Palavras-chave: Streptococcus pneumoniae, mutantes, PspA
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OBTENÇÃO DE LINHAGENS DE Streptococcus pneumoniae MUTANTES PARA OS GENES ply E pspA E CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE INDUZIDA EM CAMUNDONGOS Pedro Almeida Gonçalves Profa. Dra. Michelle Darrieux Sampaio Bertoncini Universidade São Francisco [email protected] Introdução: Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno humano, responsável por milhares de mortes anuais no mundo. Duas proteínas imunogênicas, a proteína de superfície de pneumococo A (PspA) e a pneumolisina (Ply), são essenciais para a patogênese desta bactéria. A fusão de fragmentos de PspA com uma forma detoxificada da pneumolisina (PLD1) foi protetora contra desafio sistêmico, porém a contribuição individual de cada antígeno na proteção não foi investigada. A geração de bactérias mutantes permite avaliar a contribuição desses fatores de virulência em várias fases da doença em modelos animais. O objetivo do estudo é produzir linhagens mutantes de S. pneumoniae negativas para os genes pspA e ply, e caracterizar a resposta imune induzida em camundongos. Método: A cepa D39 foi cultivada e estocada. Os mutantes foram obtidos com auxílio do sistema TargeTron® Gene Knockout System (Sigma). Os primers foram desenhados utilizando o algoritmo Targetron e utilizados na amplificação do íntron por PCR, seguida pela ligação ao vetor pACD4K-C. Pneumococos quimio-competentes foram co-transformados com o vetor pAC modificado, juntamente com o vetor pAR, que contém a sequencia codificante da enzima RNA polimerase T7. A expressão do complexo RNP foi ativada por IPTG, e as bactérias mutantes foram selecionadas por plaqueamento em meio contendo canamicina. Resultados: Na obtenção de mutantes negativos para o gene ply, o sítio-alvo escolhido foi o 297/298s por sua maior pontuação na classificação (score 10.95/ e-value 0.009). A presença de colônias bacterianas resistentes à canamicina sugere que a mutação do gene ply foi bem sucedida. Considerações Finais: A confirmação da mutação será feita por PCR a partir do DNA cromossomal dos pneumococos resistentes à canamicina. Novos primers serão desenhados para obtenção de mutantes para o gene pspA. Confirmadas as mutações, estas linhagens serão utilizadas na avaliação da resposta imune conferida por vacinas híbridas, PspAPlD1. Palavras-chave: Streptococcus pneumoniae, mutantes, PspA, Pneumolisina Apoio financeiro:
