Patrícia Soares - evz - ppgca

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
IDENTIFICAÇÃO DO CIRCOVÍRUS TIPO 2 E DO TORQUE TENO
VÍRUS EM SUÍNOS DE CRIAÇÕES INTENSIVAS DO ESTADO DE
GOIÁS
Patrícia Soares
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito
GOIÂNIA
2011
ii
iii
PATRÍCIA SOARES
IDENTIFICAÇÃO DO CIRCOVÍRUS TIPO 2 E DO TORQUE TENO
VÍRUS EM SUÍNOS DE CRIAÇÕES INTENSIVAS DO ESTADO DE
GOIÁS
Dissertação apresentada para obtenção
do grau de Mestre em Ciência Animal
junto à Escola de Veterinária da
Universidade Federal de Goiás
Área de Concentração:
Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo
Prof. Dr. Jürij Sobestiansky
GOIÂNIA
2011
iv
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
S676i
Soares, Patrícia.
Identificação do circovírus tipo 2 e do torque teno vírus
em suínos de criações intensivas do Estado de Goiás
[manuscrito] / Patrícia Soares. - 2011.
117 f. : il., figs, tabs.
Orientadora: Profª. Drª. Wilia Marta Elsner Diederichsen
de Brito; Coorientadores: Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de
Araújo, Prof. Dr. Jurij Sobestiansky.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Escola de Veterinária e Zootecnia, 2011.
Bibliografia.
Inclui lista de figuras, abreviaturas, quadros e tabelas.
Anexo.
1. Circovírus suíno – Coinfecção – Goiás (Estado). 2.
Torque teno vírus - Suíno. 3. Suíno – Doença multifatorial. I.
Título.
CDU: 636.4:616-022(817.3)
v
vi
Aos meus pais, pela oportunidade
da vida e por me ajudarem na
descoberta mais importante: Meu
caminho e minha verdade, por meio
dos seus esforços e apoio a minha
educação.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ser fonte inesgotável de luz que ilumina e
guia todos os meus passos. Por ter sido sustentação nestes anos de estudo
que direcionaram para a obtenção deste título.
Agradeço a toda minha família (apesar da distância), especialmente aos meus
pais, Marta e Rafael, ao meu irmão Marcinho e tios Adair, Mirtes, Meire e
Marcelo e à Lorenna pelo amor, pela força e motivação que dedicaram a mim,
muitas vezes sem nem saberem ao certo o que seria este trabalho.
A tia Aninha (sempre presente) , ao Juninho, ao Wagner, ao Reis e ao
Vinícius...vocês me possibilitaram o início e eu nunca esquecerei por
acreditarem, ampararem e investirem em mim.
Ao meu amorzinho Diego, que mesmo sem entender o meu trabalho e sem
saber rezar, me ajudou com seus pensamentos positivos, seu companheirismo,
suas horas de sono, com suas palavras de amor, conforto e incentivo. Você me
faz querer ser melhor a cada dia, como profissional e principalmente como
pessoa.
Ao Netinho, por todos estes anos de convivência, pelo apoio, amor e carinho.
Eu não poderia deixar de agradecê-lo, por tudo que vivemos. Você faz parte de
tudo isso e uma parte importante. Crescemos juntos e esta vitória também é
sua.
A minha querida orientadora, a Wi, que mais que orientar, foi como uma mãe
com seus valiosos conselhos que me fizeram crescer pessoal e
profissionalmente. Agradeço por todo carinho e amizade incondicionais, pois
sei que muitas vezes não os mereci. Pela alegria de trabalharmos juntas e pela
compreensão silenciosa dos momentos difíceis pelos quais passei, permitindo
que meu tempo interno fluísse, respeitosamente. A disponibilidade que sempre
manifestou e a empatia com que recebeu as minhas ideias foram o estímulo
que me permitiu vencer as inseguranças deste processo.
Ao professor Jürij Sobestiansky, por tentar corrigir minhas falhas e por me
apresentar ao Bordin, com certeza a melhor herança profissional que eu
poderia receber. Sei que o senhor só fez tudo isso porque, mesmo no seu jeito
alemão de ser, deseja-me o melhor.
Agradeço também à Anna Sobestiansky, pelas vezes que lhe roubei a
companhia do professor, por toda ajuda e pelos incômodos sem dia e nem
horários marcados que ela tão docemente compreendia.
Ao Professor Eugênio, por ser o ponto de equilíbrio e tranquilidade desta
equipe, sempre com saldo bancário e pensamentos positivos. Obrigada por
viii
compreender e perdoar minhas falhas, pelo auxílio, amizade e por ter me
recebido de maneira tão acolhedora na UFG.
Ao Professor André Kipnis. Faltam-me palavras para agradecer todo
conhecimento transmitido, a paciência e por ter aberto as portas de sua sala e
do seu laboratório. Levo comigo o seu exemplo de doação e amor a profissão
de ensinar.
As minhas amigas do laboratório, Dri, Du, Keiloca, Mari,Tatá e, em especial, a
Taty, com quem dividi todos os acontecimentos dessa dissertação. Eu poderia
dizer muitas coisas sobre vocês, mas tudo a ser dito está para sempre
guardado em nossos corações e em nossas memórias. Obrigada por todos os
momentos de alegrias e agonias. Mais que um título, a amizade de vocês foi o
maior presente que eu conquistei ao longo desta caminhada.
À Denise por plantar a sementinha da biologia molecular e da pesquisa com
meus óinc-óincs no Lab.
À Marília (Bá), Fábio (Filhote) e ao Adriano (Dri), meus queridos amigos de
todas as horas nesta jornada.
Aos colegas do Laboratório de Virologia Humana, Fabíola, Menira, Anna e
Tâmera e de Bacteriologia do IPTSP, Lorena, Aureliano, Aline e Vivi, pela
colaboração na obtenção dos resultados.
À Nutrial, em especial ao Marquinhos e à Vanessa, não só porque sem eles
este estudo seria mais difícil, mas pela amizade sincera que construímos. Muito
obrigada por tudo.
