ANDRÉA CRISTINA MARIANO IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

ANDRÉA CRISTINA MARIANO
IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DO HOSPEDEIRO QUE
INTERAGEM COM A PROTEÍNA NSP DO GEMINIVIRUS
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de PósGraduação
em
Genética
e
Melhoramento, para obtenção do
título de “Doctor Scientiae”.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2002
ANDRÉA CRISTINA MARIANO
IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DO HOSPEDEIRO QUE
INTERAGEM COM A PROTEÍNA NSP DO GEMINIVIRUS
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de PósGraduação
em
Genética
e
Melhoramento, para obtenção do
título de “Doctor Scientiae”.
APROVADA: 8 de outubro de 2002.
_______________________________
Prof. Sérgio H. Brommonschenkel
(Conselheiro)
_______________________________
Dra. Eunize Maciel Zambolim
(Pesquisadora)
_______________________________
Profa. Márcia Rogéria de Almeida
_______________________________
Dr. Rogélio Lopes Brandão
________________________________
Profa. Elizabeth Pacheco Batista Fontes
(Orientadora)
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento- UFV
pela oportunidade
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos.
A prof Elizabeth P. B. Fontes pela orientação no decorrer do curso.
Aos Professores Sérgio H. Brommoshenkel, Márcia Rogéria de Almeida,
Rogélio L. Brandão e Eunize M Zambolim pela participação na banca de defesa
de tese.
Aos amigos dos laboratórios de Virologia Vegetal, Patologia Florestal e
Virologia Animal e em especial aos amigos do laboratório de Biologia Molecular
de Plantas onde este trabalho foi desenvolvido.
Aos amigos Soninha, Rafaelo, Andréia, Maxuel, Leo, Joci, Camila,
Fabiene, Dani, Simone, Raquel e Zinho pela amizade e a todos aqueles que
contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
A minha família pelo apoio.
ii
ÍNDICE
RESUMO ........................................................................................................
v
ABSTRACT ....................................................................................................
viii
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................
4
2.1. Organização genômica dos geminivírus e função gênica ....................
4
2.2. Movimento do genoma viral durante o processo de infecção..............
11
2.3. Interação de proteínas virais com proteínas do hospedeiro .................
13
3. OBJETIVOS ...............................................................................................
20
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................
21
4.1. Clonagem dos genes virais nos vetores pADGAL4 e pBDGAL4
Cam.......................................................................................................
21
4.1.1. Clonagem do gene REn em pBDGAL4 Cam ................................
21
4.1.2. Clonagem dos genes MP e NSP ....................................................
24
4.2. Propagação dos clones em S. cerevisae estirpe YRG-2.......................
24
4.3. Determinação da atividade de ativação transcricional e/ou atividade
de ligação ao DNA de proteínas virais.................................................
26
4.4. Identificação da interação entre a proteína nsp e proteíns do
hospedeiro ............................................................................................
26
4.4.1. Construção da biblioteca de cDNA de tomate (Lycopersicum
esculentum) ....................................................................................
26
4.4.2. Interação entre a proteína viral NSP e proteínas do tomateiro ......
27
iii
4.4.3. Caracterização molecular do clone pUFV371, identificado no
ensaio de interação com NSP.........................................................
29
4.4.4. Análise das seqüências...................................................................
29
4.5. Expressão da proteína cinase de tomate...............................................
31
4.5.1. Clonagem da seqüência parcial da proteína cinase de tomate no
vetor de expressão pET16B (Novagen) .........................................
31
4.5.2. Indução da versão truncada da proteína cinase de tomateiro.........
31
4.5.3. Purificação da versão truncada da proteína cinase de tomateiros ..
32
4.6. Obtenção do anticorpo contra a proteína cinase de tomate..................
33
4.6.1. Imunização de coelhos ...................................................................
33
4.6.2 Verificação da especificidade do anticorpo ....................................
33
4.6.3. Extração de proteínas e “immunoblotting”....................................
34
5. RESULTADOS...........................................................................................
35
5.1. A proteína REn complementa o domínio de ativação transcricional
de GAL4...............................................................................................
35
5.2. Oligomerização da proteína viral MP detectada pelo sistema duplohíbrido ..................................................................................................
37
5.3. Interação entre as proteínas de movimento NS e MP ..........................
39
5.4. Identificação de fatores do hospedeiro que interagem com a proteína
NSP de TGMV.....................................................................................
40
5.5. Caracterização molecular do clone pUFV364 .....................................
44
5.6. O homólogo de soja da proteína NIK possui domínios característicos
de receptores de membrana e genes de resistência ..............................
47
5.7. GmNIK interage com a proteína NSP de geminivírus.........................
49
6. APÊNDICE .................................................................................................
53
6.1. Obtenção de anticorpos contra ocarboxi-terminal de LeNIK ..............
53
7. DISCUSSÃO...............................................................................................
56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................
64
iv
RESUMO
MARIANO, Andréa Cristina, D.S., Universidade Federal de Viçosa, outubro de
2002. Identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com a
proteína NSP do Geminivirus. Orientadora: Elizabeth Pacheco Batista
Fontes. Conselheiros: Prof. Sérgio H. Brommonschenkel e Francisco Murilo
Zerbini Jr.
A família Geminiviridae é uma família de vírus de planta constituída
por vírus compostos por genoma circular de DNA fita simples que utilizam
fatores do hospedeiro tanto para sua replicação quanto para a translocação
do genoma viral no hospedeiro. Com a finalidade de identificar fatores do
tomateiro que interagem com as proteínas virais do geminivírus TGMV (Tomato
golden mosaic virus), foi utilizado o sistema duplo híbrido para escrutínio de
proteínas positivas quanto à interação. As regiões codificadoras das proteínas
MP, NSP e REn foram amplificadas e inseridas, individualmente, no
vetor pBDGAL4 Cam, fusionadas ao domínio de ligação ao DNA do gene
GAL4.
Paralelamente
foi
construída
uma
biblioteca
de
cDNA
de
tomateiro, propagada em vetor de S. cerevisae derivados de lambda ZAPII. O
escrutínio da biblioteca de cDNA assim como os ensaios funcionais de
identificação de interação entre proteínas geminivirais foram conduzidos no
sistema duplo-híbrido de leveduras. Ao contrário das proteínas MP e NSP, a
proteína viral REn apresentou a capacidade de ativar a transcrição quando
v
fusionada ao domínio de ligação ao DNA, o que impossibilitou seu uso
como isca em ensaios de interação proteína-proteína por esse sistema. A
expressão correta das proteínas de movimento MP e NSP, direcionada pelos
vetores do sistema duplo-híbrido, foi comprovada pela capacidade das
proteínas recombinantes em interagirem ativando os genes repórteres. A
interação entre MP e NSP, identificada no presente trabalho, está coerente com
os modelos propostos para movimento de geminivírus no hospedeiro, os
quais sugerem a interação entre essas duas proteínas durante o processo de
translocação do genoma viral. A proteína NSP foi então utilizada como
isca nos ensaios de interação proteína-proteína, utilizando como alvo as
proteínas codificadas pela biblioteca de cDNA de tomateiro. Como resultado do
escrutínio da biblioteca de cDNA de tomateiro, foram identificados cinco
cDNAs que codificam proteínas capazes de interagir com NSP com
diferentes intensidades, conforme demonstrado em ensaios quantitativos da
atividade do gene repórter β-galactosidase. A análise de seqüência e do padrão de
restrição desses clones demonstraram que quatro deles eram idênticos e
codificavam um domínio conservado de quinase serina/treonina, sendo
denominado NIK (NSP - Interacting Kinase). Evidências indicam que,
provavelmente, a interação entre NIK e NSP seja funcional. Análise da estrutura
primária de NSP demonstrou a presença de resíduos de serina e treonina em
contexto favorável para fosforilação. Além disso, NIK não foi capaz de interagir
com outras proteínas virais e com controles, pelo sistema duplo híbrido,
confirmando a especificidade da interação NSP-NIK. A análise comparativa da
seqüência parcial do cDNA de NIK com seqüências de cDNAs de uma biblioteca
de semente de soja mostrou que a proteina NIK possui cerca de 92% de
similaridade de seqüência, na região carboxiterminal, com uma proteína quinase
de soja. A quinase identificada em soja, denominada GmNIK (Glicine max NIK),
contém 623 resíduos de aminoácidos e uma massa molecular estimada em
68586,10 kDa e foi capaz de interagir com NSP por meio do sistema duplo
híbrido. GmNIK possui, além do domínio de quinase
um domínio de ligação a ATP
309
419
IIHRDVKAANILL431,
LGKGFGNVYKKGVFPDGTLVAVKK332,
vi
uma hélice transmembrana, provavelmente responsável pela inserção da proteína
na
96
membrana
plasmática,
e
regiões
ricas
em
leucina,
como
LTNQIVLLQNNNISGPIPSELGKLKLTQLDLSNNFFSGGIPPSLGHL144
167
e
192
MTQLNFLDLSYNNLSGPVPRILAKS . Os domínios encontrados em
GmNIK são característicos de proteínas codificadas por genes de resistência e de
receptores de membrana envolvidos em programas de desenvolvimento. A
predição do modelo topológico de GmNIK baseado em sua estrutura modular,
similar `aquela da proteína codificada pelo gene de resistência Xa21, sugere a
posição intracelular do domínio de quinase e do domínio de ligação a
nucleotídeo, enquanto que as regiões ricas em leucina são voltadas para o meio
extracelular. A posição intracelular do domínio de quinase está coerente com a
hipótese de interação funcional entre GmNIK e NSP, uma vez que NSP localizase no meio celular interno. Ensaios adicionais deverão ser conduzidos para
confirmar se a proteína viral NSP é fosforilada por NIK in vitro e in vivo.
vii
ABSTRACT
MARIANO, Andréa Cristina, D.S., Universidade Federal de Viçosa, October
2002. Identification of host proteins which interact with the geminivirus
NSP protein. Advisor: Elizabeth Pacheco Batista Fontes. Committee
Members: Prof. Sérgio H. Brommonschenkel and Francisco Murilo Zerbini
Jr.
Geminiviridae is a family of plant viruses comprised by viruses with a
circular single stranded DNA genome that utilizes host factors for replication and
viral genome translocation. In order to identify factors in tomato plants which
interact with viral proteins of the geminivirus TGMV (Tomato golden mosaic
virus), the yeast two-hybrid system was used to screen for proteins with a
positive interaction. Coding regions of the proteins MP, NSP and REn were
amplified and inserted, individually, within the vector pBDGAL4 Cam, and
merged to the DNA binding domain of the GAL4 gene. Additionally, a library of
tomato cDNA was obtained and propagated in a S. cerevisae vector derived from
lambda ZAPII. The cDNA library screening and all functional assays developed
to identify the interaction among geminiviral proteins were carried out in the
yeast two-hybrid system. Differently from the MP and NSP proteins, the REn
viral protein was able to activate the transcription when merged to the DNA
binding domain. Therefore, it was impossible to use the REn viral protein as an
bait in protein-protein interaction assays by this system. The correct expression
viii
of the movement proteins MP and NSP, directed by the two-hybrid vectors, was
demonstraded by the interaction capacity of recombinant proteins, activating its
reporting genes. The interaction between MP and NSP, identified in the present
work, is consistent with the models that describe the geminivirus movement
within the host, which suggest the interaction between these two proteins during
the viral genome translocation. The NSP protein was utilized as bait in the
protein-protein interaction assays, using as target proteins codified by the tomato
cDNA library. The screeninf of the library resulted in the identification of five
cDNAs that code for proteins capable of interacting with NSP with different
intensities, according to the quantitative assays of the reporter gene
β-galactosidase. Analyses of the sequence and the restriction patterns of these
clones demonstrated that four of them were identical and code for a conserved
serine/threonine kinase domain, named NIK (NSP - Interacting Kinase).
Evidence indicates that the interaction between NIK and NSP is probably
functional. The analysis of the NSP primary structure showed the presence of
serine and threonine residues suitable to phosphorylation. Besides, NIK was not
able to interact with other viral proteins and with controls using the two-hybrid
system, corroborating the specificity of the NSP-NIK interaction. The
comparative analysis of the NIK’s cDNA partial sequence with cDNAs provided
from a soybean library showed that the NIK protein has a sequence similarity of
about 92% with a kinase protein from soybean, in the carboxy-terminal region.
The kinase identified in soybean, named GmNIK (Glicine max NIK), has
623 amino acid residues, a molecular mass around 68586.10 kDa and showed the
ability of interact with NSP using the two-hybrid system. The GmNIK
has a kinase domain
309
419
IIHRDVKAANILL431, an ATP binding domain
LGKGFGNVYKKGVFPDGTLVAVKK332, a transmembrane helix, which
is probably responsible for the introduction of the protein in the
plasmatic
96
membrane,
and
leucine-rich
regions,
such
as
LTNQIVLLQNNNISGPIPSELGKLKLTQLDLSNNFFSGGIPPSLGHL144 and
167
MTQLNFLDLSYNNLSGPVPRILAKS192. Domains found in GmNIK are
characteristic of proteins encoded by resistance genes and of membrane receptors
ix
involved in developmental programing. The prediction of a topological model of
GmNIK based on its modular structure, similar to the protein encoded by the
resistance gene Xa21, suggests an intracellular position of the kinase and
nucleotide biding domain, while the leucine-rich regions are located in the
extracellular environment. The intracellular position of the kinase domain is
consistent to the hypothesis of functional interaction between GmNIK and NSP,
since NSP is located inside the cell. Additional assays will be carried out in order
to confirm whether the NSP viral protein is phosphorylated by NIK in vitro and
in vivo.
x
1. INTRODUÇÃO
A família Geminiviridae é composta por vírus de plantas cujo genoma é
constituído de DNA de fita simples e circular que replica no núcleo de células
infectadas via uma forma intermediária de DNA dupla fita e é encapsulado em
partículas icosaédricas . Os geminivirus são vírus transmitidos por insetos, sendo
em sua maioria restritos ao floema (LAZAROWITZ, 1992).
Taxonomicamente, a família Geminiviridae encontra-se subdividida em
quatro gêneros com base em seu inseto vetor (mosca branca ou cigarrinha), tipo
de planta infectada (monocotiledôneas ou dicotiledôneas) e organização do
genoma. O gênero Topocuvirus possui apenas um representante com componente
genômico único, sendo transmitido por Micrutalis malleifera (Membracidae) e
infecta dicotiledôneas. O gênero Curtovirus é representado por espécies que
possuem apenas um componente genômico, infectam monocotiledôneas e são
transmitido pela mosca branca. O gênero Mastrevirus possui representantes com
um único componente genômico, sendo, entretanto, transmitidos por cigarrinha,
inseto do gênero Cicadulina e infectam monocotiledôneas. O gênero
Begomovirus é composto por vírus que infectam dicotiledôneas e são
transmitidos pela mosca-branca (Família Aleurodidae), sendo representado por
vírus que possuem um ou dois componentes, designados componentes A e B
(RYBICKY, 1998). O componente A codifica todas as proteínas envolvidas com
1
a replicação e transcrição do DNA viral - AC1 (Rep), AC2 (TrAP), AC3 (REn) e
a proteína da capa AV1 (CP). O componente B codifica as proteínas envolvidas
com o movimento sistêmico BV1 (MP) e movimento célula a célula BC1 (NSP)
do vírus na planta (RUIZ-MEDRANO et al., 1999).
Coletivamente, os geminivírus infectam uma variedade de culturas
agronomicamente importantes causando grandes restrições à produtividade
agrícola, particularmente em regiões tropicais e subtropicais (ANDERSON &
POLSTON, 1997). Doenças causadas por geminivírus, transmitidos por mosca
branca, têm se tornado uma grande ameaça para a agricultura brasileira devido ao
grande aumento populacional da mosca branca e à introdução de um novo
biótipo do inseto com grande capacidade
de colonização de tomateiros.
