant of uncertain origin that is cultivated in Brazil as medicinal and ornamental, and has been a subject of several chemical and pharmacological studies. Due to the therapeutic importance, this study aimed to carry out exploratory-descriptive research on the marigold order to compile data on the botanical characteristics, ecological, and the use of this species to support researches in the south of Santa Catarina. Key-words: Marigold, medicinal plant, Southern of Santa Catarina state. 1.1 Introdução Dentre as plantas medicinais cultivadas e comercializadas em Santa Catarina, cita-se a calêndula - Calendula officinalis L., que até 2001 era cultivada no Estado por sete produtores (OLTRAMARI; ZOLDAN; ALTMANN, 2002), representando 21% dos que se dedicavam à produção de plantas medicinais. A calêndula, também conhecida como malmequer, é uma planta herbácea anual, cujos capítulos florais são comercializados no Brasil principalmente em função de seu emprego como medicinal e ornamental (SILVA JUNIOR, 2006), sendo o mercado bastante específico (VAZ; JORGE, 2006). 12 O mercado de fitoterápicos e plantas medicinais é visto como promissor em Santa Catarina. O de chá está em crescimento e há muito espaço para ocupação, pois a grande maioria é importada de outros Estados e da Argentina (ALTMANN et al., 2008). Segundo estes autores, existe a expectativa de que, com a implantação da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que normatiza o uso de fitoterápicos e plantas medicinais, abrir-se-ão mercados para o setor. Considerando a importância terapêutica da C. officinalis aliada ao crescente volume de informação gerada (MULEY et al., 2009), que nem sempre aparece de forma sistematizada, buscou-se com este estudo apresentar uma revisão bibliográfica englobando aspectos botânicos e ecológicos, bem como de usos dados à espécie, visando subsidiar pesquisas no sul do Estado de Santa Catarina. 1.2 Calendula officinalis L. 1.2.1 Classificação botânica Calendula officinalis L. foi descrita por Lineu em 1753. Está inserida na família Asteraceae, com distribuição cosmopolita, especialmente comum em habitats temperados, tropicais montanos, secos e abertos. Apresenta 1.535 gêneros e 23.000 espécies (JUDD et al., 2009). O gênero Calendula inclui aproximadamente 29 espécies (MOBOT, 2010). Seu nome genérico deriva do latim calendae que significa primeiro dia do mês, pois refere à Antiga Roma, quando esta planta se encontrava sempre em flor no primeiro dia do mês. Segundo APG III (2009) a calêndula está taxonomicamente categorizada como: Clado EUASTERÍDEAS II Ordem ASTERALES Família ASTERACEAE Bercht. & J. Presl, 1820 (Compositae, nom.cons.) Subfamília ASTEROIDEAE Tribo CALENDULEAE Gênero Calendula L., 1753 Espécie Calendula officinalis L. in Sp. Pl. 2: 921, 1753 No Brasil é conhecida popularmente como calêndula, flor-de-todos-os-males, malmequer, malmequer-do-jardim, maravilha, maravilha-do-jardim, margarida-dourada, 13 verrucária (SILVA JUNIOR, 2006; LORENZI; MATOS, 2008). Em espanhol é denominada caléndula, copetuda ou maravilla e em inglês como marigold, nome originado da Idade Média devido a uma lenda que associava a virgem Maria com as flores douradas da calêndula (ROIG, 1974; MUÑOZ, 1987), holligold, goldbloom, marybud. Em outros países é conhecida como ringelblume, todtenblume (Alemanha), souci, souci des jardins (França), chin chan ts’ao (China), calendola, calendula, callandria, calenzola (Itália), belas noites, maravilha, bem me queres, calêndula hortense (Portugal), galbinele (Romênia) e ringblomma na Suécia (CENTENO, 2004; MULEY et al., 2009). 1.2.2 Origem, distribuição e cultivo Várias origens são mencionadas para a calêndula, como Egito (Luz et al., 2001), Europa central, leste e sul (WHO, 2002), Ilhas Canárias e Região Mediterrânea (SILVA JUNIOR, 2006; LORENZI; MATOS, 2008). Cultivada em toda a Europa no século XII, estendendo-se posteriormente por todo o mundo, ocorrendo subespontaneamente por toda a região mediterrânea onde é muito conhecida como planta ornamental cultivada em pátios e jardins (LUZ et al., 2001). É cultivada comercialmente na América do Norte, nos Balcans, no leste europeu e Alemanha (WHO, 2002) e no Brasil a calêndula está bem aclimatada, devido as condições edafoclimáticas serem favoráveis ao seu cultivo (BERTONI et al., 2006) que ocorre em jardins e hortos medicinais. No sul do Brasil é cultivada para fins ornamentais e para apoio à indústria de cosméticos (BARBOSA et al., 2010). 1.2.3 Descrição botânica C. officinalis é uma planta herbácea anual, que varia de 30 a 60 cm de altura, com raízes fasciculadas, ligeiramente amareladas e cilíndricas; apresenta caule anguloso, curto e sólido, ereto ou prostrado, pubescente; as folhas são ligeiramente denteadas, alternas, lanceoladas, com pelos glandulares em ambas as faces; as inferiores são espatuladas, obtusas ou agudas no ápice, com 1020 cm de comprimento e 1-4 cm de largura; as superiores são oblongas a lanceoladas e 14 mucronadas no ápice, com 4-7cm de comprimento; brácteas involucrais com 7-15 cm de comprimento, revestidas de longos pelos glandulares; inflorescências capítulos no ápice dos caules, de 3-7 cm de diâmetro, com flores de cores heterogêneas, podendo variar do amarelo ao alaranjado; as flores centrais são tubuladas e estéreis, já as periféricas são liguladas e férteis; apresentam frutos secos tipo aquênio, estreitamente oblongos e curvos (WHO, 2000; PDR, 2000; LORENZI; MATOS 2008). Figura 1.1: Calendula officinalis L.: detalhe da inflorescência (GRÃO-PARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba, out. 2008. 1.2.4 Descrição detalhada da inflorescência 1.2.4.1 Elementos morfológicos característicos Capítulos solitários, geralmente com 3-7 cm de diâmetro; brácteas involucrais lineares e acuminadas, com margem estreito-escariosa, revestidas de pelos glandulares, dispostas em 1-2 verticilos, com 7-15 mm de comprimento; receptáculo floral plano e sem brácteas interflorais; flores liguladas amarelas ou alaranjadas e as tubuladas concolores com as liguladas, estas medem 2-3 cm de comprimento e 5-7 mm de largura, tridenteadas no ápice e dotadas de abundantes tricomas tectores pluricelulares e bisseriados na base; flores tubuladas com corola pentalobada, mais curtas (5mm) que as liguladas e com menos tricomas tectores na base (WHO, 2002; CENTENO, 2004). 15 1.2.4.2 Elementos anátomo-microscópicos característicos Flores liguladas revestidas na base por abundantes tricomas tectores pluricelulares bisseriados e alguns tricomas glandulares pedicelados bisseriados de comprimento variável; flores tubuladas, com os mesmos tipos de tricomas na base, além de outros tricomas tectores pluricelulares unisseriados e alguns glandulares com pé curto e cabeça secretora, formada por vários estratos de células superpostas (CENTENO, 2004). Células epidérmicas internas das flores liguladas alongadas, retangular, com parede lisa e cutícula fracamente estriada; estômato ausente; células externas da epiderme semelhantes às internas, mas com 3 ou 4 estômatos anomocíticos; tricomas numerosos no tubo, bisseriado; células epidérmicas do estigma com parede lisa, poligonal; flores tubuladas ou do disco, com células da epiderme externa alongadas, com parede lisa ou ligeiramente sinuosa, estômato ausente; tricomas abundantes abaixo do ponto de inserção dos estames, principalmente glandular, unisseriado ou bisseriado; dentro da porção superior da antera há uma camada de células isodiamétricas a alongadas, com parede moderadamente espessa, lignificada e escavada; grãos-depólen esféricos, até 45 µm de diâmetro, com tricolporados, exine finamente granular, com numerosos espinhos curtos; ápice do estigma coberto por papilas bulbosas curtas (BRUNETON, 2001; WHO, 2002). 1.2.4.3 Características organolépticas Odor característico, de fraco a forte, com sabor amargo e aromático (PDR, 2000, WHO, 2002, CENTENO, 2004). 1.2.5 Exigências ambientais A calêndula é considerada uma espécie rústica por ser pouco exigente ao tipo de solo, ainda que prefira os argilosos (LUZ et al., 2001; CENTENO, 2004), férteis, bem drenados, ricos em matéria orgânica e permeáveis (CASTRO; CHEMALE, 1995; SILVA JUNIOR, 2006). Prefere climas temperados, mas resiste às geadas e às estiagens; cresce em altitude que vai desde o nível do mar até 1000 m. Por ser uma planta cultivada desde a antiguidade, existem 16 numerosas variedades, que se diferenciam fundamentalmente pelo tamanho, cor e complexidade da corola (LUZ et al., 2001). A temperatura ótima para a germinação está entre 18 e 24º C, porém nas fases seguintes suporta temperaturas superiores (LUZ et al., 2001). Segundo Silva Junior (2006) e Osaida et al. (2009) a calêndula em temperaturas noturnas muito elevadas reduzem o tamanho das flores. É uma planta heliófita que necessita de no mínimo quatro horas diárias de sol. No sul do Brasil é plantada no fim do inverno. Não suporta frios intensos quando novas. Os climas secos são mais favoráveis ao seu cultivo. No verão, os calores prejudicam esta cultura (CASTRO; CHEMALE, 1995). 1.2.6 Fenologia A semeadura ocorre no final do outono (LUZ et al., 2001) ou final do inverno (SILVA JUNIOR, 2006), desenvolvendo um ciclo de aproximadamente 4-5 meses. A floração ocorre no final da primavera até no final do verão (FRANCO, 2005; OSAIDA et al., 2009). Segundo Correa Junior et al. (1994) a calêndula floresce quase todo o ano, exceto em períodos de estiagem. As flores abrem ao nascer do sol e fecham ao entardecer e, dependendo do ambiente, suas estruturas florais podem ter variações de cor e tamanho (VAZ; JORGE, 2006; SILVA JUNIOR, 2006; OSAIDA et al., 2009). A colheita deve ser feita quando as sumidades floridas estão em plena floração, quando os capítulos vão sendo cortados escalonadamente a medida que se abrem (CENTENO, 2004). 