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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS PROCESSAMENTO E APRESENTAÇÃO ANTIGÊNICA E POSSÍVEIS INTERFERÊNCIAS VIRAIS Duanne Alves da Silva Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis Goiânia 2011 ii DUANNE ALVES DA SILVA PROCESSAMENTO E APRESENTAÇÃO ANTIGÊNICA E POSSÍVEIS INTERFERÊNCIAS VIRAIS Seminário apresentado à disciplina de Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás Nível: Doutorado Área de Concentração: Sanidade Animal e Higiene e Tecnologia de Alimentos Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis Comitê de Orientação: Profa. Dra. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito – EV/UFG Profa. Dra Liliane Borges de Menezes – IPTSP/UFG Goiânia 2011 iii SUMÁRIO 1-INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1 2-REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 3 2.1- Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) ................................... 3 2.2- Células apresentadoras de antígenos (APCs) ............................................ 5 2.3- Processamento e apresentação de antígenos endógenos ......................... 6 2.4- Processamento e apresentação de antígenos exógenos............................ 9 2.5- Apresentação cruzada .............................................................................. 12 2.6- Interferências virais no processamento e apresentação antigênicos ........ 16 2.6.1- Inibição do transportador associado ao processamento de antígenos .. 16 2.6.2- Evasão da macroautofagia..................................................................... 24 3-CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 27 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 28 iv LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Estrutura das moléculas de MHC classes I e II................................4 FIGURA 2: Micrografia eletrônica de uma célula dendrítica................................6 FIGURA 3: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos endógenos via MHC classe I para linfócitos TCD8+............................................8 FIGURA 4: Os quatro processos de digestão celular mediada por lisossomos...........................................................................................................9 FIGURA 5: Síntese do MHC classe II evidenciando a remoção do CLIP pela molécula HLA-DM..............................................................................................11 FIGURA 6: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos exógenos via MHC classe II para linfócitos TCD4+...........................................12 FIGURA 7: Mecanismos de proteólise lisossomal.............................................14 FIGURA 8: A macroautofagia regula a apresentação cruzada e as vias de apresentação de antígenos intra e extracelulares nas moléculas de classe II do MHC.......................................................................................................................15 FIGURA 9: Regulação do MHC I de camundongos pelas proteínas UL49.5, US3, US6, BNFL2a e ICP47................................................................................19 FIGURA 10: Expressão dos níveis de inibidores virais em células de camundongos..........................................................................................................21 FIGURA 11: Expressão das proteínas UL49.5 dos herpesvírus de ruminantes.........................................................................................................22 FIGURA 12: Citometria de fluxo evidenciando a expressão de moléculas de MHC-I na superfície de células MDBK e MJS, e de MHC-II em células MJS......................................................................................................................23 FIGURA 13: A atividade de transporte do TAP foi analisada nas células MDBK e MJS expressando as proteínas UL49.5 homólogas........................................24 FIGURA 14: Níveis de TAP1 e TAP2 expressos nas células MJS....................24 1 1-INTRODUÇÃO O organismo dos animais e humanos está exposto a constantes ataques de microrganismos, podendo sofrer as mais variadas injúrias. No entanto, existem mecanismos competentes no combate a essas invasões visando responder a esses ataques de uma forma eficiente. Um patógeno, para estabelecer-se com sucesso no organismo, precisa ultrapassar barreiras e ser capaz de driblar as defesas do hospedeiro que pretende infectar. Por sua vez, o organismo infectado necessita reconhecer o agente invasor para definir as ações a serem tomadas no intuito de restabelecer o equilíbrio. Esse ponto é crucial quando ocorre uma injúria, pois uma resposta exacerbada pode eliminar a infecção, mas por ser tão intensa, pode levar a morte do hospedeiro, assim como uma resposta fraca pode não ser suficiente para eliminar o agente. O sistema imunológico é, portanto, um vigilante do organismo, pois sua função não é apenas proteger e defender o indivíduo frente a invasão de agentes estranhos, mas principalmente de manter a homeostase corporal. Diversas substâncias, ao entrarem no organismo de um indivíduo, podem ser reconhecidas como antígenos, tais como: proteínas, carboidratos, lipídeos e ácidos nucléicos. Para que o sistema