Expressão gênica do transportador de serotonina e concentração

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
MESTRADO EM BASES EXPERIMENTAIS DA NUTRIÇÃO
EXPRESSÃO GÊNICA DO TRANSPORTADOR DE SEROTONINA E
CONCENTRAÇÃO DE SEROTONINA NO HIPOTÁLAMO DE RATOS
JOVENS MANIPULADOS COM FLUOXETINA DURANTE A
LACTAÇÃO.
ISABELI LINS PINHEIRO
RECIFE - 2013
ISABELI LINS PINHEIRO
EXPRESSÃO GÊNICA DO TRANSPORTADOR DE SEROTONINA E
CONCENTRAÇÃO DE SEROTONINA NO HIPOTÁLAMO DE RATOS
JOVENS MANIPULADOS COM FLUOXETINA DURANTE A
LACTAÇÃO.
Dissertação apresentada Programa de Pósgraduação em Nutrição do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal
de Pernambuco, para obtenção do título de
Mestre em Nutrição.
Orientadora: Prof. Drª. Sandra Lopes de
Souza
RECIFE – 2013
ISABELI LINS PINHEIRO
EXPRESSÃO GÊNICA DO TRANSPORTADOR DE SEROTONINA E
CONCENTRAÇÃO DE SEROTONINA NO HIPOTÁLAMO DE RATOS
JOVENS MANIPULADOS COM FLUOXETINA DURANTE A
LACTAÇÃO.
____________________________________
Phd. Raul Manhães de Castro - UFPE
____________________________________
Dr. Lisiane dos Santos Oliveira - UFPE
____________________________________
Elizabeth do Nascimento - UFPE
RECIFE - 2013
Com muito carinho, às minhas avós Noemia Lins e
Terezinha de Jesus (in memoriam). Sei o quanto vocês
olham por mim neste novo plano.
AGRADECIMENTOS
À Deus,
por permitir mais uma graça em minha vida e aumentar minha fé e amor por ti.
Aos meu pais, Sérgio Pinheiro e Fabiana Lins,
sem vocês eu nada seria. Esta conquista dedico à vocês em forma de agradecimento por todo
carinho e apoio. Vocês que me permitiram ter uma boa vida, cheia de amor, um exemplo de
família. Vocês que vibraram com NOSSAS vitórias, o vestibular, o mestrado e o doutorado.
Mesmo sem palavras, seus olhares sempre me confortaram nos momentos de dificuldade que
vivi nestes dois anos. Meu pai que sempre me mostrou que a vida pode ser difícil, mas a
conquista no final da batalha é sempre gloriosa. E minha mãe que me ensinou que é preciso
ter fé, fé em si mesmo. Minha eterna gratidão à vocês que me ensinaram que para ser feliz é
preciso fé, amor, respeito ao próximo e muita força para enfrentar os obstáculos que
porventura surgirem em nossas vidas. Quero preencher o coração de vocês de alegria e
orgulho, assim como o meu está. Orgulho e alegria por ter um painho e uma mainha tão
maravilhosos. Esta conquista é NOSSA ! Que venham mais ! Meus amores eternos!
A minha grande amiga Simone,
Você que esteve presente em todas as etapas desta conquista. As tardes de sábado ouvindo
música, as conversas na rede, os desabafos na faculdade, as experiências gastronômicas e
todos os momentos maravilhosos que vivemos nestes dois anos. Toda nossa sintonia e
compreensão tornou nossa amizade tão especial. Agradeço todas as palavras e abraços!
Você foi imprescindível nesta conquista !
A Sandra Lopes,
Minha orientadora que por vezes me aperriou com tanta calma e confiança. Na verdade
acredito que quem aperriou aqui, fui eu. Suas broncas mais pareciam afagos, atenção e
cuidado. No instante em que eu achava que estava tudo perdido, a senhora dizia ‘vai dar
tempo’. A senhora que me acolheu e me permitiu dar meus primeiros passos como
pesquisadora, ao meu lado me guiando e me auxiliando. Sou muito grata pela confiança nos
momentos que nem eu mesma conseguia mais acreditar, pela calma que me passava e me
tranquilizava. Esta conquista é nossa abelha rainha.
A Lívia, Paula e Larissa,
Vocês que foram além do cotidiano. Nossos momentos de alegrias são inesquecíveis, eternas
lembranças. Muito obrigado pelas palavras de motivação, confiaça, pela paciência e
principalmente pela amizade de vocês.
A Diego Koury,
O que seria de mim sem você, meu pedaço.Você que entrou na reta final desta etapa da
minha vida, mas que se fez presente em cada segundo. Quantas madrugadas a me ouvir e me
tranquilizar. Você sempre me motivou. Minha inspiração de força e dedicação. Agradeço a
você que me faz sonhar a cada dia e me faz acreditar que o amor pode ser bom, calmo e
paciente. Muito obrigada meu melhor amigo, meu amor.
Aos meus companheiros de pesquisa,
A Lígia que caminhou comigo, agradeço demais sua atenção e paciência (demais) em me
ajudar em meus experimentos. Aos tempos que vivemos juntos. Vocês que me abraçaram e
sempre me ensinaram com tanta paciência e dedicação, Amanda, Taisy, Matilde, Tássia,
Julliet, Diogo muito obrigada !
Aos meus amigos do mestrado,
A Zé meu grande companheiro, mais que um amigo, um irmão que me acompanhou nas
dificuldade e alegrias das disciplinas e projetos. A felicidade dos momentos descontraídos
que vivemos juntos Andréia, Priscila, Diego, Kelly, Júlia, Débora e Edinara.
Ao laboratório de nutrição experimental,
Em especial a professora Elizabeth do Nascimento, você que acreditou em mim e me mostrou
um mundo paralelo, o mundo científico. Com paciência e dedicação me ensinou o interesse
pelo conhecimento. A Gisa, Cybele e Diogo vivemos momentos maravilhosos. Muito
obrigada !
Aos professores do CAV,
Rhowena Matos, Mariana Fernandes e Cândido Ferraz agradeço toda disponibilidade e
atenção na execução dos meus experimentos. E ao querido estagiário Reginaldo. Obrigada.
A Pós-Nutri,
Neci, Cecília e Professor Raul muito obrigada por todo incentivo e auxílio nestes dois anos.
Muito obrigada.
Ao CNPQ e FACEPE,
Por financiarem meus experimentos e me concederam minha bolsa de estudos. Obrigada.
RESUMO
A serotonina atua na regulação de eventos biológicos envolvidos no desenvolvimento precoce
do sistema nervoso. Neste período crítico o aumento dos níveis encefálicos deste
neurotransmissor pode alterar componentes do sistema serotoninérgico, como o transportador
de serotonina. Os inibidores seletivos da recaptação de serotonina bloqueiam o transportador e
aumentam a quantidade de serotonina extracelular. O aumento farmacologicamente induzido
neste período é capaz de gerar alterações funcionais e estruturais permanentes ao sistema
nervoso. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão gênica do SERT e o conteúdo de
5-HT no hipotálamo de ratos manipulados com fluoxetina durante a lactação. Ratos Wistar
foram divididos em dois grupos, de acordo com a manipulação farmacológica realizada do 1º
ao 21º dia de vida, Salina (n=9) e Fluoxetina (n=10), compostos por filhotes que receberam,
respectivamente, solução de salina (NaCl 0.9%, 10µl/g, s.c.) e fluoxetina (10mg/kg, 10µl/g,
s.c.). Foram analisados: a expressão gênica do SERT realizada no hipotálamo aos 21 e 40 dias
e o peso corporal foi mensurado nos dias 1, 7, 14, 21 e 40. O presente trabalho demonstrou
que a manipulação neonatal com fluoxetina promoveu menor ganho de peso corporal a partir
do 14º dia até o final do experimento e aumento na expressão gênica do SERT aos 40 dias.
Estes resultados indicam que a manipulação neonatal crônica do sistema serotoninérgico
desencadeia alterações no principal componente de controle da neurotransmissão
serotoninérgica, o SERT e consequentemente no neurotransmissor serotonina.
Palavras Chaves: Proteínas da Membrana Plasmática de Transporte de Serotonina,
Serotonina, Inibidores de Captação de Serotonina, Lactação.
ABSTRACT
Serotonin acts in the regulation of biological events involved in the early development of the
nervous system. At this critical period the increased levels of this neurotransmitter stroke can
alter serotonergic system components, such as the serotonin transporter. Inhibitors selective
serotonin reuptake inhibitors block the transporter and increase the amount of extracellular
serotonin. The pharmacologically induced increase in this period can generate permanent
structural and functional changes in the nervous system. This study aimed to evaluate the gene
expression of SERT and 5-HT content in the hypothalamus of rats with fluoxetine
manipulated during lactation. Wistar rats were divided into two groups, according to
pharmacological manipulation held from 1st to 21th day of life, Salina (n = 9) and fluoxetine
(n = 10), composed of pups that received, respectively, solution of saline (NaCl 0.9%, 10μl /
g, sc) and fluoxetine (10mg/kg, 10μl / g, sc). We examined the gene expression in the
hypothalamus of SERT performed at 21 and 40 days and body weight was measured on days
1, 7, 14, 21 and 40. This study demonstrated that neonatal handling with fluoxetine treatment
reduced body weight gain from day 14 until the end of the experiment and increased gene
expression of SERT to 40 days. These results indicate that the manipulation of serotonergic
system neonatal chronic trigger changes in the primary control component of serotonergic
neurotransmission, the SERT and consequently the neurotransmitter serotonin.
Key Words: Plasma Membrane Protein Transport Serotonin, Serotonin, Serotonin Uptake
inhibitors, Lactation.
