"Molecular Mechanisms of McArdle´s Disease (Muscle Glycogen

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Projecto Tutorial
Molecular Mechanisms of McArdle´s Disease
(Muscle Glycogen Phosphorylase Deficiency)
RNA and DNA Analysis
Gautron, S., Daegelen, D., Mennecier, F., Duboq, D., Kahn, A.,
and Dreyfus J. (1987). J. Clin.Invest. 79: 275-28
Duarte Nuno Amorim dos Santos
Instituto Superior de Ciências da Saúde - Norte
Glicogénio
Polissacarídeo
ramificado
constituído
por
subunidades de glucose unidas por ligações α-1,4 e
α-1,6.
É um meio de armazenamento de energia
rapidamente mobilizável nas células animais.
É encontrado, principalmente, no fígado e músculo
e, secundariamente, nos rins e intestinos .
A sua estrutura ramificada permite a libertação
rápida da glicose.
A sua síntese e regulação são sujeitas a controlo
hormonal.
Metabolismo do Glicogénio
Síntese vs Degradação
Síntese
Degradação
•A glucose 6-fosfato convertese a glucose 1-fosfato pela
fosfoglucomutase
•A glicogénio fosforilase
remove resíduos de glicose1-fosfato
•A síntese de glicogénio a
partir de UDP-glicose é
executada pela glicogénio
sintase.
•A glicose 1-fosfato é
convertida em glicose 6fosfato pela acção da
enzima fosfoglicomutase.
•A glicosil–(4-6)-transferase cria
uma ramificação nos resíduos
de glicose α-1, 6.
•A glicose 6-fosfatase
catalisa a hidrólise da
glicose
6-fosfato
a
glicose (fígado).
Regulação do Glicogénio
A regulação do metabolismo do glicogénio é afectada por hormonas
específicas, nomeadamente:insulina, epinefrina e glucagon.
Enzimas alvo: GLICOGÉNIO FOSFORILASE e GLICOGÉNIO SINTETASE
A insulina assinala um estado alimentado e induz
a síntese de glicogénio no fígado
Activa a
glicogénio sintetase.
A epinefrina e o glucagon promovem a
glicogenólise. A epinefrina actua primariamente
no músculo esquelético. O glucagon actua
primariamente no fígado. Ambas promovem a
síntese de AMPc e a activação da glicogénio
fosforilase.
Doenças do metabolismo de Glicogénio
As glicogenoses são doenças provocadas por um erro inato do metabolismo do
glicogénio. O erro dá-se pela ausência ou deficiência enzimática na síntese ou
degradação do glicogénio, resultando numa alteração na concentração e/ou na
estrutura do glicogénio em diversos tecidos do organismo.
TIPO DENOMINAÇÃO
ENZIMA
TECIDOS
I
D. de von Gierke
Glicose-6-fosfatase
Fígado, músculos e intestino
II
D. de Pompe
α -1,4-glicosidade
Coração, músculos e intestino
III
D. de Cori
Amilo-1,6-glicosidase
Fígado, músculos e coração
IV
D. de Andersen
Amilo-(1,4 - 1,6)-transglicosidase
Fígado
V
D. McArdle
Glicogénio fosforilase muscular
Músculo
VI
D.Hers
Glicogénio fosforilase hepática
Fígado
VII
Taruí
Fosfofrutocinase muscular
Músculos
Fosforilase cinase
Fígado e cérebro
VIII
Tabela 1: Tipos de doenças geradas por um erro no metabolismo do glicogénio e sua classificação
de acordo com o defeito enzimático específico e órgãos afectados.
Doença de McArdle: Sintomatologia
É uma forma rara de uma patologia metabólica.
É caracterizada pela deficiência na actividade da
glicogénio fosforilase muscular.
É transmitida geneticamente como um traço
autossómico recessivo.
Os sintomas são vários, entre os quais:
Cãimbras ao fazer exercício; Fadiga fácil;
mionecrose e mioglobinúria na tentativa de exercício
físico intenso e níveis baixos de lactato após
exercício.
Glicogénio fosforilase
Existe sob a forma de três isoenzimas:
A Glicogénio fosforilase-BB, presente no cérebro, mas também
encontrada no miocárdio.
A Glicogénio fosforilase–LL que é a isoenzima predominante no
fígado.
A Glicogénio fosforilase –MM que se encontra no músculo estriado.
A forma muscular é a única isoenzima expressa no
músculo esquelético, mas encontra-se também presente
no coração e cérebro.
Objectivo do trabalho
Estudar a nível molecular a glicogénio fosforilase
muscular.
