Uso da técnica de dicroísmo circular para avaliação de proteínas

Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais
Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
Memorando Técnico 03/2016
Uso da técnica de dicroísmo circular para
avaliação de proteínas com aplicações
biotecnológicas
Leticia Maria Zanphorlin Murakami
Roberto Ruller
2016
MEMORANDO TÉCNICO: USO DA TÉCNICA DE DICROÍSMO CIRCULAR
PARA AVALIAR ENZIMAS BIOTECNOLÓGICAS
Leticia M. Zanphorlin & Roberto Ruller
RESUMO
A funcionalidade das proteínas e enzimas decorre de suas estruturas
tridimensionais. Assim, a grande meta a ser alcançada no estudo de enzimas é
o conhecimento de suas estruturas à nível atômico-molecular, suas funções e,
consequentemente, as relações estrutura/função, as quais, à medida que se
tornam conhecidas, formam a base que possam orientar a modificação
deliberada para aperfeiçoar ou criar novas propriedades moleculares. No estado
atual do âmbito da Ciência das proteínas/enzimas, o estudo estrutural de uma
macromolécula que atenda aos critérios de pureza, segue as seguintes etapas:
estrutura primária, que pode ser determinada usando-se cada vez mais a
espectrometria de massas; estrutura secundária, obtida via espectrometria
dicróica (dicroísmo circular) e espectrometria de infravermelho com
transformação de Fourier (FTIR); estrutura terciária, obtida por cristalografia de
raios-X ou em solução, por ressonância magnética nuclear (RMN). As enzimas,
possuem em suas estruturas unidades opticamente ativas (ligações amídicas –
sonda de estrutura secundária) que podem ser caracterizadas na região do
ultravioleta distante (abaixo de 250 nm). Dessa forma, essas unidades interagem
com a luz circularmente polarizada provocando alteração na polarização da luz
incidente. Nesse sentido, a técnica de dicroísmo circular (CD) detecta essa
alteração, medindo a diferença da absorção da luz circularmente polarizada à
direita e à esquerda, permitindo avaliar o conteúdo de estrutura secundária de
uma determinada proteína. Como resultado final, obtemos informações cruciais
da estrutura secundária de uma proteína em solução. Além disso, uma vez
conhecida o perfil de estrutura secundária dessa macromolécula, é possível
acessar informações da termoestabilidade obtendo valores de Tm (temperatura
de transição) nas condições desejadas. Com isso, é fato que utilizando a técnica
de dicroísmo circular, somos capazes de investigar e prever quais as melhores
condições (pH, temperatura, tampão, sais, inibidores, ativadores e outros
componentes) que uma determinada proteína tem seu ótimo funcional. As
vantagens da utilização da técnica de CD envolvem baixo custo (em termos
operacionais e de quantidade de amostra) e a principal desvantagem é o fato de
ser necessário a enzima estar em solução e purificada em um alto grau de
pureza.
Palavras-chaves: proteínas, dicroismo circular,enzimas, estrtura e função,
biotecnologia industrial
2
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 4
2. OBJETIVO................................................................................................... 4
3. ASPECTOS EXPERIMENTAIS ................................................................... 4
3.1. Instrumentação ........................................................................................ 4
3.2. Metodologia da preparação das amostras para análise em CD e os
parâmetros de leitura ...................................................................................... 5
3.3. Concentração de proteínas recommendados para análise...................... 6
3.4. Unidade para medidas de CD .................................................................. 6
3.5. Predição de estrutura secundária ............................................................ 6
3.6. Experimentos de desenovelamento ou agregação de proteínas ............. 7
4. CONCLUSÃO .............................................................................................. 7
5. REFERÊNCIAS ........................................................................................... 8
3
1. INTRODUÇÃO
Dicroísmo Circular é uma técnica espectroscópica extensivamente usada
para estudar conformação e estabilidade de proteínas em diferentes condições,
como por exemplo, temperatura, força iônica, pH, presença de solutos e/ou
pequenas moléculas. CD é uma técnica não destrutiva, de fácil manuseio, requer
pequenas quantidades de amostra e as análises são relativamente rápidas. CD
mede a diferença de luz circularmente polarizada à esquerda e à direita por
cromóforos que possuem quiralidade intrínseca ou estão localizados em
condições quirais. Proteínas possuem um número de cromóforos que podem
originar em sinal de CD. Na região do UV-distante (240-180nm), que
corresponde à absorção da ligação peptídica, o espectro de CD pode ser
analisado para dar informações no que diz respeito as características de
estrutura secundária, como por exemplo, α-hélice, folha-β e randômica. O
espectro de CD na região do próximo (320-260nm) reflete o ambiente de
aminoácidos com cadeia lateral de aromáticos e então fornece informação sobre
a estrutura terciária da proteína. Portanto, é evidente que a técnica de CD é
bastante versátil em biologia estrutural, com extensa aplicação.