LISTA DE TABELAS
Tabelas do Artigo de Revisão Sistemática
Tabela 1: Comparativo entre os estudos selecionados na revisão sistemática. Pág.10
Tabela 2: Número de referências encontradas por base de dados após cruzamento entre os
descritores e temas livres. Pág.13
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras do Artigo de Revisão
Figura 1: Flow of information trhough the different phases of a systematic review
(N=number). Pág.15
Figuras da Dissertação
Figura 1: Peso Corporal dos animais. Pág. 28
Figura 2: Concentração hipotalâmica de serotonina. Pág. 29
Figura 3: Expressão gênica do SERT nos dias 21 e 40. Pág. 30
LISTA DE SIGLAS
5-HT: Serotonina
SERT: Transportador de serotonina
ISRS: Inibidor seletivo de recaptação de serotonina
TPH 1: Triptofano Hidroxilase 1
TPH 2: Triptofano Hidroxilase 2
TPH2KO: Triptofano Hidroxilase 2 knockout
SERTKO: Transportador de serotonina Knockout
SUMÁRIO
1. APRESENTAÇÃO
13
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Artigo de Revisão Sistemática
16
3. HIPÓTESES
34
4. OBJETIVOS
35
5. MÉTODOS
5.1. Animais
36
5.2. Manipulação Farmacológica
36
5.3. Grupos Experimentais
37
5.4. Peso Corporal
37
5.5. Dosagem de Serotonina
37
5.6. Expressão gênica do transportador de serotonina (SERT)
38
6. ANÁLISE ESTATISTICA
40
7. RESULTADOS
41
8. DISCUSSÃO
44
9. CONCLUSÃO
51
10. REFERENCIAS
52
APRESENTAÇAO
O período de crescimento e desenvolvimento do sistema nervoso (SN) é composto por
eventos biológicos, como proliferação e diferenciação celular, migração de neurônios,
proliferação e ramificação de dendritos e axônios, mielinização e sinaptogênese, que atuam na
organização e especialização de diversas estruturas cerebrais (Morgane et al, 2002). Esta fase
do desenvolvimento bastante susceptível as influências provindas do meio ambiente é
conhecida como período crítico (Dobbing, 1970). Durante esta janela temporal os eventos de
desenvolvimento do SN ocorrem numa grande velocidade e são extremamente sensíveis à
estímulos provindos do ambiente. Em humanos, o período crítico compreende a fase prénatal, em particular do último trimestre da gestação e tem seguimento até os cinco primeiros
anos de vida (Morgane et al., 1978, 2002) e em roedores, esta fase perdura até as três
primeiras semanas de vida pós-natal (Morgane et al., 1978).
Evidências demonstram que durante o período crítico alguns fatores nutricionais
(Morgane et al.,1978; Hisatomi e Niyama, 1980; Borue et al., 2007) e farmacológicos
(Manhães de Castro et al., 1993; 2001) podem afetar os eventos biológicos importantes para o
desenvolvimento do SN desencadeando modificações funcionais e estruturais permanentes.
Entre os fatores nutricionais, a desnutrição pode acarretar alterações em vários sistemas de
neurotransmissão, em especial o serotoninérgico (Hisatomi e Niyama, 1980). Dentre as
modificações mais significativas está o aumento dos níveis encefálicos de serotonina (5-HT)
(Manjarrez et al., 1994; Hisatomi e Niyama, 1980). Segundo Manjarrez-Gutiérrez e cols
(1988) a concentração de serotonina cerebral em animais submetidos à desnutrição no início
da vida encontra-se aumentada no período pós-natal e na idade adulta. Estas alterações estão
relacionadas ao aumento da concentração encefálica do aminoácido precursor da síntese de
serotonina, L-triptofano, e na atividade da triptofano hidroxilase, enzima limitante para a
síntese de 5-HT (Hernandez, 1973; Manjarrez et al., 1994). O aumento na disponibilidade
sináptica de serotonina preconizada pela desnutrição durante a gestação e lactação é
semelhante ao que ocorre com o tratamento neonatal com ISRS (Tao et al.,2002)
O período crítico vem sendo estudado ao longo dos anos em modelos experimentais
que utilizam a manipulação farmacológica neonatal do sistema serotoninérgico e seus efeitos
em fases tardias da vida (Deiró et al. 2004, ;Manhães de Castro, 2001; Mendes da Silva et al.,
2010). Estes estudos reservam atenção especial à exposição neonatal de inibidores seletivos
de recaptação (ISRS) e suas conseqüências. A administração crônica de citalopram, um
antidepressivo ISRS, promoveu prejuízo no crescimento somático e maturação de reflexos e
de características físicas (Deiró et al., 2004) levando a diminuição do comportamento
agressivo de ratos adultos (Manhães de Castro et al., 2001). O sistema serotoninérgico
também sofre com o tratamento farmacológico, como observado por Cabrera-Vera e Battaglia
(1998) com o uso de fluoxetina na qual alterou a sensibilidade de receptores serotoninérgicos
(Hjorth et al., 2000), reduziu o número de neurônios serotoninérgicos (Mendes da Siva et al.,
2010).
Durante o desenvolvimento, a serotonina é um importante indutor de neurogênese,
diferenciação neuronal, sinaptogênese e também atua na auto-regulação de neurônios
serotoninérgicos e no desenvolvimento de tecidos-alvos (Lauder, 1993; Whitaker-Azmitia et
al., 1996). Sua expressão é observada no ínicio do desenvolvimento, por volta do 12º dia de
gestação e a maturação completa do sistema serotoninérgico ocorre ao final do período crítico
em ratos (Lautenschlager, Holtje et al., 2000). Devido seu surgimento precoce e ação
moduladora da 5-HT sobre eventos biológicos, tem-se sugerido importante papel para esse
sistema no desenvolvimento normal do SN.
O principal responsável pela regulação dos níveis de serotonina na fenda sináptica é
transportador de serotonina. Através do bloqueio deste transportador, os ISRS estimulam o
aumento os níveis de 5-HT, prolongando o tempo e a quantidade de serotonina disponível na
fenda sináptica. No estudo de Hansson e cols (1998), a expressão gênica do transportador de
serotonina é detectada precocemente no corpo celular de neurônios serotoninérgicos dos
núcleos da rafe no 12º dia da embriogênese tendo continuidade até a idade adulta em
neurônios serotoninérgicos.
Durante o desenvolvimento, o SERT pode influenciar a diferenciação, a
sinaptogênese, a arborização e a citoarquitetura neuronal. Estas observações sugerem que o
sistema serotoninérgico é um dos primeiros a surgir durante o período precoce do
desenvolvimento do sistema nervoso. A presença do gene SERT nos núcleos da rafe no início
do desenvolvimento pode atuar na regulação da ativação e desensibilização de receptores
serotoninérgicos como 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2A, 5-HT2C e 5-HT3 (Hansson et al., 1998).
O gene SERT pode representar um marcador precoce de neurônios serotoninérgicos ou um
progenitor na qual irá diferenciar neurônios serotoninérgicos.
Alguns fatores podem influenciar a expressão do SERT e/ou sua função, no entanto,
pouco se sabe a maneira com que estes fatores ambientais podem ser prejudiciais durante o
período de desenvolvimento pré e pós-natal. Em estudo realizado por Mathews (2004),
camundongos SERTKO apresentaram maiores níveis de serotonina extracelular em regiões
densamente inervadas por neurônios serotoninérgicos como o córtex cerebral em comparação
a animais com a presença do transportador da serotonina. Estes animais apresentaram falha
nas fibras tálamo-corticais (Kim et al., 2005), devido ao excesso de serotonina promovido
pelo aumento de sua síntese e diminuição de sua recaptação (Bengel et al., 1998; Kim et al.,
2005). Em ratos, a expressão de SERT no cérebro está intimamente relacionada com a
distribuição da triptofano hidroxilase no corpo celular dos neurônios serotoninérgicos
(Hoffman et al.,1998). Com esse papel ativo do sistema serotoninérgico sobre o
desenvolvimento do SN, sugere-se a existência de mecanismos de controle sobre essa ação.
Diante do exposto, é visto que tanto a manipulação nutricional quanto a farmacológica
são capazes de provocar alterações em alguns componentes do sistema serotoninérgico, em
especial a serotonina, durante o período crítico do desenvolvimento do sistema nervoso. No
entanto, os mecanismos relacionados a elas ainda encontram-se obscuros. Neste intuito,
utilizamos o inibidor seletivo da recaptação de serotonina, a fluoxetina, como uma ferramenta
para a manipulação do sistema serotoninérgico, a fim de identificar os ajustes na expressão
gênica do SERT e dos níveis de serotonina no final do tratamento crônico e após cessado este
no hipotálamo.
A dissertação encontra-se composta por um artigo de revisão sistemática intitulado: A
inibição do transportador de serotonina durante o período de lactação e suas influências
sobre o desenvolvimento morfofuncional do sistema nervoso: uma revisão sistemática, e os
resultados da dosagem de serotonina e da expressão gênica do transportador no hipotálamo.
REVISAO DA LITERATURA
Título: A inibição do transportador de serotonina durante o período de lactação e suas
influências sobre o desenvolvimento morfofuncional do sistema nervoso: uma revisão
sistemática.
Autores: ²Isabeli Lins Pinheiro; ²Lívia de Almeida Lira; ¹Raul Manhães de Castro, ²Sandra
Lopes de Souza.
Afiliação: ¹Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil;
³Departamento de Anatomia, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil.
Endereço para correspondência: Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de
Anatomia, Centro de Ciências Biológicas – CCB/UFPE Av. Prof Moraes Rêgo, 1235 Recife PE, 50670-420. Email: [email protected]
RESUMO
Durante o período neonatal, uma fase crítica do desenvolvimento do sistema nervoso,
a serotonina (5-HT) atua como importante regulador do desenvolvimento deste sistema e sua
disponibilidade é capaz de gerar alterações funcionais e estruturais permanentes. Os níveis
encefálicos deste neurotransmissor podem ser regulados pelo transportador de serotonina
(SERT) que recapta a serotonina extracelular de volta ao meio intracelular dos neurônios
serotoninérgicos. O uso de inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) bloqueia o
SERT e promove o aumento dos níveis extracelulares da 5-HT. Sendo assim, o objetivo desta
revisão sistemática foi analisar os efeitos promovidos pelo bloqueio do SERT através de ISRS
durante a lactação ao desenvolvimento do sistema nervoso. A revisão consistiu de buscas nas
bases de dados Pubmed, Scopus e Isi of Web utilizando as palavras chaves Serotonin
transporter, Serotonin uptake inhibitors, Brain development, serotonin e neonatal, durante o
período de janeiro de 2002 a junho de 2012. RESULTADO: Foram encontrados 1747
artigos, dos quais 15 foram selecionados para compor esta revisão. CONCLUSÃO: O
aumento dos níveis de 5HT no início da vida desencadeia alterações morfofuncionais do
sistema nervoso, demonstrando a importância desse transportador na regulação dos níveis de
serotonina durante o período de desenvolvimento.