Aos produtores de suínos visitados, que gentilmente cederam sua atenção,
animais, a boia e um dedinho de prosa.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, pela oportunidade de
realizar este trabalho e conviver com profissionais que me mostraram o tipo de
pessoa e profissional que quero ser. Agradeço de maneira especial aos
professores Ana Paula, Cíntia, Auxiliadora, Guido e Valéria. Agradeço também
a todos os funcionários, principalmente ao Gerson e ao Tiago, e colegas que
contribuíram direta ou indiretamente para realização deste.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento e ao Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (CNPq/MAPA) pelo apoio financeiro e
bolsa concedidos.
ix
“Sede como os pássaros que, ao
pousarem um instante sobre ramos muito
leves, sentem-nos ceder, mas cantam!
Eles sabem que possuem asas...”
(Victor Hugo)
"É do buscar e não do achar que
nasce o que eu não conhecia."
(Clarice Lispector)
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO _______________________________________________ 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ____________________________________ 5
2.1 Circovírus suíno tipo 2 ________________________________________ 5
2.1.1 O circovírus suíno e seus aspectos moleculares __________________ 5
2.1.2 Histórico _________________________________________________ 7
2.1.3 Aspectos epidemiológicos ____________________________________ 9
2.1.4 Patogenia _______________________________________________ 12
2.1.5 Sinais clínicos e aspectos patológicos _________________________ 17
2.1.6 Diagnóstico ______________________________________________ 20
2.1.7 Controle e prevenção ______________________________________ 22
3. OBJETIVO _________________________________________________ 31
3.1 Objetivo Geral _____________________________________________ 31
3.2 Objetivos específicos ________________________________________ 31
4. MATERIAL E MÉTODOS ______________________________________ 32
4.1 Local e período de realização do experimento _____________________ 32
4.2 Material e população de estudo ________________________________ 32
4.3 Extração do DNA ___________________________________________ 35
4.4 Aplicação da técnica de PCR __________________________________ 37
4.4.1 Identificação do PCV2 ______________________________________ 37
4.4.2 Identificação do TTV1 e TTV2 ________________________________ 38
4.5 Análise dos resultados _______________________________________ 41
5. RESULTADOS ______________________________________________ 43
5.1 Material e população de estudo ________________________________ 43
5.2 Circovírus suíno tipo 2 _______________________________________ 46
5.2.1 Aspectos clínicos e das lesões macroscópicas ___________________ 46
5.2.2 Identificação do DNA do PCV2 _______________________________ 49
5.2.2.1 Identificação do DNA do PCV2 em amostras de soro ____________ 52
5.2.2.2 Identificação do DNA do PCV2 em amostras de suabes __________ 54
5.2.2.3 Identificação do DNA do PCV2 em amostras fecais _____________ 56
xi
5.2.2.4 Identificação do DNA do PCV2 em fragmentos de tecidos ________ 57
5.3 Validade dos testes diagnósticos _______________________________ 59
5.3.1 Soros __________________________________________________ 59
5.3.2 Suabes orais ____________________________________________ 59
5.3.3 Suabes nasais ___________________________________________ 60
5.3.4 Fezes __________________________________________________ 61
5.4 Identificação do TTV ________________________________________ 62
5.4.1 Coinfecção PCV2 e TTV ____________________________________ 62
6. DISCUSSÃO _______________________________________________ 65
7. CONCLUSÕES _____________________________________________ 72
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ____________________________________ 73
REFERÊNCIAS _______________________________________________ 75
xii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Representação esquemática do genoma circular do circovírus
suíno Tipo 1 (PCV1) (a) e Tipo 2 PCV2 (b) ___________________________ 6
FIGURA 2- Representação (vermelho) dos países em que a circovirose suína
foi relatada ____________________________________________________ 9
FIGURA 3 – Representação esquemática da estrutura genômica do TTV suíno
____________________________________________________________ 28
Figura 4- Identificação das microrregiões de Goiás segundo a produção de
suínos _______________________________________________________ 33
Figura 5 - Procedimento para coleta de amostras _____________________ 35
Figura 6- Diagrama dos métodos de extração de DNA utilizados _________ 36
FIGURA 7- Condições utilizadas para amplificar os fragmentos de TTV`s __ 40
FIGURA 8- Localização das granjas de criação intensiva de suínos do Estado
de Goiás selecionadas para coleta de amostras ______________________ 43
Figura 9 – Sistemas clássicos de produção de suínos __________________ 44
Figura 10- Sinais clínicos identificados na seleção de animais para coleta
de amostras __________________________________________________ 47
Figura 11: Achados macroscópicos ________________________________ 49
FIGURA 12- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de espécimes clínicos de suínos de sistemas intensivos de
criação ______________________________________________________ 50
FIGURA 13- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir dos soros de suínos de sistemas intensivos de criação ___ 52
FIGURA 14- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de suabes orais dos suínos de sistemas intensivos de criação
____________________________________________________________ 54
FIGURA 15- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de suabes nasais dos suínos de sistemas intensivos de
criação ______________________________________________________ 55
xiii
FIGURA 16- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de amostras fecais dos suínos de sistemas intensivos de
criação ______________________________________________________ 56
FIGURA 17- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de fragmentos de tecidos dos suínos de sistemas intensivos
de criação ____________________________________________________ 57
FIGURA 18- Frequência de positivos em relação ao tecido avaliado ______ 58
FIGURA 19- Reação de PCR para TTV1 a partir de soros de suínos de sistema
intensivo de criação ____________________________________________ 62
FIGURA 20- Reação de PCR para TTV2 a partir de soros de suínos de sistema
intensivo de criação ____________________________________________ 62
Figura 21- Resultados referentes a identificação de coinfecção entre o
circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e o torque teno vírus (TTV1, TTV2, TTV1/TTV2).