imune responda a essas substâncias estranhas desenvolvendo suas funções eficientemente, elas precisam ser processadas e apresentadas a células específicas. A célula do sistema imunológico responsável por esse processamento e posterior apresentação de antígenos, sejam eles próprios ou não próprios, é conhecida como célula apresentadora de antígeno (APC). Macrófagos, linfócitos B, neutrófilos, células endoteliais e células dendríticas (DC) atuam como APCs, sendo que as DCs são consideradas APCs profissionais, por serem mais eficientes no processamento e apresentação antigênicos (THÉRY & AMIGORENA, 2001; LYN et al., 2008; VYAS et al., 2008). Apesar de o processamento e a apresentação de antígenos serem mecanismos complexos que envolvem diferentes fases, muitos microrganismos conseguem subverter etapas distintas desses processos. Dentre os agentes que interferem nesses mecanismos de forma eficiente encontram-se os 2 herpesvírus (KWUN et al., 2011; MARIEKE et al., 2011a, MARIEKE et al., 2011b, MARIEKE et al., 2011c;). A infecção causada por esses patógenos, que se estabelece por toda a vida do hospedeiro, se deve a um balanço estabelecido entre o sistema imunológico do indivíduo infectado e as estratégias de evasão da resposta imune utilizadas pelos vírus. Diante do exposto, pretende-se com esta revisão de literatura abordar os aspectos referentes ao processamento e a apresentação de antígenos e possíveis interferências dos herpesvírus nesses mecanismos. 3 2-REVISÃO DE LITERATURA 2.1- Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) O MHC (Major Histocompatibility Complex) é um locus amplo com genes altamente polimórficos que codifica as moléculas classes I e II, assim como outras proteínas. Essas moléculas têm a função de se ligar a peptídeos antigênicos e apresentá-los aos linfócitos T específicos. As moléculas MHC foram originariamente reconhecidas pelo seu papel no desencadeamento de resposta das células T que causavam a rejeição de transplantes (BODMER, 1987; KLEIN & SATO, 2000). As duas classes de MHC apresentam características estruturais semelhantes, no entanto, diferem quanto a apresentação dos antígenos a determinado tipo de linfócito. O MHC de classe I é uma molécula composta por duas cadeias polipeptídicas distintas ligadas de forma não covalente; a cadeia pesada (ou cadeia α) e um polipeptídeo não polimórfico que não é codificado pelo MHC, a β2-microglobulina (ABBAS et al., 2008). Já nas moléculas de classe II do MHC, as duas cadeias polipeptídicas (α e β), que também estão ligadas de forma não covalente, são codificadas por genes do MHC polimórficos (VILLADANGOS, 2001). Ambas as classes apresentam uma fenda extracelular de ligação de antígenos, uma região não polimórfica semelhante a imunoglobulina (Ig), uma região transmembrana e uma região citoplasmática. A fenda é constituída de αhélices nas laterais e uma base de oito lâminas β-pregueadas antiparalelas. A fenda das moléculas de classe I é formada pelos domínios α1 e α2 da cadeia α, enquanto que a da classe II é formada pelos domínios α1 e β1 das duas cadeias (Figura 1) (VILLADANGOS, 2001; ABBAS et al., 2008). 4 FIGURA 1: Estrutura das moléculas de MHC classes I e II. Fonte: ABBAS et al., 2008. O MHC de classe I é um receptor para antígenos endógenos (intracelulares) e está presente na maior parte das células nucleadas. Já o MHC de classe II é um receptor para antígenos exógenos (extracelulares) e é encontrado nas principais células apresentadoras de antígenos (células dendríticas, macrófagos e linfócitos B). É importante ressaltar que ambas as classes são receptores de antígenos protéicos (VILLADANGOS, 2001; ABBAS et al., 2008). QUADRO 1: características das moléculas de MHC classes I e II Características MHC classe I MHC classe II Cadeias Polipeptídicas α (44-47 kD) β2-microglobulina (12 kD) α ( 32 kD) β (29 – 32 kD) Localização dos resíduos polimórficos Domínios α1 e α2 Domínios α1 e β1 Local de ligação para correceptor de célula T Região α3 liga CD8 Região β2 liga CD4 Tamanho da fenda de ligação de peptídeo Acomoda peptídeos de 811 resíduos Acomoda peptídeos de 10- 30 resíduos ou mais Fonte: ABBAS et al., 2008. 5 2.2- Células apresentadoras de antígenos (APCs) Diferentes tipos celulares podem processar e apresentar antígenos com diversos níveis de eficiência (SCHNEIDER & SERCARZ, 1997; MELLMAN et al., 1998). Algumas células, no entanto, possuem atividade mais efetiva como apresentadoras como as células B, os macrófagos e, especialmente as células dendríticas (DC) (Figura 2), que são consideradas APCs profissionais (TROMBETTA & MELLMAN, 2005). Algumas características inerentes as células dendríticas fazem dessa classe celular a mais eficiente apresentadora de antígenos. Diferente do macrófago e do linfócito B, a DC tem como função primária a apresentação antigênica. Tanto o macrófago como a DC completam sua diferenciação quando se estabelecem em um tecido periférico após a saída da corrente sanguínea. Quase todos os tecidos contêm DCs e macrófagos num estado estacionário, apesar dos dois tipos celulares diferirem quanto a sua importância (TROMBETTA & MELLMAN, 2005). As DCs apresentam uma distribuição única nos órgãos linfóides, secundários acumulando-se em regiões onde, geralmente, não existem macrófagos e linfócitos B. As áreas onde os linfócitos T naive são ativados são ricas em DCs, uma posição ótima para que um grande número de células T possa explorar continuamente essas APCs em busca de complexos peptídeoMHC específicos (ITANO & JENKINS, 2003; MEMPEL et al., 2004). As células dendríticas apresentam propriedades de vigilância e de migração únicas (RANDOLPH et al., 2001), o que lhes permite capturar antígenos na periferia e carreá-los até os órgãos linfóides secundários ou internalizá-los diretamente da linfa (ITANO et al., 2003). 