Descritores: Serotonin, Serotonin Transporter, Serotonin Uptake Inhibitors, Brain
Development, Neonatal.
ABSTRACT
During the neonatal period, a critical stage of development of the nervous system,
serotonin (5-HT) plays an important neurotransmitter and regulator of biological events
involved in the development and availability of this system is capable of generating functional
and structural changes permanent. The brain levels of this neurotransmitter can be regulated
by the serotonin transporter (SERT) protein of a membrane capable of extracellular serotonin
recaptar back to the intracellular environment of serotonergic neurons. Through the use of
selective inhibitors of reuptake of serotonin (SSRI) class of antidepressants, it is possible to
block and prevent the entry SERT 5-HT neuronal cells back, causing an increase of
extracellular 5-HT. Therefore, the objective of this systematic review was to analyze the
effects caused by the blockade of SERT by SSRIs during lactation in the developing nervous
system. the review consisted of searches in Pubmed, Scopus and Web of Ishi using the words
Serotonin Transporter, Serotonin uptake inhibitors, Brain development, serotonin and
newborn during the period January 2002 to June 2012. RESULTS: We found 1747 articles, of
which 15 were selected to compose this review. CONCLUSIONS: Increased levels of 5HT in
early life trigger changes in morphology and behavior, demonstrating the importance of each
serotonin receptor, as well as the serotonin transporter during development.
Keywords: Serotonin, Serotonin Transporter, Serotonin Uptake Inhibitors, Brain
Development, Neonatal.
INTRODUÇÃO
O sistema serotoninérgico é formado pelo neurotransmissor serotonina (5-HT), seus
receptores específicos, neurônios serotoninérgicos e a proteína de transporte de serotonina
(SERT). Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, a serotonina atua na neurogênese,
diferenciação neuronal, mielinização e sinaptogênese (Lauder, 1993; Whitaker-Azmitia et al.,
1996). Em roedores, o aparecimento de neurônios serotoninérgicos ocorre entre o 10º a 12º
dia de vida do embrião (Lidov e Molliver, 1982), com síntese de serotonina detectada um dia
após este surgimento (Gaspar et al., 2003). Nesse período (11º dia) também é observada a
expressão gênica da proteína transportadora de serotonina (SERT) em neurônios
serotoninérgicos (Homberg et al., 2010). O SERT remove a serotonina da fenda sináptica,
possibilitando sua inativação e/ou degradação no interior do neurônio pré-sináptico, bem
como pode controlar a síntese da 5-HT modulando a atividade da enzima triptofano
hidroxilase (Gershon et al., 2003; Macgillivray et al., 2010). Em neurônios nãoserotoninérgicos, o SERT aparece entre o 14º e 15º dia de gestação no hipocampo e ao
nascimento no córtex pré-frontal em roedores (Homberg et al., 2010). O surgimento precoce
do SERT demonstra sua importância para o controle dos níveis de 5-HT durante o
desenvolvimento normal do sistema nervoso.
Localizado em neurônios e nas células da glia, o SERT é encontrado em elevada
densidade nos núcleos dorsal e mediano da rafe, substância negra, amígdala e núcleo dorsolateral do tálamo (De Souza e Kuyatt, 1987). Durante o desenvolvimento do sistema nervoso,
o SERT é importante em regiões encefálicas onde se localizam receptores serotoninérgicos
envolvidos nos processos do desenvolvimento. A exemplo, em axônios tálamo-corticais a
expressão do SERT é semelhante a do receptor 5-HT1B, e no córtex pré-frontal medial é coexpresso com os receptores 5-HT2A e 2C, mediando eventos como a maturação dendrítica e
morte celular (Homberg et al., 2010). O SERT é alvo de um conjunto de fármacos
denominados inibidores seletivos de receptação de serotonina (ISRS) que atuam
particularmente no seu bloqueio, prolongando a distribuição espaço-temporal da serotonina
extracelular (Blakely et al., 1991).
Tem sido observado que o bloqueio do SERT por ISRS durante períodos de
desenvolvimento do sistema nervoso, promove ajustes morfofuncionais em diferentes níveis,
desde alterações de crescimento, como a redução do crescimento corporal e retardo na
maturação de características físicas em roedores (Deiró et al, 2004), até modificações
celulares como redução do tamanho de fibras tálamo-corticais e de sua arborização nos
terminais nervosos (Xu et al., 2004; Lee et al., 2009). As repercussões dessa inibição do
SERT podem se manifestar na vida adulta em diferentes adaptações comportamentais frente
demanda ambiental, como redução do comportamento exploratório, maior reatividade a
estimulo sonoro, redução da atividade motora (Zheng et al., 2011; Rodriguez-Porcel et al.,
2011). A junção do importante papel da serotonina sobre eventos do crescimento e
desenvolvimento com a ampla gama de funções moduladas pela serotonina, pode indicar a
amplitude de ajustes adaptativos que serão desencadeados quando há qualquer intervenção
sobre a homeostase desse sistema. Essas repercussões serão tão mais abrangentes quando essa
perturbação ocorrer em período de estabelecimento morfofuncional do sistema nervoso.
Diante das evidências a cerca dos papéis determinantes da serotonina sobre o
desenvolvimento inicial de diversos organismos, não seriam os ajustes morfofuncionais
promovidos pelo bloqueio do SERT em períodos de desenvolvimento adequados a
sobrevivência nesse ambiente? Quão plástico é o sistema serotoninérgico para se adaptar ao
bloqueio do SERT durante período de intensa atividade no desenvolvimento do sistema
nervoso? Esses ajustes morfofuncionais podem ser modificados na vida adulta por
manipulação do sistema serotoninérgico? Assim, a presente revisão sistemática teve como
objetivo descrever os principais achados a cerca da utilização de ISRS em períodos inicias da
vida sobre aspectos morfofuncionais do sistema nervoso.
METODOLOGIA
A revisão sistemática foi realizada com o objetivo de caracterizar os efeitos
promovidos pelo bloqueio crônico do SERT, com uso de ISRS durante o período crítico ao
desenvolvimento do sistema nervoso, sobre estrutura e função do sistema nervoso. Esse
processo envolveu buscas eletrônicas nas bases de dados PubMed, Isi Web of Knowlegde e
Scopus utilizando como descritores os termos em inglês Serotonin uptake inhibitors,
Serotonin e como termos livres, Brain development, Serotonin transporter e Nostnatal. Essas
palavras–chaves foram relacionadas entre si, formando 4 cruzamentos: Serotonin transporter
AND Brain development, Serotonin transporter AND Neonatal, Serotonin uptake inhibitors
AND Brain development e Serotonin uptake inhibitors AND Neonatal. Além disto, foram
utilizadas ferramentas de refinamento em cada base de dados quando os mesmos estavam
presentes.
As buscas foram realizadas no período de abril a junho de 2012 e os artigos foram
selecionados segundo os seguintes critérios de inclusão previamente estabelecidos: (1) artigos
originais, (2) artigos no idioma inglês, (3) publicações no período de janeiro de 2002 a junho
de 2012, (4) metodologias envolvendo a experimentação em ratos e camundongos neonatos e
(5) procedimentos que correlacione, exclusivamente, a exposição de ISRS durante o período
de lactação.
Foram excluídos desta revisão sistemática, estudos sem clareza metodológica e cujo
objetivo principal fosse outro que não a relação entre ISRS e o período crítico do
desenvolvimento do sistema nervoso.
Após as combinações dos termos em cada base de dados, foi realizada uma primeira
avaliação dos artigos, de acordo com os títulos e resumos dos mesmos, sendo selecionados
aqueles que preenchiam os critérios de inclusão acima citados. Posteriormente, os artigos que
apresentaram dúvidas quanto o preenchimento de critérios, passaram por uma nova análise,
agora tomando como base a leitura completa dos artigos, a fim de se confirmar a elegibilidade
dos mesmos. Os estudos selecionados nesta segunda triagem foram sintetizados em tabelas e
comparados entre si, levando-se em consideração os objetivos/hipóteses do trabalho, espécies,
os fármacos, bem como suas respectivas doses e as idades de exposição ao mesmo, e os
resultados obtidos.
RESULTADOS
Utilizando os 4 cruzamentos acima citados, as buscas nas bases de dados resultaram
em 1747 artigos potencias, sendo deste total, 496 referências do PubMed, 756 do Scopus e
495 do ISI Web of Knowlodge. Após a leitura dos títulos e resumos dos artigos foram
excluídos 1686 estudos, restando apenas 61 que passaram para a segunda etapa de avaliação.
Nessa fase, a leitura completa dos estudos possibilitou a exclusão de 46 artigos por: fuga do
tema (4), não localizados (7), resultados encontrados em animais adultos (13), não utilizem
ISRS (19) e estudos sem clareza metodológica (3).
A síntese das 15 referências selecionadas, assim como a quantidade de estudos
encontrados nas bases de dados por cada cruzamento podem ser observados na tabela 1 e 2
respectivamente. Dos artigos incluídos nesta revisão sistemática, as espécies animais mais
utilizadas foram ratos (10), particularmente da linhagem Wistar (4), Long-Evans (4) e
camundongos (5).
Em relação às técnicas usadas, análises de comportamentos foram encontradas em 8
estudos, sendo associadas (7) ou não (1) com outras técnicas. Além disso, foram utilizados
ainda RT-PCR (1) e Western Blot (1), análise histológicas (5).
Dentre os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) mais utilizados
estavam a fluoxetina, presente em 10 artigos, e o citalopram em 5 artigos.
Quanto aos objetivos primários, 8 artigos analisaram a ação de ISRS durante o período
de lactação sobre aspectos morfológicos e funcionais de populações de neurônios, 8 sobre
aspectos comportamentais, 3 sobre os níveis de componentes do sistema serotoninérgico e 2
desenvolvimento somático/maturação física.