1.2.7 Usos terapêuticos e outros C. officinalis é amplamente difundida na medicina popular em todo o mundo desde a Idade Média, apresentando grande eficácia medicinal quando suas flores são utilizadas em forma chá, compressas ou extratos (KÖRBES, 1995; MICHALAK, 1997; LORENZI; MATOS 2008). No Brasil, a calêndula é muito utilizada na forma de chá das flores como espasmódica, expectorante e para tratar anemias nervosas. É utilizada para combater inflamações das vísceras, 17 feridas, chagas cancerosas, dor de garganta, alergia e icterícia; as pétalas maceradas em compressas de alcoolato são usadas para feridas abertas (KÖRBES, 1995; MICHALAK, 1997). As propriedades etnoterapêuticas como excitante, emenagoga, antiespasmódica, antiescorbútica, oftálmica, antisséptica, cicatrizante, sudorífica, colagoga, antiinflamatória, antiemética, analgésica, antiviral, tonificante da pele (acne), vasodilatadora, emolientes, adstringente, vulnerária, bactericida, fungicida, antiabortiva, antialérgica e resolutiva são mencionadas em Moreira (1985), Caribé et al. (1991), Martins (1994), Körbes (1995), Franco (1996) e Shaw (1999). Embora sejam citados o uso do caule e das folhas secas (SILVA JUNIOR, 2006), das sementes (FRITSCHE et al., 1999) e toda a erva (PDR, 2000), a flor é a parte mais utilizada, portanto a mais estudada, por possuir substâncias ativas como triterpenos, saponinas, ésteres, flavonóides, óleos essenciais, hidrocarbonetos, um princípio amargo chamado calendulina, pigmentos mucilagens, entre outros (HAMBURGER et al., 2003). Sobre o conteúdo químico das inflorescências da calêndula existem numerosas referências (PDR, 2000; BRUNETON, 2001; WHO, 2002; SIMÕES et al., 2003; MULEY et al., 2009). C. officinalis também tem uso homeopático, sendo usada para ulceração produzida pelo frio, queimaduras da pele e cicatrização de feridas. No entanto a eficácia de seu uso não tem sido comprovada (PDR, 2000). Aleixo (2002) apud PARENTE (2002) descreve várias formulações homeopáticas à base de C. officinalis e suas respectivas aplicações e Machado (2000) atribui à calêndula o uso homeopático para a cura de uma série de afecções, relatando que a melhora se dá pelo repouso. A Comissão E (BLUMENTHAL, 1998; PDR, 2000) indica o uso tópico externo das flores da calêndula para inflamação das mucosas bucofaríngeas e uso externo para feridas e queimaduras. Segundo PDR (2000) a calêndula tem sido usada extensivamente na medicina popular com uso externo para varicose, feridas de doenças vasculares, inflamações na pele, eczema anal, conjuntivites. É um constituinte no tratamento para pele seca, picada de abelhas e ulcerações provocadas pelo frio. Internamente para condições inflamatórias de órgãos internos, úlceras gastrointestinais, constipação, verminose e dismenorréia. É também usada como diurética e diaforética. No século XIX, foi usada como terapia para câncer, mas atualmente não é mais usada para este propósito. Preparações da parte aérea da planta, de acordo com PDR (2000), embora sem uso comprovado, são usadas para circulação, úlceras, espasmos, inchaço das glândulas, icterícia, 18 feridas e eczemas. A erva é usada na Rússia para dor-de-garganta, nas Ilhas Canárias para tosse e cãibras e na China para menstruação irregular. Segundo Who (2002) o uso medicinal da calêndula não é apoiado por dados clínicos e seu uso descrito em farmacopéias e em sistemas tradicionais de medicina é para tratamento externo de cortes superficiais, pequenas inflamações da pele e mucosa oral, feridas, incluindo as de difícil cicatrização como o ulcus cruris. Esta monografia (WHO, 2002) apresenta ainda usos pela medicina popular como: tratamento de amenorréia, angina, febre, gastrite, hipotensão, icterícia, reumatismo e vômitos. Para comprovar cientificamente a eficácia de C. officinalis sobre as diversas enfermidades utilizadas pela população em geral, cientistas vêem trabalhando para reafirmar suas evidências (ELDIN; DUNFORD, 2001; PREETHI et al., 2009). A planta apresenta, além de ornamental, medicinal e cosmética, outras propriedades: os capítulos são utilizados para condimentar sopas, ensopados, omeletes, queijos, carne assada e guisados, bem como para colorir manteiga, pudins e licores; tanto as folhas quanto os caules são utilizados como temperos; as flores são usadas como corante na indústria alimentícia e como sucedâneo do açafrão (LUZ et al., 2001; SILVA JUNIOR, 2006; OSAIDA et al. 2009); as flores podem ser utilizadas como inseticida natural (MARTINS et al., 1994). A calêndula também é utilizada no campo da cosmética e farmácias de manipulação em cremes hidratantes (produtos solares pré e pós- exposição) já que as saponinas, as gomas e as mucilagens têm grande capacidade umectante (NARDI et al., 1991), além de fazer parte na composição de preparações de medicamentos para eritemas solares, queimaduras e dermatoses secas (SIMÕES et al., 2003; ALONSO, 2008). Seu óleo essencial é usado para preparar perfumes de aroma silvestre, mesmo que seu odor não seja muito agradável (RIVERA et al., 1995 apud CENTENO, 2004). 1.3 Conclusão A cultura da calêndula tem grande importância, não somente para uso medicinal, ornamental e alimentício, mas como matéria–prima para indústria cosmética sendo usada na composição de xampus, cremes e sabonetes. Quanto às exigências ambientais, a calêndula é uma planta heliófita, que suporta geadas e estiagens; requer solos férteis, médio a argilosos, bem 19 drenados e rico em matéria orgânica para um adequado e excelente desenvolvimento da cultura. O plantio ocorre no final do inverno e o florescimento no final da primavera e verão. Referências ALONSO, J.R. Fitomedicina: curso para profissionais da área da saúde. Pharmabooks: São Paulo. 2008. 195p. ALTMANN, R.; MIOR, L.C.; Zoldan, P. 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(ASTERACEAE): UM ESTUDO DE CASO Resumo Apresenta-se caracterização do processo de produção agrícola orgânica de Calendula officinalis L. no Estado de Santa Catarina, evidenciando particularidades e discrepâncias frente aos modelos já descritos na literatura especializada, a partir de visitas ao campo, observação participante e entrevistas com um produtor de plantas medicinais. Identificaram-se como principais características a saúde na agricultura familiar, demonstrada pela prática da cultura orgânica, além do controle de pragas e manuseio da produção. Os principais problemas ou divergências evidenciados foram: características do solo; época de plantio da calêndula e suas etapas posteriores como transplante e floração. Aspectos da colheita foram discrepantes quanto ao período do dia indicado para o procedimento, bem como a ausência de informações do produtor quanto à existência de outros incentivos governamentais ao setor agrícola. Recomendam-se aos extensionistas rurais e/ou instituições competentes que busquem orientar os produtores orgânicos de calêndula para promover a adequação das práticas de cultivo desta espécie medicinal. Palavras-chave: Calêndula, planta medicinal, agricultura familiar, cultura orgânica. Abstract A characterization of the process of organic agriculture production of Calendula officinalis L. in the State of Santa Catarina is presented, evidencing particularities and discrepancies contrasting to the models already described in specialized literature, by field visits, participative observations and interviews with a medicinal plant producer. The main characteristics identified were the health in the agricultural family, demonstrated by the practice of organic culture, besides pest control and the handling of production. The main evidenced problems or divergences were: soil characteristics; period of the marigold planting and its following stages, such as transplanting and flowering. Aspects of the crop were conflicting as for the period of the day indicated for the procedure, as well as the absence of information from the producer about the existence of other government incentives to the agricultural section. It is recommended to the rural extensions and/or competent institutions to seek for guiding the organic producers of marigold to promote adequate practices for the cultivation of this medicinal species. Key-words: Marigold, medicinal plant, family agriculture, organic cultivation. 23 2.1 Introdução Calendula officinalis L. (Asteraceae) é popularmente conhecida por calêndula e malmequer, entre outros nomes (RODRIGUES, 2004; SILVA JUNIOR, 2006). É cultivada em todo o mundo, inclusive no Brasil, devido às suas propriedades medicinais e potencial ornamental (BERTONI, 2006). Suas flores são utilizadas em forma de chá, compressas ou extratos contra afecções dermatológicas, com ação antipruriginosa, antiinflamatória e cicatrizante; fazendo parte da composição de preparações de medicamentos para tratamento de eritremas solares, queimaduras e dermatoses secas (SIMÕES, 2003; PAGNANO et al., 2008). Outros usos estão relacionados à ação antiinflamatória e antiulcerogênica no tratamento de inflamações do trato digestivo superior (KÖRBES, 1995; MICHALAK, 1997; YOSHIKAWA et al., 2001; MULEY et al., 2009). O desafio das agroindústrias que utilizam a calêndula, assim como outras espécies medicinais, é obter produção organizada na quantidade e qualidade necessárias, com fornecimento regular. Via de regra, no segmento de plantas medicinais há falta de uma política pública de desenvolvimento tecnológico a partir de pesquisa participativa que valorize e resgate o conhecimento local e tradicional. Atualmente, as plantas medicinais têm chamado a atenção por parte dos pesquisadores; entretanto a parte agronômica ainda precisa obter maiores informações sobre seu cultivo, sendo que a busca dessas informações, úteis para a padronização de materiais a serem utilizados, se faz necessária diante da ausência de programas de melhoramento específicos para as plantas medicinais (VIEIRA et al., 2006). Conforme Altmann et al. (2008), a realização de pesquisa e extensão rural de forma participativa utilizando os princípios da etnociência (resgate do saber popular) com a participação de universidades e agricultores pode contribuir com subsídios para o desenvolvimento do setor produtivo de plantas medicinais. Nesta perspectiva, apresentam-se resultados de estudo de caso sobre o cultivo orgânico da calêndula realizado no município de Grão-Pará, Estado de Santa Catarina, evidenciando particularidades e discrepâncias frente aos modelos de cultivo já descritos na literatura especializada. Desta forma, espera-se contribuir para o melhor entendimento desta cultura no contexto local, evidenciando erros e omissões que podem estar comprometendo a maximização de rendimento, bem como a qualidade final do produto a ser comercializado. 24 2.2 Materiais e métodos O estudo de caso foi realizado com um produtor pioneiro no cultivo ecológico de plantas medicinais de uma propriedade particular localizada na zona rural do município de Grão-Pará (28º13’58,7” S e 49º 17’58,9” W, altitude 93 m-sede). Esta é uma das sete propriedades que praticam o cultivo orgânico de calêndula no estado de Santa Catarina, conforme Oltramari et al. (2002). Figura 2.1: Mapa de Santa Catarina, com destaque para o Município de Grão-Pará (28º13’58,7” S e 49º 17’58,9” W – sede). Fonte: Darolt (2009). O produtor de plantas medicinais, alvo deste estudo, recebeu o nome fictício de Sr. Cravo, contatado por deter conhecimento sobre o cultivo e produção da calêndula e ser um dos poucos fornecedores de plantas medicinais na região sul. A calêndula é utilizada para fins estéticos, laboratoriais, farmácias de manipulação e homeopatia, sendo somente suas flores comercializadas. A propriedade está inserida em uma região predominantemente produtora de fumo, circundada por remanescentes de Floresta Ombrófila Densa Submontana. O clima do município, segundo a classificação climática de Koeppen, é Cfa - mesotérmico úmido, com verão quente e sem estação seca definida. Apresenta temperatura média anual de 19,2ºC, e índice pluviométrico médio entre 1.300mm a 1.500mm/ano. As geadas são constantes no inverno e a cobertura vegetal original era de Floresta Ombrófila Densa (PREFEITURA MUNICIPAL DE GRÃO-PARÁ, 2007). A economia básica do Município está firmada principalmente na suinocultura e na agricultura, tendo como cultura básica o fumo, seguida pelo milho e feijão. Destaca-se, também, 25 pela fruticultura, piscicultura, apicultura, na pecuária com a criação de bovinos e produção de leite, além da avicultura com a criação de aves para o abate (PREFEITURA MUNICIPAL DE GRÃO-PARÁ, 2007). O levantamento de dados (agosto/2008 a junho/2010) incluiu visitas a campo, uso de técnicas de observação participante e entrevistas semi-estruturadas (ver apêndice 1), buscando-se caracterizar: a) histórico do início da produção; b) utilização pela família; c) sistema de plantio; d) cultivo, colheita, secagem e armazenamento;e) controle de pragas; f) produção e comercialização; g) da renda do produtor e h) incentivos governamentais referentes à Calendula officinalis. Os dados obtidos foram comparados com as informações disponíveis na literatura especializada, para detectar discrepâncias e/ou particularidades sobre a planta. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo humanos da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Para maior esclarecimento e confiabilidade do trabalho, o participante preencheu um termo de consentimento informado onde está descrito de forma simples e clara o objetivo da entrevista realizada. 2.3 Resultados e discussão 2.3.1 Histórico do início da produção de plantas medicinais No levantamento etnobiológico realizado, procurou-se antecipadamente obter informações sobre a origem do produtor que colaborou com o presente estudo e, principalmente, quanto às suas atividades desenvolvidas antes do início da produção com plantas medicinais. Inicialmente, o produtor rural informou que seus pais e avós já eram agricultores e, na época, a principal atividade estava voltada à plantação de mandioca, que foi desenvolvida até os seus 13 anos de idade, quando então foi dado início ao cultivo do fumo, produto que apresentava significativo valor rentável a sua família. A partir de 1987, quando deixou de trabalhar com o seu pai, o produtor passou a residir no município de Grão-Pará, Santa Catarina, na mesma comunidade e residência atual, a qual possui área aproximada de 22,4 hectares. Destaca-se, que inicialmente a referida propriedade era utilizada para o cultivo intensivo de fumo, atividade desenvolvida até meados de 1995 pela família do Sr. Cravo, quando constatou 26 que todos os seus integrantes estavam apresentando problemas de saúde relacionados à utilização de agrotóxicos em grande quantidade, necessária à preservação da cultura do fumo. Acrescentou que o abandono da cultura do fumo em sua propriedade se deu em razão dos malefícios provocados pelo seu manejo, principalmente pela utilização de agrotóxicos. Estes dados vão ao encontro das estatísticas apresentadas por Carvalho (2006), relatando que durante todo o período de cultivo do fumo são utilizadas diversas substâncias agrotóxicas como herbicidas, inseticidas, fungicidas, entre outras, com cerca de dezesseis diferentes tipos de aplicação de pesticidas realizadas durante três meses antes da transferência da semente para o campo. Adicionalmente, existem vários relatos sobre agravos e mesmo mortes relacionadas a envenenamento por pesticidas, uma vez que essas substâncias acarretam alta toxicidade ao produtor. Diante do diagnóstico de intoxicação, a recomendação médica foi no sentido de cessar o cultivo do fumo, que na época era a maior fonte de renda da família, sugerindo a plantação de ervas medicinais, uma vez que na região apenas uma pequena família do município de São Ludgero, trabalhava com o cultivo de plantas medicinais, de onde obteve as primeiras sementes de Calendula. officinalis, motivo incentivador para o início dessa cultura em sua propriedade. Os problemas de saúde apresentados pela família foram motivos cruciais para a adoção de novas alternativas de plantio, tais como o cultivo de ervas medicinais na modalidade orgânica, dentre elas a calêndula, conforme informações obtidas pelo agricultor, as quais indicaram uma possível qualidade de vida a partir do plantio nesta modalidade. Atualmente, do total da área produtiva, aproximadamente 03 hectares são reservados para o cultivo de plantas medicinais (13,3% da área total), dentre elas calêndula, camomila, funcho, alcachofra, maracujá, hortelã, melissa, cana-cidreira, entre outras. O restante da área é utilizado principalmente para plantação de milho, feijão, alho e laranja. Toda a plantação é cultivada pelo sistema orgânico. Sobre os conhecimentos das plantas medicinais, principalmente de C. officinalis, o produtor informou que possui formação escolar até a “quarta série primária”, porém sempre se interessou sobre o assunto, lendo livros específicos, participando de cursos promovidos pela Pastoral da Saúde e eventos relacionados, buscando também orientações junto à Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina (EPAGRI). Destacou o produtor que o aprendizado obtido foi bastante útil para a calêndula, quanto as suas indicações, quantidades utilizadas, modo de cultivo, entre outros. Com base no conhecimento adquirido, optou em dar início ao novo plantio, adotando a forma de cultivo orgânico para sua produção. Em 2007 obteve certificação de origem e manejo 27 orgânico junto à Associação de Agricultura Orgânica (AAO), que teve como principal destino, o comércio em estabelecimentos de produtos naturais e laboratório de fitoterápicos. A certificação de produtos orgânicos visa conquistar maior credibilidade dos consumidores e conferir maior transparência às práticas e aos princípios utilizados na produção orgânica. A certificação é outorgada por diferentes instituições no país, as quais possuem normas específicas para a concessão do seu selo de garantia. A certificação do produtor orgânico é um pré-requisito para o acesso ao crédito. Desde 1999, o Banco do Brasil instituiu um plano de financiamento para agricultura orgânica, valendo-se para isso de recursos do Programa Nacional de Fortalecimento da Agricultura Familiar (PRONAF) e do Programa de Geração de Emprego e Renda (PROGER) (SAMINÊZ, 2000). A cultura orgânica tem se destacado como uma das alternativas de renda para os pequenos agricultores, devido à crescente demanda mundial por alimentos mais saudáveis. Por sua vez, a menor dependência de insumos externos está associada à menor área cultivada pelos pequenos agricultores e também à maior facilidade de manejo dos sistemas produtivos com recursos da propriedade (fertilizantes orgânicos, produtos naturais para controle fitossanitário, controle biológico natural, tração animal, combustíveis não-fósseis, etc.) (CAMPANHOLA; VALARINI, 2001). Ressaltou o produtor que o cultivo orgânico de plantas medicinais exige dedicação e empenho do agricultor, pois se trata de uma prática lenta, sendo que “o agricultor tem que ser mais que um agricultor, tem que ser um observador”. Howard (2007) lembra que os estudos para procurar a solução de determinada agricultura, não deveria partir dos olhares de quem trabalha em laboratórios, mas sim das pessoas que possuem maior intimidade com o solo, um bom agricultor observador que passa a maior parte de suas vidas na agricultura, poderá ter grande importância para a ciência. 2.3.2 Utilização de Calendula officinalis L. pela família Questionado sobre a utilização da calêndula pela família, o agricultor mencionou que a planta tem sido pouco utilizada, sendo somente empregada em ferimentos expostos devido as suas propriedades “curativas e cicatrizantes”, auxiliando na prevenção de infecções. As inflorescências são maceradas e aplicadas no local do ferimento na forma de emplasto. 28 Merece destaque a utilização popular da calêndula, para a qual tem sido atribuída, popularmente, propriedades colerética, antiinflamatória, analgésica, antitumoral, bactericida, diurética, cicatrizante, sedativa e imunomoduladora (FRANCO, 1996; BROWN; DATTNER, 1998; RAMOS et al., 1998). Estudos científicos comprovam a propriedade antiinflamatória dessa espécie corroborando com a indicação popular (CORDOVA et al., 2002; HEROLD et al., 2003; UKIYA et al., 2006; MULEY et al., 2009). 2.3.3 Sistema de plantio de Calendula officinalis L. Questionado sobre o sistema de plantio, o agricultor fez uma analogia entre a prática da plantação de fumo, antes intensivamente exercida por ele, com a atual prática de cultivo orgânico de ervas medicinais, dando seu parecer aos pontos positivos do tipo de cultivo utilizado, relatando: [...] se o clima da estação não for o esperado, então as folhas do fumo amarelam e a qualidade decai, perdendo assim o valor econômico. Nas ervas medicinais não existe isso, faço a semeadura de forma aleatória, e quando chega a estação de florescência (das ervas onde suas flores são comercializadas) eu faço colheita todos os dias, se passar do dia, as flores caem com suas sementes, e na próxima estação, haverá mais indivíduos desta espécie plantada naturalmente. Conforme constatado, o produtor utiliza o sistema de replantio natural na horta, que indica a existência de um ambiente propício para o desenvolvimento das plantas medicinais, não exigindo o plantio em canteiros organizados, bastando a existência de um ambiente favorável. Segundo o Sr. Cravo “as plantas são ótimas para fazer o replantio natural”, principalmente a calêndula, pelas características mencionadas por ele e descritas acima. Conforme destacado pelo próprio agricultor, a prática por ele adotada e o modo como desenvolve as atividades relacionadas ao cultivo orgânico, tem proporcionado inúmeros benefícios, dentre eles a previsibilidade, associada à ausência de riscos relativos ao tempo exato da colheita, como exemplifica, o que leva a crer, devido às características descritas, na existência do “policultivo”. 29 Figura 2.2: Sistema de policultivo em área de produção de plantas medicinais (GRÃO-PARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba, out. 2008). A forma de cultivo adotada para as plantas medicinais pelo Sr. Cravo tem proporcionado a prática da agroecologia, voltada para o cultivo orgânico e assegurada por um controle biológico eficiente, o que pode ser verificado diante do resultado positivo da produção agrícola. Destaca-se, que o tipo de cultura adotado pelo produtor proporciona meios viáveis para desenvolver uma agricultura ambientalmente correta, produtiva e viável, valorizando assim o conhecimento empírico e local referente o cultivo e sua aplicabilidade para alcançar a sustentabilidade, sendo a agroecologia uma área voltada para a busca do conhecimento e metodologia necessários para o desenvolvimento de uma agricultura ambientalmente consistente, altamente produtiva e viável (GLIESSMAN, 2009). O mesmo autor complementa que a agroecologia abre a porta para o desenvolvimento de novos paradigmas da agricultura, pois valoriza o conhecimento local e empírico dos agricultores, a socialização desse conhecimento e sua aplicação ao objetivo comum da sustentabilidade. Merece destaque a utilização do modelo de “policultivo”, como um novo paradigma, cujos métodos têm sido abordados pela comunidade científica a partir de estudos referentes à população de pragas, relacionada com a diversidade de plantas, entendendo que o policultivo de espécies em agroecossistemas, objetiva a redução da população de pragas a partir do aumento da diversidade de insetos, o que tem proporcionado a redução do nível de ataque às plantas, comparado ao monocultivo tradicional (PAIVA, 2006). Diversas pesquisas realizadas apontam redução expressiva de pragas na agricultura com o policultivo. Conforme Veiga Silva (2009), se o cultivo em questão for conduzido de forma correta, a utilização desse método poderá trazer vários benefícios ao agricultor, tais como a redução considerável de insetos e maior produtividade por área plantada. 