6 FIGURA 2: Micrografia eletrônica de uma célula dendrítica. Fonte:http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_dend r%C3%ADtica 2.3- Processamento e apresentação de antígenos endógenos Todas as células nucleadas podem apresentar peptídeos associados ao MHC classe I, pois todas elas expressam essa molécula em sua superfície. Antígenos protéicos presentes no citosol como, proteínas virais ou proteínas que sofreram mutação em células tumorais são, em sua maioria, sintetizados endogenamente. Esses antígenos protéicos são degradados pelo proteassoma, um grande complexo catalítico de proteases presente no citoplasma e no núcleo da célula para, posteriormente, serem apresentados aos linfócitos TCD8+ via MHC classe I (PEAPER et al., 2008). O proteassoma degrada proteínas em peptídeos contendo de três a 20 aminoácidos. A forma ativa do proteassoma é o complexo 26S, o qual reconhece e se liga a proteínas ubiquitinadas. A ubiquitina é um pequeno polipeptídeo que funciona como uma chaperonina, sendo responsável pela checagem estrutural das proteínas que são sintetizadas pela célula. Quando ocorre algum erro na síntese protéica, a ubiquitina se liga de forma covalente a proteína, permitindo o reconhecimento desta pelo proteassoma. O complexo 26S é composto pela subunidade catalítica 20S e pela subunidade reguladora 19S. Em todas as células eucariotas, o complexo 26S é formado por uma estrutura anelar que apresenta regiões não catalíticas (subunidades α) e catalíticas (subunidades β). Três subunidades β, que são expressas 7 constitutivamente, são substituídas por subunidades induzíveis chamadas LMP2 (iβ1), MECL1 (iβ2) e LMP7 (iβ5) quando há estímulo do IFN-γ sobre as células. Essas subunidades constituem o chamado imunoproteassoma e são importantes na geração dos peptídeos de ligação a classe I do MHC, pois alteram a especificidade do substrato do proteassoma que passa a produzir peptídeos contendo de seis a 30 aminoácidos (MURATA et al., 2009). O imunoproteassoma apresenta uma elevada capacidade de clivar regiões com aminoácidos hidrofóbicos ou que contenham terminal carboxila básico, os quais são freqüentemente encontrados na porção C- terminal dos peptídeos ligados ao MHC classe I (VAN DEN EYNDE & MOREL, 2001). Os peptídeos antigênicos gerados no citosol precisam ser encaminhados ao retículo endoplasmático, pois é nessa organela que ocorre a síntese das moléculas de MHC classe I. Os genes do MHC codificam as duas cadeias de um heterodímero chamado transportador associado a processamento de antígenos (TAP). Esse transportador está localizado na membrana do retículo endoplasmático e medeia o transporte ativo dependente de ATP dos peptídeos citosólicos para o interior do retículo. A síntese da proteína TAP também é estimulada pelo IFN-γ e os genes TAP1 e TAP2 (que codificam as proteínas formadoras do canal de entrada dos peptídeos no retículo) estão próximos aos genes que codificam LMP2 e LMP7 no MHC (MURATA et al., 2009). Além disso, apesar da proteína TAP apresentar uma ampla especificidade de substrato, assim como o imunoproteassoma, ela possui um transporte ótimo de peptídeos que contenham de seis a 30 aminoácidos e que possuem terminais carboxilas básicos (no homem) ou resíduos hidrofóbicos (no homem e nos camundongos), que são as características dos peptídeos gerados no imunoproteassoma permitindo a ligação às moléculas do MHC (ABBAS et al., 2008). A proteína TAP é altamente conservada entre diversas espécies. A TAP1 e a TAP2 de humanos, suínos, bovinos e roedores apresentam 70 a 80% de similaridade de aminoácidos (McCLUSKEY et al., 2004; GARCIA-BORGES et al., 2006). Acredita-se que este transportador esteja envolvido na apresentação antigênica mediada pelo MHC I em diferentes espécies (OHTA et al., 2003). 8 Existe um controle durante o transporte desses peptídeos que é feito por várias moléculas chaperoninas presentes no retículo. O transporte ocorre por meio de um complexo formado pela cadeia pesada do MHC I (cadeia α), pela β2 microglobulina e pelas chaperoninas tapasina, calnexina, calreticulina e ERp57. Enquanto a calnexina, a calreticulina e a ERp57 estabilizam o complexo MHC recém formado, a tapasina e a ERp57 mantém o mesmo fixado a TAP e facilitam a aquisição de peptídeos com alta afinidade (VERWEIJ et al., 2011a). Quando o peptídeo entra no retículo endoplasmático por meio do TAP, ele é aparado por aminopeptidases residentes no retículo (ERAP) para que apresente o tamanho apropriado de ligação à fenda do MHC (HAMMER et al., 2007). Após essa ligação, o complexo peptídeo- MHC classe I é liberado da tapasina, podendo sair do retículo e ser transportado para a superfície celular apresentando o antígeno para as células TCD8 + (Figura 3) (GANNAGE & MÜNZ, 2010). FIGURA 3: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos endógenos via MHC classe I para linfócitos TCD8+. Fonte: ABBAS et al., 2008. 