____________________________________________________________ 63
xiv
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1- Lesões macroscópicas mais frequentes associadas à circovirose
suína _______________________________________________________ 19
QUADRO 2- Sequência e posições de nucleotídeos dos iniciadores utilizados
nas reações de PCR para identificação do PCV2 _____________________ 37
QUADRO 3- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura
de reação ____________________________________________________ 38
QUADRO 4- Sequência dos iniciadores utilizados nas reações de PCR para
identificação dos TTV's _________________________________________ 39
QUADRO 5- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura
de reação para identificação do TTV1 ______________________________ 39
QUADRO 6- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura
de reação para identificação do TTV2 ______________________________ 40
QUADRO 7- Matriz de cálculos das principais medidas de risco __________ 41
QUADRO 8- Matriz de cálculos de correção da prevalência obtida com a
aplicação de um teste diagnóstico imperfeito _________________________ 42
QUADRO 9– Fatores de risco avaliados nas granjas de suinocultura intensiva e
associados à ocorrência de PCVAD _______________________________ 45
QUADRO 10 - Número de animais selecionados por exploração, faixa etária,
fases de criação, sexo e sinais clínicos _____________________________ 46
QUADRO 11- Positividade para PCV2 nos fragmentos de tecidos coletados dos
suínos de granjas de criação intensiva no Estado de Goiás, no período de
março de 2009 à janeiro de 2010 __________________________________ 58
xv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1– Prevalência de agentes bacterianos isolados em animais
infectados com PCV2 ___________________________________________ 14
TABELA 2- Frequência dos sinais clínicos observados nos suínos selecionados
em criações intensivas do Estado de Goiás no período de março de 2009 à
janeiro de 2010________________________________________________ 48
TABELA 3- Frequência dos sinais macroscópicos observados nos suínos
selecionados em criações intensivas do Estado de Goiás no período de março
de 2009 à janeiro de 2010 _______________________________________ 48
TABELA 4 - Distribuição dos resultados para PCV2 nos espécimes clínicos
coletados dos suínos de granjas de criação intensiva do Estado de Goiás,
segundo a fase de criação, manifestação clínica e sexo, no período de março
de 2009 à janeiro de 2010. _______________________________________ 51
TABELA 5- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos
para PCV2 nos soros dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de
Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010 _________________ 53
TABELA 6- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos
para PCV2 nos suabes orais e nasais dos suínos de granjas de criação
intensiva no Estado de Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010
____________________________________________________________ 55
TABELA 7- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos
para PCV2 nas fezes dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de
Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010 _________________ 57
TABELA 8- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com
soros de suínos _______________________________________________ 59
TABELA 9- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com
suabes orais de suínos _________________________________________ 60
Tabela 10- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com
suabes nasais de suínos ________________________________________ 60
TABELA 11- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com
fezes de suínos _______________________________________________ 61
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
AGS Associação goiana de suinocultores
BFDV Vírus da doença dos bicos e penas de galinhas e psitacídeos
BVDV Vírus da diarreia viral bovina
CAV Circovírus do canários
CE Comunidade Europeia
CS Circovirose suína
CsCl Cloreto de Césio
CoCV/PiCV Circovírus dos columbídeos ou pombos
CoGV Circovírus dos gansos
HEV Vírus da Hepatite E
ICTV Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus
MEM Meio mínimo essencial
ORF Quadros de leitura aberta
PCR Reação em cadeia pela polimerase
PCVAD Circovirose suína e doenças associadas
PCV Circovírus suíno
PCV1 Circovírus suíno tipo 1
PCV2 Circovírus suíno tipo 2
PERV Retrovírus Respiratório Endógeno Suíno
PEV Enterovírus suíno
PLHV-1 Herpesvírus linfotrópico suíno Tipo 1
PMWS Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome
PNP Pneumonia necrosante proliferativa
PPV Parvovírus suíno
PRCV Coronavírus respiratório suíno
PRRSV Vírus Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína
SDNS Síndrome da Dermatite e Nefropatia Suína
SIV Vírus da Influenza suína
SMDS Síndrome Multissistêmica do Definhamento do Leitão
xvii
TBE Solução tampão Tris- Borato- EDTA
TE Solução tampão Tris- EDTA
TEN Solução tampão Tris- EDTA- NaCl
TES Solução tampão Tris- EDTA-SDS
TGEV Vírus da Gastroenterite transmissível
TTV Torque teno vírus
TTV1 Torque teno vírus Tipo 1
TTV2 Torque teno vírus Tipo 2
VDA Vírus da doença de Aujeszky
xviii
RESUMO
O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) ocorre em todas as áreas produtoras de
suínos do mundo e suas manifestações clínicas são cada vez mais
reconhecidas como uma séria ameaça à suinocultura mundial. Vários estudos
tem indicado que a coinfecção de PCV2 com outros agentes, pode exacerbar
as doenças associadas ao vírus. Nos últimos anos, o torque teno vírus (TTV)
foi identificado em soros de suínos nas diferentes partes do mundo. Este
parece não ser patogênico para suínos. No entanto, pode potencializar as
manifestações clínicas causadas por PCV2. Assim, com o objetivo de verificar
a ocorrência de PCV2 e TTV (tipos 1 e 2) ou a coinfecção, em animais hígidos
e com manifestação clínica relacionada à PCVAD, em sistemas intensivos de
criação de suínos, diferentes espécimes clínicos foram analisados por meio da
técnica da reação em cadeia pela polimerase (PCR) com oligonucleotídeos
específicos para região da ORF2 do PCV2 e para os dois genótipos de TTV.
De um total de 368 espécimes clínicos que incluem soro, suabes nasais e
orais, fezes e tecidos, obtidas de suínos em fases de creche e recria, o DNA do
PCV2 foi identificado em 71% delas, com maior ocorrência (85%) nos animais
com alguma evidência clínica. Foi observada um maior índice de positividade
pontual nos animais de recria (74%) quando comparada aos índices referentes
à creche (67%). Também houve maior detecção nas fêmeas (71%) quando
comparado ao percentual de identificação viral nos machos (69%). Alguns
animais apresentaram positividade para o DNA viral em todos os espécimes
avaliados. Para o TTV, 47 amostras de soros foram analisadas por PCR e 47%
delas amplificaram fragmentos específicos para o TTV suíno, sendo 19%
corresponde ao TTV1, 32% positivas para o TTV2 e 13% para ambos os vírus.
A associação entre PCV2 e TTV foi verificada em 45% das amostras. O índice
de coinfecção nos suínos com PCVAD (76%) foi significativamente maior que o
observado nos animais sem evidência clínica (24%), com um destaque para a
coinfecção pelo TTV2 (38%) em relação àquela pelo TTV1 (33%) ou ambos
(29%). Este foi o primeiro estudo com amostras de suínos de sistema intensivo
de criação, em Goiás, a comprovar a presença dos dois vírus nos plantéis.
Além disso, os resultados apontaram que manifestações clínicas respiratórias
são os sinais mais comuns em infecções pelo PCV2.
