Enzimas - Moodle
Propaganda
Enzimas Enzimas Diferenças em relação aos catalisadores químicos: 1.Maiores velocidades de reacção Com enzima P reacção Sem enzima tempo A P 2. Condições de reacção mais suaves 3. Maior especificidade 3. Capacidade de regulação História Anos: 1700 – estudos sobre a digestão da carne por secreções do estômago. 1800- Conversão do amido em açucar pela saliva e extractos de plantas (amilase) 1850 – Pasteur – a fermentação do açucar em álcool pelas leveduras era catalisada por “fermentos”, inseparáveis das células vivas – vitalismo. 1893 – Ostwald - enzima = catalisador 1894 - Fischer: -teoria chave-fechadura 1897 – Eduard Buchner – as moléculas do extracto de levedura responsáveis pela conversão de açucar a etanol, continuavam a funcionar quando removidas das células. É uma molécula !? 1877 Kühne: in zyme enzima 1926 - Sumner: - urease cristal É uma proteína ! 1905 Harden e Young: coenzima isolado(NAD+) 1909 Sorensen: escala de pH 1913 Michaelis e Menten: teoria cinética 1925 Briggs e Haldane: teoria cinética modificada 1931 Lineweaver e Burk determinação das constantes cinéticas. 1960 Hirs, Moore e Stein ribonuclease (estrutura primária) 1962 Phillips lisozima (estrutura terciária) 1970 Chang e Cohen clonagem do gene do β-lactamase de Staphylococcus aureus em E. Coli 1982 produção de mutante de tirosil-RNA sintetase por mutagénese dirigida Mas todos os enzimas são realmente proteínas? Cech 1968 “ribozimas”- RNA com actividade catalítica Wade 1997 “abzimas”- anticorpo monoclonal com actividade catalítica. Aplicações industriais de enzimas DISTRIBUIÇÃO DO MERCADO 14% 29% 32% 15% p.lácteos deterg. texteis amido outros 10% 1983-1995 (2x) -2005 (2x) Godfrey,T., West, S.(eds)Industrial Enzimology, Macmillan, London(1990) Indústria Função dos enzimas alimentos quebra do xarope de amido em xarope de glucose (osidases); isomerização de glucose em frutose, mais doce logo menor quantidade (isomerase); hidrólise da sacarose em glucose e frutose (hidrolases); fabrico de adoçantes artificiais; alimentos bébé início da digestão da comida (proteases e lipases) sumos de frutos impedir turvação (pectinase) detergentes biológicos anti-nódoas (proteases para as proteinas e lipases para as gorduras); amaciadores (celulases quebram os “borbotos” ) carne tornar mais tenra medicamentos cancro, produção de drogas sintéticas (penicilina) Enzimas em medicina enfarte miocárdio (diagnóstico) terapêutica Desenvolvimentos da última década Mais estruturas Mais sequências •Sobre-expressão •Mutagénese dirigida + Modificar e estudar propriedades Novos métodos de cálculo automático + desenho molecular Desenho de novos biocatalisadores enzimas artificiais Enzimas artificiais maior estabilidade térmica Ex: subtilisina com 8 aa substituidos vida média a 100o passa de 30s para 170min A maioria dos enzimas são proteínas! MM 12 000 – 1 000 000 Classificação internacional de enzimas Nº Classe Tipo de reacção 1 Oxidoreductases Transferência de electrões 2 Transferases Reacções de transferência de grupos 3 Hidrolases Reacções de hidrólise (transferência de grupos para a água) 4 Liases Adição de grupos a ligações duplas ou formação de ligações duplas por remoção de grupos 5 Isomerases Transferência de grupos dentro da molécula para dar origem a formas isoméricas 6 Ligases Formação de ligações C-C, C-S, C-O e C-N, por reacções de condensação acopladas à hidrólise de ATP Cada enzima tem um nome sistemático, um nº de classificação e um nome trivial Ex: O enzima que catalisa a reacção ATP + D-glucose → ADP + D-glucose6-P Nome sistemático : ATP glucose fosfotransferase Nº de classificação: E.C. 2.7.1.1. E.C. – Enzyme Commission 2- classe das transferases 