Genética IV: Genética Bioquímica - mit

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Genética IV: Genética Bioquímica
§1. Genética Populacional
Este campo avançou em virtude das leis propostas por dois indivíduos: Hardy e Weinberg (1908)
Suponha que em uma população existam 2 alelos para um determinado gene, A e a.
Alelos:
A a
Freqüência: p q
há apenas dois alelos para o gene, então p + q = 1
A freqüência com que o alelo "A" estará no óvulo (em fêmeas) = p
A freqüência com que o alelo "a" estará no óvulo = q
AA = p2
Aa = 2pq AA : Aa : aa
Aa = q2
p2
2pq q2
Esta é a distribuição de equilíbrio – chamada de equilíbrio de Hardy-Weinberg
Se você conhece as Freqüências de Alelos, você pode calcular as freqüências de genótipo:
(p+q)2 = 1
p2 + 2pq + q2 = 1
No Equilíbrio Hardy-Weinberg:
AA = p2
Aa = 2pq
Aa = q2
Presumindo um equilíbrio, as freqüências de alelos (e assim, as freqüências genotípicas) não se alteram
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ao longo do tempo. As freqüências de alelos tendem a “manter-se constantes” nas populações.
Exemplo: fibrose cística (doença autossômica recessiva)
Freqüência de indivíduos em uma população com fibrose cística é 1/2000
Onde A = alelo normal ou de tipo selvagem e a = alelo de fibrose cística (doença)
q2 (indivíduos afetados) = 1/2000 então q =
= 1/44 portanto p = 43/44
Freqüência de Portadores: 2pq = 2(43/44)(1/44) ~ .044 = 1/22
Assim, cerca de 5% da população é portadora
Por que doenças como a fibrose cística (fc) ainda são prevalentes em certas populações?
Os heterozigotos que carregam o alelo mutante – podem ter uma certa vantagem, como maior
resistência a infecção por cólera, assim “um” alelo ainda se encontra na população.
§2. Genética Bioquímica
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Archibald Garrod uniu uma falha genética a uma falha enzimática.
A Genética Bioquímica usa a genética experimental para dissecar a bioquímica
Sistema Experimental:
Levedura: fungo unicelular, eucariota (possui núcleo)
Pegue uma suspensão de células de levedura e espalhe em um meio sólido de ágar em uma placa de
Petri que contenha nutrientes. Ao longo do tempo, essas unicélulas crescem no ágar em aglomerados
visíveis chamados colônias. Cada colônia representa uma pilha de células idênticas, cada uma um
descendente da unicélula colocada nessa posição.
Ciclo de Vida da Levedura
A levedura pode crescer como diplóide (2n) ou haplóide (n) n=16 cromossomos na levedura
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Requisitos de Crescimento
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A levedura pode crescer em um meio mínimo: meio líquido ou sólido que contenha: uma fonte de
carbono (um açúcar fermentável como glicose, frutose ou lactose), nitrogênio, fósforo, sais.
A levedura possui vias biossintéticas pelas quais pode criar todos os componentes biológicos
requeridos a partir dos nutrientes simples fornecidos em um meio mínimo.
A levedura também pode crescer em meio enriquecido: meio sólido ou líquido que contém
nutrientes complexos e macromoléculas. As células de levedura irão retirar os nutrientes do meio
em vez de sintetizá-los.
A levedura pode desabilitar suas vias sintéticas e usar o que estiver disponível no meio ao regular as
enzimas envolvidas nas vias.
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A levedura pode sintetizar aquilo que precisa
A levedura também pode obter nutrientes do meio
Para entender essas vias biossintéticas, precisamos caracterizar leveduras que não possuem certas
enzimas e assim não podem crescer sob certas condições. Por exemplo…
Como você isolaria os genes/proteínas envolvidos na síntese de aminoácidos (por ex., a síntese de
arginina)?
