Como apanhamos bactérias boas para as plantas

Universidade de Évora – ICAAM
Laboratório de Microbiologia do Solo
Ana Neves
José Neto
Responsável:
Solange Oliveira
Investigadoras:
Marta Laranjo
Ana Alexandre
18/07/2011-22/07/2011
Rizóbios são bactérias que apresentam
uma relação de simbiose com plantas
leguminosas.
 Na relação simbiótica, as bactérias
promotoras da fixação do azoto
atmosférico fornecem compostos
azotados às plantas e estas fornecem
energia e matéria sintetizada necessária
ao desenvolvimento das bactérias.

A existência deste tipo de bactérias nas
raízes das plantas (formando nódulos)
diminui a necessidade de utilização de
fertilizantes na agricultura para além de
incrementar o desenvolvimento da
planta.
 Essa diminuição vai promover uma
diminuição da eutrofização que se
verifica ao nível de cursos de água.


O estudo deste tipo de bactérias tornase portanto essencial para o
desenvolvimento de uma agricultura
sustentável.
Procedeu-se à recolha no campo de
leguminosas noduladas.
 Numa câmara de fluxo laminar
horizontal, as raízes foram
desinfectadas de modo a eliminar
microrganismos indesejados. Para a
desinfecção as raízes foram
mergulhadas 30 seg em álcool (C2H6), 2
min em peróxido de hidrogénio (H2O2) e
por fim lavadas em água (H2O).

Leguminosa nodulada

Preparou-se um meio de cultura propício
ao desenvolvimento de colónias de rizóbio,
MLA (contendo cloreto de sódio,
hidrogenofosfato dipotássico, sulfato de
magnésio, manitol, extracto de levedura,
água e apresentando um valor de pH de
cerca de 7.1) a que se adicionou Vermelho
do Congo, um corante que permite a
identificação de colónias de rizóbio, visto
que estas apresentam uma cor
esbranquiçada já que não incorporam o
corante.
Preparação do meio de cultura
De seguida colocou-se MLA+VC em
caixas de petri que foram devidamente
identificadas.
 Após o arrefecimento do meio de cultura
picaram-se os nódulos existentes nas
raízes de modo a inocular em placa.
 Por fim, colocaram-se na estufa a 28ºC,
temperatura ideal ao desenvolvimento
das colónias.

Colocação de placas na estufa
Quando já se observavam colónias
formadas no meio de cultura sólido
(MLA+VC) procedeu-se ao isolamento
das mesmas.
 Após o isolamento, uma colónia de
bactérias é colocada em meio líquido,
ficando em meio líquido de um dia para
o outro.

Isolamento de colónias
Extracção de DNA
Centrifugaram-se as células e
adicionou-se lisozima para destruir as
paredes celulares de modo a permitir a
libertação do material genético para a
sua extracção.
 Com o apoio de um kit comercial,
E.Z.N.A. Bacterial DNA Kit, procedeu-se
à extracção do DNA total em coluna. A
coluna de extracção apresenta uma
membrana onde o DNA fica retido.




O DNA retido na membrana, é retirado da
mesma por adição de tampão TE, sendo
posteriormente transferido para microtubos.
Tendo o DNA bacteriano extraído (DNA total)
realiza-se uma electroforese.
O DNA apresenta carga eléctrica negativa e
como tal vai-se deslocar do pólo negativo para
o positivo da tina. As partículas de maiores
dimensões vão deslocar-se menos ao longo do
gel (constituído por agarose e tampão TBE
0.5X) enquanto que as partículas de menores
dimensões se vão deslocar mais.
Colocação das substâncias na tina para electroforese
Coloca-se um marcador no gel que
serve de controlo de modo que seja
possível determinar a dimensão das
partículas de DNA por meio de
comparação.
 Como se fala de DNA total, este
apresenta grandes dimensões não sendo
possível determinar o seu tamanho.
 Procedeu-se a uma diluição da amostra.

Sujeitaram-se as amostras a um PCR
(Polymerase Chain Reaction) com o intuito
de amplificar um gene característico deste
tipo de bactérias, o gene RNA ribossomal
16S.
 Para isso foram adicionadas às amostras
primers (sequências de nucleótidos
conhecidas que se vão ligar por
complementaridade a uma cadeia de
nucleótidos de DNA dizendo onde começa
e onde acaba o gene que se pretende
amplificar).

PCR
Sendo as moléculas de DNA constituídas
por duas cadeias polinucleotídicas,
durante o PCR, a temperatura aumenta
até aos 92ºC de modo a separar as duas
cadeias para que os primers se liguem
por complementaridade.
 Adicionaram-se nucleótidos às amostras
e uma enzima, DNA polimerase
responsável pela polimerização.

No fim do PCR, teremos uma grande
quantidade de moléculas de RNA
ribossomal 16S.
 Fez-se uma nova electroforese,
colocou-se o gel em brometo de etídeo
(substância que confere fluorescência ao
DNA quando sujeito a radiações UV).

Por último, sujeitou-se o gel a radiações
UV e comparando com o marcador
confirmou-se que o produto obtido
correspondia ao gene 16S (cerca de
1400 bp).
 Verificou-se a existência de bandas
secundárias, provavelmente
contaminantes ou resultantes da ligação
dos primers em locais onde a
complementaridade era reduzida.

Gel após 2ª electroforese quando sujeito a UV