2. OBJETIVO
O objetivo desse memorando técnico é abordar os principais aspectos
experimentais para se obter resultados de Dicroísmo Circular com boa qualidade
experimental.
3. ASPECTOS EXPERIMENTAIS
3.1. Instrumentação
O dicroísmo circular ou CD (do inglês circular dichroism) é uma forma de
espectroscopia que utiliza a absorção diferenciada da luz polarizada no sentido
horário e ou anti-horário. Um fenômeno que é comumente utilizado nos estudos
da estrutura secundária de proteínas e destas em soluções e estudos de
interações com outras moléculas (RNA, DNA e peptídeos). A fonte de luz para a
instrumentação de CD é o xenônio, que gera bons resultados nos comprimentos
de onda de 178 à 1000 nm.
4
Durante a preparação da análise no espectropolarímetro (maquinário
destinado a análise de CD), é necessário um fluxo de N 2 para remover O2 e
prevenir a formação de ozônio, que pode causar danos para o sistema ótico,
além de permitir que medidas sejam feitas abaixo de 200 nm. Um fluxo de N 2
constante deve ser usado: geralmente 3L/min para medidas em 260 nm, 5L/min
entre 200 até 260 nm, 10L/min entre 180 e 200 nm e 50L/min em 180 nm. A
lâmpada deve ser ligada antes de cada experimento com no mínimo 30 minutos
de antecedência.
3.2. Metodologia da preparação das amostras para análise em CD e os
parâmetros de leitura
É importante que cada amostra esteja, pura, homogênea e na ausência
de partículas precipitadas (centrifuga-se ou filtra-se em 0.22 m). É essencial
minimizar a absorção de outros componentes (como tampão, solutos, solventes,
etc). Tampões fosfato, borato ou Tris em baixa molaridade (em torno de 20 mM)
possuem baixa absorção acima de 190 nm em cubetas de 0.1 nm de caminho
ótico. O indício de absorção da luz é dado pelo módulo de voltagem de dinodo
(em volts, V), que mede a resposta da fotomultiplicadora durante o experimento
e é um indicador da quantidade de fótons que não são absorvidos ou são
espalhados pela amostra. Uma alta absorção causa um aumento no ruído e
consequentemente aumenta os erros nas medidas de elipticidade. Em geral, um
limite aceitável é de 600V, mas as aquisições até 700 V são permitidas desde
que o número de acumulações seja alto o suficiente para reduzir o ruído gerado
pela absorção. Além disso, o uso de cubetas de quartzo com menores caminho
óticos diminui o número de fótons que a amostra é capaz de absorver. Outros
parâmetros são importantes para reduzir o ruído da medida. A largura da fenda,
que controla a banda espectral deve ter um valor limite que não seja capaz de
deformar e/ou destorcer o espectro. Além disso, o sinal do ruído é proporcional
a raiz quadrada do tempo de integração, então a forma mais simples de melhorar
a qualidade do espectro é aumentar o tempo de resposta. Para isso, a velocidade
de leitura multiplicada pelo tempo de resposta deve ser menos que 0.33 nm (isto
é, para uma velocidade de 200 nm/min, o tempo de resposta tem que ser no
mínimo de 0.1s e para uma velocidade de 50 nm/min, o tempo de resposta tem
5
que ser menos que 0.4s). Parâmetros sugeridos para medidas iniciais de
proteínas: “bandwidth”= 2 nm; tempo de resposta = 1s e velocidade de varredura
= 20 nm/min; o número de acumulações deve ser o necessário para que o valor
de HT não exceda 700 V.
