Miopatias mitocondriais

MIOPATIAS MITOCONDRIAIS
Carolina Fischinger Moura de Souza
[email protected]
A MITOCÔNDRIA
Glicose
 Responsável pela energia celular
 Possui seu próprio DNA
mtDNA
 Local de várias rotas metabólicas
A MITOCONDRIA
Glicose
 Responsável pela energia celular
 Possui seu próprio DNA
mtDNA
 Local de várias rotas metabólicas
Espaço intermembranas
Matriz: diversas proteínas e
ciclo de Krebs e o mtDNA
Membrana
interna: CRM
Membrana
externa
crista
CADEIA RESPIRATÓRIA
MITOCONDRIAL
complexo I
complexo II
Succinato
Subunidades
codif.pelo mtDNA
Subunidades
codif.pelo nDNA
complexo III
complexo IV
complexo V
fumarato
7
0
1
3
2 =
13
39
4
10
10
12 =
75
carboidrato
proteínas
Digestão e absorção
gordura
Ácidos
graxos
+
glicerol
glicose
amino
ácidos
Beta -oxidação
ATP
Acetil
CoA
Ciclo
de
Krebs
O2
2H
H2O
ADP
CRM
MITOCÔNDRIA
Produção aeróbia de energia:

OXOPHOS: requer uma
ação orquestrada de 5
complexos enzimáticos
com transferência de
elétrons pelos
carreadores NADH e
FADH2 para a molécula de
oxigênio
gradiente eletroquímico que
converte ADP em ATP
AS DOENÇAS MITOCONDRIAIS
Patologias de expressão clínica
heterogênea caracterizadas por uma
disfunção na produção de energia
CERÉBRO
MÚSCULO
CORAÇÃO
MULTISSISTÊMICAS
ENCEFALOPATIA
CONVULSÕES
CARDIOMIOPATIA
HIPERTRÓFICA
RETINITE PIGMENTAR
ALT. TIREÓIDE
OU
DEMÊNCIA
DILATADA
DEPRESSÃO
ATAXIA
ENXAQUECA
AVC
DEFEITO DE
CONDUÇÃO
CARDÍACO
SURDEZ
NEUROSSENSORIAL
DIABETE MELITUS
BAIXA ESTATURA
ALTERAÇÕES NA FIBRA
MUSCULAR
INSUF.
HEPATICA
FRAQUEZA
TUBULOPATIA
RENAL
INSUF. MEDULA
ÓSSEA
FADIGA
INTOLERÂNCIA AO
EXERCÍCIO
MIOPATIA
NEUROPATIA PERIFÉRICA
HERANÇA MITOCONDRIAL
A herança
materna:
Cada célula humana
contém 100
mitocôndrias e cada
uma contém 2 a 10
cópias de mtDNA
CÉLULA PROGENITORA
n N
N
Proliferação mtDNA e
Citocinese
Segregação Randomizada
90%
70%
50%
30%
10%
Limiar para a
expressão fenotípica
FENÓTIPO
FENÓTIPO
mtDNA
37 genes:



2 RNAs
ribossômicos
22 RNAs
transportadores
13 RNAs
mensageiros = 13
genes que
codificam para as
proteínas da CRM
DOENÇAS MITOCONDRIAIS
Devido ao número variável de mitocôndrias e de
mtDNA nos diferentes tecidos  co-existência de
mtDNA normal e mutado  Heteroplasmia.
Mesma mutação  diferentes manifestações clínicas.
Diferentes mutações  manifestação clínica igual.
Crianças X adultos.
Elevada freqüência: 1/5.000- 10.000 nascidos vivos
(McFarland R. et al, 2002).
Causadas por mutações que envolvem o genoma
mitocondrial e nuclear.
