Aula 2 Cinética Enzimática 2011

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Professora: Erika Liz
E
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á
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a
Elementos da Enzimologia
• Reações Químicas
– Termodinâmica – estuda a viabilidade e a reversibilidade das
reações, a partir da análise do conteúdo energético inicial e
final de uma transformação.
– Cinética – Trabalha com a velocidade com que as reações
acontecem.
– Teoria das colisões – As moléculas para reagirem em uma
solução devem colidir com orientação apropriada na qual
levará a um estado de transição.
Elementos da Enzimologia
• Energia livre de ativação
– É a energia inicial necessária para que a reação
ocorra.
• Estado de transição
– É o ponto da reação que possui a maior energia de
ativação.
– A reação está no ponto máximo da barreira
energética que separa os reagentes e os produtos.
Elementos da Enzimologia
• Catalisadores
- Compostos capazes de
aumentar a velocidade da reação sem alterar
a proporção entre reagentes e produtos.
– Criam novos caminhos para que a reação ocorra
com uma menor energia de ativação.
Reação não catalisada
Reação catalisada
Enzimas são agentes de função metabólica
Sua função é a de acelerar as reações do metabolismo
Também chamados de catalisadores biológicos
C aracterísticas
1) As enzimas possuem um enorme poder catalítico; podem acelerar
reações em até 1016 vezes em relação à reação não catalisada
2) Uma enzima é bastante seletiva, tanto em relação à substância com a
qual ela interage, como em relação à reação que ela catalisa
3) A atividade enzimática pode ser regulada de acordo com as necessidades
da célula
A noção de que há uma
complementaridade entre a
enzima e o substrato é
fundamental na
enzimologia
Mas, enzimas são moléculas
grandes e os substratos
moléculas pequenas, na maioria
das vezes.
Assim, a complementaridade está
restrita a um locus especifico, o
chamado sítio ativo.
É ali que a enzima liga o
sustrato para formar o
complexo enzimasubstrato.
Emil Fischer (1894): alto
grau de especificidade
das enzimas originou →
Chave--Fechadura
Chave
Fechadura, que
considera que a enzima
possui
sitio
ativo
complementar
ao
substrato.
Koshland (1958): Encaixe
Induzido,, enzima e o substrato
Induzido
sofrem conformação para o
encaixe. O substrato é
distorcido para conformação
exata do estado de transição.
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ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO
Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.
1. Oxido-redutases
1.1.atuando
1.2.atuando
1.3.atuando
1.4.atuando
1.5.atuando
1.6.atuando
(reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons)
em CH-OH
em C=O
em C=Oem CH-NH2
em CH-NHem NADH, NADPH
2.Transferases (transferem grupos funcionais entre moléculas)
2.1.grupos com um carbono
2.2.grupos aldeído ou cetona
2.3.grupos acil
2.4.grupos glicosil
2.7.grupos fosfatos
2.8.grupos contendo enxofre
3.Hidrolases (reações de hidrólise)
3.1.ésteres
3.2.ligações glicosídicas
3.4.ligações peptídicas
3.5.outras ligações C-N
3.6.anidridos ácidos
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ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO
Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.
4.Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água,
amônia e gás carbônico)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N-
5.Isomerases (transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros)
5.1.racemases
6.Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre
duas pré-existentes, sempre às custas de energia)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C
ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO
Subclasses
Exemplos de Tipo de reação catalisada
Subclasses
Hidratases
Adicionam H2O à ligas duplas
Quinases
Transferem fosforilas do ATP
Mutases
Movem fosforilas dentro da
mesma molécula
Sintases
Síntese independente de ATP
Sintetases
Síntese dependente de ATP
Classe
Liases
Transferase
Isomerase
Transferases
Ligases
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Muitos agentes inibem (diminuem) a atividade de enzimas
Estes agentes recebem o nome genérico de INIBIDORES
Muitas drogas são inibidores de atividade enzimática (os anti-inflamatórios
não-esteróides, por exemplo, inibem a ciclo-oxigenase)
Muitos reguladores metabólicos são inibidores
IRREVERSÍVEL ⇒ causada em geral por agentes (inibidores) que reagem
covalentemente com a enzima.
REVERSÍVEL ⇒ os inibidores ligamse à enzima através de interações
não-covalentes (interação iônica,
por exemplo)
Inibição competitiva
Inibição não-competitiva
Inibidores Reversíveis Competitivos
• Há competição pelo centro ativo do enzima
• O inibidor é estruturalmente semelhante ao substrato
• A inibição pode ser revertida adicionando mais substrato
ao meio
Inibidores Reversíveis Não competitivos
• O inibidor liga-se a um local específico da enzima (que
não o centro ativo)
• O inibidor liga-se tanto a enzima livre como ao complexo
ES
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
E + S
ES
E+P
Fatores decorrentes da natureza protéica (estrutura)
das enzimas
pH;
temperatura;
Fatores decorrentes da formação do complexo ES
concentração das enzimas;
concentração dos substratos;
pH ótimo de algumas
enzimas
E nzim a
Pepsina
Tripsina
C atalase
A rginase
Fu m arase
R ibo nuc lease
pH ótim o
1,5
7,7
7,6
9,7
7,8
7,8
POR QUE O pH AFETA A ATIVIDADE ENZIMÁTICA?