30 Trabalho similar realizado por Naiverth e Faria (2007) com agricultores familiares do município de Candói, Paraná, corrobora a tese de que as plantas medicinais precisam ser cultivadas de maneira orgânica, uma vez que poderão agregar em suas estruturas parte das substâncias tóxicas se utilizados produtos químicos. Os autores concluem que o plantio de ervas medicinais é certamente um meio viável de garantir renda aos agricultores da região e que esse tipo de plantação vem crescendo cada vez mais, ajudando nas atividades conservacionistas e o meio ambiente. Naiverth e Faria (2007) complementam que a forma de cultivo, bem como as maneiras de combater as pragas e as doenças devem ser feitos de forma ecológica. Um estudo experimental foi realizado como forma de policultivo tradicional composto por blocos de milho (Zea mays L.), feijão (Phaseolus vulgaris L.), abóbora (Cucurbita maxima Ducht.) e soja (Glycine max L.) e comparados com o sistema de monocultivo utilizando-se as mesmas plantas, tendo em ambos aplicado o sistema de cultura orgânica. Os blocos foram distribuidos ao acaso. Constatou-se que o policultivo prevaleceu positivamente em todos os parâmetros avaliados como uso eficiente da terra, retorno monetário e o retorno relativo à mão-deobra, sendo recomendado para agricultores que possuem pequena escala de produção (VEIGA SILVA, 2009). Pelo exposto, pode-se dizer que o sistema de policultivo se torna um meio eficaz para o controle de pragas na medida em que reduz a necessidade de utilização de insumos externos e, para plantas medicinais, pode ser excelente opção. Assim, o policultivo tende a melhorar a biodiversidade, o que se torna possível com o aumento da diversidade de plantas, já que quanto mais diversificadas as plantas, maior será a comunidade de inimigos naturais de pragas que a unidade de produção poderá sustentar, podendo, ainda, tornar as plantas menos visíveis, favorecendo o seu sistema de defesa (NICHOLLS, ALTIERI, 2007). 2.3.4 Cultivo, colheita, secagem e armazenamento de Calendula officinalis L. Explicando resumidamente as etapas de plantação da calêndula, o produtor informou que primeiramente é feita a semeadura, utilizando-se as sementes obtidas da colheita do ano anterior, destacando que “a calêndula não precisa ser plantada, o banco de sementes já está no solo. Não 31 colhidas todas as flores, elas caem e se semeam”. Destaca que a semeadura ocorre por volta de junho. Destacou ainda o produtor que a calêndula não é exigente quanto ao solo para o plantio. No entanto, Silva Junior (2006) menciona que a planta prefere solos férteis, médios, drenados, permeáveis e ricos em matéria orgânica. A germinação das sementes de C. officinalis ocorre em 20 dias (dentro dos diásporos) e 10 dias (fora dos diásporos), cujos índices de germinação dependem do tipo de diásporos, apresentando índice de 90% para diásporos alados e naviculares, 38% para os orbiculares alados e 5% para os orbiculares (VIEIRA et al., 2006). Segundo o agricultor, após as mudas crescerem e obterem aproximadamente 05 folhas cada uma, as mesmas são transplantadas, de forma direta para canteiros definitivos e são distribuídas no espaçamento de 60 cm entre linhas e 40 cm entre as plantas. Muito embora a literatura indique como época de plantio os meses de março a maio (SILVA JUNIOR, 2006; VAZ; JORGE, 2006), tal procedimento é realizado pelo produtor nos meses posteriores à semeadura, que ocorre em junho, considerando que as mudas são transplantadas aos 30 a 35 dias após a semeadura. Observou o agricultor que algumas mudas da calêndula nascem naturalmente fora do espaço destinado à plantação, levando-o a crer que estas possuem qualidade superior àquelas que sofrem o replantio. Conforme as etapas descritas pelo produtor, o florescimento da C. officinalis inicia em agosto estendendo-se até dezembro. Recomenda-se que a colheita tenha início entre dois a três meses após o plantio, prolongando-se por mais dois meses, devendo ser realizada periodicamente e preferencialmente no período vespertino, podendo produzir até 720 kg/ha (SILVA JÚNIOR, 2006; VIEIRA et al., 2006). Este procedimento tem sido observado pelo produtor, que realiza a colheita no início da florada, por no mínimo duas vezes na semana, enfatizando que o pico da colheita é um mês após o replantio, que é realizado em agosto sendo, portanto, a colheita realizada em setembro. Importante ressaltar a observação feita pelo agricultor quanto à colheita das ervas medicinais, no sentido de que “cada erva tem um turno diferente do outro, por exemplo: as ervas que se usam as folhas e/ou flores, colho pela manhã; as ervas que se utilizam as raízes e/ou caule, colhe-se à tarde”. Conforme orientações obtidas pelo agricultor junto à Pastoral da Saúde, a colheita da calêndula deve ser realizada no período matutino, diferentemente do que sugere a literatura, devido a quantidade de compostos (princípios ativos) presentes nas flores neste turno do dia. 32 Destacou o produtor que conforme é realizada a colheita das flores, outras vão nascendo no lugar, levando a crer que tal ação faz aumentar o número de flores por planta. Segundo o Sr. Cravo, após colhidas, todas as ervas sofrem o mesmo procedimento de secagem, sendo colocadas em bandejas dentro da estufa de alvenaria, com fluxo de ar contínuo, a temperatura controlada de aproximadamente 40ºC, mantida por meio de aquecimento a lenha, cujo tempo de permanência varia conforme a espécie. As flores de C. officinalis são mantidas na estufa por 06 a 07 dias. Tal procedimento ratifica os trabalhos científicos, cuja indicação para secagem é de 07 a 10 dias (LUZ et al., 2001). Figura 2.3: Parte externa da estufa de secagem de plantas medicinais construída pelo produtor (GRÃOPARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba – out. 2008). Figura 2.4: Parte interna da estufa de secagem de plantas medicinais construída pelo produtor (GRÃO-PARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba – out. 2008) Após desidratadas, o armazenamento é feito em embalagens de plástico, com capacidade aproximada de 2 a 4 kg, tendo o cuidado para não ultrapassar o tempo de estocagem, sob risco de perda do produto. 33 Figura 2.5: Armazenamento de plantas medicinais prontas para a comercialização (GRÃO-PARÁ/SC - Foto: Elder T. Borba – out. 2008). Outro fator que mereceu destaque pelo produtor foi o excesso de chuva, pois esta tem prejudicado a plantação da calêndula, impedindo seu crescimento e favorecendo aumento de doenças e proliferação de pragas. Acrescenta-se ainda, que o excesso de chuvas pode afetar drasticamente a produção de sementes, principalmente quanto à baixa qualidade (SILVA JUNIOR, 2006; OSAIDA, 2009). 2.3.5 Controle de pragas Com relação ao controle das pragas existentes na lavoura, o agricultor considera que se o ambiente for equilibrado “a biodiversidade dá conta de tudo”, ou seja, “quando” e “se aparecem”, sejam elas microscópicas ou não, se apresentam em quantidades tão insignificantes que não influenciam de forma negativa no plantio. Quando necessário, utiliza sulfato de cobre com cal (calda bordalesa) ou chá de camomila, que funciona como antifúngico e fortificante. Ele considera que a extinção das espécies se dá naturalmente em razão da existência dos predadores naturais, e ainda acrescentou: “Muitas vezes os pássaros entram na roça e ficam esgravatando, fazendo buraco, mas eles estão se alimentando e consequentemente livrando minha plantação de pragas, então podemos observar que eles ajudam mais do que estragam”. Dentre os animais que aparecem em sua propriedade destacou as aves, répteis, alguns anfíbios comuns na região como o sapo da família Bufonidae e pequenos mamíferos. No contexto abordado, importante informação do agricultor merece destaque ao afirmar que “as calêndulas em presença da camomila adoecem menos. Sabemos que a camomila funciona 34 como fungicida, protegendo as calêndulas contra fungos. [...] Havia um pé de calêndula e outro de camomila juntos, quando a camomila secou a calêndula adoeceu”. Fato similar comprova a ação da camomila em determinadas espécies de fungos que atacam as frutas pós-colheita. Em laboratório foi avaliado o efeito fungitóxicos de algumas plantas medicinais e aromáticas, entre elas a camomila, acreditando que poderia haver alguma ação contra os fungos Glomerella cingulata e Colletotrichum gloeosporioides, causadora da antracnose em goiaba Psidium guajava L.. Constatou-se que a camomila, preparada em decocto, deteve grande controle biológico no C. gloeosporioides, indicando sua aplicação como controle alternativo contra antracnose (ROZWALKA, 2008). Uma experiência com controle biológico foi realizada no Rio Grande do Sul em lavoura de arroz, onde o agricultor introduziu o marreco-de-pequim (Anas platyrhyncos) durante a fase vegetativa da plantação e no período pós-colheita como agente biológico no controle de pragas, substituindo assim os produtos químicos e optando pela adubação orgânica na agricultura. Dentre os benefícios apresentados relata a preservação do meio ambiente, por evitar o uso de herbicidas e outros defensivos químicos contra pragas na água; a redução do ataque de bicheira da raiz (larvas) em 30%, o controle da praga chamado popularmente de arroz-vermelho e o aumento de cerca de 80% da produção do arroz cultivado, além da quantidade significativa de esterco na utilização dos marrecos (PETTINE; RIBEIRO, 2005). Na verdade, o uso de substâncias tóxicas deve ser evitado, devendo ser utilizados para combater as pragas (dentre as mais comuns estão as vaquinhas, pulgões, formigas e ácaros), mecanismos naturais de defesa disponíveis no próprio local do cultivo, tais como a calda bordalesa, a calda sulfocálcica, a calda de pimenta e alho e o biofertilizante supermagro (NAIVERTH; FARIA, 2007). Assim sendo, o controle biológico apresenta-se como alternativa para o manejo de pragas em sistemas agrícolas sustentáveis, pois se constitui num processo natural de regulação do número de indivíduos da população da praga por ação dos inimigos naturais, ou agentes de controle biológico (MENEZES, 2006). Dentre as pragas que podem parasitar mais comumente a calêndula citam-se os pulgões (Aphis spiraecola, Uroleucon ambrosiae f. lizerianum) e tripes (SILVA JÚNIOR, 2006) e o controle biológico para essas espécies é uma alternativa segura quando se trata de uma planta medicinal. 35 2.3.6 Produção e comercialização da Calendula officinalis L. Conforme informado pelo produtor, o plantio da calêndula é feito conforme os pedidos vindos de compradores dos municípios catarinenses de Criciúma, Gravatal, São José, Florianópolis e região, sendo vendidas somente as flores para fins estéticos, laboratoriais, farmácias de manipulação e de homeopatia,. Quanto ao preço de C. officinalis para comercialização, informou que as flores da planta são vendidas pelo valor de R$ 20,00/kg, sendo sua produção anual de aproximadamente 10 kg. Destacou ainda que os preços são ajustados conforme os gastos com insumos (lenha, embalagens, energia elétrica, entre outros). Para o estado do Paraná, constatou-se que embora a calêndula alcance valores de comercialização em torno de R$ 4,00/kg, seu rendimento é baixo, pois 10kg de matéria verde produz apenas 1kg de matéria seca, após o beneficiamento de seus capítulos florais e pétalas (IPARDES, 2005). 2.3.7 Da renda do produtor De um modo geral, os produtos cultivados pela família do Sr. Cravo possuem destinação econômica como fonte alternativa de renda familiar ou complementar à renda principal, pois o sustento da família é garantido pelo plantio dos alimentos que consomem, fazendo com que os gastos com remédios e produtos alimentícios sejam mínimos. Destacou o agricultor que sua lavoura de plantas medicinais gera um ganho líquido anual no valor de R$ 5.000,00, aproximadamente, sendo que suas despesas com a produção são mínimas, já que não possui gastos com energia para a estufa (a lenha é retirada de sua propriedade), com sementes (que não precisam ser compradas) e nem mesmo com fertilizantes, diferentemente do cultivo do fumo, que muito embora seja mais lucrativo, envolve despesas maiores. Assim sendo, o cultivo de plantas medicinais se apresenta como um complemento de renda para o produtor, pois não depende única e exclusivamente da venda destes produtos para o sustento de sua família, o qual é garantido pela produção de gêneros alimentícios. 36 Ressaltou o produtor que, mesmo com uma renda tão baixa conseguiu educar os seus filhos, ressaltando “ser tão importante economizar quanto ganhar dinheiro”. Porém todos os seus filhos, assim como seus irmãos, abandonaram a lavoura em razão da escassa renda. 2.3.8 Incentivos governamentais Sobre o recebimento de incentivo governamental para o desenvolvimento agrícola, o produtor informou que atualmente não recebe auxílio algum, porém em dezembro de 2005 a família recebeu a quantia de R$ 2.100,00 do governo federal a título de “crédito de fundo perdido”. Complementou que apenas recebe orientações da EPAGRI incentivando o plantio natural (sem agrotóxicos). Salienta-se que atualmente o governo dispõe de instrumentos de apoio aos agricultores familiares, por meio do crédito rural cujo objetivo é possibilitar a introdução e uso de tecnologias modernizadas no setor agrícola, sendo o PRONAF a principal fonte de recursos financeiros, tais como linhas de ação para custeio, investimentos e infra-estrutura (TREVISAN, 2007). 2.4 Conclusão/Recomendação A abordagem aqui pretendida esteve voltada à realização de uma investigação etnobiológica com um produtor rural de plantas medicinais, com ênfase à calêndula. Pelo estudo realizado é possível aduzir que o contexto abordado apresenta a figura de um “ator social”, que, sendo a base de uma cultura de subsistência e preocupado com a qualidade de vida da família, principalmente quanto a saúde que se encontrara fragilizada em decorrência do cultivo de fumo, optou por dar início à produção orgânica em sua propriedade, com ênfase na produção de plantas medicinais. A curiosidade do agricultor o levou a obter conhecimentos específicos sobre as plantas medicinais, o que até então era desconhecido para ele, destacando-se a não utilização de fertilizantes químicos ou até mesmo de herbicidas em sua lavoura. 37 Calendula officinalis representa grande contribuição para a comunidade científica, tanto no desenvolvimento de novos compostos com ações farmacológicas, dado a sua propriedade antiinflamatória e analgésica já reconhecida, quanto na indústria cosmética. Verificou-se que a atividade rural desenvolvida na propriedade enfocada tem como fundamento a família, responsável por todas as etapas da produção agrícola, voltada ao plantio de mantimentos, coleta e beneficiamento primário de seus produtos, baseadas no trabalho familiar, sendo boa parte da produção destinada à comercialização, muito embora local, e por algumas vezes regional. Ressalta-se, ainda, que o policultivo adotado pelo produtor, além dos benefícios alusivos ao controle biológico, tem servido para garantir a participação em programas agrícolas, de compra de produtos locais, uma vez que, conforme ficou demonstrado, a produção de plantas medicinais como meio de renda ao pequeno agricultor ainda é relativamente baixa, já que conta com uma renda aproximada de 10 salários mínimos anuais. Na verdade, a situação enfrentada pelas famílias que dependem da agricultura familiar tem desestimulado o investimento pelos pequenos produtores na área, o que seria diferente se os incentivos e subsídios concedidos pelo governo fossem mais atrativos e concessivos, o que demandaria um aumento de interesse por parte dos agricultores. Em decorrência, haveria a expansão da cadeia produtiva com a valorização (ganho) em todas as etapas. Para suprir tal deficiência, cooperativas estão sendo organizadas pelos próprios agricultores a fim de escoar seus produtos e obter determinado lucro. De todo modo, a abordagem aqui pretendida esteve voltada à realização de uma investigação com um produtor rural de plantas medicinais, resgatando seu conhecimento e percepção sobre o cultivo deste grupo de vegetais, em especial à calêndula, frente aos dados já descritos na literatura. Pelas poucas discrepâncias evidenciadas com relação à produção de calêndula, aspectos que poderão ser ajustados para não comprometer a maximização de rendimento e qualidade final do produto, recomenda-se aos extensionistas rurais e/ou instituições competentes nas esferas municipal, estadual e federal, que busquem orientar os produtores orgânicos de calêndula para promover a adequação das práticas para seu cultivo. 38 Referências BERTONI, B.W. et al. Micropropagação de Calendula officinalis L. Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.8, n.2, p.48-54, 2006. 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(Asteraceae), dentre eles os flavonóides, que indicam a existência de propriedade terapêutica, principalmente analgésica e antiinflamatória, pretendeu-se avaliar comparativamente a propriedade analgésica do extrato metanólico de flores visitadas e protegidas de agressores externos (polinizadores/fitófagos), por meio do teste de formalina em camundongos, realizando ainda,a caracterização fitoquímica comparativa dos referidos extratos por meio de cromatografia de camada delgada (CCD) A investigação indicou que houve diferenciação com maior resposta analgésica (fase I e II) entre extratos de flores de plantas expostas aos agentes agressores do que as protegidas (somente fase II). Apesar da técnica da CCD não detectar diferenças fitoquímicas qualitativas entre os extratos, a presença dos agressores externos pode ter influenciado na produção de diferentes metabólitos secundários na planta exposta, resultando em uma resposta analgésica envolvendo possivelmente mecanismos que interferem com a dor neurogênica (fase I) e inflamatória (fase II). Palavras-chaves: calêndula, teste de formalina, mecanismos de ação analgésica. Abstract Starting from the understanding of the analgesic action mechanisms and verification in literature of the chemical compositions present in Calendula officinalis L., (Asteraceae), with flavonoids being one of them, which indicates the existence of therapeutic properties, mostly analgesic and anti-inflammatory, the study intended to evaluate the analgesic property of the methanolic extract from visited flowers protected from external aggressors (pollinators/phytophagous), through the formalin test in mice, and alsom accomplishing the comparative phytochemical characterization of the referred extracts through thin layer chromatography (TLC). The investigation indicated that there was differentiation, with greater analgesic answer (phase I and II) on extracts of flowers exposed to aggressive agents than the protected ones (only phase II). Spite the technique of TLC not detect qualitative phytochemical differences between the extracts, the external aggressors' presence might have influenced the production of secondary metabolites of the exposed plant, resulting on an analgesic answer involving possibly mechanisms that interferes with the neurogenic (phase I) and inflammatory pain (phase II). Key words: marigold, formalin test, analgesic action mechanisms. 42 3.1 Introdução As propriedades terapêuticas localizadas nas plantas medicinais são decorrentes, pode-se dizer, da presença de certos componentes como enzimas e organelas celulares, as quais são capazes de produzir, armazenar e transformar substâncias primárias em produtos não essenciais ao modo de vida; esse conjunto de reações são chamados de metabólitos secundários. Assim, o conjunto de substâncias produzidas a partir dos compostos essenciais, garante vantagens no ecossistema onde se encontra, possuindo vantagens para a perpetuação e sobrevivência da espécie em seu habitat (SIMÕES, 2007). Porém, deve-se esclarecer que a qualidade e a quantidade de princípios ativos produzidos pelas plantas podem ser alteradas durante o processo de cultivo pela influência de fatores externos, uma vez que as rotas metabólicas podem ser ativadas e/ou inativadas, levando à produção de diversos metabólitos secundários em cada situação (SODRÉ, 2007). Conforme este mesmo autor, o teor dos princípios ativos extraídos de plantas aromáticas e medicinais pode variar em função dos fatores ambientais como clima, época de coleta e estágio de crescimento da planta, podendo influenciar na composição química das mesmas. Assim sendo, dentre as plantas medicinais constantes na “Lista de Registro Simplificado de Fitoterápicos”, estabelecida pela Resolução-RE n.º 89, de 16 de março de 2004, da Diretoria Colegiada da ANVISA, está Calendula officinalis L. (BRASIL, 2004), objeto do presente estudo, cuja importância para o meio científico será adiante demonstrada. A literatura descreve a presença de grande variedade de metabólitos secundários em todas as estruturas de C. officinalis. Em sua composição química, destaca-se o óleo essencial, carotenóides, flavonóides, mucilagens, saponinas, resinas, entre outros (RODRIGUES, 2004; LORENZI; MATOS 2008; MULEY, 2009). Quanto aos óleos essenciais, também conhecidos como “essências”, tem-se que eles possuem volatilidade e consideráveis odores, podendo ser observados no interior de células ou no interior de glândulas altamente especializadas, constituídas de uma série de substâncias compostas e complexas, dependendo de suas funções orgânicas (SIMÕES et al., 2007). Destaca-se que a presença do aroma produzido pelos óleos voláteis pode estar envolvida na atração de polinizadores e, dentre os insetos, as abelhas e borboletas são frequentemente os mais atraídos por aromas de diversas flores (SIMÕES, 2007). Do mesmo modo, há ainda evidências de que algumas plantas produzem óleos voláteis tóxicos como proteção contra predadores e infestantes (ROZWALKA, 2008). 