Palavras-chave: coinfecção, doenças multifatoriais, PCV2, PCVAD, TTV
xix
ABSTRACT
The porcine circovirus type 2 (PCV2) occurs in all pig producing areas of the
world and its clinical manifestations are increasingly recognized as a serious
threat to the swine industry worldwide. Several studies have shown that coinfection of PCV2 with other agents may exacerbate the disease associated
with the virus. In recent years, the torque teno virus (TTV), was identified in sera
from pigs in different parts of the world. This appears not to be pathogenic for
pigs. However, you can enhance the clinical manifestations caused by PCV2.
Thus, in order to verify the occurrence of TTV and PCV2 (types 1 and 2) or
coinfection in healthy animals and clinical manifestation related to PCVAD in
intensive systems of rearing pigs, different clinical specimens were analyzed by
technique of polymerase chain reaction (PCR) with primers specific for the
region of ORF2 of PCV2 and the two genotypes of TTV. From a total of 368
clinical specimens including serum, nasal swabs and oral, feces and tissues
obtained from pigs in the nursery and recreates the PCV2 DNA was identified in
71% of them, with higher prevalence (85%) in animals with some clinical
evidence. We observed a higher rate of positivity in occasional rearing animals
(74%) compared to the indices relating to daycare (67%). There was also
greater detection in females (71%) compared to the percentage of viral
identification in males (69%). Some animals were positive for viral DNA in all
specimens evaluated. For the TTV, 47 serum samples were analyzed by PCR
and 47% of amplified fragments specific for porcine TTV, which corresponds to
TTV1 19%, 32% positive for TTV2 and 13% for both viruses. The association
between TTV and PCV2 was detected in 45% of samples. The rate of
coinfection with PCVAD in pigs (76%) was significantly higher than that
observed in animals with no clinical evidence (24%), with a highlight for the
coinfection TTV2 (38%) compared to that at TTV1 (33%) or both (29%). This
was the first study with samples of pigs from intensive system of creation, in
Goiás, to prove the presence of both viruses in herds. Furthermore, the results
showed that respiratory clinical manifestations are the most common signs in
PCV2 infections.
Keywords: coinfection, multifactorial diseases, PCV2, PCVAD, TTV
1
1. INTRODUÇÃO
Os resultados zootécnicos e os baixos custos de produção conferem
à suinocultura brasileira uma posição de destaque no cenário mundial.
Mudanças na estrutura produtiva do setor tais como a utilização de técnicas de
manejo intensivas, alterações no ambiente, aprimoramento da nutrição, uso de
animais geneticamente melhorados, aumento na densidade dos rebanhos e a
concentração da produção em algumas áreas geográficas, conduziram ao
crescimento da suinocultura como atividade econômica.
A pecuária goiana possui forte participação na economia nacional e
faz com que o Estado de Goiás figure entre os maiores produtores brasileiros,
sendo o quinto na produção em 2009 (IBGE, 2010) e o quarto maior exportador
brasileiro de suínos no ano de 2010 (ABIPECS, 2011).
O plantel suíno do Estado de Goiás é de 1.929.062 animais,
distribuídos de forma heterogênea entre 18 microrregiões. A região Sudoeste é
a maior produtora, com uma participação de 45,62% do efetivo total do Estado,
e a região da Chapada dos Veadeiros com cerca de 1% deste total, a que
representa a menor participação (GOIÁS, 2010).
O Centro-Oeste brasileiro, especialmente os Estados de Mato
Grosso e Goiás, tem recebido de empresas nacionais e multinacionais, novos
investimentos no setor. Tais aplicações na atividade suinícola elevaram o
rebanho da região, estimado em torno de dois milhões e meio de cabeças em
1998, para cerca de cinco milhões em 2009 (GIROTTO, 2006; IBGE, 2010).
Por outro lado, os desafios sanitários presentes na suinocultura
intensiva acompanham esta expansão. Num cenário mundial, no qual o
desenvolvimento da pecuária aponta para o aumento no trânsito de animais e
produtos entre países há uma maior facilidade para a emergência e
disseminação de doenças. Isso demanda maior atenção quanto à questão
sanitária dos rebanhos, uma vez que, algumas destas enfermidades, elevam os
custos de produção, podendo inclusive comprometer os lucros da atividade ou
até mesmo serem responsáveis pelo fechamento de mercados.
Entre estes desafios, a síndrome circovirose suína e doenças
associadas ou “porcine circovirus associated diseases” (PCVAD) tem sido
2
descrita em vários países e ocasionando um grande impacto econômico na
produção de suínos (SEGALÉS et al., 2005).
O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é reconhecido como o agente
essencial da PCVAD e é constantemente encontrado em rebanhos comerciais.
Sua detecção foi realizada em suídeos com e sem sintomatologia (MORÉS et
al., 2007).
O PCV2 foi descrito pela primeira vez no Canadá, em 1991 sendo,
mais tarde, identificado em países da Europa, Ásia, nas Américas, Oceania e
África, confirmando a sua ubiquidade (GRAU-ROMA et al., 2011).
No Brasil, o vírus foi descrito pela primeira vez no ano de 2000, no
Estado de Santa Catarina (CIACCI-ZANELLA et al., 2001) e, posteriormente,
nos Estados do Rio Grande do Sul, São Paulo, Minas Gerais, Bahia, Espírito
Santo e Paraná (PESCADOR et al., 2003; CASTRO et al., 2003; FRANÇA et
al., 2005; CHIARELLI-NETO et al., 2005; PINTO et al, 2003; BARBOSA et al.,
2005; CHIARELLI-NETO et al., 2007; CIACCI-ZANELLA et al., 2009a; DEZEN
et al., 2010).
Poucos são os dados existentes no Estado de Goiás. ARAÚJO et al.
(2002) relataram evidências clínicas de infecção, reforçadas pela identificação
de lesões compatíveis com PCV2, à necropsia e análise histopatológica dos
tecidos de suínos de um caso suspeito de circovirose. Em adição, fetos
mumificados e natimortos provenientes de granjas do Estado, com e sem
evidências de circovirose, também apontaram para a circulação do vírus na
região (ROCHA, 2007). E ainda, dados do Laboratório de Virologia Animal do
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de
Goiás (LVA/IPTSP/UFG) indicaram a presença do DNA de PCV2 em soros e
amostras de tecidos animais de criações extensivas (BARTHASSON, 2009).