9 2.4- Processamento e apresentação de antígenos exógenos A geração de moléculas do complexo peptídeo- MHC classe II e sua expressão na superfície celular são essenciais para a ativação de linfócitos TCD4+ (ROCHA & NEEFJES, 2008). A geração de peptídeos que se ligarão as moléculas de MHC II pode ocorrer por diversos mecanismos de endocitose que diferem em importância de acordo com a APC. Eles podem acessar a via endocítica por pinocitose, fagocitose, endocitose mediada por receptor e autofagocitose (ou autofagia) (Figura 4) (WATTS, 1997). FIGURA 4: Os quatro processos de digestão celular mediada por lisossomos. (i) endocitose mediada por receptores específicos; (ii) pinocitose (englobamento de gotículas contendo líquido extracelular); (iii) fagocitose (partículas extracelulares); (iv) autofagia (micro- e macro- de proteínas e organelas intracelulares). Fonte: CIECHANOVER, 2005. A formação do complexo peptídeo- MHC é resultado do encontro de duas vias: o transporte de antígenos por meio de endossomos; e a síntese do 10 MHC II no retículo endoplasmático seguida do envio da molécula ao compartimento endocítico para que haja a ligação ao antígeno. Três estruturas principais estão envolvidas nesse processo: os endossomos precoces (ou primários), os endossomos tardios (ou secundários) e os lisossomos. Os endossomos precoces são as primeiras vesículas que entram em contato com o material endocitado, apresentam um pH ligeiramente ácido e não possuem boa capacidade proteolítica. Já os endossomos tardios são mais ácidos e contêm alguns dos componentes característicos de compartimentos lisossômicos, como proteases e glicoproteínas. Enquanto os lisossomos apresentam pH baixo e são ricos em enzimas hidrolíticas sendo uma das principais estruturas eliminadoras de resíduos da célula (VILLADANGOS, 2001). A via endocítica é interceptada por uma rota que se origina nos últimos componentes do complexo de Golgi, a rede trans-Golgi (TGN). Essa rede é um meio de comunicação onde as moléculas recém sintetizadas provenientes do retículo são direcionadas para a via endocítica, caso apresentem sinais específicos (como manose 6-fosfato, por exemplo). Se essas moléculas se destinarem a secreção ou expressão na membrana plasmática elas também podem entrar na via endocítica (VILLADANGOS, 2001). As cadeias α e β do MHC de classe II são sintetizadas coordenadamente e se associam no retículo endoplasmático formando um heterodímero. Este se liga a uma proteína chamada cadeia invariante (Ii) que ocupa as fendas de ligação de peptídeos da molécula de classe II. Os dímeros recém formados são instáveis e suas dobras e agregação também são auxiliadas por chaperoninas residentes no retículo como a calnexina, assim como ocorre na formação do MHC classe I. Logo, com a cadeia Ii ocupando a fenda de ligação, o MHC classe II não consegue se ligar e apresentar os antígenos que encontra no retículo, deixando tais peptídeos se associarem as moléculas de classe I. Além disso, a cadeia invariante também promove o dobramento e agregação das moléculas classe II recém formadas e direciona o complexo classe II- cadeia Ii para a via endocítica de modo que ocorra o encontro com os peptídeos interiorizados e processados nas vesículas (HASTINGS & CRESSWELL, 2011). 11 Um conjunto de endossomos ricos em moléculas classe II desempenha um importante papel na apresentação de antígenos. Esses endossomos são chamados de compartimento do MHC classe II (MIIC) e contém todos os componentes necessários para a associação dos peptídeos ao MHC II, além de uma molécula chamada de antígeno de leucócitos humanos DM (HLA-DM). No MIIC a cadeia invariante é removida para que ocorra a ligação dos peptídeos antigênicos na fenda. Essa remoção ocorre pela ação das mesmas chaperoninas já citadas, como a catepsina, enzima responsável pela degradação de proteínas interiorizadas em endossomos, lisossomos e fagossomos (HASTINGS & CRESSWELL, 2011). Após essa proteólise resta apenas um resíduo de 24 aminoácidos chamado de peptídeo de cadeia invariante associado à classe II (CLIP), que é removido pela ação da molécula HLA-DM (Figura 5). Essa molécula atua como um trocador, auxiliando a retirada do CLIP e o acréscimo de outros peptídeos. (GANNAGE & MÜNZ, 2010). FIGURA 5: Síntese do MHC classe II evidenciando a remoção do CLIP pela molécula HLA-DM. Fonte: ABBAS et al., 2008. Uma vez removido o CLIP, os peptídeos que foram gerados pela proteólise dos antígenos protéicos interiorizados nas vesículas, podem se ligar a fenda do MHC classe II, estabilizando a molécula. A HLA-DM também atua 12 nessa etapa como uma chaperonina, assegurando a ligação de peptídeos de elevada afinidade ao MHC classe II. Como as extremidades da fenda de ligação do MHC II estão abertas (Figura 1), pode ocorrer a ligação de grandes peptídeos ou até proteínas inteiras desdobradas. As enzimas proteolíticas são as responsáveis por aparar essas proteínas até que tenham o tamanho apropriado para o reconhecimento das células T. Assim, os peptídeos apresentados na superfície celular em moléculas de classe II do MHC, geralmente, apresentam um tamanho que varia de 10 a 30 aminoácidos (Figura 6) (ABBAS et al., 2008; GANNAGE & MÜNZ, 2010; HASTINGS & CRESSWELL, 2011). FIGURA 6: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos exógenos via MHC classe II para linfócitos TCD4+. Fonte: ABBAS et al., 2008. 