Técnicas de análise de proteínas

Técnicas de análise de proteínas
Estrutura secundária da enzima COMT
Fundamento e aplicação das técnicas de análise de proteínas
• Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
• Hibridação Western
• Electroforese bidimensional (2D-PAGE)
• Imunoprecipitação
• Sistema de dois híbridos em levedura
• Sistema de phage display
• Espectrometria de massa
Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (1)
A velocidade de migração em campo eléctrico depende da
dimensão, forma e carga das moléculas.
Para a desagregação e desnaturação das proteínas utiliza-se
SDS, β-mercaptoetanol ou DTT (agentes redutores) e calor.
O SDS (detergente fortemente aniónico) confere às
proteínas carga negativa.
SDS-PAGE (2)
Coloração do gel com azul de coomassie
Electrotransferência de proteínas
Hibridação Western (Imuno-hibridação) (1)
Em (A) e (B) foram
utilizados anticorpos da
distrofina diferentes.
A hibridação Western detecta proteínas que foram separadas por
electroforese em gel de poliacrilamida e transferidas para uma membrana.
Hibridação Western (2)
Esta técnica permite detectar a presença ou ausência de uma proteína que reage com
o anticorpo; determinar a sua dimensão e avaliar os níveis relativos de expressão em
diferentes amostras. A dimensão da proteína na amostra 5 é diferente, talvez devido a
modificação pós-traducional.
Electroforese bidimensional (2D-PAGE)
A pH elevado as proteínas estão negativamente carregadas. A pH baixo as proteínas estão
positivamente carregadas.
Proteínas
básicas
pI intermédio
Proteínas
acídicas
Gel de focagem isoeléctrica
Na análise de proteomas a matriz é de poliacrilamida
com um gradiente de pH imobilizado (IPG) para
haver maior reprodutibilidade nos resultados.
SDS-PAGE
O ponto isoeléctrico (pI) é a posicão em que a
carga da proteína é neutra relativamente ao pH
local.
Poder de resolução do gel bidimensional
A gama de pH mais estreita aumenta o poder de resolução das proteínas.
As imagens representam prroteínas do fígado de ratinho separadas por 2D-PAGE e coradas com nitrato
de prata.
No gel em que a gama de pH é mais larga (3-12) a maioria das proteínas estão concentradas no meio,
reflectindo o facto de que a maioria das proteínas têm valores de pI na gama 4-7.
Uma proteína pode ocorrer em diferentes posições num gel 2D, por exemplo como consequência de
diferenças na modificação pós-traducional.
Imunoprecipitação
Proteínas radioactivamente marcadas são incubadas com um anticorpo, que forma complexos com a
proteína (o antigénio) contra a qual é dirigido. Estes complexos antigénio-anticorpo são colhidos em
esferas que se ligam ao anticorpo e isolados por centrifugação. As esferas são fervidas para dissociar os
complexos, e as proteínas recuperadas são analisadas por SDS-PAGE. A proteína radioactiva que foi
imunoprecipitada é detectada por auto-radiografia.
Sistema de dois híbridos em levedura (1)
Fundamento
O sistema de dois híbridos em levedura permite detectar in vivo interacções proteína-proteína.
Figure 8-51. © 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter..
Sistema de dois híbridos em levedura (2)
Fundamento:
A proteína alvo é fundida com o domínio de ligação a DNA que a localiza na
região reguladora de um gene repórter, onde funciona como “isco” (bait). Quando
esta proteína alvo se liga a uma outra proteína (“presa”, prey), no núcleo da célula,
especificamente construída em fusão com o domínio de activação da transcrição, a
sua interacção leva à aproximação dos dois módulos do activador transcricional, o
que desencadeia a expressão do gene repórter.
O gene repórter, em geral, permite o crescimento em meio selectivo (Ex.: gene
His3). Também se utiliza como gene repórter lacZ.
As proteínas de fusão bait e prey são obtidas por técnicas padrão de DNA
recombinante.
Na maioria dos casos, uma única proteína bait é utilizada para pesquisar outras
proteínas com as quais interage, partindo de um conjunto de proteínas prey
produzidas por ligação do DNA codificante do domínuio de activação de um
activador transcricional a fragmentos de DNA de uma biblioteca de cDNA.
Sistema de dois híbridos em levedura (3)
Procedimento
Sistema de dois híbridos em levedura (4)
Os domínios do factor de transcrição não têm de estar covalentemente ligados, mas devem formar
uma proteína dimérica. Os factores de transcrição funcionais são detectados pela activação de um
gene repórter.
Sistema de dois híbridos em levedura (5)
Os falsos positivos são devidos a:
• Autoactivação espontânea do gene repórter pelo bait ou pelo prey
• Interacção não específica
• Interacção irrelevante porque ocorre entre proteínas encontradas em
compartimentos separados.