Consistente com esta observação, tem sido constatado no Brasil uma proliferação
crescente de geminivírus que infectam tomateiros.
Entretanto, o interesse científico em geminivírus não está limitado à sua
importância como fitopatógeno. Por causa de sua genoma simples e dependência
extensiva da maquinaria biossintética do hospedeiro para replicação, os
geminivírus constituem excelentes modelos para análise de replicação,
transcrição e transporte inter e intracelular em plantas. Devido a sua relevância
científica e agronômica, alguns geminivírus têm sido intensamente caracterizados
molecularmente (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999). Apesar dos avanços
alcançados na biologia molecular do vírus, pouco se sabe à respeito das
interações entre geminivírus e as células hospedeiras.
Os geminivírus são altamente dependentes de fatores do hospedeiro para
sua proliferação (LIU et al., 1999). Interações entre fatores do hospedeiro e
proteínas dos geminivirus têm sido caracterizadas nos últimos anos, tendo sido
identificados fatores do hospedeiro que interagem com proteínas codificadas
pelos vírus Bean golden mosaic virus (BGMV), Africa cassava mosaic virus
(ACMV) e Tomato golden mosaic virus (TGMV) (KONG & HANLEYBOWDOIN, 2002; MORIN et al., 2000; SETTLAGE et al., 2001). Entretanto,
estes estudos foram limitados à identificação de fatores do hospedeiro que
interagem com a proteína de replicação de geminivírus. Da mesma forma que o
2
processo de replicação do genoma viral, o movimento do genoma viral célula a
célula e, em alguns casos, o movimento sistêmico na planta hospedeira é
dependente também de interações com fatores do hospedeiro (HEATON & LIN,
2001). Entretanto, os fatores do hospedeiro que interagem com as proteínas de
movimento dos geminivírus não foram identificadas.
O estudo dos mecanismos envolvidos na interação patógeno:hospedeiro
torna-se, portanto, de extrema importância para se entender o desenvolvimento
da doença e os prováveis mecanismos de resistência que são ativadas durante a
infecção por geminivírus. Sendo assim, o propósito principal dessa investigação
foi o isolamento de fatores do hospedeiro que interagem com a proteína NSP de
Tomato golden mosaic virus (TGMV) por meio do sistema duplo-híbrido de
leveduras. Além disso, interações entre as diferentes proteínas virais proteínas
virais foram avaliadas.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Organização genômica dos geminivírus e função gênica
Geminivírus são vírus de DNA fita simples com aproximadamente
2,6 Kb, organizados em um ou dois componentes, denominados A e B. Os vírus
com apenas um componente possuem cerca de seis a sete quadros abertos de
leitura (“ORF, open reading frame”), que codificam as proteínas envolvidas na
replicação, movimento e encapsidação do genoma viral (Figura 1).
Nos curtovírus, cujo membro típico é o monossegmentado Beat curl top
virus (BCTV), são observados sete ORFs: C1, C2, C3 e C4 na unidade de
transcrição da fita complementar e V1, V2 e V3 na unidade senso
(LAZAROWITZ, 1992). Os produtos das ORFs da fita complementar estão
envolvidos na replicação e na transativação das ORFs da unidade senso, que por
sua vez, estão envolvidas no desenvolvimento de sintomas sistêmicos e
empacotamento do genoma viral (BRIDDON et al., 1989 e STENGER et al.,
1996). Os curtovírus têm a particularidade de serem provavelmente originados da
fusão por recombinação da unidade de transcrição à esquerda do componente A
dos begomovírus com a unidade localizada à direita do componente genômico
dos mastrevírus. Análises de comparação de seqüência e homologia de função
dos genes virais reforçam esta hipótese (RYBICKY, 1994).
4
C2690
+DNA
V247
C1
V392
V428
V466
C1
C4
+DNA
V2
V3
BCTV
V2
2933bp
WDV
Splice
juntions
V1
2749bp
V1
C2
C2
-DNA
AL2540
AL2515
AL61
AL1
BL2449
+DNA
AR1319
CR
CR
AL4
AL1935
BL62
+DNA
BL2237
V2
BR446
AR1
BL1
TGMV B
TGMV A
BR1
2522 bp
2586 bp
AL2
AL1629
AL3
Figura 1. Organização genômica de representantes da família Geminiviridae. A
organização genômica dos componentes A (TGMV A) e B (TGMV B)
do vírus Tomato golden mosaic virus é mostrada na parte superior da
Figura, representando o gênero Begomovirus. Beet curly top vírus
(BCTV) representa o gênero Curtovirus, Tomato pseudo curl top vírus
(TPCTV), o gênero Topocuvirus e Wheat dwarf vírus (WDV), o
gênero Mastrevirus. As setas indicam a direção da transcrição e a
extensão relativa dos genes indicados, RC indica a região comum.
5
O único componente genômico do Maize Streak Virus (MSV), membro
típico do gênero Mastrevirus, codifica quatro ORFs denominadas V1, V2 (na fita
do virion) e C1, C2 (na fita complementar) (Figura 1). Os produtos das ORFs da
fita senso estão envolvidos no desenvolvimento de sintomas sistêmicos e no
empacotamento, enquanto que os da fita complementar, na replicação. Além da
região intergênica maior (LIR- “Large Intergenic Region”), os geminivírus desse
gênero possuem a chamada região intergênica menor (SIR - “Small Intergenic
Region”) ao final das unidades transcricionais divergentes (STANLEY, 1993;
BOULTON et al., 1993 e RYBICK, 1994).
O recém criado gênero Topocuvirus é representado pela espécie Tomato
pseudo curly top virus (TPCTV) (BRIDDON et al., 1996). O genoma deste vírus
possui seis ORFs. A unidade transcricional da fita complementar ao vírion possui
quatro ORFs sobrepostas denominadas C1, C2, C3, e C4, assim como ocorre nos
vírus dos gêneros Curtovirus e Begomovirus. Na fita do sentido viral, o TPCTV
possui duas ORFs, V1, a capa protéica e V2, a proteína de movimento, numa
organização similar a que ocorre no BCTV. Entretanto, ao nível de seqüência, as
ORFs de TPCTV divergem significativamente de suas correspondentes nos
demais geminivírus.
Os begomovírus possuem as proteínas de replicação e movimento em
componentes genômicos separados (Figura 1). O componente A contêm os genes
que codificam para as proteínas Rep (AC1) e REn (AC3) envolvidas com a
replicação do genoma viral, a proteína TrAp (AC2), relacionada à transativação
dos gene CP (AR1) e NSP (BV1) e a proteína CP (AR1) formadora do
nucleocapsídeo (LAZAROWITZ, 1992). O componente B possui os genes que
codificam para as proteínas de movimento NSP (BV1) e MP (BC1). Esses
componentes possuem uma região denominada região intergênica ou região
comum (CR ou IR) praticamente idêntica entre os componentes de um mesmo
vírus (FONTES et al., 1994a e 1994b, OROZCO et al., 1996 e 1998) .
Na região comum (RC), ocorre o início da transcrição dos genes virais
em ambas as fitas, viral e complementar (STANLEY & GAY, 1983,
HAMILTON et al., 1984). Essa região contém seqüências promotoras que são
6
reconhecidas pela RNA polimerase II, responsável pela transcrição divergente
dos genes virais e a origem de replicação da fita positiva (OROZCO et al., 1996).
A região comum contém uma sequência repetida inversa, conservada em todos
os geminivírus, que tem a capacidade de formar uma estrutura em forma de
grampo, que é requerida para a replicação do genoma viral. Na alça dessa
estrutura, encontra-se a seqüência conservada 5'-TAATATTAC, que contêm o
sítio sobre o qual a proteína Rep atua promovendo a clivagem específica na fita
positiva do genoma viral para iniciar a replicação círculo rolante (LAUFS et al.,
1995; STANLEY, 1995). Mutações na seqüência conservada causam uma
inibição da replicação do DNA viral in vivo (OROZCO & HANLEYBOWDOIN, 1996). A região comum contém ainda o sítio de ligação específico
para Rep, além de outros cis-elementos que contribuem para o reconhecimento
específico da origem (OROZCO et al., 1998).
A região comum também delimita duas unidades de transcrição
divergentes, uma na fita viral e outra na fita complementar do vírion. Os RNAs
resultantes da transcrição das ORFs presentes no DNA viral são poliadenilados e
iniciam-se “upstream” da seqüência consenso TATA ou de elementos
iniciadores, o que indica que eles são realmente transcritos pela RNA polimerase
II do hospedeiro (HANLEY- BOWDOIN et al., 1999).
Os geminivírus replicam seu DNA via o mecanismo de círculo rolante no
núcleo de células de plantas infectadas, sendo a proteína Rep (“Replication
associated protein”) a única proteína viral essencial para suportar o processo de
replicação do genoma viral na presença de fatores do hospedeiro (STANLEY et
al., 1995, HANLEY-BOWDOIN, 1996). A proteína Rep é uma proteína
multifuncional que tem atividade seqüência-específica de ligação ao DNA dupla
fita (FONTES et al., 1992; 1994a e 1994b), catalisa a clivagem e ligação do
DNA durante a síntese de ssDNA (HEYRAUD-NITSCHKE et al., 1995; LAUFS
et al., 1995), possui atividade repressora sobre a transcrição de seu promotor de
forma vírus específica (EAGLE et al., 1994) e induz a expressão de proteínas do
hospedeiro (NAGAR et al., 1995). Recentemente, os domínios responsáveis
pelas diversas funções da proteína Rep têm sido mapeados. Experimentos com
7
versões truncadas da proteína Rep do Wheat dawrf virus (WDV), Tomato yellow
leaf curl virus (TYLCV) e TGMV demonstraram que a região aminoterminal da
proteína é capaz de realizar a clivagem e a ligação do DNA in vitro
(HEYRAUD-NITSCHKE et al., 1995; OROZCO et al., 1997). O domínio de
oligomerização de Rep de TGMV, assim como o domínio de ligação desta
proteína à proteína viral REn também foram mapeados e encontram-se entre os
aminoácidos 132 a 180 (OROZCO et al., 2000; SETTLAGE et al., 2001). Já a
região carboxi-terminal da proteína Rep contêm o domínio de ATPase,
localizado entre os aminoácidos 182 a 352 (OROZCO et al., 1997). Estudos
bioquímicos revelaram que a proteína Rep de geminivírus exibe atividade de
endonuclease seqüência-específica necessária para o início de replicação da fita
positiva (HEYRAUD-NITSCHKE et al., 1995; LAUFS et al., 1995 OROZCO &
HANLEY-BOWDOIN, 1996). Além disso, Rep atua de maneira vírus-específica,
reconhecendo a origem de replicação cognata, através de interação específica
com seu sítio de ligação (FONTES et al., 1994a). O sítio de ligação da proteína
Rep foi mapeado no genoma de TGMV e consiste de um elemento de 13 pb com
duas seqüências repetidas diretas (FONTES et al., 1994b), sendo este domínio
requerido não só para o reconhecimento da origem de replicação como para a
regulação negativa da transcrição de seu gene (EAGLE et al., 1994).
A proteína REn (“Replication Enhancer”) está associada ao acúmulo de
DNA viral durante o processo de infecção, podendo formar multímeros com a
proteína Rep; entretanto, esta proteína não é essencial para a replicação do
genoma viral (SUNTER et al., 1990, SETTELAGE et al., 1996). Mutações nesta
proteína causam decréscimo na eficiência de replicação do genoma viral e
atenuação de sintomas. Durante a infecção viral, a proteína REn acumula no
núcleo em níveis similares aos observados para a proteína Rep, sugerindo uma
ação conjunta durante o processo de replicação do genoma viral (PEDERSEN et
al., 1994; NAGAR et al., 1995). Experimentos realizados com proteínas REn
heterólogas demonstraram que esta proteína não contribui de maneira
significativa para a especificidade de replicação do genoma de geminivírus
(SUNTER et al., 1994). A região que codifica para as proteínas TrAP e REn,
8
denominada AL23, de Bean golden mosaic virus (BGMV) e TGMV também foi
caracterizada como sendo uma das regiões responsáveis pela especificidade de
hospedeiro; porém, o mecanismo pelo qual este evento ocorre ainda não foi
elucidado (GILLETTE et al., 1998).
A proteína TrAP (“Transactivator protein”) possui a atividade de
ativador transcricional, sendo importante na regulação da expressão de genes
virais NSP e CP (HAYES & BUCK, 1989; SUNTER & BISARO, 1992).
Elementos conservados, presentes em promotores de genes de expressão tardio
de muitos geminivírus têm sido identificados como alvos funcionais da proteína
TrAP transativador (TrAP) geminiviral. Mutações nestes elementos mostram que
eles perdem a capacidade de serem transativados por TrAP (RUIZ-MEDRANO
et al., 1999). Além disso, durante a infecção por African cassava mosaic virus
(ACMV), a proteína TrAP é capaz de ativar um transgene que encontra-se sob o
controle do promotor de CP (HONG et al., 1996). TrAP também mostrou-se
capaz de ativar promotores cromossomais influenciando a expressão de genes do
hospedeiro (SUNTER & BISARO, 1994). Embora o mecanismo de atuação da
proteína TrAP não tenha sido elucidado, sabe-se que a proteína TrAp tem a
capacidade de se ligar a zinco e de sofrer modificações pós-traducionais como
fosforilação (HARTITZ et al., 1999). Análises de seqüência mostraram que TrAp
contém ainda um domínio ácido na região carboxi-terminal responsável pela
ativação da transcrição e experimentos, utilizando o sistema duplo-híbrido de
levedura, confirmaram a função de ativador transcricional exercida pela proteína
TrAP (HARTITZ et al., 1999).
A ORF AC4 é uma ORF pequena contida dentro da seqüência do DNA
que codifica para proteína Rep, porém, em diferente quadro de leitura. A ORF
AC4 de begomovírus bissegmentados possui o homólogo C4 em curtovírus, que
codifica uma proteína de massa molecular de 10 KDa (ELMER et al., 1988).
Experimentos com plantas transgênicas contendo genes repórteres fusionados a
promotores do gene Rep de TGMV mostraram que a expressão de Rep pode ser
regulada por AC4 de begomovírus (GRÖNING et al., 1994; EAGLE et al., 1997)
Porém, mutações na ORF AC4 de TGMV não interfere no processo de infecção
9
viral e, consequentemente, a função biológica da proteína permanece
indeterminada (POOMA et al., 1996).
As proteínas codificadas pelo componente B estão envolvidas com o
movimento do vírus durante a infecção, uma vez que na ausência dessas
proteínas, os vírus são incapazes de se movimentarem na planta hospedeira
(ELMER et al., 1988; ETESSAMI et al., 1988). As proteínas MP (‘Movement
protein”) e NSP (“Nuclear shuttle protein”) parecem atuar conjuntamente
facilitando o movimento do genoma viral (SANDERFOOT & LAZAROWITZ,
1995; PASCAL et al., 1994). O gene MP (BC1) codifica a proteína responsável
pelo movimento célula-célula do vírus, sendo necessária também para a
patogenicidade de geminivírus bissegmentados (INGHAM et al., 1995).
A proteína MP de Squash leaf curl virus (SqLCV) foi localizada na
membrana plasmática por meio de experimentos de imunolocalização (PASCAL
et al., 1994). A proteína MP de Bean dwarf mosaic virus (BDMV) é capaz de
aumentar o limite de exclusão do plasmodesma quando introduzida em células
por meio de microinjeção, sendo capaz ainda de mediar o movimento do genoma
viral para a célula adjacente (NOUEIRY et al., 1994).
A proteína MP de SqLCV foi também detectada na mesma fração do
retículo endoplasmático pela sua co-localização com a proteína BiP (“Binding
protein”), que é uma proteína residente do retículo endoplasmático (WARD et
al., 1997). Baseado nessas observações foi proposto que a MP é capaz de
interagir com o retículo endoplasmático, formando canais para o movimento
intercelular.