2.5- Apresentação cruzada Originalmente, acreditava-se que as moléculas de MHC classe I seriam apresentadoras, principalmente, de antígenos endógenos. No entanto, notou-se que certos tipos celulares, principalmente APCs profissionais como as células dendríticas, eram capazes de exibir antígenos extracelulares nas 13 moléculas de classe I por meio de um mecanismo de apresentação cruzada (AMIGORENA & SAVINA, 2010). Tal mecanismo também ocorre com as moléculas de classe II, que podem ligar-se a antígenos endógenos e exibí-los na superfície das células apresentadoras (MARRACK et al., 1993; DENGJEL et al., 2005) inclusive, após o processamento intracelular desses antígenos (JARAQUEMADA et al., 1990; MÜNZ et al., 2000). Alguns antígenos ganham acesso a degradação lisossômica nos compartimentos carreadores de MHC II por meio do processo de autofagia (NIMMERJAHN et al., 2003; PALUDAN et al., 2005; JAGANNATH et al., 2009). A autofagia é uma via catabólica que leva a degradação proteolítica dos compartimentos celulares por lisossomos (Figura 4). Este mecanismo permite o contato de antígenos intracelulares com o MHC de classe II e sua posterior apresentação por essas moléculas. Além disso, já se tem evidências de que a autofagia pode auxiliar a apresentação de antígenos extracelulares tanto pelo MHC I quanto pelo MHC II (Figura 7) (DENGJEL et al., 2005; HAYASHI- NISHINO et al., 2009; MÜNZ, 2010). Um tipo particular de autofagia, a macroautofagia, tem sido implicado na apresentação de antígenos intracelulares via MHC classe II para os linfócitos TCD4+. Durante esse processo componentes celulares, como organelas danificadas, agregados protéicos ou mesmo antígenos, são englobados por vesículas originárias do retículo endoplasmático, do complexo de Golgi ou da membrana mitocondrial (Figuras 4 e 7) (ENGLISH et al., 2009; HAYASHI-NISHINO et al., 2009). 14 FIGURA 7: Mecanismos de proteólise lisossomal. Microautofagia- invaginação da superfície lisossomal que leva a produção de vesículas cujo conteúdo protéico sofre degradação no interior do lisossoma. Macroautofagia- fusão de lisossomas com vacúolos originários de organelas celulares (Golgi ou mitocôndria). Fonte: adaptado de CUERVO & DICE, 1998. LI et al., (2008) e UHL et al., (2009) verificaram que antígenos virais e de tumores são apresentados de maneira mais eficiente quando a célula processadora consegue realizar macroautofagia. Esses estudos sugerem que a macroautofagia auxilia no acondicionamento do antígeno para uma apresentação cruzada eficiente. Outra assistência do mecanismo de macroautofagia (Figuras 7 e 8) refere-se ao transporte do antígeno endocitado para ser degradado nos lisossomos, facilitando o carreamento do mesmo pelas moléculas de classe II (MÜNZ, 2010). 15 FIGURA 8: A macroautofagia regula a apresentação cruzada e as vias de apresentação de antígenos intra e extracelulares nas moléculas de classe II do MHC. Fonte: MÜNZ, 2010. Durante o processamento de partículas endocitadas ou que estejam presentes no citosol, é formado o autofagossomo, uma vesícula que apresenta uma membrana isoladora ao redor dessas partículas ou de constituintes do citoplasma celular. O autofagossomo se funde com o MIIC gerando os corpos multivesiculares (MVBs). Os autofagossomos podem fundir-se diretamente com os MVBs ou após a fusão com endossomos (formando o anfissomo). As partículas internalizadas pelo autofagossomo também podem escapar dos MVBs por exocitose, sendo apresentadas pelas células dendríticas via MHC I (MÜNZ, 2010). 16 2.6- Interferências virais no processamento e apresentação antigênicos 2.6.1- Inibição do transportador associado ao processamento de antígenos (TAP) Os herpesvírus conseguem escapar da eliminação dos linfócitos T citotóxicos por meio de interferências específicas na função de apresentação antigênica das moléculas do MHC I. Muitos vírus, especialmente os herpesvírus, codificam moléculas que bloqueiam a função do TAP. Atualmente, quatro genes codificados pelos herpesvírus já foram identificados como inibidores desta proteína transportadora (VERWEIJ et al., 2011a). Os herpesvírus de animais, pertencentes ao gênero Varicellovirus, como o herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), o vírus da Doença de Aujeszky ou pseudoraiva (PRV ou SuVH-1) e os herpesvírus de eqüinos tipos 1 e 4 (EHV 1 e 4), são capazes de inibir o TAP por meio de uma proteína chamada UL49.5, codificada por esses patógenos. A UL49.5 do BoHV-1 bloqueia mudanças conformacionais no complexo TAP, impedindo os rearranjos estruturais necessários para o transporte do antígeno. Ademais, o TAP é direcionado para degradação pelo proteassoma (KOPPERS-LALIC et al., 2005; VERWEIJ et al., 2008). As proteínas UL49.5 codificadas pelos herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), herpesvírus bubalino tipo 1 (BuHV-1), herpesvírus cervídeo tipo 1 (CvHV-1) e herpesvírus felídeo tipo 1 (FeHV-1), também já foram identificadas como potentes inibidores do TAP (VERWEIJ et al., 2011b). Outros herpesvírus de animais como os herpesvírus de galídeos tipos 1 e 2 (vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV) e vírus da Doença de Marek (MDV), respectivamente), pertencentes aos gêneros Iltovírus e Mardivirus, também já foram alvo de estudos com relação as prováveis proteínas inibidoras da apresentação pelo MHC I. Apesar de VERWEIJ et al., (2011b) terem observado que as proteínas UL49.5 desses vírus falharam na inibição do TAP, ainda não está esclarecido se o ILTV possui outro tipo mecanismo e se o MDV codifica alguma proteína que tenha ação inibidora. 