A) a ligação do substrato pode depender de grupos dissociáveis (COOH/
NH3)no sítio ativo e no próprio substrato
B) o ato catalítico pode depender de grupos dissociáveis
C) a conformação da proteína varia com o pH, podendo inclusive haver
desnaturação em pHs extremos
Influência da temperatura do meio sobre a
atividade enzimática
• a taxa de reação
aumenta, como se
observa na maioria
das reações
químicas;
• a estabilidade da
proteína decresce
devido a desativação
térmica.
Temperatura ótima
Ativação
térmica
Desnaturação
térmica
Influência da concentração da enzima sobre
a atividade enzimática
Velocidade de
transformação do S
em P -- Quantidade
de E.
Recomenda-se:
Enzimas com alto grau de pureza;
Substratos puros;
Métodos de análise confiável.
[E]
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
[S] varia durante o curso da reação à medida
que S é convertido em P.
[S]
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
Baixa concentração de substrato
S +
E
E
E
E
S
E
E
E
E
E
E
E
E
+
Formação do produto é PROPORCIONAL à concentração de
substrato
P
P
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
100 % de saturação do centro ativo da enzima
S
S
+
S
S
E
E
E
E
S
E
E
S
E
S
E
P
E
E
S
E
E
+ P
P
P
Formação do produto é PROPORCIONAL à concentração de
substrato
P
P
P
P
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
[Substrato] em excesso
S
S S S
S
+
S
S
S
E
E
E
E
S
E
E
E
S
E
S
P
E
E
S
S
S
S
S
Velocidade da reação independe da [S]
E
E
+ P
P
P
S
S
P
P
P
P
S
S
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
Em baixas concentrações de
substrato a velocidade de reação é
de primeira ordem – isto é, é
proporcional a concentração de
substrato
Em altas concentrações de substrato, a
velocidade da reação é de ordem zero
– isto é, é constante e independente
da concentração de substrato
[S]
Cofator ⇒ qualquer molécula não protéica que participa da catálise
enzimática
Coenzima ⇒ é um cofator orgânico que auxilia a enzima no ato
catalítico (em geral transferência de grupos)
Pode estar ou não ligada covalentemente à proteína
Quando está ligada covalentemente constitui, adicionalmente, um grupo
prostético
Holoenzima
Estrutura
Enzimática
Proteína
Apoenzima ou
Apoproteína
Covalente
Grupo Prostético
Cofator
Pode ser:
• íon inorgânico
• molécula orgânica
Coenzima
Cinética Enzimática
• Medir as velocidades das transformações que se processam;
• Estudar a influência de condições de trabalho naquelas
velocidades;
• Correlacionar as velocidades das transformações com alguns
dos fatores que afetam;
• Colaborar na otimização do processo considerado;
• Estabelecer critérios para o controle do processo;
• Projetar o reator mais adequado.
Cinética Enzimática
• Estudo do mecanismo da combinação Enzima
– Substrato;
• Compreensão da atividade enzimática;
E + S
ES
E+P
1913
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maude Menten - Pediatra
O que é uma “constante de velocidade”?
A constante de velocidade é um número, um
parâmetro, a ser determinado empiricamente e
que, quando multiplicado pela concentração
nos fornece a velocidade de um processo.
L. M ich ae lis e M . L. M e nte n p ropu se ram um a teo ria g era l s obre a aç ão da s e nz im as em
1 91 0, prop ond o u m rá pid o e qu ilíb rio e ntre o sub stra to e a en zim a :
E+S
k1
k2
ES
P ara um eq uilíbrio po de-s e es cre ve r:
k 1 [ E ][ S ] = k 2 [ ES ]
ks =
[ E ][ S ] k 2
=
[ES ]
k1
O produ to é fo rm a do num a se gun da eta pa :
E + S
k1
k2
ES
k3
E + P
N o fina l E é libe rad o p ara lig ar o utra m o léc ula do su bs trato .
Isto leva, finalmente, à EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN:
v =
V=
Vmax [ S ]
K M + [S]
Onde Vm é velocidade
máxima da reação
Vm . [S]
Km +[S]
Km+ [S] = [S]. Vm
Quando V =Vm
2
V
Km= [S] . Vm . 2
Vm
[S]
Km= [S]
V max
20
15
Vmax /2
10
O KM é a concentração de
substrato para o qual
v = Vmax/2
5
0
0
KM
5
10
15
20
25
Concentração do substrato, [S]
Numericamente, Km pode ser expresso como a [substrato] necessária para que a velocidade da
reação seja metade da velocidade máxima
A constante de Michaelis, KM:
KM =
k2 + k3
k1
KM tem as unidades da molaridade, e é uma medida da afinidade da enzima pelo
substrato; quanto menor KM, maior a afinidade da enzima pelo substrato.
Km
Afinidade da
enzima pelo
substrato
Km
Afinidade da
enzima pelo
substrato
O
B
R
I
G
A
D
A
!