Desenvolvimento de bibliotecas de “shotgun” do mtDNA

51º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 51º Congresso Brasileiro de Genética • 7 a 10 de setembro de 2005
Hotel Monte Real • Águas de Lindóia • São Paulo • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 85-89109-05-4
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Palavras-chave: genômica mitocondrial, long-PCR, shotgun, Calliphoridae
Junqueira, ACM1; Russo, CAM2 e Azeredo-Espin, AML1
1
Lab. Genética Animal, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), Departamento de Genética e Evolução,
Instituto de Biologia, UNICAMP, Campinas, SP; 2 Lab. Biodiversidade Molecular, Instituto de Biologia, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ.
Desenvolvimento de bibliotecas
de “shotgun” do mtDNA: perspectivas
para a genômica mitocondrial
em Calliphoridae (Diptera)
As espécies da família Calliphoridae (Diptera: Brachycera) são conhecidas como moscas varejeiras e podem
ser consideradas como uma das famílias de insetos mais comuns do mundo, representando espécies-praga e
de importância sanitária e forense que se reproduzem e se alimentam em lixo urbano, fezes e matéria orgânica
em decomposição. A família Calliphoridae é formada por mais de 1000 espécies, possuindo 800 sequências
depositadas no GenBank. Destas, cerca de 250 pertencem aos genes cox1 e cox2 do DNA mitocondrial
(mtDNA), sendo os genes mais representados. Além disso, dois genomas mitocondriais completos estão
disponíveis, incluindo as espécies Cochliomyia hominivorax e Chrysomya chloropyga. O mtDNA animal é
uma molécula circular dupla-fita com herança materna, geralmente contendo 37 genes para codificação
de proteínas, rRNAs tRNAs. A maior porção não codificadora é a região controladora da transcrição e
da replicação. Este genoma é extremamente utilizado como marcador molecular em estudos evolutivos,
filogenéticos e populacionais. Por esta razão, o sequenciamento de mtDNAs foi impulsionado nos últimos
anos possibilitando o surgimento da genômica mitocondrial. Neste sentido, três bibliotecas de mtDNA das
espécies de califorídeos Calliphora vomitoria, Chloroprocta idioidea e Phormia regina estão sendo desenvolvidas
com técnicas otimizadas para facilitar o sequenciamento completo do mtDNA, podendo ser estendidas
a outras espécies de invertebrados. O primeiro passo para a construção das bibliotecas é a amplificação
do mtDNA completo através de “long-PCR”, obtendo-se dois fragmentos de 8 e 9kb, com sobreposição
de ~2kb. Os parâmetros da reação foram otimizados para a obtenção dos dois amplicons nas mesmas
condições de temperatura e concentração de reagentes. As três espécies tiveram seu mtDNA amplificado
com os mesmos pares de oligonucleotídeos, empregando-se uma combinação de “primers” universais já
descritos para insetos e “primers” desenhados em regiões conservadas. Esta abordagem facilita a obtenção
de quantidade suficiente de DNA para o sequenciamento através do “shotgun” dos amplicons. A seguir,
os produtos foram aleatoriamente quebrados por sonicação e os fragmentos entre 1 e 2kb foram purificados
para dar início à biblioteca de “shotgun”. Para a condução desta biblioteca utilizou-se o vetor pMOSBlue
para fragmentos com extremidades abruptas. A seleção dos clones recombinantes mostrou 70% de eficiência
na clonagem, com clones positivos que continham os fragmentos com o tamanho de interesse. Estes clones
foram purificados e o sequenciamento automático da biblioteca está sendo conduzido para a montagem e
anotação. O sequenciameto de novos genomas mitocondriais, associados aos já depositados em bancos de
dados, resultará em um estudo comparativo, permitindo a análise dos padrões de organização e evolução
do mtDNA desta família, além de contribuir para o esclarecimento de relações taxonômicas deste grupo
utilizando diversos genes mitocondriais. Além disso, as análises comparativas contribuirão para a avaliação
do potencial de genes como marcadores moleculares para estudos filogenéticos em Diptera.
Apoio Financeiro: Fapesp, CNPq.
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