43 Ensaios realizados constatam a presença de vários tipos de óleos voláteis nos capítulos florais de C. officinalis, dentre os principais estão os grupos dos terpenóides, δ-cadineno e αcadinol (GAZIM, 2008; FONSECA, 2010). Os terpenos, conforme já mencionado, são constituintes de óleos essenciais formados por uma diversificada família, que se deve ao número de átomos de carbono em sua cadeia. Os monoterpenos e sesquiterpenos são os óleos voláteis mais comuns, apresentam respectivamente 10 (dez) e 15 (quinze) carbonos em sua cadeia. Diterpenos, triterpenos e tetraterpenos apresentam 20 (vinte), 30 (trinta) e 40 (quarenta) átomos de carbono respectivamente (SIMÕES et al., 2007). A maioria dos terpenos é volátil e, por terem tal característica, são muito utilizados na indústria farmacêutica como inaladores e enxágües bucal, assim como na aromaterapia. Os terpenos são muito utilizados como flavorizante (p.ex. óleo de limão) e na perfumaria (p.ex. óleo de rosa); além desses usos, os compostos terpênicos produzem importantes efeitos na permeabilidade cutânea, ajudando no transporte transdérmico de fármacos (MOREIRA, 2008) No grupo dos compostos químicos formados pelos triterpenos, estão presentes os metabólitos de grande importância biológica; tais substâncias possuem ações antitumorais, antioxidante, analgésica, antiestresse, entre outras (ROCHA, 2006). Além disso, estudos comprovam que os terpenóides constituem um vasto grupo de metabólitos secundários, com ação sobre o sistema nervoso central, apresentando atividades sedativa, ansiolítica e antinociceptivas (PASSOS et al., 2009). Os flavonóides são compostos naturais com diversas aplicabilidades e ampla distribuição no reino vegetal (SIMÕES et al., 2007). São amplamente distribuídos no reino vegetal e formam uma classe de compostos polifenólicos. Encontram-se principalmente em forma de glicosídeos representando nos vegetais os pigmentos amarelos, azuis, laranja, vermelhos das flores e também a cor amareladas das folhas no outono. As cores fornecidas pelos flavonóides beneficiam as angiospermas, fornecendo atrativos visuais para a polinização, atuando também como mecanismo de proteção contra insetos e fungos indesejáveis e microorganismos, além de fornecer proteção contra raios ultravioleta por suas propriedades antioxidantes (CECHINEL FILHO; YUNES; 1998). Os pigmentos presentes em C. officinalis, que variam do amarelo ao laranja, são compostos de licopeno, rubixantina, violaxantina entre outros. Materiais não desidratados da planta contêm 0,34 mg/kg de ácido salicílico, e suas raízes possuem inulina (DUKE, 1985 apud SILVA JUNIOR, 2006). Suas sementes desidratadas possuem proteína e óleo (SILVA JUNIOR, 44 2006). Podem ser encontrados em diferentes estruturas carbônicas, sendo a grande maioria constituída por 15 carbonos em seu núcleo fundamental (SIMÕES et al., 2007). Os flavonóides têm recebido destaque pela comunidade científica em razão das várias ações demonstradas em experimentos atuais, cujos efeitos apresentados são os seguintes: antiviral, antiulcerogênico, antineoplásico, antioxidante, antihepatotóxico, antihipertensivo, hipolipidêmico, antiinflamatório, antiplaquetário (MACHADO, 2008). Em C. officinalis, os flavonóides possuem alta importância biológica, devido a sua ação antitumoral, analgésica e anti-inflamatória (GAZIM, 2008; KOELZER, 2009). Diante da constatação das propriedades antiinflamatórias, as plantas medicinais estão sendo amplamente utilizadas com essa finalidade, principalmente as que compõem a família Asteraceae, geralmente utilizadas em forma de extrato (AL-SAGHIR, 2009). Vários compostos com ação antiinflamatória de C. officinalis já foram identificados (UKIYA et al., 1996). Diante do contexto que agentes agressores podem induzir a alteração de produção de compostos secundários das plantas e, pelo fato de C. officinalis ter em seus metabólitos secundários compostos antiinflamatórios e analgésicos, poderia se questionar qual a influencia dos agressores externos, como por exemplos os insetos herbívoros, na ação antiinflamatória e analgésica. No presente estudo, pretendeu-se avaliar, comparativamente, a propriedade analgésica do extrato metanólico das flores de C. officinalis visitadas e protegidas de insetos polinizadores e fitófagos, por meio do teste de formalina em camundongos, além de caracterizar o perfil fitoquímico dos respectivos extratos. 3.2 Materiais e métodos 3.2.1 Plantio de Calendula officinalis L. e obtenção das amostras O material utilizado para o experimento foi doado por um produtor rural cuja propriedade está localizada na zona rural do município de Grão-Pará (28013’58,7” S e 490 17’58,9” W), pelo fato da atividade lá desenvolvida estar voltada para a produção de plantas medicinais no sistema orgânico, sendo esta a principal fonte de renda da família. Da área agrícola de aproximadamente 22,4 hectares da propriedade do produtor, 03 hectares (13,39%) são reservados ao cultivo de plantas medicinais, e destes, 250 m2 (0,83%) foi 45 reservado ao plantio de C. officinalis, sendo nesse espaço montada uma construção retangular medindo em sua base 68 m2 e com 1,70 m de altura. Sua estrutura montada com bardelas de eucaliptos e bambus, foi fechada com tela de coloração verde-claro com aberturas de 20 mesh (0,841 mm), com a finalidade de deixar no interior as mesmas condições climáticas do seu exterior e impedir a entrada de insetos (Figura 3.1). As plantas cultivadas no interior da área protegida foram inspecionadas diariamente pelo proprietário, para evitar entrada de eventuais invasores. O plantio de calêndula, protegida pela tela e a não protegida, foi feito por mudas em canteiros cavados em cumes, alinhados e com espaçamento aproximado de 30 cm entre uma muda e outra. Figura 3.1: Detalhe da área de estudo utilizada para o cultivo de plantas medicinais protegidas e expostas a agentes agressores, na propriedade rural de Grão-Pará, SC (Foto: Elder T. Borba – out. 2008). O material botânico utilizado, correspondente aos capítulos florais de calêndula, foi coletado diariamente, durante o período de floração, ocorrido entre os meses de setembro a novembro, que correspondem à época de maior quantidade de flores por indivíduos. Após as coletas diárias, os capítulos florais eram encaminhados à desidratação, em estufa de alvenaria, construída pelo produtor, de aproximadamente 16 m2 e com aquecimento a lenha, consistindo de sistema com entrada e saída de ar. A temperatura em seu interior variou de 300C a 400C. Os capítulos florais foram colocados em bandejas com telas de policloreto de vinila (PVC) dentro da estufa, sem identificação pelo produtor da data de coleta de cada lote diário, e permanecendo na estufa até as pétalas periféricas alcançarem características quebradiças. O período de secagem foi de aproximadamente 07 dias. Foram utilizados, para este estudo, 03 kg de capítulos florais expostos ao contato de insetos e 03 kg de capítulos florais protegidos do contato de insetos, ambos desidratados. 46 3.2.2 Preparação do extrato metanólico de C. officinalis L. O material de C. officinalis desidratado em estufa foi moído e colocado em suspensão com solvente metanol PA, com quantidade suficiente para cobrir o material e deixado em repouso por 07 dias em local seco e protegido da luz. O solvente foi reposto, conforme a necessidade, durante esse período. Após esta etapa, com auxílio de funil e gaze, o extrato fluido foi filtrado e concentrado em Rota-vapor (Fisaton 802D), numa temperatura de 40ºC e 117 RPMs. Os extratos metanólicos (plantas protegidas e plantas visitadas por insetos) foram armazenados em frascos hermeticamente fechados, em local fresco e ao abrigo da luz. 3.2.3 Animais utilizados Foram utilizados camundongos machos da linhagem CF1, adquiridos da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde – RS (FEPPS), com idade entre 2 a 3 meses e com massa corporal entre 35-40 gramas. Os animais ficaram mantidos a uma temperatura controlada (23 +/- 2ºC), com água e comida “ad libitum”. As soluções foram administradas nos animais numa concentração de 0,01mL/g de peso corporal. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso Animal (CEUA) da UNESC sob o número: 029/2010. 3.2.4 Avaliação da resposta nociceptiva no teste de formalina em camundongos Grupos de camundongos machos da linhagem CF1, com idade entre 2 a 3 meses e com massa corporal entre 35-40 gramas, foram habituados individualmente numa caixa de acrílico (30 cm2) sem a parte superior e aclimatados pelo menos 30 minutos antes do início dos procedimentos. Todos os experimentos foram conduzidos a temperatura controlada de 23+/-2 ºC. Grupos de animais (n = 6) foram pré-tratados com extratos metanólicos de C. officinalis 50, 100, 200 e 400,00 mg/kg via oral (v.o.), como controle foi utilizado solução salina 0,9% (v.o.) e diclofenaco sódico 50,0 mg/kg intraperitonial (i.p.) e morfina 6mg/kg (i.p.). Trinta min. após este 47 procedimento foi injetada sub-cutâneamente na região intraplantar da pata posterior direita com uma seringa Hamilton 25µL de solução formalina 2,5%. Logo após a injeção, os animais foram colocados individualmente em caixas para observação. A administração subcutânea de formalina na pata de ratos gera comportamentos estereotipados, apresentando o animal duas fases diferentes de nocicepção, envolvendo estímulos distintos (SOARES et al., 2009). A medida de dor (nocicepção) foi quantificada pelo número de lambidas na pata tratada nos intervalos de 0-5 min. (fase I) e 15-30 min. (fase II) após a injeção de formalina. O primeiro período de observação é considerado fase de resposta neurogênica (estimulação direta dos neurônios nociceptivos com terminações na pele liberando neuropeptídeos que levam a dor) e o segundo período considerado como fase de resposta à dor inflamatória (lesão tecidual que desencadeia uma série de eventos em cascata, caracterizada pela liberação de mediadores inflamatórios (DUBUISSON; DENNIS, 1977; NASCIMENTO, 2008; MARCON, 2009). Todos os animais utilizados foram mortos com deslocamento cervical e auto-clavados, após descartados em aterro sanitário controlado por empresa terceirizada, contratada pela UNESC. 3.2.5 Análise estatística As análises estatísticas dos resultados dos testes de formalina foram realizadas pelo teste de variância ANOVA, seguido de post hoc Student-Newman-Keuls para comparação entre os grupos. A correlação entre o extrato de flores de calêndula expostas e protegidas de insetos polinizadores/fitófagos e os resultados dos testes farmacológicos foi testada por meio do cálculo de correlação de Pearson e da análise de regressão (P < 0,05). Os dados foram expressos como a média + erro padrão da média (E.P.M.). 48 3.2.6 Análise cromatográfica 3.2.6.1 Cromatografia em camada delgada A cromatografia em camada delgada é um método físico de separação, no qual os compostos a serem separados são distribuídos em duas fases (fixa e móvel). A fase fixa é constituída por sílica gel, de grande área superficial, denominada de fase estacionária. A fase móvel é onde o fluído elui através da fase estacionária. As soluções foram aplicadas em placas de camada delgada (sílica gel 60 – MERCK). Utilizou-se para a fase móvel solventes com polaridades crescentes (CECHINEL FILHO et al., 2000). Foram utilizados três solventes para este ensaio: clorofórmio, acetato de etila e metanol. Para a fração clorofórmio (CHCl3), utilizou-se para a fase móvel hexano/acetato de etila (Hex/AcOEt) nas proporções de 80:20; 70:30; 60:40 e 50:50. As placas foram expostas a reveladores, sendo eles: espectro de varredura com ondas de radiação Ultra Violeta (UV) curtas e longas (200nm e 400nm) e anisaldeído sulfúrico. Para a fração acetato de etila (AcOEt), utilizou-se para a fase móvel acetato de etila/metanol (CHCl3/MeOH) nas proporções 80:20; 90:10; 95:05. As placas foram expostas a reveladores, sendo eles: espectro de varredura com ondas de radiação Ultra Violeta (UV) curtas e longas (200nm e 400nm), anisaldeído sulfúrico e cloreto férrico (FeCl3). Para fração de metanol (MeOH), utilizou-se para a fase móvel clorofórmio/metanol (CHCl3/ MeOH) nas proporções 90:10 e 50:50. As placas foram expostas a reveladores, sendo eles: espectro de varredura com ondas de radiação Ultra Violeta (UV) curtas e longas (200nm e 400nm) e cloreto férrico (FeCl3). A avaliação fitoquímica dos extratos foi realizada no laboratório NIQ-FAR da Univali, coordenado pelo Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho. 49 3.3 Resultados 3.3.1 Teste de formalina Na fase I, não foi registrada diferença significativa na resposta analgésica com relação aos grupos que receberam diclofenaco sódico (controle positivo), quando comparados aos grupos de animais que receberam o controle negativo (salina) (Fig. 3.2). No entanto, o grupo de camundongos que recebeu morfina (controle positivo), apresentou diferença significativa ao comparar