CLASSIFICAÇÃO
Mutações do
mtDNA
deleções e
duplicações de
larga escala
esporádico
Mutações do DNA
nuclear
CPEO -
Oftalmoplegia Externa Crônica Progressiva
KSS -
Síndrome de Kearns Sayre – alterações
cardíacas, proteínorraquia elevada,
oftalmoplegia
PS –
Síndrome de Pearson – alterações na medula
óssea – pancitopenia, anemia sideroblástica
DOENÇA MULTISSISTÊMICA
PADRÃO MIOPÁTICO
CPEO –17 ANOS
CPEO –30 ANOS
KSS–30 ANOS
KSS –35 ANOS
KSS –35 ANOS
8 ANOS
13 ANOS
13 ANOS
10
ANOS
CLASSIFICAÇÃO
Mutações do
mtDNA
mutações de
ponto e
microdeleção
Herança
materna
> 200 tipos diferentes
tRNA:
MELAS-
Miopatia, Encefalopatia, Acidose Lática e
Episódios de Acidente Vascular Cerebral
(Mutação A3243G)
MERRF-
Epilepsia Mioclônica com Fibras Rotas Vermelhas
(RRF) (Mutação A8344G)
mRNA:
NARP-
gene ATPase
Neuropatia, Ataxia e Retinopatia Pigmentar
(mutação T8993G)
Síndrome de LEIGH (DE TRANSMISSÃO MATERNA)Encefalomiopatia Subaguda Necrotizante
DOENÇA MULTISSISTÊMICA
ENCEFALOPATIA PROGRESSIVA
MELAS – PACIENTE 18 ANOS
MELAS – PACIENTE 7 ANOS
LEIGH – PACIENTE 1 ANO
RRF
CLASSIFICAÇÃO
Mutações do
mtDNA
Mutações do DNA
nuclear
defeitos
bioquímicos na
CRM
Herança
mendeliana
CLASSIFICAÇÃO
Mutações do
mtDNA
deleções e
duplicações
de larga
escala
Defeitos de
sinalização
intergenômica
Mutações do DNA
nuclear
DIAGNÓSTICO DAS MIOPATIAS
MITOCONDRIAIS
Manifestações Clínicas
Músculo: CPEO, fraqueza, fadiga
SNC: ataxia, surdez, atrofia óptica
HF sugestiva
Investigação Clínica
Sindrome mitocondrial?
(MELAS, MERRF,NARP,LHON)
SIM
Testar mutações
comuns no sangue
NÃO
Negativo
HISTOQUÍMICA
BIOQUÍMICA
MOLECULAR
ASPECTOS HISTOQUÍMICOS
Corte transversal de tecido muscular:
Paciente com S. de Kearns Sayre
apresentando hiperatividade (RRF) em
SDH e ausência de atividade em
Citocromo C Oxidase
RRF na coloração de Tricromio de Gomori.
RRF representada na reação SDH.
Hipoatividade da citocromo C oxidase
ASPECTOS BIOQUÍMICOS
 Medida da atividade das enzimas da CRM por
fluorimetria
 Idealmente com homogeneizado de tecido muscular
fresco - Medida dos Complexos I, II, III, IV, V
 Trabalhoso
 Custo elevado
 Difícil padronização
 Difícil interpretação
 Defeitos isolados ou mistos
ASPECTOS MOLECULARES
Mutações de ponto:
A3243G, 3271-T, A8344G, T8356C e T8993G  PCR e digestão
por endonuclease de restrição.
Deleção:
Extração de DNA (músculo)  digestão com a PvuII 
separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose
0,8%  transferência para membrana de nylon Hybond+ 
hibridização com sonda previamente marcada com o kit ECLTM
Direct nucleic acid labelling and detection system  autoradiografia da membrana.
Seqüenciamento:
método da terminação por fluorescência em seqüenciador
automático (ABI PrisMTM 310 - Applied Biosystems).
Auto-radiografia da detecção de deleções no
mtDNA
1 2 3 4 5 6 7
16.569 kb
11.592 kb
Canaleta 1: controle positivo; canaletas 3 e 7:
pacientes com uma deleção no DNA mitocondrial;
canaletas 2, 4, 5 e 6: pacientes que não apresentam
uma deleção no DNA mitocondrial.
PROGNÓSTICO
Arpa, J. et al. Prevalence and Progression of Mitochondrial Diseases: a
study of 50 patients
Muscle Nerv 28: 690-695, 2003
TRATAMENTO
1) Acompanhamento multidisciplinar: neuro, oftalmo,
endócrino, cardio, nefro, gastro, fisioterapeuta,
outros.
2) Exercício físico regular individualizado e
respeitando limites
3) Evitar stress físico e mental, frio, calor, uso de
alcool, nicotina, medicações como corticóides, ác.
Valpróico, barbitúricos, tetraciclina, cloranfenicol,
etc.
4) Dieta: regular, evitar jejum prolongado, redução de
gorduras e rica em CH.
TRATAMENTO
5) Vitaminas e outras medicações: sem comprovação
científica, tto empírico, mínimo benefício:
•
Aceptores de elétrons como a menadiona
(vitamina K3) e filoquinona (vitamina K1), e ácido
ascórbico (vitamina C) tem sido usados no
sentido de melhorar o transporte de elétrons
na cadeia respiratória,
•
Riboflavina (vitamina B2), na dose de 50-100
mg/dia age como cofator dos complexos I e II.