A proteína de movimento NSP apresenta sinal de transporte nuclear
(NES), e um sinal de localização nuclear (NLS), atuando como “nuclear shuttle
protein” (LAZAROWITZ et al., 1999). Essa proteína possui a capacidade de
interagir com o DNA viral fita simples facilitando o seu transporte do núcleo
para o citoplasma. Experimentos realizados com a MP e NSP de SqLCV
demostraram que a proteína MP relocaliza a proteína NSP na periferia da célula,
enquanto que, na ausência da proteína MP, NSP localiza-se no núcleo
(SANDERFOOT & LAZAROWITZ, 1995). Tem sido demonstrado que as
10
proteínas MP e NSP de SqLCV sofrem modificações pós-traducionais, sendo
fosforiladas durante o processo de translocação do genoma viral (PASCAL et al.,
1994). Consistente com o envolvimento dessas proteínas com o movimento do
genoma viral, MP e NSP exibem atividade de ligação ao DNA (PASCAL et al.,
1994, ROJAS et al., 1998). No caso de SqLCV, ensaios de ligação ao DNA in
vitro demonstraram que NSP liga a ssDNA com alta afinidade, enquanto que a
proteína MP parece ter baixa afinidade por ácidos nucléicos (PASCAL et al.,
1994). No entanto, as proteínas MP e NSP de BDMV exibem afinidade e
especificidade de interação ao DNA similares, caracterizada pelo reconhecimento
dependente de forma e tamanho do DNA (ROJAS et al., 1998).
2.2. Movimento do genoma viral durante o processo de infecção
Para que os vírus de planta produzam uma infecção produtiva é
necessário que eles se movimentem célula-à-célula e sistemicamente no
hospedeiro. O movimento célula-à-célula é mediado por proteínas virais
denominadas proteínas de movimento que alteram a arquitetura da célula
infectada possibilitando a superação da barreira intracelular, constituída pela
parede celular. Estudos detalhados em vários vírus que relicam no citoplasmática
sugerem que as proteínas de movimento interagem com os componentes do
citoesqueleto (HEATON & LIN, 2001) e com o sistema de transporte intercelular
para permitir o movimento viral (SOELLICK et al., 2000). Pelo fato dos
geminivírus apresentarem replicação nuclear, o transporte desses vírus requer
uma etapa adicional que é o deslocamento dos genomas virais recém replicados
do núcleo para o citoplasma. O transporte intracelular do genoma viral requer
uma proteína de movimento adicional, designada NSP, além da proteína
envolvida no transporte célula-à-célula, designada MP. Assim, o movimento do
genoma viral é facilitado pela ação cooperativa entre as duas proteínas de
movimento NSP e MP (Figura 2) (SANDERFOOT & LAZAROWITZ, 1995;
SANDERFOOT & LAZAROWITZ, 1996).
11
A
NES
d e p e n d e n te
MP
NSP
N LS
d e p e n d e n te
RE
B
NES
d e p e n d e n te
MP
NSP
NLS
d e p e n d e n te
RE
Figura 2. Modelos para o movimento intercelular dos geminivirus na planta
hospedeira. A. A proteína NSP forma, inicialmente, um complexo
com o DNA viral, este complexo sai do núcleo em direção ao
citoplasma, onde, na presença da proteína de movimento MP é
translocado para periferia celular. A MP aumenta então o limite de
exclusão do plasmodesma possibilitando a passagem do complexo
NSP-DNA viral de uma célula a outra. B. A proteína NSP forma um
complexo com o DNA viral e juntamente com a proteína de
movimento MP se move de uma célula a outra por mio d tubulo
formdos a partir do RE.
12
Além das proteínas virais, o transporte de geminivírus pode envolver a
formação de microtúbulos em células recém infectadas. Em células infectadas
por SqLCV, foi observado a formação de túbulos, ausentes em plantas sadias ou
inoculadas com mutantes de MP defectivos em movimento (WARD et al., 1997).
Experimentos de marcação evidenciaram a ligação da proteína MP a esses
túbulos, assim também a foi co-localização da proteína BiP (“Binding protein”).
O fato da proteína BiP ser um chaperone molecular residente no retículo
endoplasmático sugere que estes túbulos são originários do RE (WARD et al.,
1997). PASCAL et al. (1994) observaram a formação do complexo NSP-ssDNA
e propuseram que o genoma de SqLCV se move de uma célula a outra por meio
de interações com túbulos que atravessam a parede de células meristemáticas do
floema e cuja formação é induzida pelo vírus (Figura 2B). Entretanto, os
experimentos de microinjeção realizados por NOUEIRY et al. (1994) mostraram
que a proteína MP de BDMV aumenta o limite de exclusão do plasmodesma,
atuando como mediadora do movimento intercelular do genoma viral,
independentemente de estruturas tubulares. No contexto desse modelo de
movimento, tem sido sugerido que após a formação do complexo NSP-DNA, a
proteína NSP transfere o genoma viral para a proteína MP e o complexo
MP-DNA se move de uma célula a outra. Recentemente, experimentos realizados
com os genes MP e NSP fusionados a genes repórteres e utilizadas em ensaios de
biobalística, demonstraram que o complexo NSP-DNA e não MP-DNA, é que se
move de uma célula a outra (Figura 2A) (ZHANG et al., 2001).
2.3. Interação de proteínas virais com proteínas do hospedeiro
O processo de infecção de vírus de plantas depende do processo de
replicação do genoma viral, do movimento célula-célula do vírus na planta
hospedeira e do movimento sistêmico, que geralmente são dependente de fatores
do hospedeiro (HEATON & LIN, 2001). A família Geminiviridae é composta
por vírus que são altamente dependentes de fatores do hospedeiro para sua
13
proliferação (LIU et al., 1999). Experimentos realizados com BGMV
demonstraram que esses vírus podem controlar o ambiente celular em células
diferenciadas de maneira a propiciar condições para a replicação viral (WANG
et al., 1996).
Fatores do hospedeiro são possivelmente inibidos ou ativados durante a
infeccão viral por proteínas produzidas pelo patógeno. Análises de interações
proteína-proteína têm sido feitas com a utilização do sistema duplo-híbrido de
leveduras, capaz de identificar proteínas do hospedeiro que são capazes de
interagir com proteínas virais (Figura 3). O sistema duplo-híbrido envolve a
expressão de proteínas quiméricas em leveduras, onde a proteína "isca" é
fusionada ao domínio de ligação do fator transcricional GAL4 de leveduras.
Seqüências que codificam a proteína "alvo", são fusionadas à seqüência do
domínio de ativação do fator transcricional GAL4. A restauração funcional da
proteína GAL4 é mediada pela interação das proteínas "isca" e "alvo"
posicionando os domínios de ligação e ativação de GAL4 no promotor alvo
(FEILOTTER et al., 1994).
Com a utilização do sistema duplo-híbrido, foi possível detectar
interações específicas entre a proteína Rep de WDV e a proteína retinioblastoma
humana (ACH et. al., 1997). As retinoblastomas são proteínas que alteram o
ciclo celular, podendo participar da regulação de um dos eventos que determinam
a transição da fase G1 para a fase S. A identificação de proteínas homólogas à
proteínas da família retinoblastoma em plantas, sugere uma estreita relação entre
a regulação do ciclo celular de plantas e animais. O domínio de ligação a Rb,
LXCXE, está presente em proteínas associadas à replicação de alguns vírus de
plantas, como o WDV, Maize streak virus (MSV) e Digitaria streak virus (DSV)
(HORVÁTH et al., 1998). A proteína RB humana interage ainda com a proteína
DNA5 do Banana bunch top virus (BBTV), um vírus de ssDNA que infecta
plantas e possui seis componentes genômicos (WANITCHAKORN et al., 2000).
Embora a proteína Rep de TGMV não possua o domínio clássico de
interação a Rb (LXCXE), foi demonstrado que esta proteína interage com a
14
A
Isca
BD
UAS
Promotor
Genes reporter
AD
Alvo
B
UAS
Promotor
Genes reporter
Promotor
Genes reporter
AD
C
Isca
Alvo
BD
UAS
Figura 3. Representação esquemática do funcionamento do sistema duplohíbrido. A. A proteína “isca” fusionada ao domínio de ligação ao
DNA (BD) se liga a seqüência UAS mas não capaz de ativar a
transcrição dos genes repórteres. B. As proteínas “alvo”, codificadas
pela biblioteca de cDNA, fusionadas ao domínio de ativação de Gal4
(AD) não conseguem se ligar ao DNA consequentemente ativar a
transcrição dos genes repórteres. C. Interação entre as proteínas
“isca” e “alvo”, resultando na restauração de Gal4 consequentemente
na expressão dos genes repórteres.
15
proteína retinoblastoma, e que o domínio de interação esta localizado entre os
aminoácidos 134 a 180 (SETTLAGE et al., 2001). Este domínio se sobrepõe ao
domínio de interação à proteína viral REn. Experimentos realizados com
proteínas recombinantes mostram que a proteína REn de TGMV também é capaz
de interagir com a proteína retinoblastoma de milho. Essa interação sugere que o
complexo REn/Rep e não Rep/Rb seja funcional para o início da replicação de
geminivírus.
O escrutínio de uma biblioteca de cDNA de Arabdopsis thaliana
utilizando o sistema duplo-híbrido e usando como isca a proteína Rep de
Cabasse leaf curly virus (CbLCV), foi realizado com a finalidade de identificar
fatores do hospedeiro que estão envolvidos no processo de infecção (KONG &
HANLEY-BOWDOIN, 2002). Foram identificados três cDNAs cujas proteínas
codificadas interagem com a proteína Rep de TGMV. A proteína Rep foi capaz
de interagir com a histona H3, o que é consistente com a função da proteína Rep
durante o processo de replicação do DNA viral. A ligação da proteína Rep à
histona H3 pode alterar ou desfazer os nucleossomos, facilitando assim a
replicação e transcrição do genoma viral. O segundo cDNA identificado foi o que
codifica para proteína denominada GRIMP. Essa proteína, além de um domínio
de cinase, contêm em sua região central um domínio de ligação à ciclina (cdc2),
o que sugere sua participação no processo de divisão celular. A região central
também é responsável pela interação com a proteína viral Rep. Experimentos de
imunolocalização mostraram que a proteína GRIMP foi localizada no fuso e em
cromossomos condensados durante a mitose. A interação GRIMP/Rep pode estar
relacionada com a condensação da cromatina observada em células infectadas
por meio de hibridização in situ (BASS et al., 2000). Nestes experimentos foi
demonstrado que células de N. benthamiana infectadas por TGMV apresentavam
a cromatina condensada em estágio semelhante àquele observado em células em
prófase.
O domínio de Rep que interage com GRIMP também interage com a
proteína GRIK, cujo cDNA foi identificado pela capacidade interagir com a
proteína Rep (KONG & HANLEY-BOWDOIN, 2002). A GRIK é uma proteína
16
cinase citoplasmática, não relacionada a receptores de cinase e tem sua expressão
regulada durante o desenvolvimento da planta, possuindo altos níveis em folhas
jovens. Experimentos mostraram que a proteína GRIK não fosforila Rep, o que
sugere que Rep pode recrutar o substrato para proteína GRIK, em células
infectadas.
Estudos relacionados aos processos pelos quais ocorre a transmissão do
vírus pelo inseto vetor ainda são pouco difundidos. Experimentos in vitro
demonstraram a afinidade entre uma proteína homóloga a GroEL, encontrada em
mosca branca e partículas do Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (MORIN
et al., 1999). A utilização do sistema duplo-híbrido permitiu verificar a interação
ente a proteína GroEL e a proteína CP de dois geminivírus Abutilon mosaic virus
(AbMV) e Tomato yellow leaf curl virus – Israel (TYLCV-Is), uma vez que
experimentos anteriores demonstraram o envolvimento da proteína CP na
transmissão pelo inseto vetor (MORIN et al., 2000). A interação entre a proteína
CP e a proteína GroEL pode estar envolvida na especificidade do vírus pelo vetor
na família Geminiviridae.
Embora evidências sugerem que o movimento célula à célula e sistêmico
de geminivírus na planta infectada seja absolutamente dependente de interações
com fatores do hospedeiro, as bases moleculares dessas interações ainda não
foram elucidadas. Entretanto, caracterizações moleculares de interações entre
proteínas virais de movimento e fatores do hospedeiro têm sido conduzidas para
outras famílias de vírus de planta.
Os Tospovirus são vírus de RNA fita simples que infectam plantas. O
RNA S de Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV) codifica as proteínas do
nucleocasideo (N) e de movimento (NSm), que parecem estar envolvidas com o
movimento do vírus na planta (UHRIG et al., 1999). A avaliação da capacidade
de multimerização da proteína N por meio do sistema duplo híbrido mostra que
essa proteína é capaz de formar homomultímeros in vivo, sugerindo que essa
proteína possa estar relacionada ao reconhecimento especifico e ligação correta
ao RNA viral. KORMELINK et al. (1994) sugeriram que as proteínas N e NSm
de TSWV interagem formando estruturas tubulares que facilitam o movimento
17
do vírus célula-célula. A interação entre essas proteínas foi confirmada por meio
de experimentos, utilizando também o sistema duplo-híbrido de leveduras. Uma
vez que a proteína N de TSWV tem sido relacionada à formação do
nucleocapsídeo, esta interação pode sugerir o reconhecimento específico de
estruturas presentes no nucleocapsídeo (SOELLICK et al., 2000). Utilizando o
sistema duplo híbrido, foi demostrado que a proteína NSm de TSWV interage
com proteínas homólogas à família DnaJ de Nicotiana tabacum e A. thaliana. As
proteínas da subclasse da família que contêm o domínio DnaJ podem se ligar às
chaperoninas Hsp70, regulando sua atividade através de modificações
conformacionais e estimulação da hidrólise de ATP (KELLEY, 1998). A
interação entre a proteína NSm/DNAJ sugere o recrutamento de Hsp70 durante o
processo de translocação do genoma viral (SOELLICK et al., 2000).
O TMV é um vírus de RNA que codifica uma proteína relacionada ao
movimento do genoma viral muito bem caracterizada. Essa proteína de 30kDA é
capaz de interagir com o plasmodesma aumentando o limite de exclusão e
facilitando a translocação do genoma viral célula-célula (WAIGMANN et al.,
1994; WOLF et al., 1989). Experimentos para a detecção de fatores do
hospedeiro que interagem com a MP de TMV, mostraram que a MP se liga a
uma pectina metiltransferase (PME), uma proteína ligada à parede celular
(CHEN et al., 2000). Esta proteína é também capaz de interagir com a MP de
Turnip vein clearing virus (TVCV) e de Cauliflower mosaic virus (CaMV). A
PME modula o pH e o transporte de íons, o que afeta a porosidade da parede
celular (PRESSEY et al., 1984; NAIRN et al., 1998). Deleções no domínio de
interação entre a MP e PME levam à perda da capacidade de infecção do vírus na
planta hospedeira, sugerindo uma função biológica para esta interação durante o
movimento célula a célula do vírus (WAIGMANN et al., 1994). A interação
MP-PME pode estar relacionada a induções de mudanças da permeabilidade do
plasmodesma (CHEN et al., 2000). Interações entre proteínas cinase e a MP de
TMV também foram detectadas (CITOVSKY et al., 1993). Estes estudos
sugerem que a fosforilação de proteínas seja um mecanismo pelo qual a planta
regula o transporte de macromoléculas na célula. A fosforilação da proteína MP
18
de TMV parece atuar como um regulador negativo no transporte através do
plasmodesma, dificultando o tráfego do genoma viral (WAIGMANN et al.,
2000). O efeito regulatório sobre a permeabilidade do plasmodesma pode ser
variável de acordo como hospedeiro, o que poderia contribuir para a
susceptibilidade diferencial das diferentes plantas hospedeiras.