7- subclasse fosfotransferase 1- fosfotransferase com um grupo hidroxilo como aceitador 1- D-glucose como aceitadora do grupo fosforilo Nome trivial : hexoquinase Há enzimas que precisam de outras moléculas ou iões para a sua actividade Cofactores – iões ou pequenas moléculas orgânicas (coenzimas) necessários à actividade enzimática. Os coenzimas podem estar transientemente ou permanentemente – grupo prostético -ligados aos enzimas . Enzima + cofactor → holoenzima Enzima sem cofactor → apoenzima Cofactores - iões inorgânicos Ião Enzima Cu 2+ Fe 2+ Fe 2+ K+ Mg 2+ Citocromo oxidase Mn 2+ Mo Ni 2+ Se Zn 2+ Arginase,ribonucleotido redutase Peroxidase, catalase, citocromo oxidase Piruvato cinase Hexocinase, 6-P-glucose fosfatase, piruvato cinase Dinitrogenase Urease Glutationo peroxidase Anidrase carbónico, alcool desidrogenase, carboxipeptidases A e B Coenzimas: moléculas orgânicas complexas ou organometálicas que transferem átomos específicos ou grupos funcionais coenzima Grupo transferido Precursor na dieta do mamífero Biocitina CO2 biotina Coenzima A Grupos acilo Ácido pantoténico Coenzima B12 H, grupos alquilo Vit B12 FAD Electrões Riboflavina (Vit B2) Lipoato Electrões, grupos acilo Não necess. na dieta NAD+ Ião hidreto (:H-) Ácido nicotínico Fosfato de piridoxal Grupos amina Piridoxina (Vit B6) Tetrahidrofolato Grupos de 1C Folato Pirofosfato de tiamina Aldeídos Tiamina (Vit B1) Os enzimas são altamente específicos: Estereoespecificidade – reconhecem substratos quirais Especificidade geométrica – são selectivos em relação aos grupos químicos dos substratos. Os enzimas variam no grau de especificidade geométrica Regulação da actividade enzimática Controlo da quantidade de enzima Controlo da actividade enzimática Funções termodinâmicas úteis para compreender o funcionamento dos enzimas • Variação de energia livre de Gibbs entre os produtos e os reagentes •Energia necessária para iniciar a conversão de reagentes em produtos A variação da energia livre padrão de uma reacção está relacionada com a constante de equilíbrio Relação entre K’eq e ∆G’o S ↔P K eq´= [P]/[S] ∆Go = -RT lnK´eq Como é que os enzimas funcionam? Os enzimas fornecem um ambiente em que a reacção ocorre mais rapidamente. A reacção tem lugar no local activo do enzima. A molécula que se liga ao local activo é chamada substrato. Forma-se um complexo enzima-substrato Os enzimas afectam as velocidades de reacção e não o equilibrio E + S ↔ES ↔ EP ↔E + P Os catalisadores aumentam a velocidade das reacções baixando a energia de activação A reacção chega mais depressa ao equilíbrio A velocidade de reacção é determinada pela concentração do(s) reagente(s) e pela constante de velocidade, k. v = k[S] A constante de velocidade de uma reacção está relacionada com a energia de activação: k = kT/h . e- ∆G*/RT k – constante de Boltzman h – constante de Planck Uma energia de activação mais baixa significa uma maior velocidade de reacção – para um reacção ser acelerada por um factor de 10, a energia de activação tem que baixar cerca de 5,7 kJ/mole 2 H2O2 2 H2O + O2 Catalisador Eactiv (Jmol-1) ----------------- ------------------------ Pt coloidal Catalase 75 600 49 140 8 400 Como é que os enzimas conseguem aumentar tanto as velocidades das reacções? Interacções covalentes entre enzimas e substratos baixam a energia de activação fornecendo uma via reaccional alternativa com energia mais baixa. Formação de um complexo específico enzima substrato em que são formadas muitas interacções fracas. A energia libertada aquando da formação destas ligações contribui para a especificidade e para a catálise. As ligações fracas são optimizadas no estado de transição. Os locais activos são