17 Homólogos da proteína UL49.5 são codificados por muitos herpesvírus (McGEOCH et al., 2006; DAVISON et al., 2009). Em muitos herpesvírus já foi demonstrado que a UL49.5 está envolvida na maturação e infectividade do agente, pois ela forma um heterodímero com a glicoproteína M (gM), que é necessário para a glicosilação e maturação do complexo (KLUPP et al., 2000; FUCHS & METTENLEITER, 2005; LIPINSKA et al., 2006). Logo, para alguns herpes, a UL49.5 possui um duplo papel, funcionando como uma chaperonina e como uma proteína de evasão da resposta imune (VERWEIJ et al., 2011b). Dentre alguns varicelovírus de humanos, essa atividade inibidora do TAP não é tão eficiente. A proteína UL49.5 do herpesvírus humano tipo 3 ou Varicela Zoster (VZV), não apresenta nenhuma atividade inibidora. Já a UL49.5 do herpesvírus canino tipo 1 (CaHV-1), apresenta pouca inibição do TAP. Apesar desses vírus também pertencerem ao gênero Varicellovirus, eles diferem dos outros herpesvírus supracitados quanto a atividade da UL49.5, indicando que a capacidade de inibição do TAP por essa proteína é encontrada apenas em alguns membros do gênero (VERWEIJ et al., 2011b). O primeiro inibidor do TAP a ser relatado foi a proteína ICP47 do herpes simplex tipo 1, verificando-se mais tarde que a ICP47 do herpes simplex tipo 2 também apresentava a mesma função (AHN et al., 1996; TOMAZIM et al., 1998) A ICP47 obstrui o sítio de ligação do peptídeo no TAP, impedindo o transporte do mesmo para o interior do retículo (AHN et al., 1996; TOMAZIM, et al., 1996; AISENBREY et al., 2006). O citomegalovírus humano (HCMV) também possui atividade inibidora do TAP, pois codificada a proteína US6 que previne a ligação do ATP ao TAP, retirando o suprimento de energia necessário para o transporte do antígeno. Outra proteína envolvida na inibição do TAP é a BNFL2a, codificada pelo vírus Epstein Barr (EBV). Essa proteína é capaz de impedir tanto a ligação do ATP quanto do antígeno ao complexo TAP (HISLOP et al., 2007; HORST et al., 2009). Em 2011(a), VERWEIJ e colaboradores desenvolveram um estudo com vistas ao entendimento da inibição do TAP por proteínas codificadas pelos herpesvírus não murinos expressas em diferentes linhagens de células de camundongos. A atividade das proteínas UL49.5, BNFL2a, US3 (inibidora de 18 tapasina), US6 e ICP47 foi avaliada por meio de citometria de fluxo. Primeiramente os autores notaram que os diversos alótipos de MHC de camundongos foram afetados de forma diferente pelas proteínas inibidoras. Todas as linhagens celulares de camundongos apresentaram níveis diminuídos de expressão de MHC I, com exceção das que expressavam as proteínas BNFL2a e ICP47. Em contraste, a linhagem de células de melanoma humano, MJS, sofreu regulação negativa pelas proteínas inibidoras BNFL2a e ICP47, diferente das células de camundongo (Figura 9A e B). Em todas as linhagens celulares testadas, o efeito da expressão do MHC I na superfície das células foi marcadamente mais reduzido na presença da UL49.5 do que na presença da US6, indicando que a UL49.5 é um potente inibidor viral da TAP nessas células de camundongos (Figura 9A e B). 19 FIGURA 9: Regulação do MHC I de camundongos pelas proteínas UL49.5, US3, US6, BNFL2a e ICP47. (A) Expressão das moléculas de MHC I na superfície de células L, 3T3, MC38 e MJS (gráfico 2) e células expressando UL49.5, BNLF2a, ICP47, US6 ou US3 (gráfico 3). As células foram coradas usando os anticorpos específicos para cada alelo indicado. Gráfico1: coloração padrão na presença somente do anticorpo secundário. (B) Níveis de MHC I nas células que expressaram as proteínas inibidoras; a expressão é relativa aos níveis de MHC I das células controle (100%). Fonte: VERWEIJ et al., 2011a. 20 A expressão das proteínas UL49.5, BNFL2a e US6 foi avaliada por meio de Western Blot (Figura 10A- superior). Para as proteínas ICP47 e US3, os níveis de RNA mensageiro foram determinados utilizando-se RT-PCR (Figura 10A- inferior). Apesar de terem sido observadas algumas diferenças, esses resultados confirmam a expressão das proteínas UL49.5, BNFL2a, US6, ICP47 e US3 nas linhagens celulares de camundongos. Neste estudo também foram avaliados os níveis de expressão das subunidades protéicas TAP1 e TAP2 e a influência da tapasina na regulação negativa do MHC I. Os níveis de TAP1, TAP2 e tapasina foram consistentemente baixos nas células 3T3 quando comparados com as células L e MC38 (Figura 10B). A diminuição do nível de tapasina nas células 3T3 pode ter contribuído para a forte inibição do MHC I mediada pela US3. Nos resultados obtidos pode-se confirmar a atividade de degradação do TAP mediada pela UL49.5 previamente relatada por outros autores (KOPPERS-LALIC et al., 2005; VAN HALL et al., 2007) Comparando-se os níveis de TAP1 no estado estacionário do controle e a expressão da UL49.5 pelas células, confirma-se as observações anteriores de que a proteína UL49.5 do BoHV-1 é capaz de induzir a degradação do TAP de camundongos (Figura 10C). A redução observada nos níveis de TAP1 foi específica, já que o nível de tapasina no estado estacionário não diminuiu na presença de UL49.5 (Figura 10C). 