Você poderia encontrar leveduras que não podem sintetizar a arginina. Você iria em busca dos mutantes
(procura pelas leveduras mutantes que não podem crescer sem a adição de arginina ao meio de
crescimento)
Estratégia de Busca aos Mutantes
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comece com células de levedura de tipo selvagem
mutagenize essas células com produtos químicos ou radiação para danificar o DNA
coloque uma fina camada de células mutagenizadas em placa de ágar em meio enriquecido
transfira as colônias de levedura para uma placa com meio mínimo
procure por colônias que não podem crescer em meio mínimo – mutantes que possuam algum
tipo de defeito em uma via biossintética
a forma em que você projeta uma busca por mutantes irá determinar os mutantes que encontrará
Assim que você obtiver uma coleção de mutantes que não podem crescer em um meio mínimo sem um
suplemento, é preciso determinar qual componente (suplemento nutricional) os mutantes precisam para
crescimento em meio mínimo. Por exemplo, procure por uma cepa mutante que não possa sintetizar a
arginina:
Coloque uma fina camada de células em placa com meio enriquecido
transfira para meio mínimo + arginina
transfira para meio mínimo
Todas as células crescem em meio enriquecido. Todas as colônias crescem em meio mínimo, exceto as
que possuem deficiência em uma via biossintética. As que forem deficientes na via sintética de arginina
crescerão no meio mínimo com arginina. (Você também poderia fazer a seleção em meio enriquecido –
arginina. As colônias que não crescessem nesse meio seriam mutantes com relação à síntese de arginina)
Se testássemos o crescimento de levedura em meio enriquecido vs. meio mínimo, poderíamos obter uma
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variedade de mutantes chamados auxótrofos
Definições:
Prototrofos: cepa de tipo selvagem que pode crescer em meio mínimo
Auxótrofos: Cepa mutante que perdeu a capacidade de crescer em meio mínimo
Os mutantes isolados acima que não crescem em meio mínimo, mas em meio mínimo + arginina, são
chamados auxótrofos de arginina. Mas para analisar um grande número de células precisamos de uma
maneira melhor para avaliar o crescimento sob certas condições e fazer triagem de mutantes.
Uma técnica chamada réplica de placas foi desenvolvida por Esther Lederberg (usando seu
aplicador de pó compacto facial)
A Réplica de Placas é a transferência de todas as colônias na mesma ordem entre duas placas
pressionando as placas levemente sobre um pedaço de veludo. Você pode fazer esse tipo de triagem
para isolar mutantes com perda de função.
Dois tipos de Ensaios para procurar colônias que possuem uma propriedade ou função desejada
1. Triagem Genética: Procure por todas as colônias que crescem e então procure as que não
cresceram em determinado meio. A triagem por mutantes que “ perderam uma função” – sua
capacidade de crescer sob certas condições.
2. Seleção Genética: Procure por colônias que possam crescer em determinado meio. Selecione
os mutantes que “ganharam uma função“ ”a capacidade de crescer sob certas condições
(condições que normalmente não permitiriam o crescimento, como resistência às drogas)
Para estudar os mutantes que são incapazes de crescer em arginina – é preciso fazer uma coleção de
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auxótrofos de arginina –mutantes que precisam apenas de arginina para crescer em meio mínimo.
Para obter esses mutantes – é preciso usar células de levedura haplóides –possuem apenas 1 cópia (n)
de cada gene. Não é possível usar levedura diplóide (2n) pois uma mutação em 1 dos 2 genes não é
suficiente para a auxotrofia. Isto ocorre pois o nível de enzimas produzido por 1 cópia do gene (metade
dos níveis normais) é suficinte para a função normal
Observe a levedura haplóide vs. diplóide:
Haplóide: 1 mutação no gene da arginina leva a auxotrofia de arginina
Diplóide: 1 mutação no gene da arginina não leva a auxotrofia de arginina porque o outro gene é de tipo
selvagem
Para que fossem auxotróficos de arginina, ambas as cópias do gene da arginina precisariam ser
mutantes; é raro encontrar leveduras diplóides que possuam duas mutações no mesmo gene
§3. Caracterização de Mutantes
Colete diversas cepas mutantes de levedura auxotróficas em arginina – chame-as de Arg1, Arg2, Arg3
etc.