Tabela 1: Comparativo entre os estudos selecionados na revisão sistemática.
Referência
Parâmetro Avaliado
Espécie
Tratamento
Xu et al.,
2004
Bloqueio do SERT no
desenvolvimento de
aferências tálamocorticais
SpragueDawley
(n=12)
Paroxetina/
Salina
Deiro et al.,
2004
Citalopram sobre o
desenvolvimento
somático e crescimento
corporal
Ishiwata et
al., 2005
Níveis de 5HT, 5HIAA e
NA; Corticosterona;
Morfologia de células
piramidais na região
CA3 do hipocampo
Chang et al.,
2006
Maciag et al.,
2006
Fluoxetina sobre a
plasticidade neural após
lesão cerebral por HI em
neonatos
Citalopram na lactação
sobre a expressão da
TPH e SERT
Wistar
(n=106)
Citalopram/
Salina
C57bl/6J
(n=)
Fluoxetina/
Sacarose
(5%)
Dose
5mg/kg
5mg/kg
10mg/kg
20mg/kg
5mg/kg
SpragueDawley
(n=)
Fluoxetina/
Salina
5mg/kg e
15mg/kg
Long Evans
(n=)
Citalopram/
Clomiprami
na/ Salina
5mg/kg
15mg/g
Período
Tratamento
Período
Análise
PN0 – PN8
PN0 –
PN8
PN1 – PN21
PN1 –
PN21
Semana pósnatal:
1-3
6-8
Semana
pós-natal
3e9
Técnicas Usadas
Resultados
Imunohistoquímica
Análise histológica
Paroxetina ↓ fibras tálamo-corticais, ↓ peso
corporal, altera a dissociação das fibras tálamocorticais e ↓ áreas PMBSF do córtex
Crescimento somático
Maturação Física
↓ peso corporal dos animais CIT10
↓comprimento da cauda CIT20; ↓
crânio dos animais CIT10 E CIT20;
maturação física da abertura do
auditivo e erupção dos incisos.
HPLC
Radioimunoensaio
Histologia
P1 – P7
P7 – P50
Teste comportamental
Imunohistoquímica
Western Blot
RT - PCR
PN8 – PN21
P22 PN130
Teste Comportamental
Imunohistoquímica
e CIT20;
eixos do
Atraso na
pavilhão
Na 3ª semana Fluoxetina ↑ a concentração de
5HT no hipocampo; ↓ taxa de turnover de 5HT;
Não há influência nos níveis de 5HIAA; ↑
Densidade dos espinhos dendríticos
Animais 15FLU-HI maior distância para
encontrar a plataforma submersa; 5FLU-HI
distância menor que o NS-HI e o 15FLU-HI;
5FLUO-HI ↑ expressão de pCREB no
hipocampo e córtex 12h e 72h após a HI, ↑
BDNF no hipocampo após 72h, ↑ Synapsin Ia e
Ib no hipocampo, ↑ densidade celular no
hipocampo.
Aos 22 dias de vida citalopram ↓ TPH nos
núcleos dorsal e mediano da rafe e ↓ SERT no
córtex pré-frontal medial e somatossensorial
Referência
Parâmetro Avaliado
Espécie
Tratamento
Deiró et al.,
2008
Citalopram sobre o
tempo de aparecimento
dos reflexos e o peso
corporal
Wistar
(n=80)
Citalopram/
Salina
C57BJ/6J
(n=86)
Fluoxetina/
Salina
Karpova et
al., 2009
Lee, 2009
Thompson,
Thompson,
2009
Bianchi et al.,
2010
Fluoxetina sobre a
ansiedade e depressão e
expressão do BDNF e
TrkB
Fluoxetina sobre a
estrutura e função do
sistema somatosensorial
Wistar
(n=78)
Fluoxetina sobre os
níveis de 5HT e SERT
em neurônios LSO
Camundong
o Knockout
MAO-A
(n=25)
Fluoxetina sobre a
neurogênese e
comportamento em
neonatos com Síndrome
de Down
Ts65Dn
(n=116)
Fluoxetina/
Salina
Fluoxetina/
Salina
Fluoxetina
Dose
5mg/kg e
10mg/kg
10mg/kg
10mg/kg
30mg/kg
5 mg/kg
10 mg/kg
Período
Tratamento
P1 – P21
P4 – P21
PN0-PN6
P5, P6
PN3-PN7
P8-PN15
Período
Análise
Técnicas Usadas
Resultados
P1 - P21
Crescimento
somático
Maturação Física
↓ peso corporal nos animais CIT5 e CIT10; Atraso
na preensão palmar, endireitamento em queda livre,
colocação pelas vibrissas e geotaxia negativa.
P4 – P110
Teste
comportamental
PCR-RT
Fluoxetina ↑ a imobilidade no adulto; ↓expressão
de BDNF total, TrkB.T1, TrkB.FL no dia P9; ↓
expressão de BDNF total, BDNF IV, TrkB.FL no
dia P14.
PN30PN35
P0 – P15
PN15
PN45
Teste
Comportamental
Histologia
Imunohistoquímica
Histologia
HPLC
Fluoxetina ↓ atividade exploratória; ↓ ramificação
e terminais das aferências tálamo-corticais aos 7
dias; ↓ complexidade dendrítica: menos interseções
e ordens dendríticas, ↓ comprimento e campo
dendrítico; ↓ densidade espinhal e terminais TCA
pré-sinápticos .
Fluoxetina ↓ númeuro de neurônios LSO-5HT-IR;
Nos dias P0, P5-P6 neurônios LSO imunoreativos a
5HTe SERT; Neurônios LSO não foram
imunoreativos a TPH;
Fluoxetina aos 45 dias ↓ peso cerebral do Ts65Dn;
↑ células e a migração para hilo e camada granular;
↑ número de neurônios e astrócitos; Aos 15 dias, ↑
da proliferação de células no DG e SVZ
RodriguesPorcel, Green
et al., 2011
ISRS e Bupropriom
sobre aspectos
comportamentais e
neurônios
serotoninérgicos
Capello,
Bourke et al.,
2011
Quantificar a ocupação
do SERT após a
exposição à ISRS
durante a gestação e
lactação
Liao, Lee et
al., 2011
Fluoxetina sobre
aspectos fisiológicos e
morfológicos de
neurônios sublaminares;
Zheng, Xu et
al., 2011
Densidade dendrítica de
neurônios da região CA1
do hipocampo
Simpson et
al., 2011
Citalopram durante a
lactação sobre
características estruturais
e eletrofisiológicas do
circuito cortical
Long Evans
(n=48)
Fluoxetina/
Citalopram/
Buproprion/
Salina
5mg/kg
10mg/kg
15mg/kg
0,1ml
Long Evans
(n=)
Sertralina/
Paroxetina/
Venlafaxina/
Fluoxetina/
Escitalopram
7-10mg/kg
3-8mg/kg
50-80mg/kg
8-12mg/kg
4,2520mg/kg
Wistar
(n= 57)
Fluoxetina/
Salina
GPF
transgênico
(n=105)
Fluoxetina/
Fluvoxamina
/Salina
Long Evans
(n=)
Citalopram/
Salina
20mg/kg
10mg/kg
5mg/kg
PN8 – PN21
PN25 –
PN184
Teste
Comportamental
Antidepressivos ↑ o tempo de imobilidade;
↓ frequência de interação social
E12-E21
PND1PND8
E21;
PNC3;
PNC7;
PNC14;
BF3; BF7
HPLC
Teste
comportamental
Análise de imagem
No PNC3, animais expostos a fluoxetina
exibiram 40 a 91,5% de ocupação do
SERT; No PNC7, Paroxetina e sertralina
apresentaram ocupação negativa do SERT;
No BF3 e BF7 a fluoxetina promoveu
ocupação do SERT de 43.2 a 57.2%
PN0 – PN4
PN7 PN8
PN13 –
PN15
Análise
Eletrofisiológica;
Morfométrica
Fluoxetina ↓ excitabilidade neuronal;
Altera a poda e o alongamento dendrítico
PN4 – PN21
PN22 e
PN100
Histologia
Teste de
comportamento
Fluoxetina e a fluvoxamina ↓ densidade da
espinha dendrítica basal; Apenas a
fluvoxamina ↓ densidade da espinha
dendrítica apical
PN22 –
PN130
Teste
comportamental
Imunohistoquímica
Análise
Ultraestrutural
Mapeamento
Auditivo
Aos 25 dias ↓ congelamento ao um novo
tom; Aos 39dias ↓atividade exploratória a
novos objetos; Neurônios com
anormalidades, campos receptivos
irregulares e redes intracorticais anormais
PN8 – PN21
5-HT: Serotonina; LSO: Núcleo lateral superior da oliva; MAO-A KO: Knokcout MAO-A; SERT: Transportador de serotonina; PMBSF: Subcampo póstero-medial de barris;
CIT20: Citalopram (20mg/kg); CIT10: Citalopram (10mg/kg); 5HIAA: Ácido 5-hidroxiindolacético; 15FLU-HI: Hipóxia-isquemia Fluoxetina (15mg/kg); 5FLU-HI: Hipóxiaisquemia Fluoxetina (5mg/kg); TPH: Triptofano hidroxilase; TCA: Aferência tálamo-cortical; LSO: Lateral superior da oliva; PNC: Posnatal Clearance; BF: Breast Feeding;
Tabela 2: Número de referências encontradas por base de dados após cruzamento entre os descritores e temas livres.