O Turnip crinkle virus (TCV) é um vírus de RNA que codifica duas
proteínas envolvidas no movimento do genoma viral (HACKER et al., 1992).
Experimentos realizados com a proteína viral p8 mostraram que esta interage
com a proteína Atp8 de A. thaliana (HEATON & LIN, 2001). Atp8 possui dois
domínios transmembrana e duas seqüências RDG. A seqüência de aminoácidos
RDG está relacionada à interação com integrinas (ROIVAINEN et al., 1994;
WICKHAM et al., 1993), o que sugere que esta proteína pode estar envolvida no
movimento célula-célula do vírus na planta (HEATON & LIN, 2001). TCV,
similarmente ao que acontece em vírus animais, pode utilizar interações tipo
RDG-integrinas-citoesqueleto para facilitar o seu movimento na planta
hospedeira.
Em resumo, o sistema duplo híbrido em leveduras tem sido amplamente
utilizado para detectar interações vírus-hospedeiro. Particularmente no caso de
geminivírus, as interações identificadas se concentram no processo de replicação
do genoma viral, especialmente no que se refere ao isolamento de cDNAs de
proteínas que interagem com a proteína Rep. Assim também, evidências indicam
que ocorre uma interação produtiva entre a proteína CP de geminivírus e a
proteína GroEL do inseto vetor, durante o processo de transmissão. Quanto ao
mecanismo de movimento do genoma viral na planta hospedeira, enquanto que
as evidências demonstram uma dependência absoluta de fatores do hospedeiro,
conforme demonstrado pelas interações identificadas entre proteínas de
movimento de vírus de RNA e proteínas do hospedeiro, nenhuma interação
específica vírus-hospedeiro possivelmente envolvida no movimento de
geminivírus tem sido identificada, o que constitui objetivo primordial dessa
investigação.
19
3. OBJETIVOS
No Brasil tem sido recentemente identificado um grande aumento
populacional de geminivírus em tomateiros. Contudo o conhecimento sobre as
interações patógeno:hospedeiro e movimento do vírus célula:célula ainda é
restrito. Pouco se sabe sobre fatores do hospedeiro que são induzidos ou inibidos
durante a infecção viral. Esses fatos argumentam a favor do desenvolvimento de
pesquisas que definam estratégias gerais eficientes para resistência engenheirada
aplicáveis contra diversos membros da família Geminiviridae. Sendo assim o
objetivo geral desse trabalho foi estudar os mecanismos envolvidos na interação
patógeno:hospedeiro na infecção de tomateiros pelo vírus TGMV envolvidos no
processo de movimento do genoma viral no hospedeiro. Especificamente a
verificação da ocorrência de interações entre as proteínas de movimento viral
NSP e MP de TGMV e o isolamento de fatores do hospedeiro que interagem com
a proteína de NSP.
20
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Clonagem dos genes virais nos vetores pADGAL4 e pBDGAL4 Cam
4.1.1. Clonagem do gene REn em pBDGAL4 Cam
O gene que codifica a proteína viral REn foi amplificado por PCR
(“Polymerase Chain Reaction”) a partir do clone pTG 1.3A, que contém
1,3 cópias do componente A de TGMV (Tomato golden mosaic virus), utilizando
os oligonucleotídeos específicos AL3FECO1453 e AL3RSM1003 (Tabela 1). As
sequências dos oligonucleotídeos introduzem os sítios para enzimas de restrição
Eco RI e Pst I nas extremidades 5´e 3´do gene Ren, respectivamente. A reação de
amplificação foi conduzida em um termociclador MJ RESEARCH Peltier
Thermal Cycler 200 com incubação inicial de 1 min a 94oC, seguido por
30 ciclos consecutivos de 94oC por 45 seg para desnaturação, 50oC por 1 min
para anelamento e extensão por 1’30 min a 72oC. Após os ciclos, a reação foi
submetida a um período adicional de polimerização de 10 min a 72oC. Cada
reação continha além do DNA molde, 1 unidade de Pfu polimerase (Pharmacia
Biotech) e 20 pmoles dos oligonucleotídeos em um volume final de 100 µL.
Os
produtos
das
amplificações
foram
dessalinizados,
utilizando-se
o
“Kit Prep-A-Gene”(BIORAD) e, em seguida, digeridos com as enzimas de
restrição Eco RI e Pst I.
21
Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos genes MP, NSP,
REn e para amplificação de fragmentos inseridos nos vetores
pAD-GAL4 2.1 e pBD-GAL4 Cam
Oligonucleotídeos
Seqüência
5´gene MP
BL1FECO2185
GGGAGGTCTTCAGAATTCATGGATTC
3´gene MP
BL1RPS1612
CCTGTTAGATCTGCAGGGGGATCTG
5´gene MP
FCBL1PST1620
GGGCCTGTTAGATCTGCAGGCGGATC
3´gene MP
RBNBL1ECO2020
GTGTGATTGAATTCAGGCAACAGG
5´gene NSP
BR1F443 e
GGATATTATAAGTTAACATGTACTC
3´gene NSP
BR1RPS1250
AGTTGGCTGCAGTATGACATTATTG
5´gene REn
AL3FECO1453
CGACTGCAGAATTCATGGATTCACGC
3´gene REn
AL3RSM1003
TGCCTCTAACCCGGGGTATGCGACG
Vetor pADGAL4 2.1
AD745F
AGGGATGTTTAATACCACTAC
AD929R
GCACAGTTGAAGTGAACTTGC
GAL4BDF
GATTGGCTTCAGTGGAGACT
PBDR
GAAATTCGCCCGGAATTAGC
Vetor pBDGAL4 Cam
A região sublinhada representa o sítio da enzima de restrição introduzido por
mutações induzidas por PCR.
A reação de ligação do fragmento ao vetor foi conduzida de acordo com
técnicas padrões de clonagem molecular em plasmídeos (SAMBROOK et al.,
1989). Foi utilizada a proporção de 3:1 do DNA a ser clonado e do vetor
pBDGAL4 Cam (Tabela 2), previamente digerido com as mesmas enzimas de
restrição e desfosforilado. A reação de ligação foi feita em um volume de 15 µL,
na presença de 0,5 U da enzima T4 DNA ligase (GIBCO/BRL), Tris HCl 50 mM
pH 7,6, MgCl2 10mM, ATP 1mM, DTT 1mM, polietilenoglicol 8000 5% (p/v),
seguida de incubação a mistura incubada a 14°C por 24 horas.
Após a reação de ligação, 200µL da suspensão de células competentes de
E. coli, estirpe JM109, preparadas como descrito por SAMBROOK et al. (1989),
foram transformadas com 7,5 µL do DNA recombinante. Para transformar as
22
Tabela 2. Estirpes de leveduras e plasmídeos usados na presente investigação
Levedura
S. cerevisae
Estirpe
YRG-2
Características relevantes
Referência
Matα ura3 his3-200 ade-1-1 lys2-801 trp1-901
leu2-3 112 gal4-542 gal80-553 LYS::UASGAL1TATAGAL1-HIS3 URA3:: UASGAL4-TATAGCYC: lacZz
Stratagene
Plasmídeos
Características relevantes
Referência
leu2 AmpR Gal4AD
Stratagene
R
pBDGAL4 Cam trp1 Cam GAL4BD
Stratagene
pSV40
Stratagene
pADGAl4 2.1
pADGAL4 Cam contendo t-antisenso de SV40
R
pGAL4
leu2 Amp Gal4
Stratagene
pBD-NSP
pBDGAL4 Cam contendo ORF (807 pb) de NSP
Este trabalho
pBD-MP
pBDGAL4 Cam contendo ORF (573pb) de MP
Este trabalho
pBD-REn
pBDGAL4 Cam contendo ORF (450 pb) de REn
Este trabalho
pBD-Rep
pBDGAL4 Cam contendo ORF (1470 pb) de Rep
Este trabalho
pBD-AC4
pBDGAL4 Cam contendo ORF (261 pb) de AC4
Este trabalho
pAD-MP
pADGAL4 Cam contendo ORF (573pb) de MP
Este trabalho
pAD-tMP
pBDGAL4 Cam contendo ORF (400 pb)MP truncada
Este trabalho
pAD-NIK
pADGAL4 Cam contendo cDNA parcial (1000 pb) de NIK Este trabalho
pAD-GmNIK
pADGAL4 Cam contendo ORF (2200pb) GmNIK
Este trabalho
células competentes, a mistura contendo a suspensão de células e o DNA
recombinante foi mantida a 0°C por 30 minutos. Após um choque térmico de
1 minuto a 42°C, foi adicionado 1mL de meio LB e incubado a 37°C por 1 hora.
Em seguida, as células foram concentradas por centrifugação, ressuspendidas em
100 µL de meio LB e distribuídas em placa de Petri contendo meio LB contendo
cloranfenicol (SIGMA) 50 µg/mL, para seleção das colônias transformantes. O
clone resultante pUFV285 contém a seqüência codificadora de REn fusionada ao
domínio de ligação de Gal4.
23
4.1.2. Clonagem dos genes MP e NSP
Os genes MP e NSP foram amplificados por PCR (“Polymerase Chain
Reaction”) a partir do clone pTG 1.4B que contém 1,4 cópias do componente B
de TGMV. Nessa reação, foram utilizados oligonucleotídeos específicos que
introduziram sítios para enzimas de restrição apropriadas para clonagem nos
vetores pAD-GAL4 2.1 (Tabela 2) e pBD-GAL4 Cam (Stratagene) (Tabela 1).
As reações de amplificação foram conduzidas, conforme descrito no item 3.1.1.
O gene que codifica a proteína de movimento viral MP foi clonado no
vetor pAD GAL4 2.1 em duas versões, uma que codifica a proteína integral
obtida com a amplificação do gene utilizando os oligonucleotídeos
BL1FECO2185 e BL1RPS1612 e, em uma versão truncada obtida com os
oligonucleotídeos FCBL1PST1620 e RBNBL1ECO2020. Os fragmentos
amplificados foram digeridos com as enzimas Eco RI (GIBCO) e Pst I (GIBCO)
e clonados em pADGAL4 Cam, previamente digerido com as mesmas enzimas
de restrição, resultando nos clones pUFV208 e pUFV237. O clone pUFV208
contem uma versão truncada da proteína MP que codifica os aminoácidos da
posição 1 a 127, fusionado ao domínio de ativação de GAL4. No clone
pUFV237, a seqüência completa da proteína MP foi fusionada ao domínio de
ativação de GAL4. O gene que codifica a proteína MP também foi clonado nos
sítios Eco RI e Pst I do vetor pBDGAL4, dando origem ao clone pUFV 239.
O gene que codifica a proteína NSP foi amplificado a partir do DNA do
clone pTG 1.4B, utilizando–se os oligonucleotídeos BR1F443 e BR1RPS1250.
Após amplificação, o fragmento de DNA foi digerido com a enzima de restrição
Pst I e inserido nos sítios das enzimas de restrição Sma I e Pst I do vetor pBD
Gal4. O clone obtido foi denominado pUFV264.
4.2. Propagação dos clones em S. cerevisae estirpe YRG-2
Os clones obtidos no item anterior foram utilizados para transformação
da levedura S. cerevisae estirpe YRG-2 (Tabela 2). Aproximadamente 25 µl de
24
uma suspensão de células competentes foram transformadas com 100 ng do
plasmídeo em 240 µL de polietilenoglicol 50% (v/v), 36 µL acetato de lítio 1 M e
50 µL de ssDNA (DNA de esperma de salmão) na concentração 20 mg/mL. A
mistura foi incubada a 30 °C por 30 minutos e, posteriormente, a 20 min por 4°C.
A suspensão celular foi concentrada por centrifugação, ressuspendida em 200 µl
de meio SD (6,7 % de meio para leveduras sem dextrose e sem aminoácido –
YNB, BIO) e plaqueada em meio seletivo SD sem o aminoácido triptofano para
o clone pUFV264 ou em meio SD sem o aminoácido leucina para os clones
pUFV208 e 237. O diagnóstico dos transformantes foi realizado por PCR,
utilizando-se oligonucleotídeos específicos que flanqueiam o sitio de clonagem
nos vetores pBDGAL4 Cam ou pAD-GAL4 2.1 (Tabela 1) e os clones obtidos
propagados em S. cerevisae estirpe YRG-2 encontram-se descritos na Tabela 3.
Tabela 3. Clones obtidos em S. cerevisae estirpe YRG-2
Clone
Descrição
pUFV 343
(pBD-NSP)
Levedura YRG-2 transformada com a construção proveniente de pUFV264 (BD-NSP)
pUFV 344
(pAD-MP)
Levedura YRG-2 transformada com a construção proveniente de pUFV237 (AD-MP)
pUFV 346
(pGAL4)
Levedura YRG-2 transformada com DNA de pGAL4
pUFV 349
(pAD-MP+
pBD-NSP)
Levedura YRG-2 transformada com a construção proveniente de pUFV237 (AD-MP) e
pUVF 264 (BD-NSP)
pUFV 360
(pBD-REn)
Levedura YRG-2 transformada com a construção proveniente de pUFV285 (BD-REn)
pUFV 361
(pAD-tMP+
pBD-NSP)
Levedura YRG-2 transformada com a construção proveniente de pUFV208 (AD-tMP) e
pUFV 264(BD-NSP)
pUFV 370
(pAD-MP+
pBD-MP)
Levedura YRG-2 transformada com a construção proveniente de pUFV237 (AD-MP) e
pUFV 239(BD-MP)
25
4.3. Determinação da atividade de ativação transcricional e/ou atividade de
ligação ao DNA de proteínas virais
A atividade de ativação transcricional ou de ligação ao DNA foi avaliada
segundo a metodologia descrita por SONG et al. (1994), utilizando o o-nitrofenol
β-D-galactopiranosídeo
(ONPG).
Neste
ensaio,
células
transformadas
com a construção apropriada foram crescidas em meio seletivo durante
24 horas e as absorvâncias (OD600) foram ajustadas para 1,0 em 100 µl do
tampão Z (Na2HPO4.7 H2O 60 mM, NaH2PO4. H2O 40 mM, pH 7,0, KCl 10 mM,
MgSO4.7H2O 1 mM). Em seguida, as celulas foram rompidas em nitrogênio
líquido. Foram adicionados às amostras 700 µL de tampão Z com
β-mercaptoetanol
e
160
µL
de
uma
solução
de
o-nitrofenol
β-D-galactopiranosídeo 14,6 mM diluído em tampão Z. Às amostras foram
incubadas a 30°C até que houvesse o desenvolvimento de uma cor amarela,
resultado da atividade da enzima β-galactosidase e, em seguida, a reação foi
bloqueada usando 400 µL de uma solução de Na2CO3 1M. A atividade foi
determinada de acordo com a equação sugerida por SONG et al. (1994).
4.4. Identificação da interação entre a proteína nsp e proteíns do hospedeiro
4.4.1. Construção da biblioteca de cDNA de tomate (Lycopersicum
esculentum)
Plantas de tomateiros Santa Clara cultivados em casa de vegetação foram
utilizados para a obtenção do mRNA. Folhas jovens foram coletadas, trituradas
em nitrogênio lÍquido na presença de tampão de extração (Tris 0,18 M, pH 8,5,
LiCl 0,09 M, EDTA 4,5 M, SDS 1% (p/v), β-mercaptoetanol) e fenol tamponado
pH 7,0 para a extração da fração protéica. O RNA total foi então precipitado em
cloreto de lítio 8 M e, finalmente, ressuspendido em água. O mRNA foi isolado
utilizando o RNasy maxy kit (Quiagen), de acordo com as instruções do
fabricante e utilizado para a síntese do cDNA, segundo o protocolo descrito no
26
manual do kit “two hybrid” cDNA (Stratagene). O cDNA obtido foi clonado no
vetor HibriZap (Stratagene), contendo as seguintes características: domínio de
ativação de gal4, leu+ e ampr. A biblioteca obtida foi posteriormente amplificada
(6,0 x 1013) e excisada de acordo com o protocolo descrito no manual do kit “two
hybrid” cDNA (Stratagene).