com grupo salina (controle negativo). A partir da utilização de tais controles em camundongos (n = 6), foi possível contrapor os resultados obtidos nos testes de formalina realizados com os resultados obtidos pela aplicação do mesmo teste em grupos de camundongos que receberam, por via oral, diferentes concentrações de extratos de flores de C. officinalis protegidas ou expostas à ação de insetos. Assim, ao comparar os quatro grupos de animais que receberam o pré-tratamento de extrato das flores expostas aos polinizadores/fitófagos com o grupo dos animais que recebeu salina (controle), foi constatado que os animais tratados com os extratos diluídos em diferentes concentrações (50, 100, 200 e 400,0 mg/kg) apresentaram estatisticamente resposta analgésica (P<0,05) de acordo com a quantidade de lambidas e/ou mordidas na pata direita traseira, verificadas na fase I (Figura 3.2), contadas entre 0-5 min. Figura 3.2: Resultado da Fase I do teste de formalina. Efeito causado pela administração, por via oral, do extrato metanólico de C. officinalis, diluído em diferentes concentrações, de plantas exposta ao ambiente e protegidas, em relação à 1ª fase da dor induzida pela injeção de formalina em grupos (n=6) de camundongos. * = Diferença significativa p< 0,05 e ** = Diferença significativa p< 0,01 em relação ao grupo controle salina. Na fase II (Fig. 3.3), observou-se que os mesmos grupos de animais apresentaram uma possível potencialização analgésica no teste realizado, demonstrando estatisticamente níveis de 50 significância (P<0,01), de acordo com a quantidade de lambidas e/ou mordidas na pata direita traseira, levando-se a crer num possível efeito analgésico nas duas fases da nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina. Figura 3.3: Resultado da Fase II do teste de formalina. Efeito causado pela administração, por via oral, do extrato metanólico de C. officinalis, diluído em diferentes concentrações, de plantas exposta ao ambiente e protegidas, em relação à 2ª fase da dor induzida pela injeção de formalina em grupos (n=6) de camundongos. * = Diferença significativa p< 0,05 e **= Diferença significativa p< 0,01 em relação ao grupo controle salina. # = Diferença significativa p< 0,05 entre grupos que receberam extrato de plantas protegidas em relação ao grupo expostas com a mesma concentração. Porém, importante ressaltar que os grupos dos animais que receberam o pré-tratamento com extratos das flores protegidas dos insetos polinizadores ou fitófagos e diluídas nas mesmas concentrações das flores expostas, não mostraram resposta analgésica, nas doses apresentadas na fase I, de acordo com a quantidade de lambidas e/ou mordidas na pata direita traseira (Figura 3.2). No entanto, na fase II (Figura 3.3), os mesmos grupos de animais que receberam o prétratamento com diluições de 50, 100 e 200 mg/kg, mostraram estatisticamente diferenças significativas, em comparação ao grupo salina, apresentando nível de significância (P<0,05) e para o grupo tratado com 400 mg/kg, o nível de significância foi de (P<0,01). Deste modo, há indícios de uma provável ação e eficácia do extrato na fase II do teste aplicado. 3.3.2 CCD e caracterização fitoquímica dos extratos das flores de C. officinalis L. A análise cromatográfica realizada com amostras de extratos de flores protegidas e expostas a insetos polinizadores e/ou fitófagos não apresentou diferenças significativas nas imagens apresentadas nos dois tipos de extratos. 51 A comparação entre os perfis obtidos entre as substâncias analisadas nos sistemas de eluentes testados pode ser observada nas Figuras 3.4, 3.5 e 3.6. Figura 3.4: Perfil cromatográfico dos extratos expostos e protegidos de insetos polinizadores e/ou fitófagos. Eluente: Hex/AcOEt (8:2); revelador: Anisal. Sulfúrico; solvente CHCl3. Figura 3.5: Perfil cromatográfico dos extratos expostos e protegidos de insetos polinizadores e/ou fitófagos. Eluente: CHCl3/MeOH (9:1); revelador: Anisal. Sulfúrico; solvente AcOEt. Figura 3.6: Perfil cromatográfico dos extratos expostos e protegidos de insetos polinizadores e/ou fitófagos. Eluente: CHCl3/MeOH (1:1); Revelador: UV longo; solvente MeOH. 52 Os resultados apresentados nos cromatogramas revelaram que esta metodologia mostrou-se eficiente para a revelação da possível presença das mesmas substâncias químicas nos dois tipos de extratos analisados, pois ambas apresentaram poucas diferenças visíveis com relação à ação ou não de polinizadores e/ou fitófagos quanto à presença de determinados compostos químicos. 3.4 Discussão O teste de formalina realizado, com relação à administração de diclofenaco sódico na Fase I, não apresentou resposta para o tratamento da dor neurogênica, corroborando estudos realizados que seu mecanismo de ação age somente na dor inflamatória (OLIVEIRA, 2009; PIRES, 2009; MORTON et al., 2007; TOUITOU, 2005). No entanto, analisando-se o resultado do grupo de camundongos que recebeu morfina (controle positivo), verificou-se alto poder de analgesia, quando comparados com o grupo salina (controle negativo). Destaca-se que na comunidade científica é comum o emprego de tais controles (salina, diclofenaco e morfina) na realização do teste de formalina, em experimentos semelhantes (ACOSTA-MADRID, 2009; MUNRO, 2009). Os resultados obtidos no teste de formalina a partir da aplicação oral de diferentes concentrações de extratos de flores de C. officinalis em grupos de camundongos indicam que houve diferença de resposta analgésica entre os grupos de animais que receberam tratamento com extratos obtidos de plantas expostas e protegidas de agentes agressores. Quanto aos grupos de animais que foram pré-tratados com extrato das flores expostas aos polinizadores e fitófagos, verificou-se que houve resposta para o tratamento da dor neurogênica (Fase I) e inflamatória (Fase II), com base nas ações comportamentais de indicação analgésica verificadas nos camundongos. Importante se faz destacar, o aumento nos níveis de significância analgésica nos extratos de C. officinalis exposto ao ambiente nas fases I e II. Ensaios vêm ratificando que tais reações têm sido comumente observadas em Asteraceae, sendo que plantas desta família, assim como C. officinalis, têm apresentado efeito sobre o sistema nervoso central (SNC) e resposta antinociceptiva em ambas as fases do teste da formalina, demonstrando efeitos analgésicos de grande valor farmacológico (SANTOS, 2010). 53 Em experimento no qual se pretendeu analisar o efeito analgésico do princípio ativo do óleo essencial de Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish, também pertencente às Asteraceae, por meio do teste da formalina foi induzida a nocicepção em camundongos. Constatou-se que o óleo essencial inibiu a primeira e a segunda fase da lambida da pata, considerando o primeiro período a fase de resposta neurogênica e o segundo período como fase de resposta à dor inflamatória (SOUSA, 2008). Quanto aos grupos de animais que foram pré-tratados com extrato das flores protegidas dos polinizadores e fitófagos, verificou-se que não houve resposta neurogênica em todas as concentrações utilizadas. Na Fase II ocorreu a potencialização analgésica, indicando possível resposta à dor inflamatória. Merece destaque o extrato com concentração de 400 mg/kg que teve o seu nível de significância maior que as demais concentrações (P<0,01), sugerindo nessa concentração de extrato, a existência de quantidade suficiente dos compostos químicos responsáveis pela ação analgésica com tal nível de significância. Observou-se que no teste realizado houve diferenciação dos resultados de resposta analgésica entre extratos de flores de plantas protegidas e das expostas aos agentes agressores, diante da constatação de diferentes níveis de significância apresentados em ambas as fases. Em experimento semelhante, pretendeu-se avaliar a atividade analgésica do extrato etanólico de Polygala paniculata L. Pelo método da dor induzida pela formalina, constatou-se que este extrato foi capaz de inibir a dor durante as duas fases do processo analgésico, agindo de modo dependente da concentração de extrato aplicada. Em tal procedimento foi constatado que durante o desenvolvimento da dor neurogênica (fase I), o maior percentual de atividade analgésica foi obtido a partir do extrato das plantas de campo (expostas ao ambiente) em comparação com os extratos obtidos das plantas in vitro (protegidas), aplicando-se para ambas a mesma concentração. Da mesma forma, durante o desenvolvimento da dor inflamatória (fase II), o extrato obtido a partir das plantas de campo reduziu a dor em maior percentual, comparada ao extrato obtido a partir das plantas in vitro (NOGUEIRA et al., 2005). Estes resultados podem estar diretamente relacionados ao aumento da quantidade dos componentes químicos da planta, responsáveis por tal significância, o que pode ser decorrente das atividades dos polinizadores e/ou fitófagos. A presença de agentes polinizadores, ou ainda, insetos fitófagos, colabora para que a planta produza determinados fitoquímicos, substâncias estas que poderão ser responsáveis pela ação contra doenças específicas (VALLADARES et al., 2002), mostrando que a mudanças da 54 composição química das plantas podem ser induzidas em resposta ao ataque de insetos fitófagos (DA ROLT, 2009). Vizzotto et al. (2008) analisaram a relação inseto/planta, a partir da identificação de metabólitos secundários e demais componentes químicos, em frutos expostos e protegidos de pessegueiro Prunus domestica L. e verificaram que tais resultados foram mais significativos nos frutos que mantiveram contato com insetos polinizadores e/ou fitófagos, pois nestes foram encontrados maior quantidade de metabólitos secundários. Sugere-se que a ação analgésica de C. officinalis exposta a agentes agressores decorre da presença de compostos flavônicos em suas estruturas florais, apresentando ação contra dor neurogênica e inflamatória (BRASIL, 2004; SIMÕES, 2007; MULEY, 2009). Estudos científicos afirmam o potencial analgésico de C. officinalis, em experimentos nos quais foram caracterizados os principais componentes químicos das flores da planta, dentre eles os flavonóides, identificados no extrato etanólico (PARENTE et al., 2009). Meotti (2006) corrobora em ensaio científico que os flavonóides são eficazes no tratamento da dor e regeneração tecidual devido ao seu papel na inibição de fosfolipases e ciclooxigenases, possuindo efeitos sobre o SNC, podendo atuar como agonistas de alguns receptores opióides. Trabalhos anteriores relatam a atividade analgésica do extrato etanólico das flores da C. officinalis sobre SNC, devido a presença de flavonóides em sua composição, sugerindo o efeito depressor central com a diminuição da movimentação espontânea (PARENTE et. al., 2009) Em estudo no qual foram avaliados os mecanismos de ação envolvidos na atividade antinociceptiva de Baccharis illinita DC. (Asteraceae), por meio de teste da formalina intraplantar, ficou comprovada sua eficácia na diminuição do efeito hiperalgésico induzido pela prostaglandina e bradicinina e na redução da alodinia e a hiperalgesia (FREITAS, 2009). De acordo com os resultados apresentados, deduz-se que o extrato de C. officinalis. exposta ao ambiente, teve algum tipo de ação nos receptores opióides na fase I deste experimento, sendo que tais receptores estão presentes no cérebro, tronco encefálico, medula espinal e também nas terminações