Base dados/
Cruzamento
PubMed
ISI Web of Knowlodge
Scopus
Brain development AND
Serotonin transporter
Total: 201
Potencias: 23
Total: 355
Potencias: 9
Total: 289
Potencias: 8
Serotonin uptake
inhibitors AND neonatal
Total: 69
Potencias: 13
Total: 7
Potencias: 1
Total: 128
Potencias: 18
Serotonin uptake
inhibitors AND Brain
development
Total: 173
Potencias: 12
Total: 34
Potencias: 2
Total: 267
Potencias: 16
Serotonin transporter
AND Neonatal
Total: 53
Potencias: 5
Total: 99
Potencias: 4
Total: 72
Potencias: 7
Artigos pré–
selecionados
53
16
49
Artigos Selecionados
não repetidos
43
10
8
DISCUSSÃO
As análises dos estudos selecionados nesta revisão sistemática revelaram os
efeitos promovidos pelo uso de ISRS durante o período de lactação sobre aspectos
morfológicos, fisiológicos e comportamentais do sistema nervoso. Os diferentes
inibidores utilizados pelos estudos, dosagens e período de intervenção, fornecem
variadas evidências de ajustes morfofuncionais do sistema nervoso em resposta a
inibição da proteína de recaptação da serotonina durante períodos de vulnerabilidade de
desenvolvimento do sistema nervoso. Os resultados apresentados abrangem variadas
regiões encefálicas e funções analisadas, bem como variações temporais na inibição do
SERT.
A inibição da receptação da serotonina em períodos de desenvolvimento,
promove na maioria dos estudos, déficit do crescimento corporal. Nesse contexto, os
estudos de Deiró e colaboradores (2004, 2008) descrevem detalhadamente os ajustes de
parâmetros de crescimento físico, maturação de característica físicas e desenvolvimento
de reflexos. Esses estudos, com a utilização de diferentes doses do citalopram, indicam
retardo de crescimento e desenvolvimento durante o período da inibição do SERT. Um
ponto importante nesses resultados é a identificação de diferentes resultados a depender
da dose utilizada. Isso indica que os ajustes de crescimento e desenvolvimento
promovidos pela inibição do SERT tem relação direta com as doses utilizadas, assim
como evidenciamos em outros estudos. Aqui levantamos a questão da dificuldade na
interpretação de resultados de diferentes estudos com esse tipo de intervenção, pois as
variações entre tipos de ISRS, as doses utilizadas e o tempo de utilização não são
homogêneos.
Um conjunto de achados descreve ajustes sobre a maturação do sistema somatosensorial (Xu et al., 2004; Lee, 2009) e límbico (Zheng et al., 2011;Ishiwata et al.,
2005) em resposta a exposição aos ISRS durante fases da lactação. Redução da
arborização nos terminais de fibras tálamo-corticais foi evidenciada após administração
de paroxetina (Xu et al., 2004; Lee, 2009). O uso de outro ISRS, fluoxetina, promoveu
redução da complexidade dendrítica, com menor comprimento e campo dendrítico,
terminais pré-sinápticos, densidade espinhal e ocupação dendrítica (Lee, 2009). O
aumento dos níveis de serotonina em animais MAO-A-KO e SERT-KO também
promove desagregação das aferências tálamo-corticais semelhante ao que ocorre em
neonatos tratados com paroxetina (Vitalis et al., 1998; Salichon et al., 2001). Estas
alterações ocorreram particularmente devido ao papel relevante que a serotonina exerce
sobre o desenvolvimento do sistema somatosensorial. Nessa fase, O SERT e o receptor
5-HT1B são expressos em elevados níveis nas aferências tálamo-corticais (BennettClarke et al., 1993, 1996).
No hipocampo, o bloqueio da atividade sináptica durante as primeiras semanas
de vida pós-natal leva a diminuição do comprimento dos dendritos de neurônios CA1
(Groc et al., 2002). O uso com ISRS, em especial, a fluoxetina e fluvoxamina parece
afetar a densidade dendrítica de neurônios da região CA1 do hipocampo através da
remodelação e reorganização sináptica provocada pela ativação de vias de sinalização
por receptores serotoninérgicos (Zheng et al., 2011). Neste estudo, a aplicação de ISRS
durante o período de aproximadamente duas semanas promoveu redução na densidade
dendrítica basal e apical de neurônios da região CA1 do hipocampo ao final da lactação.
De maneira diferente, o uso de fluoxetina durante as três semanas de lactação promoveu
aumento na densidade das espinhas dendríticas de neurônios da região CA3 do
hipocampo de animais submetidos a estresse pré-natal ao final do período de aplicação
do fármaco (Ishiwata et al., 2005). Parece que a manipulação com fluoxetina reverte a
redução na densidade sináptica induzida pelo estresse pré-natal, demonstrando o papel
da serotonina no processo de formação das sinapses.
A exposição a fluoxetina durante os quatro primeiros dias de vida, que
corresponde ao terceiro trimestre de gestação nos humanos, afeta o potencial de ação e
interrompe a remodelação dendrítica de neurônios sublaminares em desenvolvimento no
córtex somatosensorial (Liao et al., 2011). Tem sido demonstrado que um maior
desenvolvimento dos neurônios sublaminares parece reduzir a excitabilidade neuroral
(Zhao et al., 2009). Analisados nos dias P7 e P8, os animais apresentaram menor
excitabilidade neuronal, sugerindo maturação acelerada dos animais que receberam
fluoxetina durante os primeiros dias de vida (Zheng et al., 2011). Além disso, o
crescimento dendrítico dos neurônios sublaminares é interrompido durante a primeira
semana pós-natal. Visto que, maior parte dos contatos sinápticos estão na árvore
dendrítica, uma redução na arborização dendrítica dos neurônios sublaminares altera a
condutividade sináptica (Komendantov e Ascoli, 2009).
O excesso de 5-HT em animais MAO-A KO é responsável pelo surgimento de
anormalidades observadas no padrão de projeções de neurônios não-serotoninérgicos
que acumulam 5-HT (Vitalis et al., 1998). Durante o desenvolvimento de neurônios
não-serotoninérgicos, os níveis de 5-HT são regulados no ambiente extracelular em
torno dos terminais neuronais (Gaspar et al., 2003). Acredita-se que os níveis
extracelulares de 5-HT sejam regulados nas terminações dos neurônios LSO por meio
do SERT (Thompson et al., 2011). O acúmulo de 5-HT em neurônios sensoriais nãoserotoninérgicos parece necessário para a formação dos seus campos terminais, assim
como a captação de 5-HT pode ser necessária para a organização do padrão das
projeções neuronais (Thompson et al., 2011). Estes estudos indicam que durante o
desenvolvimento, o acúmulo de serotonina em neurônios não-serotoninérgicos depende
de uma regulação precisa dos níveis de 5-HT.
Muitos estudos demonstram os efeitos a longo prazo sobre aspectos
comportamentais (Maciag et al., 2006; Karpova et al., 2009; Lee, 2009; Rodrigues et
al., 2011; Simpson et al., 2011). No estudo de Simpson e cols (2011), animais machos
recém-nascidos tratados duas vezes ao dia durante duas semanas da lactação com
citalopram exibiram aos 25 dias de vida resposta neofóbica exacerbada a estímulos
auditivos. Esses animais exibiram na adolescência menor atividade de exploração a um
novo objeto. Estes déficits de comportamento permaneceram até a idade adulta. Estes
resultados sugerem que a exposição precoce ao ISRS promove características
semelhantes a crianças com autismo (Simpson et al., 2011).
No estudo de Lee
(2009), os neonatos tratados com fluoxetina durante os seis primeiros dias de vida
apresentaram menor atividade exploratória ainda na adolescência. O processamento da
informação sensorial pode ser alterado nestes animais devido à deformação nas
projeções tálamo-corticais e estruturas dendríticas (Lee, 2009). Rodrigues-Porcel e cols
(2011) demonstraram que animais expostos aos ISRS, quando surpreendidos por um
estímulo sonoro, apresentavam a reação igual a dos controles, ou seja, parada de
movimentos. No entanto, após o estímulo sonoro os animais tratados demoravam mais
tempo para retornar as suas atividades, implicando numa alta responsividade a
estímulos sensoriais. Ao que parece, o uso crônico de ISRS durante o período de
lactação leva a alterações persistentes à resposta a novos estímulos apresentados em
vários campos sensoriais. Estes animais apresentavam reduzida exploração e
investigação a novos objetos, e mostraram menor interação social. A interação e
reciprocidade social prejudicada é uma característica do autismo.
Podemos encontrar estudos que enfatizam os benefícios (Bianchi 2010; Chang,
2006; Ishiwata, 2005) e prejuízos (Deiró, 2004 e 2008; Lee, 2009; Liao, 2011;
Rodriguez-porcel, 2011; Simpson, 2011; Xu, 2004) da exposição neonatal a ISRS. No
entanto, mesmo os estudos que conduzem a discussão interpretando as modificações
observadas pelo tratamento, não realizam analise detalhada das repercussões do ponto
de vista dos diferentes estímulos ambientais ao longo da vida. Os ajustes promovidos
pelo sistema serotoninérgico em resposta ao bloqueio do SERT durante o
desenvolvimento podem ser direcionados para a adequada interação com o meio que se
apresenta nesse momento. Quando não se consideram as mudanças ambientais, novos
ajustes podem se sobrepor a esses iniciais, em resposta ao ambiente da vida adulta.
Nesse contexto, o estudo de Karpova e cols (2009), demonstra que os ajustes,
interpretados como prejudiciais, promovidos pela inibição do SERT durante o
desenvolvimento no peso corporal, comportamento e genes relacionados a plasticidade
no hipocampo foram modificados para padrões normais quando houve inibição crônica
do SERT na vida adulta. Isso demonstra as compatibilidades entre a intervenção e as
demandas ambientais. Em outro modelo de intervenção durante o período de
desenvolvimento, Bianchi e cols (2010), apontam os benefícios da inibição do SERT
em restaurar numero de neurônios hipocampais e subsequente atividade cognitiva em
animais modelos de retardo mental. Nesse mesmo pensamento, Chang e cols (2006),
demonstra que a inibição do SERT em períodos iniciais da vida, protege o sistema
nervoso contra injurias promovidas por isquemia ao induzir neurogênese e
neuroplasticidade.