4.4.2. Interação entre a proteína viral NSP e proteínas do tomateiro
A interação das proteínas virais com proteínas do tomateiro foi avaliada
utilizando o “Two Hybrid System” (Stratagene) (Figura 4). O clone pUFV 264,
contendo a proteína viral NSP, clonada em pBD-GAL4 Cam foi utilizada como
“isca” em ensaios de interação específica pelo sistema duplo-híbrido, tendo como
alvo a biblioteca de cDNA de tomate.
A levedura S. cerevisae estirpe YRG-2 foi inicialmente transformada
com o clone pUFV264 e, subseqüentemente, co-transformada com a biblioteca
de cDNA de tomate, que encontra-se clonada no vetor pAD-GAL4, fundida ao
domínio de ativação de GAL4, conforme descrito no item 3.4.1. Os clones de
interação vírus-hospedeiro foram selecionados em meio seletivo SD na ausência
dos aminoácidos histidina, leucina e triptofano. Após a seleção em meio SD, os
clones foram crescidos em meio líquido e submetidos a ensaios de avaliação
quantitativa da atividade da enzima β-galactosidase, conforme descrito
anteriormente.
O DNA plasmidial dos clones de interação positiva foi extraído da
levedura com tampão de extração [(Tris-HCl 10 mM pH 8,0; NaCl 100 mM;
EDTA 1 mM; Triton X 2% (v/v); SDS1% (p/v)], seguido de adição de fenol:
clorofórmio na proporção 1:1, precipitado com etanol 70 % v/v e acetato de
sódio 0,3 M pH 7,5. O DNA plasmidial extraído foi utilizado para diagnóstico
por PCR com oligonucleotídeos específicos, AD745F eAD929R (Tabela 1) e
para transformação de E. coli estirpe XL1-Blue, por meio de eletroporação, a
2500 V, 2,5 µF e 250 Ω.
27
Estirpe de levedura YRG -2
TRP1
Cam r
Transformação com
o plasmídio isca
P ADH1
GAL4BD
NSP ORF
tADH
Seleção transformantes em Ura -Trp LEU2
Amp r
Transformação com
a biblioteca de cDNA
P ADH1
GAL4AD Biblioteca cDNA
t ADH
Seleção transformantes em Ura -Trp -Leu -His Replicação de placas no meio seletivo
Seleção de ttransformantes lacZ+
Isolamento de DNA plasmidial
Diagnóstico por PCR
Transformação de E. coli
Seleção de transformantes com ampicilina
Caracterização molecular do cDNA isolado
Figura 4. Estratégia experimental para identificação de proteínas de tomateiros
que interagem com NSP. A levedura estirpe YRG-2 foi
sequencialmente transformada com pBD-NSP e a biblioteca de cDNA
de tomateiros. Os transformantes foram selecionados em meios
apropriados, conforme descrito em material e métodos. Candidatos
His+ e lacZ+ foram selecionados para caracterizações adicionais.
28
4.4.3. Caracterização molecular do clone pUFV371, identificado no ensaio de
interação com NSP
O cDNA obtido no ensaio de interação foi eletroporado em suspensão de
células de E coli estirpe XL1-Blue, dando origem ao clone pUFV 371. Após a
obtenção do mapa de restrição do clone pUFV371, foram gerados dois subclones,
com a finalidade de facilitar o sequenciamento. O clone pUFV371 foi digerido
com a enzima de restrição Hind III e o fragmento liberado foi inserido no mesmo
sítio do vetor pUC118 originando o clone pUFV431. O subclone pUFV432 foi
obtido por meio da transferência do fragmento Bam HI e Pst I de pUFV371 para
o vetor pUC118, previamente digerido com as mesmas enzimas de restrição.
As reações de sequenciamento foram realizadas em seqüenciador
automático Pelkin Elmer, modelo 377, utilizando o “Pelkin Elmer ABI-Prism
Thermo cycle Sequencing Dye Terminator Kit”, segundo recomendações do
fabricante.
4.4.4. Análise das seqüências
As análises de comparação de sequências do DNA foram realizadas com
o auxílio dos programas computacionais encontradas no endereço eletrônico
http://www.genome.ad.jp/SIT/SIT.html (“Sequence Interpretation Tools”), onde
estão
disponíveis
os
endereços
dos
seguintes
programas:
http://blast.genome.ad.jp/ (“Blast”), http://clustalw.genome.ad.jp/ (“Clustalw”) e
a análise dos domínios nos programas http://psort.nibb.ac.jp (PSORT- Prediction
of protein sorting sinals and localization sites in amino acids sequences). A
tradução
de
seqüências
de
DNA
foi
feita
utilizando
o
programa
http://bio.lundberg.gu.se/edu/translat.html (“DNA to protein translation”). As
sobreposições das seqüências dos sub-clones foram feitas utilizando o programa
http://www.infobiogen.fr/services/analyseq/cgi-bin/cap_in.pl (CAP). A árvore de
homologia foi feita no programa DNAMAN versão 4.0. As seqüências utilizadas
na construção do cladograma de homologia encontram-se relacionas na Tabela 4.
29
Tabela 4. Proteínas utilizadas na análise de homologia
NÚMERO DE
ACESSO NO
GENBANK
PROTEÍNA
AY088040
Receptor protein kinase-like (Arabidopsis thaliana) - AtRPK
NM_127957
Putative LRR receptor protein kinase (Arabidopsis thaliana) - AtPLRRPK
AC002292
Putative Serine/Threonine protein kinase (Arabidopsis thaliana) - AtPSTK
AJ277703
Somatic embriogeneses receptor kinase (Zea mays) - ZmSERK2
NM_123946
Leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, (Arabidopsis thaliana) AtPLRRTPK
AP003044
Putative receptor like kinase (Oryza sativa) - OsPRLK
Y14600
Putative protein serine/threonine kinase (Sorghum bicolor).- SbSTK
BAB78668
Putative receptor protein kinase PERK1 (Oryza sativa) - OsPERK1
AAK21965
Receptor protein kinase PERK1 (Brassica napus) - BnPERK1
NP_173940
Pto kinase interactor, putative; (Arabidopsis thaliana) - AtPtoP
T50851
Receptor protein kinase homolog - soybean - GmRPKH
AAF91322
Receptor-like protein kinase1(Glycine max) - GmRLPK
AAK58568
Receptor-like protein kinase (Lycopersicon peruvianum) - LpRLPK
AAK28346
Receptor-like protein kinase 1 (Zea mays) - ZmRLP
AAB47421
Serine/threonine protein kinase Pto (Lycopersicon esculentum) - LeSTPKPto
T07589
Disease resistance protein Prf - tomato. -LeDRPPrf
AAK28345
Receptor-like protein kinase 3 (Lycopersicon esculentum) - LeRLK3
CAC83607
Putative receptor-like serine-threonine protein kinase (Solanum tuberosum).StRLKST
S42867
Protein kinase (EC 2.7.1.-) – spinach - SpoPK
gi:18405693
Wall-associated kinase 2, putative; protein id: At1g56120.1 (Arabidopsis
thaliana) - AtWKP
AF197946
Receptor protein kinase-like protein (CLV1A) (Glycine max) - GmCLV1A
AY007367
Lycopersicon esculentum tospovirus resistance protein C (Sw5-c) - LeSW5C
A análise do potencial de fosforilação da proteína NSP foi feita
utilizando o programa http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos (NetPhos 2
Prediction Server).
30
4.5. Expressão da proteína cinase de tomate
4.5.1. Clonagem da seqüência parcial da proteína cinase de tomate no vetor
de expressão pET16B (Novagen)
O inserto do clone pUFV 371 que corresponde a seqüência parcial de
uma cinase de tomateiro foi liberado com as enzimas de restrição Eco RI e Pst I .
O fragmento liberado foi tratado com a enzima Klenow (Pharmacia Biotech) para
a obtenção de extremidades abruptas e clonado no vetor pET16B (Novagen), que
foi previamente digerido com a enzima de restrição Bam HI (GIBCO) e reparado
com a enzima Klenow. O diagnóstico da orientação senso foi feito por meio de
digestão com a enzima de restrição Bgl II (G IBCO) e o clone resultante na
orientação senso foi denominado pUFV423. O DNA plasmidial do clone
pUFV423 foi extraído e utilizado para transformação de suspensão de células
competentes de E. coli estirpe BL21(DE3), originando o transformante
pUFV466.
4.5.2. Indução da versão truncada da proteína cinase de tomateiro
Células de E. coli transformadas com o clone pUFV466 foram crescidas
em 2 mL de meio LB com ampicilina (50 µg/mL) a 37°C, por 16 horas e usadas
como inóculo para expressão da proteína em 50 mL de meio. A suspensão de
células de E. coli foi crescida a 37°C em meio seletivo até atingir a absorvância
(OD600) de 0,6, quando foi submetida à indução com IPTG 2mM, por 10 horas.
Após o período de indução, as células foram centrifugadas durante 5 minutos a
5000 g a 4°C e, em seguida, ressuspendidas em tampão de ligação (Imidazol
5,0 mM, NaCl 0,5 mM, Tris HCl pH7,9 120 mM), sonicada para o rompimento
celular e centrifugada durante 15 minutos, 20.000 g a 4°C. O sobrenadante
contendo as proteínas solúveis foi coletado. O “pellet” foi ressuspendido em
tampão de ligação, contendo uréia 9 M e incubado no gelo durante 1 hora. Após
este período, a suspensão foi novamente centrifugada nas mesmas condições
31
anteriores e a fase aquosa contendo as proteínas insolúveis coletada foi filtrada
em membrana de 22 µm (Millipore), para posterior utilização. As frações solúvel
e insolúvel foram analisadas em gel de poliacrilamida contendo SDS, segundo a
metodologia descrita por LAEMMLI (1970).
4.5.3. Purificação da versão truncada da proteína cinase de tomateiros
A purificação da versão truncada da proteína cinase de tomateiro foi feita
por cromatografia de afinidade, uma vez que esta se encontrava fundida a uma
cauda de histidina. A indução da expressão da proteína cinase de tomate foi feita
em 500 mL de meio LB, contendo ampicilina (50 µL/mL), seguindo os mesmos
passos descritos anteriormente. A fração insolúvel ressuspendida em tampão de
ligação contendo uréia 9 M foi aplicada em coluna de cromatografia, contendo a
resina “Chelanting Sephane” (Pharmacia Biotec), ativada com Ni++.
A coluna cromatográfica contendo 2 mL da resina “Chelanting Sephane”
(Pharmacia Biotech) foi inicialmente lavada com 10 mL de água, seguida de
15 mL de tampão de troca (NiSO4 50 mM) e finalmente equilibrada com 10 mL
de tampão de ligação contendo uréia 9 M. O extrato bruto de proteínas insolúveis
foi aplicado à coluna, sendo a coluna inicialmente lavada com 18 mL de imidazol
60 mM, NaCl 0,5 M, tris-HCl 20 mM pH 7,9 e, posteriormente, a proteína
recombinante foi eluída em 15 mL de tampão de eluição (Imidazol 1 M,
NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM pH 7,9, Uréia 6 M). Foram coletadas frações de
1mL e a purificação da proteína cinase de tomate foi analisada em gel de
poliacrilamida contendo SDS, corado com “coomassie brillant blue”.
32
4.6. Obtenção do anticorpo contra a proteína cinase de tomate
4.6.1. Imunização de coelhos
O anticorpo contra a proteína cinase de tomate foi obtido pel imunizção
de coelhos. Foram realizadas quatro imunizações em intervalos de sete dias
utilizando como imunógeno a proteína recombinante. A primeira aplicação
continha 500 µg da proteína truncada purificada e 250 µl de Adjuvante de
Freud’s completo. As demais imunizações continham o Adjuvante de Freud’s
incompleto e a mesma quantidade de proteína. As coletas de sangue para a
obtenção do anticorpo, em um total de quatro, foram realizadas após o término
das imunizações em intervalos de sete dias. Após a coleta, o sangue foi incubado
a 37°C por uma hora, incubado a 4°C durante a noite e, em seguida, centrifugado
a 3000 g por 15 minutos a 4°C. O soro foi coletado e estocado a -20°C. O
anticorpo proveniente das quatro diferentes imunizações foi testado nas diluições
1:500, 1:1000 1:2000 e 1:5000 em “imunoblotting”.
4.6.2. Verificação da especificidade do anticorpo
Extratos protéicos de suspensão de células de E. coli transformadas com
a construção proveniente de pUFV 466 e com a suspensão de células de E. coli
não transformadas, foram obtidos de acordo com o protocolo descrito no item
3.5.2. Os extratos protéicos fracionados por eletroforese em gel de acrilamida
contendo SDS (LAEMMLI, 1970). Após a eletroforese, as proteínas foram
transferidas para membranas de nitrocelulose em cuba de transferência (Biorad)
durante uma hora a 60 V. As membranas foram bloqueadas com o “Blocker”
(Biorad). Posteriormente, as membranas foram lavadas três vezes com TBS
(Tris-HCl 10 mM/L, pH 7,6 e NaCl 140 mM) adicionado de Tween 0,1% (v/v)
(TBS-T) e, em seguida, incubadas durante 2 horas com anticorpo contra a
proteína cinase truncada na diluição 1:500. Após as membranas foram,
novamente lavadas com TBS-T e incubadas durante 2 horas com um anticorpo
33
contra IgG conjugada à fosfatase alcalina (SIGMA), numa diluição de 1:5000. A
membrana foi lavada extensivamente com TBS-T e, subseqüentemente, incubada
com tampão da enzima (Tris-HCl 0,1 M, pH 9,8, NaCl 0,1 M, MgCl2 0,5 M) por
cinco minutos. A atividade da fosfatase alcalina foi detectada, usando-se os
substratos NBT (azul-nitro-tetrazolium, GIBCO/BRL) e BCIP (5-bromo-4-cloro-3indolil-fosfato, GIBCO/BRL).
4.6.3. Extração de proteínas e “immunoblotting”
Extratos protéicos provenientes de diversos órgãos da planta foram
extraídos de acordo com a metodologia descrita por GÖRG et al. (1988).
Aproximadamente 2 g de tecido de folha foram triturados em nitrogênio líquido e
homogeneizados com ácido tricloroacético 10% (v/v), em acetona contendo
2-mercaptoetanol 0,07% (v/v). A fração de proteína total foi precipitada a -20oC
durante 40 minutos, centrifugada a 16.000 g a 4oC, por 15 minutos e lavada
2-3 vezes com acetona contendo 0,07% (v/v) de 2-mercaptoetanol. O precipitado
foi secado à vácuo, ressuspendido em Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, SDS 1% (p/v) e
EDTA 25 mM, na proporção de 100 mg/pmol. Após nova centrifugação a
25.000 g por 20 minutos, a concentração de proteína no sobrenadante foi
determinada como descrito por BRADFORD (1976). Os extratos protéicos foram
analisados em gel de acrilamida (LAEMMLI, 1970) e por “imunoblotting”,
conforme descritos no item 4.6.2.
34
5. RESULTADOS
Os genes que codificam para as proteínas virais NSP, MP e REn de
Tomato golden mosaic virus (TGMV) (Figura 1) foram clonados em vetores
apropriados e utilizados na triagm da bibliotca d cDNA por meio do sistema
duplo híbrido. As construções obtidas são apresentadas na Tabela 4.