3.3. A qualidade e concentração de proteína recomendada para análise
O espectro de CD de uma proteína depende tanto de sua conformação
como concentração da amostra pura analisada. Medidas precisas de
concentração é fundamental para a predição de estrutura secundária. Para isso
recomenda-se
uma
quantificação
proteica,
utilizando
metodologias
padronizadas de Bradford ou BCA, associados a uma análise de pureza em gel
de poliacrilalida SDSPAGE. Uma vez a amostra proteica, centrifugada, filtrada e
quantificada, inicia-se a análise por CD. Para cubetas com caminho ótico para
medidas entre 1 até 5 mm, pode-se usar concentrações de 0.2 até 1 mg/mL.
Dependendo do desenho da cubeta, o volume necessário pode ser de 50 µL até
2 mL. Por exemplo, para cubetas de 1 mm, 300 µL de amostra na concentração
de 200 µg/mL deve fornecer bons resultados.
3.4. Unidade para medidas de CD
Para proteínas, os resultados são expressos em elipticidade molar
residual, [θ]:
[θ]= (θ*100*M)/(C*l*n)
Onde θ é a elipticidade em graus, l é o caminho ótico em cm, C é a
concentração em mg/mL, M é a massa molecular e n é o número de resíduos de
aminoácidos da proteína. O resultado, portanto, é dado em graus.cm 2.dmol-1.
3.5. Predição de estrutura secundária
Obviamente, a técnica de CD não pode fornecer detalhes estruturais
como outras técnicas de alta resolução como é o caso de cristalografia de raiosX (X-TAL) e ressonância magnética nuclear (RMN); mas pode fornecer uma boa
estimativa da fração de resíduos na estrutura que estão envolvidos em α-hélice,
6
folha-β e/ou formação desordenada. Muitos métodos (CONTIN-CD, SELCON,
DICHROWEB, DICROPROT, K2D2) têm sido desenvolvidos para predizer
estrutura secundária de proteínas através do espectro de CD. Esses métodos
estabelecem metodologias de estatística que usam combinações do espectro de
CD da proteína alvo com proteínas que possuem estrutura terciária conhecida.
No entanto, é necessária atenção na interpretação dessas análises, pois o
espectro de CD de uma proteína não depende apenas da quantidade de
estrutura secundária, mas também da extensão da cadeia polipeptídica.
3.6. Experimentos de desenovelamento ou agregação de
proteínas
A técnica de CD é extensivamente usada para estudar a estabilidade de
uma proteína na presença de condições desnaturantes, como por exemplo,
temperatura, químicos (ureia e cloreto de guanidina) e extremos de pH
(usualmente ácidos). Conforme a temperatura ou a concentração desses
agentes aumentam, a estabilidade da proteína é afetada e, portanto, ocorre a
perda de estrutura (desenovelamento). CD é uma técnica conveniente para
avaliar a estabilidade uma vez que os espectros de uma proteína enovelada e
desenovelada são totalmente diferentes. A transição pode ser facilmente
determinada fixando o comprimento de onda onde a diferença de sinal para
enovelada
e
desenovelada
é
grande.
Por
exemplo,
proteínas
predominantemente α-hélice tem um sinal de CD característico em 222 nm e
quando se desenovela o sinal é muito baixo ou praticamente zero.
4. CONCLUSÃO
CD é uma técnica estrutural que tem um importante papel no estudo de
proteínas (conformação, função e estabilidade). Está técnica (desde que
respeitada o alto grau de pureza), pode ser utilizada para avaliação de proteínas
recombinantes (ou não), frente às condições variadas de temperature, presença
de alguns inibidores (que não interfiram na análise por dicroismo), variados pHs,
interações moleculares com substratos, entre outras; o quais são elementos
importantes para possíveis aplicações biotecnológicas. A principal vantagem no
uso dessa metodologia está relacionada à economia de amostra e velocidade
7
de aquisição dos dados. CD é provavelmente uma das técnicas mais importantes
para que se inicie uma investigação estrutural de uma amostra proteica pura.
Neste sentido, esse memorando técnico destacou uma série de aspectos
experimentais visando a aquisição de dados de boa qualidade auxiliando nas
avaliações relacionadas a estrutura de proteínas com aplicações biotecnológicas.
5. REFERÊNCIAS
Para mais informações consultar:

Sharon M. Kelly and Nicholas C. Price. The Use of Circular Dichroism in the
Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein and Peptide
Science, 2000, 1, 349-384.

Daniel H. A. Corrêa and Carlos H. I. Ramos. The use of circular dichroism
spectroscopy to study protein folding, form and function. African Journal of
Biochemistry Research Vol.3 (5), pp. 164-173.
8