A diversidade do período de intervenção utilizado em cada estudo, bem como da
dose utilizada e o tipo de inibidor, induzem a conclusões parciais indicando a
necessidade de estudos padronizados, e o acompanhamento mais detalhados dos
diferentes ajustes encontrados. No estudo de Capello e cols (2011), foi analisada a
ocupação do SERT levando em consideração uma via de administração mais próxima
daquela que ocorre em humanos, através da mãe. Assim, o feto ou neonato, foram
influenciados pelo SSRI veiculado pela placenta ou leite materno. Eles enfatizam a
necessidade de estudos mais fidedignos em relação ao período e dose dos SSRI em
relação ao que ocorre em humanos, concluindo que essa iniciativa é necessária para
conclusões sobre influencias da inibição do SERT em períodos do desenvolvimento
sobre anatomia ou função do sistema nervoso. Desse ponto de vista, podemos verificar
que em alguns estudos, como o de Liao e cols (2011), os resultados apontados como
influência prejudicial da inibição do SERT sobre células importantes ao
desenvolvimento dos sistema nervoso, podem ser questionados devido a elevada dose
utilizada do inibidor (25mg/Kg). A dose utilizada para mimetizar aquela utilizada em
humanos é geralmente entre 5 e 15mg/Kg. Em outros estudos, as influências da inibição
do SERT no período neonatal promove resultados diferentes a depender da idade de
análise. No estudo de Zheng e cols (2011), foi observado redução de espinhas
dendríticas em neurônios hipocampais aos 22 dias de vida e aumento aos 90 dias. O
tempo de bloqueio do SERT também é muito variável, sendo encontrado nesses estudos
desde quatro dias inicias, durante toda a gestação e lactação ou durante apenas a
lactação.
Diante dos estudos descritos, pode-se sugerir que a amplitude e diversidade de
funções do sistema serotoninérgico, e seu relevante papel nos processos de
desenvolvimento, promovem ajustes adaptativos importantes na estrutura e função do
sistema nervoso, que possivelmente tornarão aquele organismo compatível as
adversidades do ambiente que se apresenta durante essa fase da vida.
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HIPOTESE
A utilização do ISRS, fluoxetina, durante o período crítico de desenvolvimento
do sistema nervoso eleva os níveis de serotonina de forma permanente e não modifica a
expressão de SERT no hipotálamo de ratos.
OBJETIVOS
Avaliar os níveis de serotonina e a expressão gênica do SERT no hipotálamo de
ratos submetidos a inibição crônica do SERT durante o período de lactação.
METODOS
ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos da linhagem Wistar provenientes da colônia do
Departamento de Nutrição – UFPE. As fêmeas adultas (±120 dias de vida) foram
mantidas em condições padrão de biotério com temperatura de 22°C ± 2ºC, ciclo claroescuro invertido de 12/12 horas (escuro: 6:00h às 18:00h/claro: 18:00h às 6:00h) e livre
acesso à água e alimentação padrão de biotério (LABINA, Purina do Brasil®).
As ratas em período estral foram acasaladas na proporção de duas fêmeas para
um macho. A prenhez foi diagnosticada pela presença de espermatozóides no esfregaço
vaginal, sendo considerado como indicador do dia 0 da gestação, logo após, as ratas
foram alocadas em gaiolas individuais até o nascimento dos filhotes (considerado dia 0
de vida dos filhotes). Para a confirmação da gestação o ganho de peso corporal foi
acompanhado. Um dia após o nascimento, foi considerado o primeiro dia de vida dos
filhotes e foi realizado randomização aleatória dos filhotes com peso corporal ideal (6g
a 8g) mantendo oito filhotes por nutriz, sendo quatro filhotes de cada grupo
experimental, até o 21º dia de vida quando serão desmamados e alocados em gaiolas
com um total de quatro filhotes por gaiola até a realização das análises. O manejo e os
cuidados seguiram as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA).
MANIPULAÇÃO FARMACOLÓGICA
Inicialmente, os grupos experimentais foram obtidos aleatoriamente de acordo
com o tipo de manipulação oferecida as fêmeas. As fêmeas da receberam aplicação de
fluoxetina ou salina durante toda a lactação. Para manipulação farmacológica foi
utilizado o inibidor seletivo de recaptação de serotonina, fluoxetina (10 mg/Kg, 10µl/g),
durante o período de lactação. A droga foi obtida na forma de cloridrato de fluoxetina e
foi dissolvida em solução salina (NaCl 0.9%). Os animais receberam o tratamento uma
hora após o início do ciclo escuro (7:00h). Este horário foi determinado por coincidir
com o pico de serotonina (SÁNCHEZ et al., 2008). A concentração usada neste estudo
foi determinada em estudo prévio de relação dose-efeito (MENDES et al., 2002).
GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os grupos experimentais foram formados segundo a manipulação farmacológica.
O total de 21 ninhadas foi utilizado para atingir o número total de amostras. As
ninhadas foram organizadas com um total de oito neonatos machos por nutriz, sendo
quatro manipulados com salina e quatro com fluoxetina, a fim de minimizar os efeitos
promovidos pelo fármaco ao comportamento alimentar dos animais.
Grupo Salina (GC): Os filhotes receberam solução de salina (NaCl 0.9%,
10µl/g) via subcutânea no dorso, diariamente, do 1º ao 21º dia de vida (n=19).
Grupo Fluoxetina (GF): Os filhotes foram submetidos ao tratamento com
solução de fluoxetina (10mg/Kg,10µl/g), diariamente, via subcutânea no dorso, do 1º ao
21º dia de vida (n=20).
PESO CORPORAL
O peso corporal dos filhotes foi mensurado durante todos os dias da lactação e
no 40º dia de vida. O peso foi registrado utilizando balança digital (Marte, modelo S100/ sensibilidade de 0,01g).
DOSAGEM DE SEROTONINA
Os animais dos grupos experimentais foram sacrificados nos dias 21, após a
aplicação farmacológica, e aos 40 dias por decaptação para obtenção dos encéfalos.
Após abertura do crânio, o encéfalo foi removido da cavidade craniana e foi dissecado o
hipotálamo. Os tecidos foram acondicionados em tubos isolados e imediatamente
congelados em gelo seco, sendo em seguida acondicionados em freezer -82 C° até o
momento da análise.
Homogeneizado de tecido
O hipotálamo foi colocado individualmente em tubos contendo 1 ml de 25 mM
Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA e 1 mM EGTA, e homogeneizado com um
homogenizador Ultra-Turrax (tipo TP 18/10; Janke & Kunkel KG, Staufen, Alemanha).
O homogeneizado foi centrifugado a 11,000 g a 4º graus durante 30 minutos. O
resultado do sobrenadante aliquotado para determinar os níveis de 5-HT. O extrato do
tecido foi utilizado para determinar a concentração de proteínas (Mateos et al., 2008).
Após a homogeneização a concentração de proteínas foi determinada no
hipotálamo através do método de Bradford. Este método consiste da formação de um
composto de absorção de cor azul entre os resíduos de aminoácidos básicos de proteínas
e o corante azul de Comassie. A absorbância depende do conteúdo de aminoácidos e o
conteúdo de proteína presente no tecido (Bradford, 1976).
A serotonina foi determinada através do kit ELISA RE59121 (IBL, Hamburg,
Alemanha) de acordo com o manual de instruções. Este ensaio imunoenzimático é
baseado no princípio de interação específica entre antígeno e anticorpo. Anticorpo
purificado encontra-se ligado à superfície interna de cada microcavidade da microplaca.
O antígeno biotinilado e o antígeno não-biotinilado (serotonina da amostra) competem
por um número fixo de locais de ligação de anticorpos. A quantidade de antígeno
biotinilado que liga ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração da
amostra. Quando o sistema está em equilíbrio, o antígeno biotinilado livre é removido
por um passo de lavagem e o antígeno biotinilado ligado ao anticorpo é determinado
usando uma enzima fosfatase alcalina. A quantificação da amostra é realizada por meio
da comparação entre a atividade enzimática da amostra com uma curva resposta
preparada utilizando padrões conhecidos. A determinação foi realizada em duplicata. Os
resultados são expresso em ng/µg de proteína.
EXPRESSÃO GÊNICA DO TRANPOSTADOR DE SEROTONINA (SERT)
Foi analisada a expressão gênica do transportador de serotonina no hipotálamo
nos dias 21 e 40 dos animais de todos os grupos experimentais pela técnica da reação
em cadeia da polimerase em tempo real (PCR real time). O RNAm foi extraído
utilizando o reagente Trizol (Invitrogen®, Carlsbad, CA, USA) e tratado com DNAse
por 30 minutos a 37°C. Em seguida 2μL de RNA purificado foi transcrito reversamente
usando Superscript II RNAseH – transcriptase reversa (Invitrogen®) em um volume
total de 20μL. O cDNA resultante foi diluído 50ml de água livre de DNAse e RNAse.
Em seguida, 4,5μL de cada amostra de cDNA diluído foi utilizado para amplificação
PCR utilizando SYBR Green (Qiagen®, Courtaboeuf, França) como fluorogênico em
termociclador (Qiagen®). Os parâmetros foram: desnaturação inicial de 5 minutos a
95°C seguida de 40 ciclos de 30 segundos a 95°C e 30 segundos a 60°C. As sequências
direta e reversa (Forward e reverse) do primer utilizado para amplificação foi:
Forward, 5´- GGC GGA GAT GAG GAA TGA AGA TG - 3´; Reverse 5´- GGA
AGA AGA TGA TGG CAA AGA ACG - 3´. Os níveis de expressão relativa de
RNAm do transportador de serotonina nas amostras de tecidos foi calculada utilizando o
método comparativo DCT (Livak e Schmittgen, 2001) e β actina RNA como gene
normalizador (LOPES DE SOUZA et al., 2008).
ANALISE ESTATISTICA
Os dados são apresentados em média e erro padrão da média. O teste t não
pareado foi utilizado para a comparação entre os grupos em cada idade. Foi utilizado o
software GraphPad Prism versão 4.0 2004. O nível de significância foi mantido em 5%
(p<0,05).
RESULTADOS
O grupo Fluoxetina apresentou redução no peso corporal a partir do 14º dia de
vida (GC, 34,3±1,8g; n=8 vs GF, 30,4±2,7g; n=8) até o final da lactação e persistiu após
a retirada do fármaco até os 40º dias de vida (GC, 166,9±27,2g; n=6 vs GF,
127,3±17,5g; n=6) (Figura 1).