O vírus pode determinar um complexo de manifestações clínicas que
envolvem a circovirose suína (CS) (HARDING et al., 1998), a síndrome da
dermatite e nefropatia suína (SDNS) (ROSSEL et al., 2000), doenças do
complexo respiratório suíno (KIM et al., 2003), a pneumonia necrosante
proliferativa (PNP), enteropatias, encefalopatias, distúrbios reprodutivos e
tremor congênito (ALLAN et al., 1998; LUKERT & ALLAN, 1999; HARDING et
3
al., 1998; HARDING, 2004; SEGALÉS et al., 2004; SEELIGER et al., 2007;
MATEUSEN et al., 2007; LEFEBVRE et al., 2008; BATISTA, 2009).
A
síndrome
da
circovirose
suína,
a
mais
importante
das
manifestações clínicas, é uma enfermidade multifatorial que leva à queda da
imunidade nos animais afetados. Além das perdas diretas provocadas pela
morte dos animais, a doença gera elevados prejuízos econômicos em função,
principalmente, da redução da conversão alimentar e da maior susceptibilidade
dos animais às infecções secundárias (BATISTA, 2009).
O papel do PCV2 neste complexo é claro em termos de sua
associação com as patologias. No entanto, a patogenia e imunogenicidade não
estão bem compreendidas. Ainda há dúvidas sobre a importância dele como
agente causal e à provável existência de outro agente principal para ocorrência
da enfermidade (ALLAN, 2007). Contribui para isto, o fato do vírus ser
cosmopolita e estar presente tanto em granjas afetadas ou não pela doença,
além de, até o momento, não existir um modelo consistente que reproduza a
progressão dos sinais clínicos após a inoculação experimental ou infecção
natural a campo (DONADEU & TUCKER, 2005; ALLAN, 2007; SEGALÉS,
2007a).
Em função desta incerteza com relação à etiologia e a necessidade
de múltiplos fatores para ocorrência da CS, o estudo de outros agentes que
possam estar de alguma forma associados ao PCV2 e a manifestação dos
sinais clínicos é de suma importância. Assim, nos últimos anos, o torque teno
vírus (TTV) tem sido identificado em soros de suínos em diferentes partes do
mundo (LEARY et al., 1999; OKAMOTO et al., 2002; McKEOWN et al., 2004;
JELCIC et al., 2004; BIGARRÉ et al., 2005; NIEL et al., 2005; KEKARAINEN et
al., 2006). Esse vírus parece ser não patogênico para suínos. No entanto,
alguns pesquisadores tem apontado o TTV como um potencializador das
manifestações clínicas causadas pelo PCV2. Estudos em suínos domésticos
mostraram que a infecção pelo TTV é mais comum em suínos afetados pela
CS que os não afetados (KEKARAINEN et al., 2006; ELLIS et al. 2008).
Dois genogrupos de TTV (TTV1 e TTV2) tem sido detectados em
suínos (NIEL et al., 2005), havendo poucas informações sobre a epidemiologia
da infecção por este vírus atualmente.
4
A identificação destes agentes poderá auxiliar no desenvolvimento
de métodos diagnósticos de rotina, bem como na compreensão da patogenia e
epidemiologia viral, possibilitando o direcionamento de estratégias para
controle e prevenção do complexo circovirose suína e doenças associadas, no
Estado e no Brasil.
Em face ao exposto, neste estudo objetivou-se identificar a presença
do PCV2 e do TTV em amostras provenientes de animais de criações
intensivas do Estado de Goiás, visando fornecer informações a respeito da
ocorrência e associação entre esses vírus.
5
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Circovírus suíno tipo 2
2.1.1 O circovírus suíno e seus aspectos moleculares
O circovírus suíno pertence ao gênero Circovírus da família
Circoviridae. De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus
(ICTV), este gênero compreende os circovírus suínos tipos 1 e 2 (PCV1 e
PCV2), o vírus da doença dos bicos e penas das galinhas e dos psitacídeos
(BFDV), o circovírus dos columbídeos ou pombos (CoCV/PiCV), circovírus dos
gansos (CoGV) e o circovírus dos canários (CAV) (TOOD et al., 2001).
Os circovírus são pequenos vírus não envelopados, com cerca de
17nm de diâmetro, capsídeos icosaédricos e possuem genoma DNA circular de
fita simples. É um dos menores genomas de vírus animais, com cerca de 1760
nucleotídeos (nt) (FINTERBUSCH & MANKERTZ, 2009).
O PCV é resistente à inativação pós-exposição a pH 3,0, clorofórmio
e a temperaturas entre 56°C e 70°C por 15 minutos. Possui densidade de
flutuação em CsCl de 1,33-1,34 g/mL e um gradiente de sedimentação
correspondente a 57S (ALLAN et al., 1994).
Os genomas do PCV1 e do PCV2 possuem 1759 pares de base (pb)
e 1768pb, respectivamente, com identidade de 65% a 76% entre eles
(BATISTA, 2009). Ambos possuem dois principais quadros de leitura aberta
("open reading frames" – ORF's), denominadas ORF1 e ORF2 (Figura 1). Além
destas, já foram mapeadas outras 10 ORF's (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12),
porém, com exceção da ORF3 que parece codificar proteínas que induzem a
apoptose das células infectadas, estas regiões não foram caracterizadas
(HAMEL et al., 1998; MANKERTZ et al., 2004; LIU et al., 2006).
A ORF1, com 945nt, codifica uma proteína com 315 aminoácidos
(aa) e é essencial para a replicação do DNA viral (proteína Rep). Há uma
identidade de 85% entre os nucleotídeos e de 86% na sequência de
6
aminoácidos da ORF1 entre os vírus PCV1 e PCV2 (HAMEL et al., 1998;
MANKERTZ et al., 2004).
FIGURA 1 - Representação esquemática do genoma circular do circovírus
suíno Tipo 1 (PCV1) (a) e Tipo 2 PCV2 (b)
Fonte: (a) SWISS INSTITUTE OF BIOINFORMATICS (2008); (b) DEZEN (2007)
A ORF2, com 699nt, codifica uma proteína estrutural com 30kDa,
composta por 233aa e formadora do capsídeo (proteína Cap) (MEEHAN et al,
1998; LUKERT & ALLAN, 1999; CHAE, 2004). A ORF2 é mais variável entre os
dois tipos virais, com identidade de 67% na sequência de nucleotídeos e de
65% na configuração dos aminoácidos (MOROZOV et al., 1998).
PCV1 é considerado um contaminante e é persistente em células
PK-15. A infecção experimental de neonatos não produziu sintomatologia
clínica e o vírus foi, portanto, considerado não patogênico para suínos.