21 FIGURA 10: Expressão dos níveis de inibidores virais em células de camundongos. (A) Expressão da UL49.5, BNLF2a e US6 em células L, 3T3 e MC38 foi avaliada por SDSPAGE e Western blot (WB) usando os anticorpos indicados. β-actina foi utilizada como controle. Após a extração do RNA total das células L, 3T3 e MC38, a expressão de ICP47 e US3 foi verificada por meio de RT-PCR usando primers específicos. Legenda: −= controle, + = células expresssando inibidores. (B) Os níveis de TAP1, TAP2 e tapasina no estado estacionário expressos nas linhagens celulares de camundongos foram determinados por SDS-PAGE e Western blot (WB). (C) A indução da degradação do complex TAP pela UL49.5 foi estudada pela determinação dos níveis de TAP 1 e tapasina no controle (−) e nas células que expressavam a UL49.5 (+) por SDS-PAGE e WB. Fonte: VERWEIJ et al., 2011a. Ainda em 2011, outro estudo foi desenvolvido buscando elucidar o grau de conservação da atividade inibidora do TAP da proteína UL49.5, entre quatro membros do gênero Varicellovirus que infectam ruminantes, a saber: BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1, CvHV-1 (VERWEIJ et al, 2011b). A sequência de aminoácidos das proteínas UL49.5 codificadas pelo BoHV-5, BuHV-1 e CvHV-1 apresentam 79, 80 e 74% de identidade com a UL49.5 do BoHV-1, respectivamente (VERWEIJ et al., 2011b). Estes autores tiveram como objetivo a determinação do grau de conservação existente entre as proteínas codificadas pelos herpesvírus de 22 ruminantes em sua capacidade de inibição do TAP. As UL49.5 codificadas por esses vírus foram expressadas em células de rim de bovino (MDBK) e de melanoma humano (MJS). A expressão das UL49.5 homólogas foi verificada com o auxílio de anticorpos específicos contra a UL49.5 do BoHV-1. Estes anticorpos foram capazes de detectar a proteína do BoHV-1, BoHV-5 e CvHV-1 em células MDBK e MJS (Figura 11). Já a UL49.5 do BuHV-1 não foi detectada segundo os autores, devido a possíveis diferenças existentes na região Cterminal da proteína, que é o alvo do anticorpo que foi utilizado. FIGURA 11: Expressão das proteínas UL49.5 dos herpesvírus de ruminantes. Lisados derivados do controle e das células MDBK e MJS que expressaram a UL49.5 foram corados com GFP; anticorpos específicos foram utilizados contra a UL49.5 e a análise foi feito por SDS-PAGE e imunoblot (IB).A β-actina foi usada como controle. Fonte: VERWEIJ et al. 2011b. Análises da expressão das moléculas de MHC I na superfície celular revelaram que as UL49.5 do BoHV-5, BuHV-1 e CvHV-1 causaram uma forte regulação nas células MDBK e MJS (Figura 12, primeiro e segundo painéis). A redução nessa expressão pode ser comparada a causada pela UL49.5 do BoHV-1. Essa redução foi específica para moléculas MHC I, já que a expressão das moléculas MHC II não foi afetada pelas UL49.5 homólogas (Figura 12, terceiro painel). 23 FIGURA 12: Citometria de fluxo evidenciando a expressão de moléculas de MHC-I na superfície de células MDBK e MJS, e de MHC-II em células MJS. Gráfico 2- células não transfectadas. Gráfico 3- células expressando proteínas UL49.5 homólogas do BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 e CvHV-1 utilizando os anticorpos indicados. Gráfico 1- coloração padrão na presença somente de anticorpo secundário. Fonte: VERWEIJ et al., 2011b. A função do TAP foi avaliada nas células MDBK e MJS expressando as UL49.5 homólogas dos herpes de ruminantes. O transporte dos peptídeos foi reduzido de 70 a 90% tanto nas células de humanos quanto de bovinos, indicando que isso ocorreu devido a inibição do TAP (Figura 13). KOPPERS-LALIC et al., (2005) e KOPPERS-LALIC et al., (2008) observaram que a UL49.5 do BoHV-1 induzia a degradação do TAP de humanos e bovinos. VERWEIJ et al., (2011b) buscando analisar se as proteínas homólogas codificadas pelo BoHV-5, BuHV-1 e CvHV-1 apresentavam a mesma capacidade, avaliaram os níveis de TAP1 e TAP2 expressos nas células MJS (Figura 14). Os níveis do TAP foram reduzidos consideravelmente na presença dos homólogos da UL49.5 testados, sugerindo 24 que essas proteínas também induzem a degradação do complexo TAP, sendo uma característica conservada entre os herpesvírus que infectam ruminantes. FIGURA 13: A atividade de transporte do TAP foi analisada nas células MDBK e MJS expressando as proteínas UL49.5 homólogas. O transporte de peptídeos foi avaliado na presença de ATP (preto) ou EDTA (branco). Fonte: VERWEIJ et al., 2011b. FIGURA 14: Níveis de TAP1 e TAP2 expressos nas células MJS. Os níveis TAP1 e TAP2 em células MJS no estado estacionário foram determinados utilizando anticorpos específicos. A β-actina foi usada como um controle. Fonte: VERWEIJ et al., 2011b. 2.6.2- Evasão da macroautofagia O papel da macroautofagia durante a resposta imune é ainda mais enfatizado pela sua importante ação reguladora nas infecções virais. Três 25 sistemas in vivo ligaram a macroautofagia ao controle imune de infecções víricas. Estes estudos incluíram o herpesvírus simplex (HSV), o vírus Sindbis (um arbovírus que tem como