Figura 1: Efeito da manipulação farmacológica neonatal do sistema
serotoninérgico sobre o Peso corporal aos 1, 7, 14, 21 e 40 dias de vida. Os
filhotes receberam, diariamente, solução salina (C, n=10, NaCl0,9%, 1µl/g, s.c)
ou fluoxetina (GF, n=10, 10mg/Kg, 1µl/g p.c, s.c) durante a lactação. Os dados
estão representados em MED±EP. *P=0.01, **P=0,001, ***P=0,0001, t-Test
Student.
O grupo Fluoxetina apresentou aumento na concentração hipotalâmica de 5-HT
aos 21 dias de vida quando comparado ao grupo salina (GC 2,9±0,3; n=4 vs GF 4,5±0,3
n=4). No entanto, após dezenove dias sem a exposição ao fármaco, aos 40 dias de vida,
os níveis de 5-HT não exibiram alteração entre os grupos (GC 2,5±0,3 n=4 vs GF
2,7±0,5 n=4) (Figura 2).
Figura 2: Concentração de 5-HT no hipotálamo após exposição a fluoxetina
ou salina durante o período de lactação. Os animais foram tratados com
fluoxetina (10mg/kg,10µl/g) ou solução salina (NaCl 0.9%, 10µl/g) durante
o período neonatal. Os dados são expressos em média±EP. As análises foram
realizadas em duplicatas e houve menos de 5% de variação entre os valores
obtidos. *P<0,05 Student t teste.
No grupo Fluoxetina, no 40º dia de vida, houve um upregulation na expressão
gênica do SERT (GC= 1,00±0,07, n=5, versus GF= 1,40±0,08, n=5). Não houve
diferença na expressão gênica do SERT entre os grupos aos 21 dias de vida (GC=
1,03±0,3, n=5, versus GF= 1,01±0,1, n=5).
Figura 3: Expressão gênica do SERT no hipotálamo após exposição a fluoxetina
ou salina durante o período de lactação. Os animais GF21 e GF40 foram tratados
com fluoxetina (10mg/kg,10µl/g) e GC21 e GC40 tratados com solução salina
(NaCl 0.9%, 10µl/g) durante o período neonatal. Os pares de colunas representam
a expressão dos níveis de mRNA de SERT em relação à β-actina endógena
amplificada dentro da mesma amostra sob as mesmas condições experimentais.
Cada par de colunas representa média±SEM de 5 diferentes amostras de mRNA.
As análises foram realizadas em triplicatas e houve menos de 5% de variação
entre os valores obtidos. . ***P=0,0001 Student t teste.
DISCUSSAO
No presente estudo, utilizamos a exposição neonatal ao inibidor seletivo de
recaptação de serotonina, a fluoxetina, como ferramenta para manipular o sistema
serotoninérgico. Observamos que o bloqueio do SERT durante o período de lactação
promoveu aumento no nível de serotonina hipotalâmica que retornou a normalidade
após cessado o tratamento. Por outro lado, a expressão gênica do SERT apresentou
upregulation após a retirada do fármaco.
O uso de fluoxetina provocou aumento na concentração da serotonina no
hipotálamo no último dia de manipulação neonatal. A fluoxetina inibe seletivamente a
recaptação de serotonina atuando no bloqueio da proteína de transporte SERT,
induzindo o aumento na disponibilidade deste neurotransmissor na fenda sináptica, bem
como sua ação sobre os receptores serotoninérgicos (Blakely et al., 1991; Hjorth et al.,
2000; Stenfors e Ross, 2002). O tratamento crônico com ISRS favorece a
desensibilização de receptores serotoninérgicos, devido à elevada concentração de
serotonina e a superestimulação dos mesmos (Hjorth et al., 2000; Azmitia, 2001).
Inicialmente, o auto-receptor 5-HT1A é estimulado pela fluoxetina, e sua
ativação produz a inibição na taxa de disparo dos neurônios 5-HT (Hjorth et al., 2000;
Gardier et al., 1996). O aumento da serotonina parece ocorrer a princípio no corpo
celular e dendritos, consideravelmente nos núcleos dorsal e mediano da rafe (Bambrilla
et al., 2005). O maior conteúdo extracelular de serotonina, promovido pelo bloqueio do
SERT por antidepressivos, resulta em uma redução na liberação de 5-HT pela vesícula,
devido a ativação do mecanismo de feedback negativo facilitado pelo receptor 5-HT1A
(Piñeyro e Blier, 1999). No entanto, a exposição crônica à fluoxetina provoca a
desensibilização dos auto-receptores 5-HT1A, bem como 5-HT1B, impedindo o
controle
da
neurotransmissão
serotoninérgica
por
estes
receptores,
o
que
consequentemente permite o aumento no disparo serotoninérgico e acúmulo de
serotonina na fenda sináptica (Hjorth et al., 2000; Stenfors e Ross, 2002). No estudo de
Tao e cols (2002), a infusão de fluoxetina no hipotálamo de animais adultos promoveu o
aumento de 5-HT. Quando utilizado um agonista do auto-receptor 5-HT1A, o aumento
inicial dos níveis de 5-HT promovido pela fluoxetina foi atenuado. Demonstrando que a
ação de ISRS pode ser modulada pelo disparo neuronal serotoninérgico (Gartside et al.,
1995). A desensibilização encefálica destes receptores é relevante para os efeitos
terapêuticos observados após o tratamento crônico com antidepressivos (Piñeyro e
Blier, 1999). O efeito terapêutico dos ISRS ocorre após três dias de tratamento em
roedores (Le Poul et al., 1995) e em humanos após duas ou três semanas (Quitkin et al,
1995).
A manipulação serotoninérgica durante o período perinatal promove alterações
em componentes deste sistema (Cabrera-Vera et al.,1997; Bengel et al.,1998; Kim et
al., 2005; Mathews et al.,2004). A exposição pré-natal a fluoxetina reduziu 28% do
conteúdo de 5-HT no córtex frontal de ratos machos aos 26 dias de vida. Esta diferença
não foi observada no hipotálamo, hipocampo e tronco encefálico dos animais jovens
(Cabrera-Vera et al.,1997). Estes achados demonstram a sensibilidade de determinadas
regiões encefálicas a exposição à ISRS durante a fase de desenvolvimento do sistema
nervoso. Whitaker-Azmitia e cols (1996), observaram que animais tratados com
inibidor da MAO, enzima de degradação da 5-HT, apresentaram redução na densidade
de terminais serotoninérgicos no córtex no 5º dia da lactação. E aos 30 dias de vida, a
inervação do córtex encontrava-se ainda mais prejudicada (Whitaker-Azmitia et al.,
1996). As repercussões na homeostase do sistema serotoninérgico, durante o período
precoce do desenvolvimento, tem recebido pouca atenção, em contraste ao vasto
número de estudos que investigam o uso de ISRS em animais adultos e os efeitos sobre
componentes do sistema em questão.
Mecanismos compensatórios e alterações neuroadaptativas ocorrem em animais
knockout SERT durante o período embrionário e subseqüente neurodesenvolvimento
(Bengel et al., 1998), permitindo a utilização deste modelo de animais para o
entendimento das possíveis alterações provocadas pela exposição a ISRS durante o
período crítico do sistema nervoso. Em animais SERTKO, as concentrações de 5-HT e
sua liberação estão aumentadas no córtex e no estriado de camundongos (Mathews et
al., 2004). Como resultado de uma reciclagem deficiente de serotonina, estes animais
apresentam alterações compensatórias, como o aumento da síntese e turnorver da 5-HT
em regiões encefálicas (Bengel et al., 1998; Kim et al., 2005). O consequente aumento
dos níveis extracelulares da serotonina ampliam e estendem a duração de sua
sinalização em receptores 5-HT e alteram o estado homeostático de todo o sistema
serotoninérgico (Mathews et al., 2004).
Neste trabalho, a exposição neonatal crônica a fluoxetina induziu ao aumento na
expressão gênica do SERT no hipotálamo após o tratamento. Este resultado parece um
efeito compensatório do sistema serotoninérgico, visto o período de bloqueio sofrido
por este transportador durante a lactação e a expressão normal ainda durante o uso deste
fármaco. Os ISRS ligam-se diretamente neste sítio de recaptação, visto sua semelhança
com o principal substrato do SERT, a serotonina, impedindo sua função (Ravna et al.,
2006). A utilização de ISRS durante a gestação ou infância pode modificar propriedades
de neurônios que expressam SERT através de alterações na sua transcrição específica ou
mudanças em sua expressão gênica (Narboux-Nême et al., 2008). Como uma reação de
feedback para o bloqueio da recaptação, a transcrição do gene SERT seria aumentada
para estimular a síntese da proteína SERT, e permitir um maior controle dos níveis
extracelular de 5-HT que encontravam-se aumentados ao final do período de exposição
ao fármaco.
Os resultados sobre os efeitos do uso de antidepressivos a longo prazo sobre o
SERT são contraditórios. Numerosos estudos sobre ISRS e sua ação sobre a expressão
do SERT encontram aumento (Cabrera-vera e Battaglia, 1998; Hansen et al., 1998;
Benmansour et al., 1999), redução (Cabrera-vera e Battaglia, 1998) e outros nenhuma
alteração (Blakely et al., 1994; Ramamoorthy et al., 1998). Esta contradição se dá
devido o tipo de fármaco utilizado, a duração, o período do tratamento, e as doses
administradas.
O uso de fluoxetina durante a última semana de gestação provocou aumento na
densidade do SERT no núcleo lateral do hipotálamo aos 28 dias de vida. Estes animais
apresentaram ainda, uma diminuição na densidade do SERT no núcleo dorsomedial, e
não houve diferença em outros núcleos hipotalâmicos como, arqueado, paraventricular e
ventromedial (Cabrera-Vera e Battaglia, 1998). Estas alterações são importantes uma
vez que estes núcleos tem papel importante no controle do comportamento alimentar e
regulação do peso corporal (Grzeskowiak et al., 2012). Hansen e colaboladores (1998),
utilizando clomipramina, um antidepressivo tricíclico que atua na recaptação da
serotonina e noradrenalina, durante 14 dias do período neonatal encontraram um
aumento da expressão do SERT aos 22 dias de vida no núcleo dorsal da rafe. Em
animais adultos, o tratamento crônico com paroxetina, um antidepressivo ISRS, também
aumentou a expressão do SERT no núcleo dorsal da rafe (Benmansour et al., 1999). O
uso neonatal de citalopram, outro ISRS, reduziu a expressão do SERT no córtex, e a
enzima triptofano hidroxilase no núcleo dorsal da rafe dos animais após o desmame. A
reduzida expressão do SERT persistiu até a idade adulta (Maciag et al., 2006). Em
contraste aos efeitos prolongados da exposição neonatal, o tratamento crônico com
ISRS em animais adultos, não apresentou diferenças no SERT e na TPH (Maciag et al.,
2006). Estes dados indicam que os efeitos da exposição à ISRS durante o período de
vulnerabilidade pode promover alterações prejudiciais ao sistema serotoninérgico, além
de demonstrar a sensibilidade deste período de crítico do desenvolvimento do sistema
nervoso.