•
Coenzima Q10 (5-15 mg/kg/dia)
•
Creatina 100-200 mg/kg/dia
•
Dicloroacetato – redução dos níveis de lactato
UM ESTUDO CLÍNICO, BIOQUÍMICO,
HISTOQUÍMICO E GENÉTICO-MOLECULAR
DE PACIENTES COM DOENÇAS DO DNA
MITOCONDRIAL
VARIÁVEL PROBABILIDADE
Alta
 Combinação de sintomas multisistêmicos patognomônicos de doença
mitocondrial, incluindo, no mínimo, 3 sistemas (neurologico, muscular,
cardíaco, endócrino, gastrointestinal, renal, hematológico, otológico,
oftalmológico ou hepático);
 Apresentação de síndrome clássica como MELAS, MERRF, Kearns Sayre,
Leigh com herança materna;
Baixa
 Crianças com encefalopatia não específica
convulsivas, acidose lática e/ou hipotonia;
apresentando
crises
 Pacientes com evolução atípica de doença envolvendo SNC sem achados
clínicos característicos e em que já foram excluídas outras patologias;
 Sintomas isolados: AVC em pacientes
manifestações endocrinológica ou neurológicas;
jovens,
cardiomiopatia,
RESULTADOS – análise de mutações
43 pacientes
Triagem para 5 mutações de ponto
PCR/RFLP
38 sem mutação detectada no mtDNA
(88.4%)
5 pacientes com mutação de ponto no mtDNA
(11.6%)
Biópsia de músculo
4 pacientes com A3243G
1 paciente com T8993G
SIM
23 (53.5%)
NÃO
15 (34.9%)
Southern blot
Sequenciamento do
tRNALeu(UUR) and tRNAlys
12 pacientes com deleção
(27.9%)
11 pacientes negativos
(25.6%)
Mutação no mtDNA: 17 (39,5%)
26 pacientes negativos para
as mutações investigadas
(60,5%)
RESULTADOS – comparação dos positivos com negativos
Positivo para mutação
mtDNA
Negativo para mutação
mtDNA
Valor p
Média de idade início dos sintomas
29.5*
17.1*
< 0.001
Média de idade na avaliação
28.8*
17.5*
0.004
Média do lactato jejum
18.4*
13.5*
NS
Média lactato pós-prandial
17.9*
13.0*
NS
Diferença do lactato pré e pós
prandial
20.1*
16.4*
NS
% (N)
% (N)
óbito
23.5 (4)
11.5 (3)
NS
alteração EEG
52.9 (9)
65.4 (17)
NS
Alteração ENMG (miopatia)
46.7 (7)
11.5 (3)
0.032
Alteração TC ou RNM
64.7 (11)
42.3 (11)
NS
Retinopatia pigmentar
41.2 (7)
3.8 (1)
0.007
Oftalmoplegia e ptose palpebral
70.6 (12)
19.2 (5)
0.002
Baixa estatura
59.0 (10)
23.1 (6)
0.04
Atraso no DNPM
35.3 (6)
53.8 (14)
NS
Convulsões
41.0 (7)
65.4 (17)
NS
Hipotrofismo
76.5 (13)
38.5 (10)
0.033
Acidose lática
82.4 (14)
34.6 (9)
0.006
5.9 (1)
19.2 (5)
NS
Sinais e sintomas clínicos:
Herança materna
* Média do Rank
RESULTADOS – comparação dos positivos com negativos
Positivo para mutação
mtDNA
Negativo para mutação
mtDNA
Valor p
Média de idade início dos sintomas
29.5*
17.1*
< 0.001
Média de idade na avaliação
28.8*
17.5*
0.004
Média do lactato jejum
18.4*
13.5*
NS
Média lactato pós-prandial
17.9*
13.0*
NS
Diferença do lactato pré e pós
prandial
20.1*
16.4*
NS
% (N)
% (N)
óbito
23.5 (4)
11.5 (3)
NS
alteração EEG
52.9 (9)
65.4 (17)
NS
Alteração ENMG (miopatia)
46.7 (7)
11.5 (3)
0.032
Alteração TC ou RNM
64.7 (11)
42.3 (11)
NS
Retinopatia pigmentar
41.2 (7)
3.8 (1)
0.007
Oftalmoplegia e ptose palpebral
70.6 (12)
19.2 (5)
0.002
Baixa estatura
59.0 (10)
23.1 (6)
0.04
Atraso no DNPM
35.3 (6)
53.8 (14)
NS
Convulsões
41.0 (7)
65.4 (17)
NS
Hipotrofismo
76.5 (13)
38.5 (10)
0.033
Acidose lática
82.4 (14)
34.6 (9)
0.006
5.9 (1)
19.2 (5)
NS
Sinais e sintomas clínicos:
Herança materna
* Média do Rank