complementares do estado de transição e não do substrato. Formação de um complexo enzima-substrato. As interacções fracas entre o enzima e o substrato são optimizadas no estado de transição Para baixar a energia de activação o sistema deve adquirir uma quantidade de energia equivalente à que diminui. Muita desta energia (∆GB )vem da formação de ligações fracas entre o enzima e o substrato no estado de transição. glucocinase PDB ID 2YHX “A catálise pode ser descrita formalmente em termos de estabilização do estado de transição através de ligação forte (tight binding) do reagente ao catalisador” Jencks 1975 Ligação do reagente (substrato) ao centro activo do enzima(quimotripsina) Aumentos de velocidade produzidos por enzimas: Ciclofilina Anidrase carbónico P-triose isomerase Carboxipeptidase A Fosfoglucomutase Succinil - coA transferase Urease Monofosfato de oritidina descarboxilase O tamanho dos enzimas reflecte a necessidade de a superestrutura ter os grupos reactivos posicionados de modo correcto e de manter o local activo formado. Os enzimas podem ser inibidos por moléculas específicas Inibição irreversível - os inibidores ligam-se covalentemente (ou não)ou destroiem um grupo funcional essencial para a actividade do enzima. A penicilina modifica por meio de ligações covalentes o enzima transpeptidase, impedindo a síntese das paredes bacterianas. A aspirina inibe o enzima que catalisa o 1º passo da síntese das prostaglandinas, compostos envolvidos nos processos de produção de dor. Inactivadores-suicidas Compostos pouco reactivos que se ligam ao enzima no local activo, sofrem os primeiros passos da reacção normal mas não se transformam em produto. Convertem-se num composto muito reactivo que se combina irreversivelmente com o enzima. Design de fármacos Especificidade – menos efeitos secundários Inibição reversível – Rápida dissociação do complexo enzima-inibidor. Inibição competitiva – um inibidor competitivo compete com o substrato para o local activo do enzima. O inibidor é semelhante ao substrato. Substrato Enzima Inibidor competitivo Enzima Ex. malonato (inibidor) e succinato (substrato da succinato desidrogenase) -OOCCH 2 - COO- malonato OOCCH2 CH2 COO- succinato Metotrexato – anticancerígeno Inibidor competitivo do dihidrofolato reductase Tratamento para a ingestão de metanol (solvente existente nos anticongelantes). Metanol ↔ formaldeído (provoca cegueira) desidrogenase alcoólica do fígado Etanol é inibidor competitivo do metanol e também é substrato para o enzima dando origem a acetaldeído. Outros tipos de inibição reversível: Inibição incompetitiva – o inibidor liga-se a um local diferente do local activo. Liga-se ao complexo ES Substrato Inibidor incompetitivo Enzima Inibição mista – o inibidor também se liga a um local diferente do local activo. Liga-se a E ou a ES Enzimas regulatórios Aumentam ou diminuem a sua actividade catalítica em resposta a sinais. Os enzimas alostéreos – funcionam através de ligações reversíveis de compostos regulatórios. Outros enzimas são regulados por ligações covalentes reversíveis. Regulação alostérea Forma activa Forma inactiva Substrato ligado ao local activo Inibidor ligado ao local alostéreo Alguns enzimas são regulados por modificações covalentes reversíveis Modificação covalente (resíduos alvo) Fosforilação ( Tyr, Ser, Thr, His) Inactivo Activo A actividade enzimática depende do pH Pepsina – estômago G-6-P - hepatócitos Perfil da actividade enzimática vs pH de dois enzimas Como estudar o mecanismo de acção dos enzimas? •Cinética enzimática •Estudos estruturais •Química de proteínas •Mutagénese dirigida Efeito da concentração de substrato na velocidade inicial de uma reacção enzimática