5.1. A proteína REn complementa o domínio de ativação transcricional de
GAL4
Os plasmídeos recombinantes pBD-NSP e pBD-Ren foram mantidos em
leveduras, praqueadas em o meio seletivo sem o aminoácido triptofano, enquanto
que os plasmídeos pAD-MP e pAD-tMP foram propagados em leveduras
multiplicadas em meio seletivo sem leucina. As leveduras transformadas com
pBD-NSP, pAD-MP e pAD-tMp não cresceram na ausência de histidina,
confirmando que as referidas proteínas virais não substituem o domínio ativação
ou de ligação de GAL4 ausente nos respectivos plasmídeos e não induzem o
promotor HIS3 (Figura 5A) e o promotor lacZ (Figura 5B), ambos sob o controle
de GAL4. Em contraste, transformação de S. cerevisae, estirpe YRG-2 com o
35
-HIS
A
pBD-REn
pBDpBD-Rep pBDpSV40
pBDpBD-AC4
pBDpBD-REn
pBDpBD-NSP
pBDpBD-Rep
B
pBDpBD-MP
nanomoles de o-nitrofenol/ min
/ mg de proteina total
0,7
0,6
0,5
YRG-2
GAL 4
0,4
pBD-Rep
pBD-Ren
0,3
pAD-tMP
0,2
pAD-MP
0,1
pAD-MP/pBD-SP
pBD-NSP
pAD-tMP/pBD-NSP
0
-0,1
Figura 5. Fenótipo dos transformantes obtidos em S. cerevisae estirpe YRG-2.
A.Crescimento dos transformantes de S. cerevisae, estirpe YRG-2 em
meios seletivos. Os transformantes foram plaqueados no meio seletivo,
–His, e crescidos a 30°C durante três dias. As construções de DNA
usadas para transformar levedura são indicadas na Figura e descritas na
Tabela 4. B. Avaliação da atividade da enzima β-galactosidase. As
leveduras S. cerevisae, estirpe YRG-2, transformadas com os
plasmídeos indicados, foram crescidas em meio seletivo e a atividade
da enzima β-galactosidase foi avaliada.
36
plasmídeo pBD-REn capacitou seu crescimento na ausência do aminoácido
histidina (Figura 5A)
O crescimento da levedura transformada com o clone pBD-Ren, na
ausência de histidina, sugere que a proteína REn de TGMV é capaz de
complementar o domínio de ativação transcricional do gene GAL4 na indução do
promotor HIS3. A propriedade de ativador transcricional da proteína REn foi
confirmada por meio de ensaio de ativação transcricinal do gene lacZ, também
sob o controle do gene GAL4. A atividade da enzima β-galactosidase das
leveduras transformadas com pBD-REn foi similar àquela extraída das leveduras
transformadas com a construção que contém o gene GAL4 intacto (Figura 4B,
pGAL4 e pBDREn).
As proteínas REn e TrAP são codificadas por seqüências que se
sobrepõem no genoma de TGMV (Figura 1). O fragmento de TGMV clonado em
pBD-REn contém a ORF completa de REn e a seqüência que codifica o carboxiteminal de TrAP em diferente fase de leitura. Com a finalidade de confirmar a
identidade da proteína recombinante, a junção das seqüências BDGAL4-REn foi
seqüenciada (dado não mostrado). O sequenciamento de pBD-Ren confirmou a
fusão traducional de REn com o domínio de ligação ao DNA de GAL4 e
eliminou a possibilidade de que a atividade de ativação da transcrição exibida
pela proteína recombinante fosse uma contribuição do domínio carboxi-terminal
de TrAp. Assim sendo, a ativação transcricional exercida pela proteína REn
impossibilitou o seu uso como “isca” em ensaios de interação proteína:proteína
por meio do sistema duplo-híbrido, que tem por finalidade detectar fatores do
hospedeiro capazes de interagir com esta proteína viral.
5.2. Oligomerização da proteína viral MP detectada pelo sistema duplohíbrido
Uma vez que a proteína MP foi clonada nos vetores pADGAL4 2.1 e
pBDGAL4 Cam, foi possível avaliar a formação de homo-oligômeros da proteína
por meio do sistema duplo-híbrido de leveduras. Ambos os plasmídeos
37
recombinantes, pAD-MP e pBD-MP foram mantidos em leveduras, usando meio
seletivo sem leucina e sem triptofano, respectivamente. A levedura transformada
com a construção pAD-MP foi co-transformada com a construção pBD-MP e os
transformantes plaqueados em meio seletivo na ausência dos aminoácidos
leucina, histidina e triptofano (dados não mostrados). A capacidade da levedura
co-transformada com pAD-MP e pBD-MP de crescer na ausência de histidina
demonstrou que a proteína de movimento MP de geminivírus forma homooligômeros. A eficiência da interação MP-MP foi avaliada por meio de ensaio de
atividade da enzima β-galactosidase (Figura 6). A atividade de β-galactosidase
em extratos de leveduras co-transformadas com pAD-MP e pBD-MP foi superior
àquela de extratos de leveduras transformadas com pGAL4. Estes resultados
indicam que MP oligomeriza com alta eficiência e confirmam a expressão correta
da proteína em ambos os vetores.
nanomoles de o-nitrofenol/min/mg
de proteina total
4
3
2
1
0
-1
YRG-2
pGAL 4
pAD-MP
pBD-MP
pAD-MP/pBD-MP
Figura 6. Oligomerização da proteína MP de TGMV. A atividade de
β-galactosidase foi determinada em extratos protéicos de leveduras
co-transformadas com os plasmídeos pAD-MP e pDB-MP
(pAD-MP/pBD-MP). A levedura transformada com a construção
pGAL4 representa o controle positivo, enquanto que a levedura não
transformada (YRG-2), o controle negativo.
38
5.3. Interação entre as proteínas de movimento NS e MP
O plasmídeo recombinante pBD-NSP foi mantido em leveduras
seletivamente na ausência de triptofano (Figura 7, -TRP; Figura 8B, linha
pBD-NSP) enquanto que pAD-MP, em meio sem leucina (Figura 7, -LEU;
Figura 8A, pAD-MP). A levedura, estirpe YRG-2, foi co-transformado com
pBD-NSP e pAD-MP ou pAD-tMP e os transformantes foram crescidos em meio
na ausência dos aminoácidos leucina, histidina e triptofano, demonstrando a
interação entre as proteínas virais (Figura 6). O clone positivo His+ (Figura 7,
-HIS, -LEU, -TRP) teve a sua identidade confirmada por meio de PCR (Figura 8,
pBD-NSP/pAD-MP), sendo que os fragmentos amplificados apresentaram
tamanhos similares ao dos genes virais clonados. A confirmação da interação
entre as proteínas de movimento NSP e MP, foi realizada por meio de avaliação
quantitativa
da
enzima
β-galactosidase,
sendo
que
o
transformante
pAD-MP/pBD-NSP apresentou atividade enzimática similar àquela de leveduras
expressando a proteína GAL4 intacta (Figura 5). A forma truncada da proteína
MP, que apresenta uma deleção de 57 aminoácidos na região carboxi-terminal,
reteve a capacidade de interagir com NSP, embora a atividade de β-galactosidase
foi menor para a combinação pAD-tMP/pBD-NSP (Figura 5). Tentativas de
avaliar a quantidade produzida de proteínas recombinantes, utilizando anticorpos
contra GAL4, não foram bem sucedidas e, como conseqüência, os valores
relativos da atividade da enzima não puderam ser correlacionados com a
eficiência da interação entre as proteínas parceiras.
Coletivamente, estes resultados demonstraram que a proteína NSP de
TGMV é capaz de interagir com MP. Além disso, eles confirmaram a expressão
correta de NSP na construção pBD-NSP, possibilitando o uso dessa construção
para identificação de fatores do hospedeiro que interagem com a respectiva
proteína viral, por meio do sistema duplo-híbrido.
39
- TRP
BD-Rep
-
BD-NSP
- LEU
BD-REn
BD-Rep
-
AD-MP
-
BD-NSP
-
- HIS, -LEU, -TRP
BD-REn
AD-MP
-
AD-MP
-
BD-Rep
-
BD-NSP
-
AD-MP
BD-NSP
-
Figura 7. Interação entre as proteínas virais MP e NSP. Células de S. cerevisae,
estirpe YRG-2, transformadas com os plasmídeos indicados e descritos
na tabela 4, foram crescidas em meio seletivo desprovido dos
aminoácidos triptofano, leucina ou leucina/ histidina/ triptofano durante
três dias a 30°C. A interação entre as proteínas MP e NSP foi verificada
pela capacidade de crescimento em meio desprovido dos aminóacidos
leucina, histidina e triptofano.
5.4. Identificação de fatores do hospedeiro que interagem com a proteína
NSP de TGMV
A interação patógeno:hospedeiro tem sido recentemente alvo de
inúmeros estudos na literatura. A interação mais bem caracterizada entre
proteínas de geminivírus e seu hospedeiro é a interação entre as proteínas da
família retinoblastoma e a proteína viral Rep (ACH et al., 1997; HORVÁTH et
al., 1998; SETTLAGE et al., 2001). Até então, não foram identificadas
interações entre proteínas virais de movimento e fatores do hospedeiro de
espécies da família Geminiviridae.
De um total de 4,7 x 106 fagos, foram isolados cinco clones denominados
pUFV364, pUFV365, pUFV380, pUFV381 e pUFV382, que cresceram na
ausência de histidina e mostraram expressão de LacZ em membranas indicadoras
de X-Gal (dado não mostrado). Os tamanhos dos insertos dos clones isolados
40
-M
YR P
GpA 2
DMP
pB
D- N /
SP
λ
MP
*
pA
D
A
2.7
1.6
1.4
0.9
0.8
0.7
0.5
λ
NS
P*
MP
*
ppB
DNN
pA SSPP
DMP
pA
D
pB -MP/
DNS
P
B
573 pb
2.7
2.0
1.6
1.4
1.1
0.9
807 pb
Figura 8. Diagnóstico dos clones em S. cerevisae estirpe YRG-2, por meio de
PCR. Oligonucleotídeos específicos foram utilizados para a
amplificação de insertos no vetor pADGAL4 2.1 (A) e pBDGAL4
Cam (B) usando como molde DNA plasmidial extraído de leveduras
transformadas com pBD-MP, pBD-NSP, pBD-MP/pBD-NSP. O
asterisco indica a amplificação a partir de DNA plasmidial de clones
em E. coli, utilizados como controle da reação. λ corresponde a
marcadores de DNA de tamanhos conhecidos.
41
foram determinados por PCR (Figura 9). Exceto a construção pUFV380 cujo
inserto possui tamanho de 2000 pb, os demais clones, pUFV364, pUFV365,
pUFV381 e pUFV382 possuem insertos similares (1000 pb). Baseado no padrão
de restrição e sequenciamento do inserto, verificou-se que os clones pUFV364 e
pUFV382
pUFV381
pUFV380
pUFV365
M
pUFV364
pUFV381 eram idênticos.
2.7
2.0
1.6
1.4
1.1
0.9
Figura 9. Diagnóstico por PCR dos clones isolados da biblioteca de cDNA.
DNA isolado de leveduras His+, conforme indicado na figura, foi
amplificado por PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para
amplificação de insertos no vetor pADGAL4 2.1.M indica marcadores
de DNA, cujos tamanhos são indicados em pb.
As interações identificadas no escrutínio da biblioteca de cDNA de
tomateiro, pBD-NSP/pAD-cDNA foram confirmadas por meio de ensaio da
atividade de β-galactosidase (Figura 10B), assim como pelo fenótipo observado
42
em placas de meio seletivo desprovido dos aminoácidos leucina, histidina,
triptofano (Figura 10A, -HIS, -LEU, -TRP). O crescimento da levedura na
ausência de histidina foi dependente da presença da proteína isca NSP e da
construção quimérica contendo o domínio de ativação de GAL4 fusionadas ao
cDNA de tomateiro (Figuras 10A e 10B).
A
- LEU
- TRP
- HIS, LEU, TRP
pUFV364
BD-NSP
pUFV364
BD-NSP
pUFV364
BD-NSP
pUFV365
YRG-2
pUFV365
YRG-2
pUFV365
YRG-2
B
nanomoles de o-nitrofenol/min/mg
Unidades
de β-galactosidase
de proteina
total
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
YRG-2
pGAL4
pBD-NSP
pUFV364
PUFV365
pUFV380
pUFV381
pUFV382
Figura 10. Interação entre a proteína NSP e proteínas de tomateiro. A. Fenótipo
dos clones de interação obtidos em S. cerevisae estirpe YRG-2.
Células de S. cerevisae, estirpe YRG-2, transformadas com os
plasmídeos indicados foram crescidas em placas de meio seletivo
desprovido dos aminoácidos leucina, histidina e triptofano a 30oC
durante três dias. B. Avaliação quantitativa da atividade da enzima
β-galactosidase. Os clones foram crescidos em meio seletivo a 30oC e
a atividade enzimática foi quantificada, utilizando o o-orto-nitrofenolβ-D-galactopiranosídeo
como
substrato
para
a
enzima
β-galactosidase.
43
A fim de determinar se a proteína codificada pelo cDNA pUFV364
interage especificamente com NSP, o plasmídeo pUFV364 foi utilizado para
transformar diversas leveduras utilizando BiP e Rep fusionadas ao domínio
GAL4 como isca (dados não mostrados). A co-transformação das referidas
leveduras com pUFV364 não restaurou prototrofia de histidina. Estes resultados
confirmam que a interação entre NSP e a proteína expressa por pUFV364 é
específica, o que sugere que possivelmente o complexo é formado durante o
processo de infecção viral. Assim sendo, o clone pUFV364 foi selecionado para
as avaliações adicionais.
5.5. Caracterização molecular do clone pUFV364.
O sequenciamento de pUFV 364 revelou a presença de uma ORF parcial
de 211 resíduos de aminoácidos, com homologia com proteínas tipo
serina/treonina cinase (Figura 11). As maiores identidades de seqüência
encontradas para a seqüência pUFV364 foi com o gene ZmSERK2 (Zea mays
Somatic Embryogenesis Receptor Kinase 2) de milho (61%) e com os cDNAs
que codificam proteínas serina/treonina cinases de A. thaliana [número de acesso
AY088040 (79%) e AY075617 (79%)]. Com base na homologia de seqüência, a
proteína codificada por pUFV364 foi denominada NIK (NSP - Interacting
Kinase). A ausência do códon iniciador de tradução AUG na seqüência do cDNA
NIK indicou que este cDNA obtido era truncado. Com a finalidade de se obter a
seqüência completa do cDNA de NIK , cDNAs preparados de mRNA de folhas
de tomateiro foram amplificados, utilizando oligonucleotídeos baseados na
seqüência amino-terminal de homólogos de NIK e na seqüência 5’ do clone
pUFV364, em ensaios de RT-PCR (Figura 12). Estes oligonucleotídeos
extenderam a extremidade 5’ do cDNA de NIK, resultando na amplificação de
um fragmento de aproximadamente 1100 pb (Figura 11, linhas 1, 2, 3). O mesmo
conjunto de oligonucleotídeos amplificou um fragmento de tamanho similar a
44
M
1
2
3
4
2.7
2,7
1.6
1,6
1,4
1.4
1.1
1,1
Figura 11. Amplificação da extremidade 5’do cDNA NIK. O mRNA de folhas de
tomateiro foi extraído e utilizado como molde em reação de RT-PCR
usando oligonucleotídeos específicos para a amplificação da
extremidade 5’ do cDNA que codifica a proteína NIK. 1, 2 e 3 são
amplificaçãoes feitas a partir de cDNA de tomateiros. 4. é um
controle positivo, usando como DNA molde o clone pUVF444 que
contém o cDNA de um homólogo de soja. M corresponde a
marcadores de DNA, expressos em pb.
partir do cDNA de uma proteína cinase homóloga de soja (Figura 11, linha 4). O
tamanho do fragmento amplificado indica que a proteína NIK completa deve
possuir aproximadamente 610-620 resíduos de aminoácidos, tamanho similar aos
seus homólogos em milho e Arabidopsis (Figura 12). Uma vez que a interação
entre NSP e NIK envolveu a região carboxi-terminal de NIK, onde se encontra o
domínio de cinase, o potencial de fosforilação da proteína NSP foi avaliado. A
análise da seqüência de aminoácidos de NSP apresentou resíduos de serina e
treonina, em um contexto favorável para fosforilação por cinase do tipo serina
treonina (Figura 13). Contudo, a hipótese de que NSP constitui substrato para
NIK não foi avaliada bioquimicamente.
