C - Marilanda Bellini

Disciplina: Bioquímica Clínica
Curso: Análises Clínicas
2º. Módulo
Docente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini
Fundamentos da Espectrofotometria
“Uma maneira boa de cutucar moléculas, é
com radiação eletromagnética (luz)”
A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos
analíticos que baseiam-se na interação da matéria com a
energia radiante
•Boa sensibilidade
•Baixo custo de
análise
•Fácil operação
•Equipamentos
robustos
Luz
incidente
Luz
emergente
Perdas:
- reflexões
- dispersão
-absorção
Luz absorvida
Fundamentos da Espectrofotometria
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
f= c/ λ
c = velocidade da luz no vácuo 3.1010 cm/s
unidades
nm = 10-9 m
A= 10 -10 m
•Comprimento de onda (λ)
•Período (p) = tempo necessário
para completar um ciclo
•Freqüência (f) = ciclos/s ou
Hertz
Energia (E)
E = h.f => E = h.c/λ
h= constante de Planck
Fundamentos da Espectrofotometria
(a)
(b)
Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada
por um prisma: (a) esquema e (b) fotografia.
Arco-Íris: exemplo de difração
de luz produzida na natureza.
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?
• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a
absorção de energia.
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?
• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a
absorção de energia
– TRANSIÇÕES ELETRÔNICAS
• Níveis discretos de energia são absorvidos devido à vibrações
e rotações das moléculas
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?
• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a
absorção de energia
– ROTACIONAL E VIBRACIONAL
• Por este motivo não se observa uma linha de absorção nítida,
mas sim uma banda de absorção
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?
• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a
absorção de energia
– ESPECTRO UV-VISÍVEL
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?
• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a
absorção de energia
– TRANSIÇÕES ELETRÔNICAS
• Níveis discretos de energia são absorvidos devido à vibrações
e rotações das moléculas
– ROTACIONAL E VIBRACIONAL
• Por este motivo não se observa uma linha de absorção nítida,
mas sim uma banda de absorção
– ESPECTRO UV-VISÍVEL
Cores de Radiação
Região do Visível
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer
– Quando uma radiação monocromática passa
através de uma solução, uma parte da energia é
absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é
transmitida.
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer
– Grandezas:
1- Transmitância
2- Absorbância
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer
– Grandezas:
1- Transmitância:
quantidade de energia radiante transmitida pela solução.
A transmitância é dada pela relação entra a intensidade da
radiação transmitida (I) e a intensidade da radiação
incidente (Io), ou seja, T = I/Io.
Seu valor varia de zero a 1 (ou 0 a 100%)
T=O toda a luz incidente é absorvida (I=O)
T=1 toda a luz incidente é transmitida (I=Io).
2- Absorbância
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer
– Grandezas:
1- Transmitância:
2- Absorbância
quantidade de energia radiante absorvida pela solução.
A absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente
proporcional à concentração da amostra.
Para se determinar a concentração de uma determinada
solução, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade
(ou Fator de Calibração), o qual é obtido através da relação
entre a concentração e a absorbância de uma solução padrão
de concentração exatamente conhecida.
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer
• 2- Absorbância
Uma vez conhecido o Fator de Proporcionalidade, fica
fácil se descobrir a concentração da solução teste. Basta
realizar a seguinte equação:
Praticando:
1-Determine o Fator de Proporcionalidade de
uma amostra, sabendo:
[padrão] = 12,4 g/dL
abs. padrão = 0,52
Praticando:
2-Sabendo que o Fator de Proporcionalidade de
uma amostra é 22,4. Qual o valor da [padrão]
se a abs. padrão for de 0,33?
Lei de Lambert-Beer
A espectroscopia de absorção molecular está baseada
na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que
estão relacionadas através das equações:
Io
I
T= I/Io (%T = 100x T)
A = log (1/T) = log (I/Io)
A=0 T= 1 100% Transmissão
A=1 T=0,1 10 % transmissão
90% Absorção
Lei de Lambert-Beer
A absorbância é muito importante porque ela é diretamente proporcional à
concentração de espécies absorventes de luz na amostra.
Partes Essenciais de um Espectrofotômetro
• Fontes de radiação;
• Monocromador;
• Compartimento de
amostra;
• Detector.
Fontes de Radiação
Fonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de
comprimento de onda.
•Lâmpada de tungstênio: utilizada para região UV próximo e
visível
•Lâmpada de deutério: utilizada para a região do UV
Sistema Óptico
• Filtros de vidro:
transmitem faixa ampla
de comprimento de
onda;
•Prismas: transmitem
pequena faixa de onda;
•Redes de difração:
transmitem pequena
faixa de comprimento
de onda.
Cubetas de Medida
Detectores
Utilizados para receber a energia radiante transmitida através
da solução e transformá-la em energia elétrica.
Espectrofotômetros
Feixe Simples
Feixe Duplo
Espectrofotômetros com duplo feixe
Espectrofotômetros com duplo feixe
Análises Quantitativas
Análises Quantitativas
Análises Quantitativas
Análise Qualitativa
3,2
D
3,0
C5H11
2,8
R
OH
R
OH
(A)
(B)
OH
2,4
2,6
A ou B
OH
C5H11
2,2
C5H11
OH
2,0
Log ε
C
C5H11
240
250
260
270
280
290
Comprimento de onda (nm)
300
OH (C)
OH
(D)
Espectro de absorção do canabidiol comparado com outros fenóis.
OH