nervosas periféricas aferentes primárias. Os grupos de camundongos que receberam tratamento do extrato de C. officinalis exposta ao meio ambiente, demonstraram resposta analgésica (fase I), apresentando reduzido número de mordidas/lambidas na pata que recebeu formalina em comparação ao grupo salina. Este comportamento pode estar relacionado com os compostos químicos da planta atuante nos receptores opióides do organismo dos animais. Tais grupos de camundongos, também analisados na fase da dor inflamatória (fase II), apresentaram números ainda menores com relação a 55 quantidade de mordidas/lambidas na pata que recebeu formalina em comparação ao grupo salina. Por este comportamento pode-se sugerir que os compostos químicos presentes nos extratos de flores da planta expostas ao ambiente agiram de forma semelhante ao mecanismo de ação dos antiinflamatório não esteróides (AINEs). Os grupos de camundongos que receberam tratamento do extrato de C. officinalis protegido dos agentes externos, estes apresentaram comportamentos diferentes quando relacionados ao grupo pré-tratado com o grupo controle negativo (salina). Estes grupos apresentaram resposta somente na dor inflamatória (fase II), devido ao número reduzido de mordidas/lambidas na pata que recebeu formalina. Diante da resposta apresentada, sugere-se que a ausência de agentes externos não estimulou a produção de metabólitos secundários responsáveis pelo efeito analgésico relacionado à dor inflamatória como observado com os extratos de C. officinalis exposta. Supõe-se que tal extrato atuou de forma semelhante ao mecanismo de ação dos AINEs. Os grupos de animais que receberam doses de extrato de C. officinalis protegida de agentes externos na fase I, não apresentaram diferenças significativas quando comparados ao grupo de animais que receberam doses de salina (controle negativo). Com base em trabalhos semelhantes produzidos, atinentes à relação inseto/planta (VALLADARES, 2002; VIZZOTO et al., 2008; DAROLT, 2009), pode-se propor que tal resultado foi provocado devido ao baixo teor de compostos químicos produzidos pelas plantas, já que estas permaneceram em local protegido de agentes agressores externos. Diante disso, sugere-se que os extratos obtidos das flores de C. officinalis exposta ao ambiente apresentou melhor perfil analgésico no teste de formalina, devido a influência dos agressores externos, como insetos polinizadores e fitófagos, sabendo-se que tais agentes podem influenciar na produção dos compostos fitoquímicos da planta, dentre eles os metabólitos secundários, compostos antiinflamatórios e analgésicos. Ficando demonstrada a presença de compostos químicos com propriedades terapêuticas, principalmente quanto a característica analgésicos em C. officinalis, dentre eles os flavonóides, pode-se afirmar que a sua utilização é potencialmente eficaz no tratamento da dor nociceptiva que resulta em inflamação devido ao mecanismo de ação daqueles componentes ficar comprovado na comunidade científica. Diante da diferença analgésica apresentada entre os extratos de flores de C. officinalis expostas ou protegidas, pretendeu-se por meio de CCD verificar as características (por meio de comparação) das substâncias presentes nos diferentes extratos. 56 Os resultados apresentados nos cromatogramas revelaram que esta metodologia mostrou-se eficiente para a demonstração da possível presença das mesmas substâncias químicas nos dois tipos de extratos analisados, pois ambas apresentaram poucas diferenças visíveis com relação à ação ou não de polinizadores no tocante a presença de determinados compostos químicos. Conforme pode ser verificado na literatura correlata, habitualmente a CCD tem sido utilizada com o objetivo de caracterizar preliminarmente os extratos de plantas pela determinação do perfil cromatográfico qualitativo, avaliando-se tão somente a existência de classes de compostos presentes nos extratos analisados para permitir uma posterior correlação com resultados obtidos em outros testes correlatos (RODRIGUES, 2009). Tendo em vista que no presente trabalho não foram identificadas e quantificadas, as substâncias presentes nos extratos de C. officinalis, não é possível afirmar quais os compostos responsáveis pela ação analgésica verificada nos testes realizados, sendo as conclusões aqui expostas meramente especulativas, sabendo-se somente que os referidos extratos apresentaram ação analgésica.. 3.5 Conclusão Neste estudo observou-se que houve diferenciação nos resultados com maior resposta analgésica (fase I e II) entre extratos de flores de calêndula expostas aos agentes agressores do que as protegidas (somente fase II), diante da constatação de diferentes níveis de significância apresentados em ambas as fases no teste de formalina. A presença dos agressores externos pode influenciar na produção dos compostos fitoquímicos da planta, dentre eles os metabólitos secundários, compostos antiinflamatórios e analgésicos. Os extratos obtidos das flores de C. officinalis exposta ao ambiente apresentaram melhor perfil analgésico no teste de formalina devido a influência dos agressores externos, como insetos polinizadores e/ou fitófagos; Ambos os extratos apresentaram o mesmo perfil cromatográfico. Apesar da técnica da CCD não ter apresentado diferenças fitoquímicas qualitativas entre os extratos, a presença dos agressores externos pode ter influenciado na diferenciação da produção de metabólitos 57 secundários da planta exposta, resultando em uma resposta analgésica envolvendo possivelmente mecanismos que interferem com a dor neurogênica (fase I) e inflamatória (fase II). Os grupos de camundongos que receberam tratamento do extrato de flores de C. officinalis exposto ao meio ambiente, demonstraram resposta analgésica na dor neurogênica e inflamatória, sugerindo sua atividade nos receptores opióides e atuação similar ao mecanismo de ação dos AINEs. Os grupos de camundongos que receberam tratamento do extrato de flores de C. officinalis protegido dos agentes externos apresentou deficiência na ação analgésica referente a dor neurogênica, não obtendo respostas significativas. No entanto, os mesmos grupos de animais apresentaram ação contra dor inflamatória no referido teste. Em razão da presença de compostos químicos com propriedades terapêuticas, pode-se afirmar que a utilização da calêndula é potencialmente eficaz no tratamento da dor resultante de inflamação, conforme já comprovado pela comunidade científica. No entanto, o presente estudo necessita de complementação no sentido de investigar sobre qual classe de compostos de C. officinalis é responsável pelos efeitos apresentados. Referências ACOSTA-MADRID I.I. et al. Interaction between Heliopsis longipes extract and diclofenacon the thermal hyperalgesia test. Phytomedicine, n.16, p.336-341, 2009. Disponível em: http://www.sciencedirect.com. Acesso em: jun.2010. 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No estudo de caso realizado no qual foi apresentado a figura de um produtor rural que desenvolve agricultura familiar, aplicando o sistema de cultivo orgânico de plantas medicinais, entre outros produtos, foi constatada a importância desse sistema de plantio para o agricultor, tendo como principais enfoques a agricultura orgânica de plantas medicinais (com destaque para a calêndula), em busca da saúde da família que se encontrara fragilizada em decorrência do cultivo do fumo e agricultura de subsistência familiar, apesar da sua pouca valorização e incentivo. Destaca-se, que se os incentivos e subsídios concedidos pelo governo fossem mais atrativos e concessivos, demandaria maior interesse por parte de agricultores pelo cultivo orgânico. Em decorrência, haveria a expansão da cadeia produtiva com a valorização em todas as etapas. Quanto à viabilidade da utilização de C. officinalis para fins terapêuticos, principalmente quanto a característica analgésica de seus compostos, os dados apresentados nos testes realizados indicaram diferenciação da resposta analgésica entre extratos de flores de plantas protegidas e expostas a insetos polinizadores e/ou fitofagos, diante da constatação de diferentes níveis de significância apresentados em ambas as fases (teste de formalina). No entanto, para constatar os possíveis diferentes aspectos fitoquímicos por meio da CCD, verificou-se que a técnica aplicada não foi eficaz para revelar diferenças quantitativas significativas dos compostos químicos da planta. De todo modo, destaca-se a importância dos agressores externos junto a C. officinalis para a produção de seus compostos químicos, sendo que seus princípios ativos podem ser alterados pela visitação ou não de polinizadores e/ou fitófagos, e consequentemente comprometer sua segurança de uso e eficácia terapêutica. 62 REFERÊNCIAS ALMEIDA, M.Z. Plantas Medicinais. 2 ed. Salvador: EDUFBA, 2003. 216p. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução-RE n.º 84, de 16 de março de 2004. Dispõe sobre o Registro de Nova Apresentação Comercial, Alteração de Local de Fabricação/de Fabricante, Alteração por Modificação de Excipiente, Retificação de Publicação de Registro, de produtos farmacêuticos, conforme na relação em anexo. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 17 mar. 2004. Seção 1, p. 84. Disponível em: < http://www.jusbrasil.com.br/diarios/navegue/2004/Março/ 17/ DOU >. Acesso em: 20 jul. 2009. ELDIN, S.; DUNFORD, A. 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Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15, n.4, p.361-372. 2005. 63 APÊNDICES 64 APÊNDICE A – Questionário Etnobotânico 1) Nome do entrevistado. 2) Localização e tamanho da área total de plantação. 3) Há quanto tempo mora nesta localidade? 4) Há quanto tempo o Sr. decidiu trabalhar com ervas medicinais? 5) Por que a proposta de trabalhar com ervas medicinais? 6) Como conheceu as propriedades das ervas medicinais? E a da calêndula? 7) De que forma obteve conhecimentos referentes as plantas e suas formas de cultivo? 8) Como obteve conhecimento das propriedades medicinais e formas de plantações das ervas? 9) Forma de cultivo (horta)? 10) O que levou a escolher a calêndula para plantio, entre as outras plantas medicinais? 11) Tamanho da área da plantação da calêndula? 12) Os canteiros da calêndula são feitos através de mudas ou sementes? 13) Qual a parte da calêndula utilizada pela família? 14) Referente as calêndulas, quando utilizam e de que forma? 15) Referente a fauna de forma geral, quais são os principais animais vistos naquela região? 16) Estes animais prejudicam de alguma forma a plantação? 17) Quais as formas de defesa utilizada pelo proprietário contra os animais terrestres e aves? 18) Existe problemas com pragas? Existe alguma específica para calêndula? 19) Se utiliza pesticidas, em que fase é utilizada? Adulta, jovem ou plântulas? 20) No período de floração das plantas, qual a espécie de inseto mais observado? E a calêndula? 21) A atividade é lucrativa? 22) O que é mais viável financeiramente, a plantação de fumo ou plantas medicinais? 23) Quanto representa no âmbito da família (financeiramente)? 24) O custo para preparação do solo, realizar a colheita, secagem e armazenagem, quanto corresponde com relação ao do lucro bruto? 25) Qual o valor real da calêndula a cada kg de planta desidratada vendida? 26) Como e para quem comercializa a calêndula? 27) Você recebe algum benefício financeiro do governo de incentivo à produção agricola?