Entretanto, o PCV2 tem sido frequentemente detectado em animais com
manifestações clínicas da síndrome circovirose suína e doenças associadas.
Ambos possuem um antígeno que pode ser distinguido por meio de técnicas
moleculares e sorológicas específicas tais como a PCR, hibridização in situ
e/ou imunohistoquímica (CHAE, 2004), sendo os dois vírus classificados como
duas espécies diferentes dentro do gênero Circovirus pelo ICTV (ALBINA et al.,
2001).
7
Por meio de análise filogenética, o PCV2 foi dividido em três
subgrupos, também chamados de genótipos, nos quais as principais diferenças
moleculares localizam-se na ORF2. Nesta ORF estão as mais elevadas taxas
de variação entre as amostras de PCV2 analisadas em todo mundo. A
identidade das sequências nucleotídicas é de, aproximadamente, 90% (HAMEL
et al., 2000; GRAU-ROMA et al., 2008). Nomenclatura utilizada na América do
Norte descrevia os genótipos em PCV2a, PCV2b, os quais eram classificados
pela Comunidade Europeia (CE) como PCV2 do grupo 2 e PCV2 do grupo 1,
respectivamente. Entretanto, o consórcio para estudos sobre a circovirose
suína da CE propôs que a nomenclatura norte-americana fosse admitida como
a classificação padrão (ROWLAND & HESSE, 2009). A análise de amostras
dinamarquesas de suínos infectados indica a presença de um terceiro
genótipo: o genótipo c (PCV2c) (DUPONT et al., 2008).
As últimas evidências indicam que as amostras originárias da Nova
Zelândia, da Tailândia e do Reino Unido possuam somente características do
genótipo b. Por sua vez, amostras com origem na Austrália, no Japão, no
Canadá, na Espanha, em Taiwan e na África do Sul possuam somente
características do genótipo a. Ainda, amostras da França, da Coréia, da
Hungria, da Áustria, da Alemanha, dos Estados Unidos e do Brasil
compartilham as duas sequências nucleotídicas, porém, não há evidências de
um ancestral comum (DONG-JUN et al., 2007).
2.1.2 Histórico
A circovirose suína (CS) foi descrita pela primeira vez, como
entidade clínica, em 1996, por meio do estudo de um surto ocorrido em 1991,
no Canadá. Os animais envolvidos no surto apresentavam sinais de
refugagem. O exame histopatológico de fragmentos de tecidos destes animais
revelou a presença de lesões linfoides que foram, primeiramente, associadas
ao vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS), porém todas as
análises para este vírus foram negativas (CLARK, 1997). No entanto,
similaridades foram observadas entre essas lesões com as produzidas pelo
8
circovírus aviário na Bursa de Fabricius. Nas lesões, foi também identificada
grande quantidade de antígenos de PCV (ALLAN et al., 1994; ALLAN,1996).
Em 1996, nos Estados Unidos, e no ano seguinte, no Canadá, a
doença
até
então
desconhecida,
foi
denominada
de
“postweaning
multisystemic wasting syndrome” (PMWS) ou síndrome multissistêmica do
definhamento dos suínos (SMDS) (DAFT et al., 1996; CLARK, 1997), sendo
circovirose suína (CS), a denominação mais correta. O termo síndrome da
refugagem multissistêmica, gerou, por muito tempo, debates sobre a utilização
de um termo tão inespecífico do ponto de vista etiológico, uma vez que,
doenças como as provocadas por Lawsonia intracellularis, Mycoplasma
hyopneumoniae, Haemophilus parasuis (e até mesmo intoxicações) cursam
com
a
síndrome
da
refugagem
(SEGALÉS, 2005). Assim,
dado o
estabelecimento internacional de critérios diagnósticos bem definidos para a
CS, atualmente a terminologia adotada é “porcine circovirus associated
diseases” (PCVAD) ou complexo da circovirose suína e doenças associadas
(SEGALÉS, 2007a).
Diferenças genômicas importantes entre os vírus encontrados nas
lesões provenientes dos casos de CS e daqueles presentes em células PK-15,
observadas após o sequenciamento genômico em 1998, estabeleceram uma
nova classificação para os mesmos, sendo o PCV1 relacionado às células da
linhagem PK-15 e o PCV2 à PMWS (HAMEL et al., 1998; MEEHAN et al.,
1998; MOZOROV et al., 1998).
As dúvidas quanto ao papel do PCV2 na indução da CS passaram a
ser menores quando, em 2004, surgiram as primeiras vacinas para o controle
da doença (CHARREYRE et al., 2005). Os resultados da utilização destas
vacinas na Europa e, principalmente, nos Estados Unidos mostraram uma
redução significativa da mortalidade e do número de animais refugos, fazendo
que com que, na atualidade, não existam dúvidas sobre o papel fundamental e
necessário do circovírus tipo 2 para o desenvolvimento da síndrome
(LATORRE & BAUTISTA, 2009).
Apesar da primeira descrição da CS ter ocorrido somente em 1996,
relatos de estudos retrospectivos, com amostras de tecidos parafinizados,
apontam para uma circulação viral ainda mais precoce: a partir de 1962, na
9
Alemanha (JACOBSEN et al., 2009); desde 1968, no Brasil (SILVA JÚNIOR et
al., 2009); desde 1985, no Japão (SATO et al., 2000); desde 1986, na Espanha
(RODRIGUEZ-ARRIOJA et al., 2003) e na Suíça (STAEBLER et al., 2005); e,
desde 1993, na Tailândia (KIATIPATTANASAKUL-BANLUNARA et al., 2002).
2.1.3 Aspectos epidemiológicos
A infecção pelo PCV2 é cosmopolita em suínos domésticos, sendo
relatada em todos os continentes (ALLAN et al., 1998a; ALLAN et al., 1999a;
ONUKI et al., 1999; CHOI et al., 2000; CIACCI-ZANELLA et al., 2001;
TRUJANO et al., 2001; RAYE et al., 2005). Contudo, isto não se correlaciona
necessariamente com a distribuição da CS em âmbito mundial (Figura 2).
Curiosamente, na Austrália, apesar da infecção estar presente, o processo
clínico ainda não foi descrito, gerando dúvidas sobre a baixa sensibilidade de
métodos de diagnóstico ou da ausência real da enfermidade (RAYE et al.,
2005; FINLAISON et al., 2007;SEGALÉS, 2007b).