45
AY088040
NIK
AY075617
ZmSERK2
-AKPVLDWSIRKRIAIGAARGLVYLHEQCDPKIIHRDVKAANILLDDYCEAVVGDFGLAK
------------------------FHEQCDPKIIHRDVKAANILLDDFCEAVVGDFGLAK
TAKPVLDWGTRKRIALGAGRGLLYLHEQCDPKIIHRDVKAANILLDDYFEAVVGDFGLAK
PSEPPLSWEPRRRIALGSARGLSYLHDHCDPKIIHRDVKAANILLDEDFEAVVGDFGLAK
:*:.
:*::******************: ***********
449
36
472
454
AY088040
NIK
AY075617
ZmSERK2
--LLDHQDSHVTTAVRGTVGHIAPEYLSTGQSSEKTDVFGFGILLLELVTGQRAFEFGKA
--LLDHQDSHVTTAVRGTVGHIAPEYLSTGQSSEKTDVFGFGILLLELITGMRAIEFGKA
FTLLDHEESHVTTAVRGTVGHIAPEYLSTGQSSEKTDVFGFGILLLELITGLRALEFGKA
--LMDYKDTHVTTAVRGTIGHIAPEYLSTGKSSEKTDVFGYGIMLLELITGQRAFDLARL
*:*::::*********:***********:*********:**:****:** **:::.:
507
94
532
512
AY088040
NIK
AY075617
ZmSERK2
A--NQKGVMLDWVKKIHQEKKLELLVDKELLKKKSYDEIELDEMVRVALLCTQYLPGHRP
A--NQKGVMLDWVRKIHQEKKLDVLVDKDLRIN--YDRIELEEMVQVALLCTQYLPGHRP
AFTNQRGAILDWVKKLQQEKKLEQIVDKDLKSN--YDRIEVEEMVQVALLCTQYLPIHRP
AN-DDDVMLLDWVKGLLKEKKVEMLVDPDLQKA--YEEVEVESLIQVALLCTQGSPLDRP
* ::
:****: : :***:: :** :*
*:.:*::.:::******* * .**
565
151
590
569
AY088040
NIK
AY075617
ZmSERK2
KMSE--VVRMLEGDGLAEKWEAS-QRSDSVSKCSNRINELMSSSDRYSDLTDDSSLLVQA
KMSE--IVRMLEGDGLAERWEAS-QKFDGSNKYK---TKELSSSERFSDLTDDSLLLVQA
KMSEFTVVRMLEGDGLVEKWEASSQRAETNRSYSK--PNEFSSSERYSDLTDDSSVLVQA
KMSE--VVRMLEGDGLAERWDEW-QKVEVVR-------QEAESAPLRNDWIVDSTYNLRA
**** :*********.*:*:
*: :
: .*:
.*
**
::*
622
204
648
619
AY088040
NIK
AY075617
ZmSERK2
MELSGPR
MELSGPR
MELSGPR
VELSGPR
:******
629
211
655
626
Figura 12. Comparação de seqüências de NIK com cinases de outros organismos.
O alinhamento múltiplo de seqüência da estrutura primária deduzida
de NIK, de ZmSERK2 (Zein Max Somatic Embryogenisis Receptor
Kinase 2, número de acesso AJ277703) e de proteínas cinases do tipo
serina/treonina de Arabdopsis thaliana (número de acesso AY088040
E AY075617) foi obtido com o programa “Clustal-W”. A seqüência
conservada em cinases do tipo serina/treonina está destacada em
vermelho.
46
MDSQLACPPNAFNYIESNRDEYQLSHDLTEIILQFPSTASQLSARLSRSCMKIDHCVIEF
60
RQQVPINATGSVVVEIHDKRMTDNESLQASWTFPVRCNIDLHYFSSSFFSLKDPIPWKLY
120
YKVCDSNVHQRTHFAKFKGKLKLSTAKHSVDIPFRAPTVKILSKQFTDKDVDSATWDMGN
180
GIEK
240
................S.........................S...S.............
60
.....................T.......S...................S..........
120
.......................S....S........T....S...T.....S.......
180
....
240
Figura 13. Análise do potencial de fosforilação da proteína viral NSP. A
seqüência de aminoácidos da proteína NSP (preto) foi analisada no
programa NetPhos para determinação dos possíveis resíduos de
serina e treonina que possuem potencial para serem fosforilados. Em
vermelho, encontram-se os resíduos de serina e, em azul, os resíduos
de treonina com potencial para fosforilação.
5.6. O homólogo de soja da proteína NIK possui domínios característicos de
receptores de membrana e genes de resistência
A seqüência completa do cDNA NIK de tomateiro, designado LeNIK
(Lycopersicum esculentum NIK), não foi obtida devido a dificuldade encontrada
em clonar a extremidade 5’do gene amplificado em ensaios de RT-PCR (Figura
12). No entanto, foi possível comparar o domínio carboxi-terminal de NIK com
seqüências completas de cDNAs de soja, isolados no laboratório de Biologia
Molecular de Plantas no BIOAGRO e ainda não disponibilizados para domínio
público. Esta análise permitiu a identificação de um cDNA homólogo de soja que
possui 98% de similaridade e 87% de identidade de seqüência com a região
correspondente de LeNIK (Figura 14). Este cDNA foi designado GmNIK
(Glicine max NIK), tem 2200 pb e codifica uma proteína de 620 resíduos de
aminoácidos com massa molecular estimada de 68,6 KDa e pI 6,97. A estrutura
primária deduzida para GmNIK apresenta diversos domínios conservados e
47
MGTQRGIALLSFTFFLLLSSANALLSPKGVNFEVQALMGIKDSLEDPHGVLDNWDGDAVD
PCSWTMVTCSSENLVIGLGTPSQSLSGTLSPSIGNLTNLQIVLLQNNNISGPIPSELGKL
SKLQTLDLSNNFFSGGIPPSLGHLRSLQYLRFNNNSLVGECPESLANMTQLNFLDLSYNN
LSGPVPRILAKSFSIIGNPLVCATGKEPNCHGMTLMPMSMNLNNTEDALQSGRPKTHKMA
IAFGLSLGCLCLIVLGFGLVLWWRHKHNQQAFFDVKDRHHEEVYLGNLKRFQFRELQIAT
NNFSSKNILGKGGFGNVYKGVFPDGTLVAVKKLKDGNAIGREIQFQTEVEMISLAVHRNL
LRMYGFCMTPTERLLGYPYMANGSVASRLKGKPGLEWGTRKHIALGAGKGLLY
GmNIK
LeNIK
_
_
_
_
_
_
420
430
440
450
460
470
LHEQCDPKIIHRDVKAANILLDDYYEAVVGDLGLAKLLDQQDSHVTTAVRGTVGHIAPEY
.::::::::::::::::::::::. ::::::.:::::::.::::::::::::::::::::
FHEQCDPKIIHRDVKAANILLDDFCEAVVGDFGLAKLLDHQDSHVTTAVRGTVGHIAPEY
10
20
30
40
50
60
480
490
500
510
520
530
LSTGQSSEKTDVFGFGILLLKLITGQRALEFGKSANNKGAMLDWVKKIHQEKKLDMLVDK
::::::::::::::::::::.::::.::.::::.::.::.:::::.:::::::::.::::
LSTGQSSEKTDVFGFGILLLELITGMRAIEFGKAANQKGVMLDWVRKIHQEKKLDVLVDK
70
80
90
100
110
120
540
550
560
570
580
590
DLKNNYDRIELEEMVQVALLCTQYLPGHRPKMSEVVRMLEGDGLAEKWEASQRVD-STKC
::. ::::::::::::::::::::::::::::::.:::::::::::.:::::. : :.:
DLRINYDRIELEEMVQVALLCTQYLPGHRPKMSEIVRMLEGDGLAERWEASQKFDGSNKY
130
140
150
160
170
180
600
610
620
KPQESSSSDRYSDLTDDSLLLVQAMELSGPR
: .: :::.:.::::::::::::::::::::
KTKELSSSERFSDLTDDSLLLVQAMELSGPR
190
200
211
Figura 14. Análise comparativa entre a proteína cinase de tomateiro e seu
homólogo de soja. A seqüência de aminoácidos da cinase de soja
(GmNIK) foi comparada com a seqüência da cinase de tomateiro
(LeNIK) utilizando o programa “Clustal”. O domínio de cinase
encontra-se destacado em vermelho nas duas proteínas, enquanto
qu,e na cinase de soja, estão também destacados em violeta, as
repetições ricas em leucina; em amarelo, o domínio de ligação a
nucleotídeos; em verde, o peptídeo sinal e, em rosa, o domínio
transmembrana
48
biologicamente relevantes. Estes incluem o domínio conservado de cinases do
tipo serina/treonina (em vermelho posições 419-431), um sítio de ligação a
nucleotídeos (em amarelo, posições 309-322), que contem uma seqüência
conservada tipo “walker” para a alça P {ALGX(4)G-L-(S/T)}, repetições ricas
em leucina (em violeta, 96-144 e 167-192), além de um peptídeo sinal (verde) no
terminal amino da proteína de endereçamento para o aparelho secretor e um
domínio transmembrana (em rosa, 238-259.)
A presença de um segmento transmembrana, repetições ricas em leucina,
domínio de cinase e sítios de ligação a nucleotídeos conservados indica que a
proteína GmNIK compartilha domínios característicos de receptores de
membrana envolvidos em transdução de sinais. Análise de homologia de
seqüências com proteínas cinases de plantas selecionadas no banco de dados
revela que GmNIK é mais relacionada com um putativo receptor de cinase de
Arabidopsis, RPKAt (Figura 15). GmNIK também apresenta homologia com
proteínas cinases que apresentam regiões ricas em leucina como um possível
receptor de cinase identificado em A thaliana, e denominado LRRAt (Figura 15).
Genes de resistência, como gene PTO, identificado em tomate, apresentaram
baixa homologia com GmNIK; contudo, os domínios encontrados em GmNIK
também estão presentes na proteína codificada pelo gene de resistência Xa21,
caracterizado em arroz e que confere resistência a Xanthomonas campestris.
5.7. GmNIK interage com a proteína NSP de geminivírus
Com a finalidade de verificar a interação entre as proteína NSP e GmNIK
por meio do sistema duplo-híbrido, a seqüência do cDNA de GmNIK foi
clonada no vetor pADGAl4 2.1. Leveduras transformadas com pAD-GmNIK
cresceram na ausência de leucina (Figura 16A, -LEU), mas não na ausência de
histidina (Figura 16A, -HIS). A co-transformação da levedura com pBD-NSP e
pAD-GmNIK promoveu crescimento em meio seletivo desprovido de histidina,
49
100%
80%
60%
40%
20%
0%
L e D R P P rf
A tP L R R T P K
A tP S T K
O s P R L K
A tR P K
G m N IK
A tP L R R P K
Z m S E R K 2
S b S T K
A tW K P
S tR L K S T
G m C L V 1
G m R P K H
G m R L P K
L e S W 5 C
L p R L P K
Z m R L P
L e R L K 3
A tP to P
B n P E R K 1
O s P E R K 1
L e S T P K P to
S p o P K
Figura 15. Árvore de homologia da proteína cinase de soja. A seqüência de
aminoácidos de GmNIK foi comparada com seqüências de
aminoácido de proteínas cinase de outras plantas pelo programa
DNAMAN versão 4.0
50
A
- LEU
- TRP
YRG-2
YRG-2
pAD-GmNIK/
pBD-NSP
- LEU, -TRP, HIS
pAD-GmNIK/
pBD-NSP
pBD-NSP
pAD-GmNIK
YRG-2
pAD-GmNIK/
pBD-NSP
pBD-NSP
pAD-GmNIK
pBD-NSP
pAD-GmNIK
nanomoles de o-nitrofenol/min/mg
de proteina total
B
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0
YRG2
pBD-NSP
pAD-GmNIK
pAD-GmNIK/pBD-MP
pAD-GmNIK/pBD-NSP
Figura 16. Interação entre a proteína NSP e a proteína GmNIK. A. Fenótipo dos
clones de interação obtidos em S. cerevisae estirpe YRG-2. Células de
S. cerevisae, estirpe YRG-2, transformadas com os plasmídios
indicados, foram crescidos em placas de meio seletivo desprovido dos
aminoácidos leucina, histidina e triptofano a 30oC durante três dias,
conforme indicado na figura. B. Avaliação quantitativa da atividade
da enzima β-galactosidase. Os clones foram crescidos em meio
seletivo a 30oC e a atividade enzimática foi quantificada, utilizando o
o-orto-nitrofenol-β-D-galactopiranosídeo como substrato para a
enzima β-galactosidase.
51
indicando interação produtiva entre as duas proteínas recombinantes e,
conseqüentemente, indução do promotor HIS3. A especificidade da interação foi
avaliada em leveduras transformadas com os genes MP, BiP e Rep fusionadas ao
domínio de ligação ao DNA de GAL4 como isca. A co-transformação desses
transformantes com pAD-GmNIK não restaurou o fenótipo His+, não observando
crescimento no meio seletivo His- (dados não mostrados).
A interação entre GmNIK e NSP foi confirmada pela indução do
promotor lacZ, na presença de pAD-GmNIK e pBD-NSP (Figura 16B). Embora
a combinação pAD-GmNIK e pBD-MP não tenha promovido crescimento de
transformantes na ausência de histidina, extratos protéicos desses transformantes,
crescidos em meio normal exibiram atividade de β-galactosidase em níveis
inferiores. Estes resultados sugerem que GmNIK interage fracamente com MP e,
provavelmente, de uma maneira não específica.
52
6. APÊNDICE
6.1. Obtenção de anticorpos contra ocarboxi-terminal de LeNIK
A região carboxi-terminal da LeNIK foi expressa em bactérias como uma
proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidinas no amino-terminal,
derivada do vetor de expressão pET16B (Figura 17A).
A adição de IPTG induziu a síntese de um polipeptídeo de massa
molecular em torno de 21,5 KDa, similar àquela deduzida do cDNA LeNIK
(linhas 6 e 9). A proteína recombinante foi expressa em grandes quantidades em
células induzidas de E. coli, sendo observada tanto em frações insolúveis como
em extratos totais (linhas 6 e 9). A síntese da proteína recombinante foi,
inicialmente, avaliada com base na sua mobilidade eletroforética e na indução
por IPTG (linhas 6 e 9) em comparação com o extrato protéico de bactérias não
induzidas (linhas 5 e 8) e não transformadas (linhas 4 e 7). Além disso, a proteína
recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade a partir de frações
insolúveis induzidas, sendo eficientemente retida em resinas de Ni++, devido a
presença da seqüência de histidinas no terminal amino (Figura 17B). A proteína
purificada foi utilizada para a produção de anticorpos policlonais contra a
proteína LeNIK, denominada anti-NIK.
53
A
Frações
Solúveis
Frações
Insolúveis
Extrato total
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
45,0
31,0
21,5
14,4
6,5
B
45,0
31,0
21,5
14,4
6,5
Figura 17. Indução da síntese da proteína NIK em E. coli. e purificação da
proteína recombinante. A. Indução da proteína NIK. A síntese do
terminal carboxi de LeNIK foi induzida pela adição de IPTG em
E.coli estirpe BL21(DE3) transformada com a construção
pET16B–NIK (colunas 3, 6 e 9). As frações protéicas totais,
insolúveis e solúveis provenientes do clone pUFV466 induzido
(colunas 3, 6 e 9) e não induzido (colunas 2, 5 e 8) e da bactéria não
transformada (colunas 1, 4 e 9) foram separadas em géis de
poliacrilamida, contendo SDS e coradas com “coomassie brilliant
blue R-250”. A seta indica a posição da proteína induzida. M mostra
a migração eletroforética de padrões de proteínas de massa molecular
conhecidas, em KDa. B. Purificação da proteína NIK. O clone
pUFV466 que contém a seqüência parcial do gene NIK foi induzido
com IPTG para a produção da proteína recombinante. A fração
protéica insolúvel foi coletada e aplicada em coluna de afinidade. As
frações eluídas foram analisadas em géis de poliacrilamida, contendo
SDS e coradas com “coomassie brilliant blue R-250”. M mostra a
migração eletroforética de padrões de proteínas de massa molecular
conhecidas, em KDa.