Verificar as alterações ao nível da expressão da
glicogénio fosforilase e da actividade da enzima,
ocorridas em pacientes com a doença de McArdle
Procedimento Geral
I- Identificação por hibridação heteróloga do cDNA da glicogénio
Rastreio de uma biblioteca de cDNA
Construção de uma biblioteca de cDNA
fosforilase muscular humana e sua sequenciação
Clonagem
Placa de lise
Transferência para
nitrocelulose
Placa de lise
Sonda de ácido nucleico
marcada com 32p
Placa mestra
Membrana réplica
Hibridação da sonda
com DNA ligado ao
filtro
Lavagem das sondas
não incorporadas
Sonda hibrida com DNA
ligado aos fagos que contêm
a sequência complementar
DNA clonado
Procedimento Geral
II- Determinação, por Northern-blot, dos níveis de RNAm da
glicogénio fosforilase-MM em diferentes tecidos humanos
III- Análise da expressão e da actividade da glicogénio fosforilase
em diferentes pacientes McArdle
Análise dos níveis de RNAm da glicogénio fosforilase por Northern-blot
Análise dos níveis de proteína por SDS-PAGE
Determinação da actividade enzimática.
IV- Análise do DNA genómico de pacientes McArdle por Southern-blot
Resultados
I- Identificação do cDNA da Glicogénio Fosforilase Muscular Humana
Screening de uma biblioteca de cDNA humana, utilizando como sonda cDNA de
glicogénio fosforilase muscular de coelho.
Hibridação heteróloga
Mapeamento por restrição enzimática dos clones positivos.
Identificação de três clones
que se sobrepõe ao cDNA
da glicogénio fosforilase
muscular de rato e humano.
Sequenciação do cDNA isolado
Região codificante + região 3´
94% de homologia entre a sequência
proteica deduzida e a glicogénio
fosforilase muscular do coelho.
90% homologia entre
sequências nucleotídicas.
as
Confirmação da identidade
da glicogénio fosforilase por
sequenciação do cDNA
Determinação dos níveis de RNAm da glicogénio
fosforilase muscular em diferentes tecidos humanos
Isolamento de RNAm de diferentes tecidos (músculo, fígado, cérebro e pulmão)
Northern Blot: sonda - Clone 18 F11
Transcrito de 3,4 kb
Músculo Fígado Cérebro Pulmão Músculo Músculo
do adulto adulto fetal
do adulto fetal
Proteína com
aproximadamente
840 aminoácidos
Cerca de 800-900 pb de
região não codificante
Glicogénio
fosforilase
muscular
é
expressa no músculo de adulto e fetal,
mas não no cérebro, pulmão e fígado.
1
2
3
4
5
6
Análise da glicogénio fosforilase em
pacientes McArdle
Ausência de actividade da glicogénio fosforilase muscular
Ausência da banda correspondente à glicogénio fosforilase em SDS-PAGE
Análises feitas a biópsias musculares de 10 doentes
McArdle mostraram ausência de proteína e de
actividade enzimática da glicogénio fosforilase.
Análise por Northern-blot dos níveis de RNAm da glicogénio
fosforilase do tecido muscular de diferentes pacientes
Controlo
C1C0,5 Cb5
3 6
Cb
C1 C0,5 C0.2 2
7 Cb
Cb
8
H1
9 10 H2
C- Controlo; 1 a 10- doentes McArdle;
H1 e H2- Heterozigóticos
Exibição de Heterogeneidade
molecular ao nível do RNAm
Análise do DNA genómico por Southern-blot
A – Sonda 600
B – Sonda 600 e 700
Os padrões de restrição obtidos nos diferentes pacientes foram
idênticas aos do controlo.
Sonda 600 e 700
•
•
Sonda 600 e 700
As mutações ao nível do DNA deverão corresponder a mutações
pontuais ou pequenas delecções.
Conclusões
Foram identificados 3 clones de cDNA de glicogénio fosforilase muscular
humano por hibridação heteróloga com cDNA de glicogénio fosforilase muscular
de coelho.
A sequenciação do cDNA isolado revelou 94% de homologia entre a sequência
proteica deduzida e a glicogénio fosforilase muscular do coelho
A análise da expressão da glicogénio fosforilase–MM por Northern-Blot levou à
identificação de um RNAm de 3,4 kb presente no músculo de adulto e fetal, mas
ausente no fígado e cérebro.
Conclusões (continuação)
Análise da expressão e actividade da
glicogénio fosforilase muscular em
doentes McArdle
Ausência de actividade enzimática
e da banda da glicogénio fosforilase
em gel de SDS-PAGE
RNAm ausente em tecido muscular
de alguns pacientes e presente em
menor quantidade no de outro.
heterogeneidade molecular ao nível do RNAm
Presença de RNAm não funcional em menor quantidade
Ausência de RNAm
A análise por Southern – Blot confirmou que a doença se deve a uma
mutação pontual ou a uma pequena delecção no gene que codifica a
enzima glicogénio fosforilase muscular
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