FIGURA 2- Representação (vermelho) dos países em que a circovirose suína
foi relatada.
Fonte: GRAU-ROMA et al. (2011)
10
No Brasil, o vírus foi detectado pela primeira vez no ano de 2000, no
Estado de Santa Catarina (CIACCI-ZANELLA et al., 2001). Posteriormente, foi
descrito nos Estados do Rio Grande do Sul (PESCADOR et al., 2003), Paraná,
São Paulo (CASTRO et al., 2003), Rio de Janeiro (FRANÇA et al., 2005),
Espírito Santo (CHIARELLI-NETO et al., 2005), Minas Gerais (PINTO et al,
2003; BARBOSA et al., 2005) e Bahia (CHIARELLI-NETO et al., 2007).
Apesar dos estudos iniciais sugerirem que a infecção pelo PCV
possa ocorrer em humanos, bovinos e camundongos (TISCHER et al, 1995;
NAYAR et al, 1999), inquéritos sorológicos subsequentes não indicaram
evidência de infecção nessas espécies e outras (ALLAN et al, 2000b;. ELLIS et
al., 2000b, ELLIS et al., 2001). Infecção experimental de ovinos e coelhos com
PCV2 não resultou na soroconversão ou no desenvolvimento de lesões
(ALLAN et al, 2000b;. CASALMIGLIA et al, 2002). Embora o PCV2 possa
replicar e ser transmitido entre camundongos acredita-se que somente os
suídeos sejam susceptíveis à infecção pelo PCV2 e que outras espécies não
desempenhem nenhum papel na sua epidemiologia (KIUPEL et al., 2001;
OPRIESSNIG et al., 2009a). PCV2 pode causar circovirose em javalis (ELLIS
et al., 2003; SCHULZE et al., 2004; LIPEJ et al., 2007), mas a importância
epidemiológica desta infecção ainda não está clara (VICENTE et al., 2004).
Distintas vias de eliminação viral tem sido apontadas, incluindo
secreções nasais, muco traqueal, saliva, urina, fezes, leite, sêmen e secreções
oculares de animais soropositivos (SHIBATA et al., 2003; OPRIESSNIG et al.,
2007). Além disso, sabe-se que os animais que padecem de CS, além de
apresentarem uma carga viral significativamente superior no soro, também
excretam maior quantidade de vírus (OPRIESSNIG et al., 2008; PARK et al.,
2009, GRAU-ROMA et al., 2009; HA et al., 2009). Machos infectados com
PCV2 podem excretar o vírus no sêmen (KIM et al., 2003). MADSON et al
(2007) afirmam que a transmissão do vírus por esta via às porcas, pode não
ser suficiente para desencadear patologias, como uma infecção intrauterina
que provocasse a morte embrionária ou fetal, ou ainda desenvolvimento
posterior de CS nos fetos infectados.
A presença do PCV2 foi detectada por meio de reação em cadeia
pela polimerase (PCR) em colostro e leite de porcas infectadas natural e
11
experimentalmente (SHIBATA et al., 2006; HA et al., 2009). Por meio de
análises imuno-histoquímicas e de hibridização in situ, o vírus foi encontrado
também em tecido mamário e outros tecidos de porcas experimentalmente
infectadas, demonstrando ser esta uma fonte viável de transmissão (PARK et
al., 2009).
A rota de transmissão mais provável parece ser a via oronasal,
indicando que a transmissão horizontal (porca - leitão ou leitão - leitão) é muito
frequente. Leitões com duas semanas de idade, privados da ingestão de
colostro e livres de PRRS e vírus influenza, desenvolveram viremia sete dias
após a administração oral de tecidos, como o músculo esquelético, medula
óssea e linfonodos, infectados com partículas virais/antígenos de PCV2. Ao
exame histopatológico foram observadas depleções leves a moderada em
órgãos linfoides, demonstrando a efetividade da via oral na transmissão do
vírus (OPRIESSNIG et al., 2009a).
Pesquisas com porcas gestantes inoculadas com PCV2 são
escassas, mas tem mostrado que a infecção pode ser transmitida verticalmente
(PARK et al., 2005). Além disso, tem-se encontrado PCV2 em lesões
miocárdicas de leitões abortados (BRUNBORG et al., 2004; ROCHA, 2007). A
análise microscópica de fragmentos de tecidos de leitões com dois dias de
idade, provenientes do Estado do Rio Grande do Sul e com suspeita clínica de
CS apontaram para atrofia dos órgãos linfoides ou depleção de folículo linfoide
com infiltrado de macrófagos e células gigantes no baço, lesões estas
sugestivas de CS. O DNA de PCV2 foi detectado no “pool” de órgãos dos
leitões, porém na imunohistoquímica, somente um leitão foi positivo para PCV2
(CIACCI-ZANELLA et al., 2006). A ocorrência de PCV2 em leitões recémnascidos reforça a possibilidade da transmissão vertical do vírus.
Num período de dois a quatro meses o vírus é capaz de infectar
todos os animais de uma granja. Além disso, pode ser transmitido de um
animal enfermo para outro sadio, sugerindo ser altamente contagioso
(SEGALÉS, 2008a). Animais saudáveis infectados podem desenvolver
manifestações clínicas após quatro a cinco semanas (DUPONT et al., 2009;
KRISTENSEN et al., 2009).
12
2.1.4 Patogenia
Na tentativa de esclarecer o papel do PCV2 na patogenia do
PCVAD, modelos com infecções experimentais pelo PCV2 provocando sinais
clínicos da CS levaram à aceitação de que o vírus é o agente causal do
complexo (ALLAN et al., 2004).
O PCV2 possui a capacidade de infectar células de origem epitelial,
endotelial e mielóide, o que ajuda a explicar a vasta distribuição tecidual do
vírus e das suas manifestações clínicas O antígeno viral está presente em
órgãos de suínos como linfonodos, amígdalas, pulmões, baço, rins, pele e
fígado (STEINER et al., 2008).
O vírus infecta células de sistema imune como macrófagos, linfócitos
e células dendríticas e se replica em vários tipos celulares, preferencialmente
células em divisão celular ativa. Após a replicação e infecção de células do
sistema imune, o PCV2 causa viremia e é distribuído no organismo do suíno.