hospedeiros vertebrados os pássaros e o homem) e o vírus da estomatite vesicular (VSV) (GANNAGE & MÜNZ, 2010). LIANG et al., (1998) e OVERDAHL et al., (2007) verificaram que a neurovirulência do HSV e do Sindbis foi atenuada devido ao elevado nível de macroautofagia durante a infecção por esses vírus. SHELY et al., (2009), verificaram que a infecção pelo VSV em Drosophila induziu a macroautofagia e restringiu a infecção viral nesse modelo experimental. Estes estudos não implicam o processamento do antígeno para apresentação pelo MHC, via macroautofagia, na proteção contra a infecção viral. No entanto, durante a infecção pelo HSV esse mecanismo nas células dendríticas foi necessária para ativar de forma eficiente a resposta protetora das células TCD4+ (LEE et al., 2010). Segundo GANNAGE & MÜNZ (2010) estes resultados indicam que este tipo de autofagia pode restringir a infecção viral in vivo. Outra indicação que a macroautofagia pode limitar a replicação viral de forma significativa é a capacidade que os vírus desenvolveram de escapar dessa via. Nesse sentido, dois pontos desse mecanismo podem ser inibidos pelos vírus: a formação do autofagossomo e a fusão deste com o lisossomo. Vírus que tem genoma DNA parecem comprometer, primeiramente, a formação do autofagossomo, enquanto os vírus RNA bloqueiam a degradação das moléculas internalizadas pelos lisossomos (GANNAGE & MÜNZ, 2010). Com respeito a inibição da formação do autofagossomo, os alfaherpesvírus apresentam várias proteínas inibidoras da macroautofagia. O HSV codifica a ICP34.5, uma proteína que é capaz de bloquear a formação do autofagossomo (TALLOCZY et al., 2002; ALEXANDER et al., 2007) ao se ligar ao domínio de interação do Atg6/Beclin-1 (gene relacionado a formação do autofagossomo). ORVEDAHL et al., (2007) observaram que um HSV que apresentava a ICP34.5 mutante e tinha o domínio de interação do Atg6/Beclin1, demonstrou aumento da neurovirulência após injeção intracerebral em camundongos. Os betaherpesvírus também apresentam atividade inibidora da macroautofagia (CHAUMORCEL et al., 2008). Sabe-se que o HCMV pode 26 escapar dessa via, contudo os mecanismos moleculares dessa regulação ainda não estão claros. O grupo dos gamaherpesvírus apresentam muitos membros que comprometem a formação do autofagossomo, como o herpesvírus humano tipo 8 (HHV-8: agente etiológico do sarcoma de Kaposi) e o herpesvírus murino 68 (MHV-68). O HHV-8 e o MHV-8 codificam proteínas homólogas (Bcl-2 e M11, respectivamente) capazes de interagir com o Atg6/Beclin-1, impedindo a formação do autofagossomo (PATTINGRE et al., 2005; KU et al., 2008). Além disso, o HHV-8 também age por meio da proteína inibidora v-FLIP, que prejudica a formação do autofagossomo dependente de Atg8/LC3 (moléculas responsáveis pela fusão e alongamento das membranas do autofagossomo, sendo um marcador do autofagossomo) (LEE et al., 2009). Para GANNAGE & MÜNZ (2010) esses dados sugerem que os herpesvírus impedem a formação do autofagossomo a fim de inibir a restrição da infecção e a apresentação dos antígenos virais. 27 3-CONSIDERAÇÕES FINAIS Os mecanismos de processamento e apresentação de antígenos são bastante complexos e o entendimento dos mesmos é de grande valia no estudo de inúmeras enfermidades do homem e de animais, sejam elas de causa infecciosa ou não. Muitos vírus, em especial os herpesvírus, são capazes de escapar da resposta imune dos seus hospedeiros fazendo uso de estratégias efetivas e muito específicas. Geralmente, por essa ação viral ser potente e apresentar elevado nível de especificidade, as proteínas codificadas por esses patógenos são ferramentas valiosas no estudo da biologia celular da apresentação antigênica, incluindo as vias alternativas de processamento. Para o desenvolvimento destes estudos, pesquisas utilizando camundongos são muito importantes, haja vista que o modelo murino já está estabelecido na experimentação científica, sendo simples de se trabalhar quando comparado com a maioria dos modelos in vivo. Nesse sentido, também é indispensável que sejam verificadas as prováveis diferenças existentes nas análises feitas in vivo e in vitro, quando possível. Em certos agentes, como foi demonstrado para os herpesvírus, a barreira entre as espécies foi ultrapassada nas respostas referentes aos mecanismos de evasão. Esse é outro ponto crucial no entendimento da biologia desses agentes, pois os resultados encontrados nos animais muitas vezes podem ser extrapolados para a espécie humana. Assim, fica evidente a aplicabilidade das proteínas envolvidas na evasão da resposta imune codificadas pelos herpesvírus. Elas podem atuar como poderosos imuno-moduladores, com aplicações potenciais no tratamento como no diagnóstico das mais variadas infecções virais até doenças complexas como o câncer e as doenças autoimunes. 28 REFERÊNCIAS 1. ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. Ed.Elsevier Brasil, 2008. 576 p. 2. ALEXANDER, D. E.; WARD, S. L.; MIZUSHIMA, N.; LEVINE, B.; LEIB, D. A. Analysis of the role of autophagy in replication of herpes simplex virus in cell culture. Journal of Virology, v. 81, n. 22, p.12128–12134, 2007. 3. AHN, K.; MEYER, T. H.; UEBEL, S.; SEMPE, P.; DJABALLAH, H.; YANG, Y.; PETERSON, P. A.; FRUH, K.; TAMPE, R. 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