Os falsos negativos são devidos a:
• Erros de PCR na produção de cDNA
• Condições não fisiológicas, uma vez que o teste ocorre no núcleo e as
proteínas de outros compartimentos podem não adquirir a conformação ou a
agregação correcta.
Vectores de clonagem utilizados no sistema de dois híbridos em levedura
Sistema de phage display (1)
O phage display é uma forma de clonagem de expressão de genes estranhos em
fagos. Os cDNAs são clonados de modo a expressar proteínas estranhas na
superfície dos fagos, o que permite o estudo de interacções proteína-proteína in
vitro.
O gene III codifica uma proteína secundária da cápside do fago f1.
O local de clonagem está situado na região que corresponde à extremidade N-terminal da proteína
codificada pelo gene III.
Uma biblioteca fágica de expressão é produzida a seguir à transfecção de E. coli.
Sistema de phage display (2)
Os recombinantes com insertos na mesma fase de
leitura do gene III originam proteínas de fusão em
que o componente N-terminal consiste na sequência
da proteína estranha.
Sistema de phage display (3)
A purificação de afinidade utilizando um anticorpo específico de uma das proteínas estranhas permite
a identificação de sequências de cDNA que codificam a proteína não caracterizada.
Sistema de phage display (4)
As bibliotecas de phage display são utilizadas na triagem de proteínas ou
péptidos com propriedades farmacológicas, enzimáticas ou antigénicas.
A identificação de um péptido que se liga a um ligando pode ter utilização
directa na investigação de um agente terapêutico ou fornecer informação acerca
da sequência parcial de uma proteína maior de ligação ao ligando.
A era pós-genómica
Genómica é o estudo de genomas completos. Genoma é a informação genética
total numa célula particular ou organismo.
Transcritómica é o estudo do transcritoma. Transcritoma é a população de
mRNAs expressos numa única célula ou tipo de célula.
Proteómica é o estudo do proteoma. Proteoma é o conjunto completo de
proteínas codificadas pelo genoma.
Limitações da genómica
• O número de genes (ORFs) encontrados no genoma humano é muito menor
do que o número de proteínas expressas (splicing alternativo, modificações
pós-traducionais, clivagem proteolítica) e por isso, é necessária mais informação
acerca das “unidades funcionais” da célula.
• O genoma é na sua maioria estático (numa geração) enquanto o proteoma é
mais dinâmico – ciclo celular, desenvolvimento, resposta ao ambiente.
• Os níveis de mRNA, em geral, não têm correlação com os níveis de
expressão proteica (diferente estabilidade dos mRNAs e diferentes eficiências de
tradução).
• A maioria das modificações pós-traducionais vulgarmente observadas nas
proteínas não podem ser estudadas ou previstas com rigor a partir do genoma.
Espectrometria de massa
• A espectrometria de massa é uma técnica poderosa que
permite determinar a massa molecular de proteínas/péptidos e a
sequência de aminoácidos.
• Esta informação é utilizada para identificar a proteína,
pesquisando bases de dados de sequências de nucleótidos e de
proteínas.
• Também é utilizada para determinar o tipo e localização das
modificações pós-traducionais das proteínas.
Espectrómetro de massa
A maioria dos espectrómetros de massa possuem:
• Uma fonte de ionização (produz iões – moléculas carregadas)
• Um ou mais analisadores de massa (separa os iões)
• Um detector (conta iões)
Sistema de vácuo
Amostras
2-DE
Fonte de
ionização
Analisador de
massa
Detector
Minimiza colisões, interferências
Sistema de
recolha de
dados
Espectrometria de massa em tandem
Genetics – From Genes to Genomes
Análise da expressão génica
Os parâmetros importantes na expressão génica são o material de estudo, a resolução da
expressão e a eficiência (o número de genes/proteínas que podem ser analisados de uma só vez).
Da proteína ao gene e do gene à proteína (1)
O conhecimento da biologia molecular das células torna experimentalmente possível
partir do estudo do gene para a proteína e da proteína para o gene.
Uma pequena quantidade de proteína purificada é utilizada para se obter uma sequência parcial de
aminoácidos. Esta informação permite identificar o gene correspondente numa biblioteca de DNA. Uma
vez clonado o gene, a sequência codificante da proteína pode ser inserida num vector de expressão de
modo a produzir grandes quantidades da proteína a partir de células obtidas por engenharia genética.
Da proteína ao gene e do gene à proteína (2)
Engenharia de proteínas
• Alteração da composição de bases e/ou dos codões do gene para melhorar a
sua expressão.
• Introdução de alterações específicas na sequência de DNA para melhorar as
características da enzima (aumentar a especificidade pelo substrato).
• Produção de proteínas totalmente novas.