O modelo de Michaelis - Menten A relação entre a concentração de substrato e a velocidade de reacção pode ser expressa quantitativamente Equação de Michaelis-Menten Vmax –velocidade máxima; KM – constante de Michaelis Dependência da velocidade inicial da concentração de substrato Quando [S] <<< KM , então v0 = Vmax [S] /KM A velocidade é directamente proporcional a [S] Quando [S] >>> KM , então v0 = Vmax A velocidade é independente de [S] Quando v0 = Vmax /2, então KM = [S] KM é a conc. de substrato para a qual v0 = Vmax /2 Transformações da equação de MichaelisMenten – a equação de Lineweaver-Burk (duplo recíproco) Gráfico de Lineweaver-Burk Os parâmetros cinéticos são usados para comparar actividades enzimáticas A equação de Michaelis descreve o comportamento cinético dos enzimas em que v0 tem uma dependência hiperbólica de [S]. Estes enzimas seguem uma cinética de Michaelis-Menten. Excepções enzimas regulatórios. Parâmetros cinéticos: KM Vmax Significado dos parâmetros cinéticos KM e Vmax KM – Concentração de substrato para a qual a velocidade é igual a metade da Vmax . [S] necessária para ocorrer uma catálise significativa. Consequência fisiológica do KM Fígado etanol ↔ acetaldeído desidrogenase alcoólica acetaldeído ↔ acetato desidrogenase do acetaldeído Desidrogenase do acetaldeído: Enzima mitocondrial – baixo KM Enzima citosólico – elevado KM Em pessoas susceptíveis ao etanol o enzima mitocondrial é menos activo. O KM é muitas usado como indicador da afinidade do enzima para o substrato. O KM está relacionado com as constantes de velocidade: Se k2 <<< k-1 Elevado KM baixa afinidade do enzima para o substrato Baixo KM elevada afinidade Vmax Vmax = kcat [Et ] Representa o nº de moléculas de substrato convertidas em produto por uma molécula de enzima, numa unidade de tempo, quando o enzima está completamente saturado com o substrato. kcat – Nº de turnover Exemplo: Foi descoberto um enzima que catalisa a reacção Triste ↔ Contente Uma equipa de investigadores altamente motivados resolve estudar o enzima que chamaram contentase e verificaram que o kcat para este enzima era 600 s-1 . Quando [Et ] = 20 nM e [Triste] = 40 µM, a velocidade da reacção V0 é 9,6 µM s-1 . Calcular o KM para o substrato “Triste”. R: 10 µM Inibição competitiva A competição pode ser desviada para favorecer o substrato simplesmente adicionando mais substrato. Quando [S] >>> [I] a probabilidade do inibidor se ligar é minimizada e a reacção tem a Vmax normal. No entanto [S] para o qual V0 =1/2 Vmax (KM ) aumenta. Vmax mantem o valor. KM - aumenta Representação de Lineweaver-Burk para inibidores competitivos Os investigadores a trabalhar na enzima contentase descobriram que o composto STRESS era um potente inibidor competitivo do enzima contentase. A adição de STRESS aumenta o valor de KM para o dobro. O que deverá ser feito para a reacção manter a sua velocidade máxima normal? Os outros tipos de inibição reversível com diferentes variações dos parâmetros cinéticos (inibição anticompetitiva e mista) são observados em geral em reacções enzimáticas com mais que dois substratos. Enzimas regulatórios Aumentam ou diminuem a sua actividade catalítica em resposta a sinais. Os enzimas alostéreos – funcionam através de ligações reversíveis de compostos regulatórios. Outros enzimas são regulados por ligações covalentes reversíveis. Os enzimas alostéreos não obedecem à cinética de Michaelis-Menten . Regulação da actividade enzimática Em muitas vias os passos de regulação são catalisados por enzimas alostéreos. Ex. Inibição por “feed-back” Os enzimas alostéreos apresentam uma cinética sigmoidal que reflecte interacções cooperativas entre as subunidades da proteína