Então, pergunte-se se esses indivíduos são mutantes no mesmo gene ou em genes diferentes?
Para fazer isto, primeiro teste se as mutações estão causando um fenótipo recessivo.
1. Teste de Recessividade :
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a perda de função enzimática é normalmente recessiva ao fenótipo de tipo selvagem
normalmente, 50% do produto de um gene é suficiente para se exibir um fenótipo de tipo
selvagem para uma falha enzimática – é comum que apenas 1 cópia de tipo selvagem do gene seja
suficiente para exibição do fenótipo de tipo selvagem.
Cruze duas cepas haplóides: Arg1 com tipo selvagem para gerar uma célula diplóide. Se o fenótipo da
célula diplóide resultante for do tipo selvagem, então o fenótipo associado com o mutante Arg1 é
recessivo em relação ao tipo selvagem.
2. Teste de Complementação
Faça um teste de complementação para determinar se duas mutações diferentes estão no no
mesmo gene ou em genes diferentes. Cruze dois mutantes haplóides para gerar uma célula
diplóide e analisar o fenótipo de diplóide.
a) Se as mutações estiverem no mesmo gene (i. e., o gene defeituoso no mutante Arg1 é o mesmo
no mutante Arg2), então o diplóide resultante não poderá crescer em meio mínimo. Como ambos
os mutantes carregam mutações no mesmo gene, o diplóide não possui uma enzima funcional – o
diplóide não pode crescer sem a adição de Arginina ao meio.
**Quando Arg1 e Arg2carregam mutações no mesmo gene e o diplóide resultante exibe um
fenótipo mutante, então os mutantes Arg1 e Arg2 não se complementam. Diz-se que estão no
mesmo grupo de complementação.
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b) Se as mutações estiverem em genes diferentes (i. e., o gene defeituoso no mutante Arg1 é
diferente do gene defeituso no mutante Arg2), então o diplóide resultante crescerá em meio
mínimo. Cada mutante possui uma mutação em um gene diferente, assim o diplóide possui todas
as enzimas funcionais e pode crescer em meio mínimo.
**Quando Arg1 e Arg2 carregam mutações em genes diferentes e o diplóide resultante exibe um
fenótipo de tipo selvagem, então os mutantes Arg1 e Arg2 se complementam. Diz-se que estão em
grupos de complementação diferentes.
Em geral, as mutações em genes diferentes complementam-se, restaurando a protrofia no diplóide (cada
mutante resgata o defieto do outro).
Pode-se fazer um teste de complementação entre haplóides diferentes e criar uma tabela:
Tipo selvagem Arg1 Arg2 Arg3 Arg4
Tipo selvagem
+
+
+
+
+
Arg1
+
-
-
+
+
Arg2
+
-
-
+
+
Arg3
+
+
+
-
-
Arg4
+
+
+
-
-
“+” significa complementação, o diplóide possui o fenótipo de tipo selvagem
“-” significa sem complementação, o diplóide possui o fenótipo mutante
*Observe que Todos os mutantes são recessivos em relação ao tipo selvagem
Os mutantes 1 e 2 não se complementam: assim, estão no mesmo grupo de complementação e presumese que sua mutação esteja no mesmo gene
Os mutantes 3 e 4 não se complementam: assim, estão em grupos de complementação diferentes e
presume-se que sua mutação esteja no mesmo gene.
Os mutantes 1 e 4 complementam-se: assim, presume-se que sua mutação esteja em genes diferentes.
A tabela cima sugere a existência de dois grupos de complementação ou, provavelmente, dois genes
envolvidos na síntese da arginina.
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