Além dos auto-receptores 5-HT1A e 5-HT1B, Outros receptores do sistema
serotoninérgico também sofrem mudanças por influência de antidepressivos (Cabreravera e Battaglia, 1998). Durante o período perinatal, a fluoxetina reduziu os receptores
5-HT2A e 5-HT2C no hipotálamo em animais adultos, porém aos 28 dias de vida estes
animais não monstraram diferenças (Cabrera-vera e Battaglia, 1998). Estes achados
indicam que pode ocorrer um retardo no aparecimento das alterações pós-sinápticas da
via serotoninérgica no cérebro após a exposição a antidepressivos. Corroborando com
nossos resultados, na qual a expressão do SERT não mostrou-se diferente aos 21 dias,
ao final da manipulação farmacológica. No entanto, semanas após a retirada do
fármaco, aos 40 dias, o SERT apresentou aumento de sua expressão, indicando uma
possível falha na resposta imediata do sistema serotoninérgico em reverter os elevados
níveis de 5-HT encontrados no final da manipulação.
A ausência de alteração nos sítios de captação da 5-HT também foi observada. O
uso de fluoxetina durante a gestação não modificou a densidade do SERT no
hipotálamo, córtex ou tronco encefálico, revelando que as alterações encontradas em
outros componentes do sistema serotoninérgico, como a própria serotonina, são
provavelmente causadas por modificações na função do transportador (Cabrera-Vera et
al.,1997). Animais adultos tratados com fluoxetina por 31 dias não apresentaram
alteração em níveis de mRNA do SERT (Spurlock et al., 1994).
Evidências sugerem que proteínas cinases e fosfatases regulam a expressão,
atividade e degradação do SERT. Estes transportadores são fosfoproteínas que passam
por um controle dinâmico influenciado pela atividade destas proteínas cinases e
fosfatases. A regulação do transportador ocorre via fosforilação dependente ou não de
modificações pós-transcricionais. Estas modificações podem: alterar a atividade de
transporte intrínseco; alterar a taxa de renovação do transportador; regular a fusão da
vesícula com a membrana plasmática e regular o seqüestro do transportador presente na
membrana de volta para o citoplasma (Eriksen et al., 2010).
Um dos mecanismos de internalização de proteínas de membrana plasmática é a
fosforilação. Este mecanismo de sinalização celular é mediado por enzimas quinases C
(PKC) e quinase dependente de AMP cíclico (PKA) (Iceta et al, 2007). A atividade
destas quinases induzem a adição de um grupo fosfato ao transportador de serotonina,
promovendo uma mudança em sua conformação. Quando fosforilado, o SERT tem sua
capacidade de recaptar a 5-HT extracelular reduzida (Ramamoorthy e Blakely, 1999). A
ativação da PKC e a inibição de proteínas fosfatases, esta última induz a retirada do
grupo fosfato, aumentam a fosforilação do SERT e reduz a proteína SERT na membrana
celular (Ramamoorthy e Blakely, 1998). O dano na capacidade de recaptação da 5-HT
também está relacionada com a menor disponibilidade do SERT na superfície da
membrana celular (Ramamoorthy e Blakely, 1999).
A administração de fluoxetina em cultura de células do epitélio intestinal em
humanos não promoveu alteração na afinidade da 5-HT ao transportador, nem na
expressão gênica e protéica do SERT. No entanto reduziu a captação de serotonina,
devido a uma menor taxa de transporte e menor conteúdo protéico do SERT na
membrana celular (Iceta et al., 2007). Isso mostra que mesmo sem alteração
significativa na expressão do gene SERT, a redução da proteína SERT disponível na
membrana celular impossibilita uma captação adequada da serotonina extracelular.
Estes dados podem explicar os resultados achados neste trabalho, aonde a ausência de
diferença na expressão gene SERT não foi capaz de promover uma redução nos níveis
de 5-HT, e consequemente foi observado uma elevada concentração de 5-HT logo após
o tratamento crônico com a fluoxetina.
Após a suspensão da administração do fármaco, a inibição da captação da 5-HT
desaparece (Iceta et al., 2007). Na presença de serotonina, a fosforilação mediada pela
PKC é diminuída (Ramamoorthy e Blakely, 1999), o que consequentemente permite
uma maior captação de 5-HT. Os elevados níveis de 5-HT encontrados, implicam no
aumento da atividade do SERT, que devido ao período de inativação, possivelmente
gera um estímulo a síntese de novas proteínas SERT, e para que isso ocorra é necessário
o aumento da expressão gênica e protéica do transportador. A ocupação do substrato
e/ou manutenção da atividade do SERT permite a retenção desta proteína de transporte
na superfície da membrana plasmática (Zahniser e Doolen, 2001). Como a fluoxetina
implica numa redução do SERT na membrana plasmática, a retirada do fármaco e o
aumento de sua atividade explicam a ausência de diferença nos níveis de serotonina
semanas após a retirada do fármaco. Demonstrando a grande plasticidade do sistema
serotoninérgico, através de um mecanismo compensatório para normalizar os níveis de
5-HT e consequemente privar o organismo de maiores alterações fisiológicas.
Nossos resultados trazem à tona possíveis explicações para achados em estudos
anteriores que realizaram a manipulação com antidepressivos ISRS durante o período
neonatal. A manipulação farmacológica neonatal do sistema serotoninérgico e seus
efeitos em à longo prazo vêm sendo estudados ao longo dos anos. Na literatura é bem
evidenciado que a exposição à fármacos como ISRS durante a lactação induz um
fenótipo de baixo peso corporal (Manhães de Castro, 2001; Deiró et al., 2004; Lopes de
Sousa, 2008; Mendes da Silva et al., 2002; 2010). No presente estudo, a manipulação
neonatal do sistema serotoninérgico também promoveu baixo peso corporal nos filhotes.
Mendes da Silva e cols (2010) encontraram redução de 22% do peso corporal aos 21
dias de vida de animais tratados com fluoxetina durante as primeiras três semanas após
o nascimento. A exposição à outro ISRS, o citalopram, por toda lactação também
induziu menor peso corporal (Deiró et al., 2004). Como observado por Lopes de Sousa
(2008), a redução na ingestão alimentar, induzida pela manipulação neonatal do sistema
serotoninérgico, pode ter provocado o menor ganho de peso corporal.
Uma possível explicação para a alteração no peso corporal promovida pelo
tratamento neonatal com ISRS seria o aumento da disponibilidade extracelular de
serotonina, e seu efeito sobre a ingestão alimentar, como observado ao final da
manipulação com fluoxetina. A manipulação da síntese, biodisponibilidade e
metabolismo da serotonina fornece evidências para o papel deste neurotransmissor na
regulação da ingestão alimentar e no peso corporal. A serotonina parece ter uma relação
inversa com o consumo energético, pois promove redução da ingestão alimentar por
estimular a saciedade em ratos (Blundell e Halford, 1994). Este efeito é observado em
organismos maturados, no entanto, pouco se sabe como a serotonina atua sobre a
regulação do balanço energético durante o período de crescimento e desenvolvimento.
Visto que durante o período de desenvolvimento do sistema nervoso a serotonina
parece não ter sua ação hipofágica completamente maturada, é importante investigar os
efeitos da serotonina sobre o gasto energético. Em camundongos TPH2 knockout,
enzima-chave para a síntese da serotonina, estes animais apresentam apnéia grave e
atraso no crescimento durante o desenvolvimento. Parece que esta desordem respiratória
resultou em atraso de crescimento e na mortalidade destes animais (Alenina et al.,
2009). A administração periférica de serotonina ou fenfluramina promoveram maior
consumo de oxigênio nos animais (Le Feuvre et al., 1991; Rothwell e STock, 1987),
possivelmente devido alterações na atividade locomotora destes animais. Estes achados
demonstram que a manipulação da disponibilidade de serotonina, através de drogas que
afetam a receptação de serotonina ou por meio de modificações genéticas podem induzir
danos ao controle do consumo e gasto energético.
A exposição aos inibidores seletivos da recaptação de serotonina, como a
fluoxetina e o citalopram, durante o período neonatal pode alterar a dinâmica do
transporte de serotonina em áreas encefálicas como o hipotálamo, hipocampo e córtex,
além de influenciar a neurotransmissão serotoninérgica e provocar desequilíbrios ao
desenvolvimento e maturação destas estruturas. A partir destes dados, podemos inferir a
possibilidade de que a exposição neonatal SSRI reestrutura vias regulatórias de controle
da neurotransmissão da serotonina e atividade de seu transportador, além de reorganizar
projeções serotoninérgicas e provoca efeitos a sistemas fisiológicos, principalmente o
sistema nervoso.
CONCLUSAO
A inibição crônica da proteína de recaptação da serotonina durante o período de
lactação em ratos promove, ao final do tratamento, o elevado nível de serotonina no
hipotálamo. No entanto, após a retirada do tratamento farmacológico, o nível de
expressão gênica do SERT sofre up-regulation enquanto o nível de serotonina
hipotalâmica se normaliza. Este estudo permitiu demonstrar a grande plasticidade do
sistema serotoninérgico frente a agressões ambientais em um período de extrema
sensibilidade, como o período crítico de desenvolvimento através de mecanismos
compensatórios a fim de normalizar a biodisponibilidade de seu neurotransmissor e
impedir o aparecimento de alterações fisiológicas que induzissem o comprometimento
de funções orgânicas essenciais do organismo.
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