54
O anti-soro NIK foi eficiente em detectar uma proteína em extratos
protéicos extraídos de E. coli transformada e induzida (Figura 18, linha 4) com
massa molecular relativa idêntica a da proteína recombinante, além da proteína
recombinante purificada (linha 5). O anti-soro não apresentou reações cruzadas
com proteínas bacterianas (linhas 1 a 4)
A
M
1
2
3
4
M
1
2
3
4
5
97,4
66,2
45,0
31,0
21,5
B
5
66,2
45,0
31,0
21,5
Figura 18. Especificidade do anticorpo anti-NIK. A. SDS-PAGE de proteínas
totais de bactéria. Proteínas extraídas de suspensão de células de
E.coli estirpe BL21(DE3) não transformada e não induzida (1), não
transformada e induzida (2), suspensão de células de pUFV 466 não
induzidas (3) e induzidas(4) e proteína cinase purificada (5), foram
separadas em SDS-PAGE e coradas com “coomassie brilliant blue
R-250”. B. “Western blotting”de extratos bacterianos. A
especificidade do anticorpo contra a proteína cinase de tomateiro foi
monitorada em ”imunoblotting” obtidos a partir do gel de acrilamida
contento as mesmas amostras visualizadas em A.
55
7. DISCUSSÃO
A família Geminiviridae é uma extensa família de vírus de plantas, cuja
eficiência de propagação na planta hospedeira depende de interações entre
proteínas virais e com fatores do hospedeiro, tanto para replicação quanto
translocação do genoma viral. TGMV possui dois componentes genômicos,
denominados A e B que possuem seis ORFs envolvidas na replicação,
encapsidação e movimento do genoma viral no hospedeiro.
O componente A de TGMV codifica a proteína REn, cuja ORF sobrepõe
a região 3’da ORF da proteína TrAP. A proteína REn não é essencial para a
replicação do genoma viral, mas atua como “enhancer”, aumentando o acúmulo
do DNA viral durante a infecção. Embora o mecanismo de atuação da proteína
REn não tenha sido elucidado, sabe-se que REn é capaz de interagir com a
proteína de replicação Rep do vírus e com a proteína retinoblastoma, envolvida
com a progressão do ciclo celular (SETTLAGE et al., 2001). Os resultados dessa
investigação forneceram evidências que REn também atua como ativador
transcricional, uma vez que esta proteína foi capaz de restaurar a atividade
transcricional do domínio de ligação ao DNA de GAL4, em ensaios de indução
de promotores repórteres sob o controle de GAL4, realizados em leveduras
(Figura 5). Consistente com esta observação, REn localiza-se no núcleo de
células infectadas (SUNTER et al., 1990) e apresenta na região terminal amino
56
uma seqüência conservada, característica de ativadores transcricionais (CRESS et
al., 1991). Em contraste, a proteína Rep, essencial para a replicação do genoma
viral, exibe atividade de repressão de transcrição, envolvida na auto-regulação
negativa de seu promotor (EAGLE et al., 1994). Aparentemente, a atividade de
transativação de REn pode contrapor a atividade auto-repressora de Rep,
promovendo um maior acúmulo da proteína Rep e, como conseqüência, maior
eficiência da replicação do genoma viral. Experimentos transientes de ativação
do promotor do gene Rep, na presença de Rep e REn em protoplastos poderão
explorar esta possibilidade.
Dois modelos para o movimento do genoma viral têm sido discutidos,
baseados nas atividades bioquímicas associadas às proteínas de movimento MP e
NSP. No primeiro modelo, a proteína NSP facilita o movimento do genoma viral
do núcleo para o citoplasma onde é substituída por MP, que então transporta o
DNA viral para as células adjacentes através do plasmodesma (NOUEIRY et al.,
1994). Consistente com este modelo, MP de BDMV aumenta o limite de
exclusão do plasmodesma, MP e NSP exibem atividade de ligação ao DNA
(ROJAS et al., 1998). Além disso, MP de BDMV foi capaz de mediar o
movimento célula-célula de DNA fita simples e fita dupla em estudos de
microinjeção, enquanto que NSP foi capaz de exportar DNA injetado do núcleo
(NOUEIRY et al., 1994, ROJAS et al., 1998). Os resultados da presente
investigação demonstraram que a proteína MP de TGMV é capaz de formar
homo-oligômeros (Figura 6), fornecendo novos discernimentos para o
mecanismo de atuação da proteína MP de begomovírus. De uma maneira geral,
acredita-se que a multimerização de proteínas virais de movimento seja um prérequisito para transporte de genomas virais através do plasmodesma.
O segundo modelo para translocação do genoma viral tem sido proposto
baseado nas propriedades bioquímicas das proteínas de movimento MP e NSP de
SqLCV (PASCAL et al., 1994; WARD et al., 1997). Neste modelo, MP
direciona a translocação do genoma viral, facilitando inicialmente o transporte
intracelular de DNA fita simples mediado por NSP do núcleo para o citoplasma.
Em seguida, MP intermédia o transporte do complexo NSP-ssDNA para as
57
células adjacentes via túbulos, temporariamente induzidos no floema em
desenvolvimento durante o processo de infecção viral. A aparente discrepância
entre os dois modelos têm sido explicada pela limitação ao floema de SqLCV,
enquanto que BDMV pode também infectar tecidos não vasculares
(LAZOROWITZ & BEACHY, 1999). Independente de qual modelo se ajusta
melhor para o movimento célula-célula de TGMV, ambos o modelo prevêem
uma associação entre as duas proteínas de movimento NSP e MP. Os resultados
dos ensaios de interação entre proteínas virais pelo sistema duplo-híbrido
(Figuras 5 e 7) confirmam, pela primeira vez, que, de fato, NSP e MP interagem
fisicamente. NSP foi capaz de interagir tanto com a proteína MP intacta quanto
com uma versão truncada da proteína, deletada de 55 resíduos de aminoácidos na
região terminal carboxi. Estes resultados estão coerentes com os resultados de
análises genéticas que mapearam o domínio putativo de interação com NSP na
região central da proteína MP de SqLCV (SANDERFOOT et al., 1996).
Além de avaliar diretamente as interações entre proteínas virais, o
sistema duplo híbrido foi utilizado para identificar fatores do hospedeiro que
interagem com a proteína viral NSP. De cinco clones isolados pelo escrutínio de
uma biblioteca de cDNA de tomateiro usando NSP como isca, quatro foram
idênticos e codificam um domínio conservado de cinases do tipo serina/treonina,
cuja proteína codificada foi designada LeNIK (L. esculentum NSP-Interacting
Kinase). Evidências indicam que a interação NSP-NIK pode ser biologicamente
relevante. A interação detectada é altamente específica, conforme julgada pela
falha do domínio cinase da proteína NIK em interagir com outras proteínas virais
e controles, pelo sistema duplo híbrido. Além disso, a associação entre NSP e
uma atividade de cinase é esperada, uma vez que experimentos in vitro
demonstraram que a proteína NSP de SqLCV sofre modificações por fosforilação
(PASCAL et al., 1994). Análise da estrutura primária de NSP de TGMV permitiu
identificar resíduos de serina e treonina em contexto favorável para fosforilação
por cinases do tipo serina/treonina. Entretanto, a capacidade da proteína NIK em
utilizar a proteína NSP como substrato não foi avaliada por dois motivos básicos.
Primeiro, a proteína truncada, produzido em bactéria, fracionou como proteína
58
insolúvel nos extratos bacterianos, sendo recuperada como proteína desnaturada.
Segundo a proteína truncada, produzida a partir do cDNA isolado, não contém o
sítio de ligação a nucleotídeos, não sendo provavelmente funcional.
Extensão da extremidade 5’do cDNA NIK de tomateiros por RT-PCR
revelou que o cDNA completo tem a capacidade para codificar uma proteína de
aproximadamente 610-620 resíduos de aminoácidos, tamanho similar aos
homólogos da proteína de outros organismos que possuem de 610 a 650 resíduos
de aminoácidos. Entretanto, a seqüência completa de LeNIK não foi iobtida, uma
vez que a extremidade 5’do cDNA correspondente não foi clonada. Por outro
lado, a análise comparativa de seqüências com cDNAs de soja, isolados no
laboratório e ainda não disponíveis para domínio público, identificou um cDNA
completo de soja homólogo de LeNIK, designado GmNIK (Glycine max).
Evidências indicam que LeNIK e GmNIK são genes ortólogos. A proteína
deduzida a partir da seqüência do cDNA de GmNIK possui 92% de similaridade
e 87% de identidade de seqüência com a região correspondente de LeNIK. Além
disso, as duas proteínas possuem tamanhos similares e os domínios de cinase
conservados estão localizados na mesma região carboxi terminal. Finalmente, foi
demonstrado, por meio do sistema duplo híbrido, que a proteína GmNIK intacta
é capaz de interagir com NSP.
A análise filogenética baseada em homologia de seqüência indicou que a
proteína GmNIK é mais relacionada com receptores cinases serina/treonina
típicos,
cuja
estrutura
modular
permite
comunicação
entre
estímulos
extracelulares e vias de sinalização intracelulares. De fato, a proteína GmNIK
possui domínios conservados que são bioquimicamente relevantes em algumas
classes de genes de resistência de plantas e de genes envolvidos em processos de
desenvolvimento em organismos multicelulares (BONAS & LAHAYE, 2002).
Estes incluem um domínio conservado de cinases do tipo serina/treonina, um
sítio de ligação a nucleotídeos (NBS), repetições ricas em leucinas (LRR), um
domínio transmembrana e o peptídeo sinal de endereçamento para o aparelho
secretor. A presença desse conjunto de seqüências conservadas é característica de
genes de resistência da classe extracelular LRR (JONES & JONES,1997). Esta
59
classe inclui o gene Xa21 de arroz para resistência contra a bactéria Xantomonas
(HE et al., 2000) e o gene Cf de tomate que confere resistência ao fungo
Cladosporium fulvum (JOOSTEN & De WIT, 1999). A proteína codificada pelo
gene Cf possui um domínio LRR extracelular, um segmento transmembrana, mas
não apresenta uma região intracelular que poderia constituir um componente de
sinalização, tal como um domínio cinase e, portanto, não pode constituir um
homólogo funcional de NIK. Por outro lado, a proteína codificada pelo gene de
resistência Xa21 apresenta a estrutura de receptores cinase típicos, ou seja, um
domínio LRR extracelular, um segmento transmembrana e um domínio de
proteínas cinases intracelular, compartilhando com GmNIK os mesmos domínios
estruturais. Baseado na homologia estrutural com Xa21 e na região de interação
com NSP mapeado na região carboxi terminal que contem o domínio de cinase,
uma provável topologia estrutural para a proteína GmNIK é apresentada na
Figura 19.
Região rica em leucinas
Meio extracelular
Membrana plasmática
Domínio transmembrana
Meio intracelular
Domínio de ligação a nucleotídeo
Domínio de cinase
NSP
Figura 19. Modelo topológico proposto para a proteína GmNIK. O segmento
transmembrana presente em GMNIk sugere se tratar de uma proteína
integral de membrana. A orientação da proteína é proposta baseado
na homologia modular com Xa21 e na localização intracelular do
domínio de interação com NSP.
60
Embora estudos funcionais que atribuíssem funções específicas para a
proteína GmNIK não tenham ainda sido conduzidos, a estrutura modular e a
topologia proposta para a proteína na membrana sugere que a interação NIK-NSP
seja biologicamente relevante durante o processo de infecção viral. Duas
possibilidades, mutuamente exclusivas e consistentes com a atuação de GmNIK
como gene de resistência, podem atribuir relevância funcional para a interação
NSP-NIK. A primeira refere-se à ativação de um mecanismo típico de resistência
gene-a-gene. Neste caso, o gene NSP estaria atuando como gene de avirulência
(gene avr) na indução de resistência a geminivirose. Consistente com esta
hipótese, os determinantes de avirulência (avr) em cultivares de feijão resistentes
a BDMV foram mapeados na ORF NSP, sendo provavelmente dependentes da
expressão da proteína NSP (GARRIDO-RAMIREZ et al., 2000). A segunda
possibilidade refere-se a uma possível atuação da proteína NSP como
determinante de virulência. Neste caso, a interação de NSP com NIK causaria
inibição da atividade de cinase do receptor e, como conseqüência, supressão da
resposta de defesa do hospedeiro. Experimentos de determinação da atividade de
cinase de GmNIK na presença de NSP fornecerão subsídios para avaliar
bioquimicamente esta possibilidade.
Uma explicação alternativa para interação funcional entre NSP e GmNIK
pode estar relacionada com um mecanismo de modulação das atividades
bioquímicas de NSP por fosforilação. Neste caso, a proteína NSP estaria
recrutando de uma maneira específica atividades de receptores de cinase para
regulação do movimento do genoma viral. A interação de proteínas de
movimento com proteínas cinases do hospedeiro tem sido documentado para o
caso de MP de Tabacco mosaic virus (TMV) (WAIGMANN et al., 2000). Neste
caso, a fosforilação de MP de TMV parece ter efeito inibitório na atividade da
proteína, bloqueando a interação dessa proteína com o plasmodesma e
dificultando assim o transporte do genoma viral. O efeito regulatório da
fosforilação de MP sobre a permeabilidade do plasmodesma é dependente de
hospedeiro, ocorrendo em tabaco, mas não em N. benthamiana. A fosforilação de
61
proteínas de movimento pode representar um mecanismo geral de controle de
interações de proteínas de movimento de vírus com o plasmodesma.
A determinação da localização subcelular das proteínas LeNIK e GmNIk
importante para a determinação de sua atuação durante o movimento do vírus na
planta, uma vez que a fosforilação pode exercer uma um efeito regulatório sob o
processo de translocação via plasmodesma. A proteína MP pode encontrar-se
localizada na membrana plasmática, membrana do RE ou ainda pode estar
localizada dentro associada a membrana mas na parte interna do plasmodesma
(Figura 20), interagindo com a proteína NSP e influenciando no processso de
translocação do genoma. A localização celular de NSP e sua função proposta no
movimento célula-célula do genoma viral prevê que interações com fatores do
hospedeiro possam ocorrer tanto no citoplasma quanto no núcleo. Assim, o
mecanismo de atuação de NSP como uma determinante avr ou vr pode envolver
tanto um reconhecimento ativo no poro nuclear por um receptor endógeno quanto
por um receptor da membrana plasmática. Assim, a determinação da localização
celular da proteína GmNIK fornecerá subsídios para o entendimento da
significância biológica de sua interação com NSP durante o processo de infecção
viral.
62
?
NES dependente
?
?
MP
NSP
NLS dependente
RE
Figura 20. Localização da proteína LeNIK/GmNIK em células de tomateiro. A
proteína NSP forma, inicialmente, um complexo com o DNA viral,
este complexo sai do núcleo em direção ao citoplasma, onde, na
presença da proteína de movimento MP é translocado para periferia
celular. A NSP interage então com a proteína LeNIK/GmNIK sendo
possivelmente fosforilada e o complexo é translocado através do
plasmodesma para a célula adjacente. Os pontos de interrogação
indicam os possíveis locais onde a proteína LeNIK /GmNIK pode
estar localizada.
63
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