Devido à inabilidade do animal infetado em elaborar uma resposta imune
satisfatória, o PCV2 pode infectar as células permissivas nos órgãos alvo,
causar lesões e agravar o quadro clínico. Um desequilíbrio nas substâncias
mediadoras da imunidade, morte celular de linfócitos, falha na reposição de
células linfoides colaboram para esta imunodeficiência (STEINER et al., 2008).
Análises
de
citometria
de
fluxo
demonstraram
que
suínos
acometidos pela CS apresentam alterações nas populações de células
mononucleares periféricas. Durante a infecção ocorre um aumento em
monócitos, porém uma redução em linfócitos T (CD4+) e linfócitos B, e a
presença de granulócitos imaturos de baixa densidade, sugerindo uma
inabilidade transitória dos suínos afetados em conseguir uma resposta imune
eficaz (OPRIESSNIG et al., 2007).
O mecanismo exato de ação do PCV2 e sua interação com outros
patógenos e fatores não infecciosos necessitam de maiores esclarecimentos.
Presume-se que a patogenia desta síndrome seja bastante complexa (ALLAN
et al., 2004) e que a estimulação antigênica proporcionada pelos múltiplos
fatores, infecciosos ou não, aumenta o número de células entrando na fase S
13
do ciclo celular, condição necessária para replicação do PCV2 (ELLIS et al.,
1998; KRAKOWKA et al., 2000).
O grau de suscetibilidade à PCVAD é desconhecido, sendo que a
maioria dos animais não apresenta nenhuma manifestação clínica (QUINTANA
et al., 2001). Ainda não está claro porque alguns leitões adoecem e outros,
mesmo infectados, não apresentam a doença. Sabe-se que animais com
infecção inaparente tem no organismo uma carga viral menor do que aqueles
com a CS, além de menores títulos de anticorpos neutralizantes para o PCV2
(LÓPEZ-SORIA et al., 2004; OPRIESSNIG et al., 2008).
Para o completo desenvolvimento da CS, alguns autores sugerem
que exista a necessidade de coinfecções (ALLAN et al., 1999b; CHOI e CHAE,
2001; HARMS et al., 2001) ou cofatores estimulatórios do sistema imune
(KRAKOWKA et al., 2001). São ainda citados fatores relacionados à
diversidade genética entre os isolados do PCV2 (OPRIESSNIG et al., 2006) e a
predisposição ou resistência de algumas raças suínas e mesmo de suídeos ao
agente (LÓPEZ-SORIA et al., 2004; OPRIESSNIG et al., 2009a).
Em um estudo para avaliar a coinfecção, leitões gnotobióticos foram
infectados com PCV1, PCV2 e PPV, isolados ou em combinação. Os animais
inoculados somente com o PCV2 não desenvolveram a doença clínica. Animais
coinfectados com PCV2 e PPV apresentaram doença clínica severa e lesões
macroscópicas da CS (KRAKOWKA et al., 2000).
Nas propriedades onde CS é relatada, geralmente, observa-se a
associação entre o PCV2 e outros vírus e/ou bactérias que intensificam os
sinais
clínicos
da
doença,
dificultando
a
sua
identificação.
Vários
microrganismos estão implicados nesta hipótese, tais como o parvovírus suíno
(PPV), o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), vírus da
hepatite E (HEV), vírus da doença de Aujeszky (VDA) e mais recentemente, o
torque teno vírus (TTV) (ALLAN et al., 1999a; CHOI & CHAE, 2001; HARMS et
al., 2001, ELLIS et al., 2004; FERNANDES et al., 2006; KEKARAINEN et al.,
2006).
O TTV, similarmente ao PCV2, é cosmopolita em criações de suínos
(McKEOWN et al., 2004). Pesquisas visando entender o papel deste vírus na
etiopatogenia da CS demonstram que os animais com ele infectados são mais
14
susceptíveis à doença (KEKARAINEN et al., 2006; TEIXEIRA, 2008), tendo
sido encontrado em 97% das amostras de animais com diagnóstico positivo e
em 78% das amostras de animais negativos para CS (KEKARAINEN et al.,
2006).
POGRANICHNIY et al. (2002) efetuaram um estudo em suínos
saudáveis
e
naqueles
com
histórico
clínico
e
lesões
microscópicas
características da CS. Foram testados os vírus PCV2, PRRSV, enterovírus
suíno (PEV), vírus influenza suíno (SIV), coronavírus respiratório suíno
(PRCV), vírus da gastroenterite transmissível (TGEV), retrovírus endógeno
suíno (PERV), herpesvírus linfotrópico suíno Tipo 1 (PLHV-1) e o vírus da
diarreia viral bovina (BVDV), tendo o PCV2 apresentado maior correlação com
a CS. Além disso, os animais apresentaram maior risco de desenvolver a
síndrome quando estavam coinfectados com PCV2 e PRRSV.
Um estudo feito por RISTOW et al. (2007) em 46 granjas brasileiras,
em seis Estados da federação, caracterizou as bactérias mais frequentemente
associadas ao PCV2 em animais positivos para circovirose suína (Tabela 1).
TABELA 1– Prevalência de agentes bacterianos isolados em animais
infectados com PCV2
Bactéria
%
Bactéria
%
Streptococcus suis
97,80
E. coli beta hemolytic
8,69
E. coli gamma hemolytic
52,17
Clostridium sp.
4,34
Bordetella bronchiseptica
41,30
E. coli alpha hemolytic
2,17
Haemophilus parasuis
28,30
Salmonella sp.
2,17
Pasteurella multocida
15,20
Fonte: RISTOW et al.(2007)
15
A reprodução mais consistente da CS tem sido obtida não só com a
utilização de cofatores infecciosos, mas também de não infecciosos.
Apesar de ter sido demonstrado, em modelos experimentais
inoculados com PCV2, que a aplicação de vacinas que contenham adjuvante
oleoso como imunoestimulantes, favoreça a manifestação clínica da CS
(ALLAN et al., 2000; KRAKOWKA et al., 2001; OPRIESSNIG et al., 2003),
estudos utilizando protocolos similares, em suínos convencionais, obtiveram
um resultado diferente (LADEKJAER-MIKKELSEN et al., 2002, RESENDES et
al., 2004). De acordo ALLAN et al. (2007) e evidências epidemiológicas na
Holanda (DE JONG et al., 2003), foi ainda proposto que o uso de vacinas vivas
modificadas, para controle e prevenção da PRRS,
pode potencializar a
infecção por PCV2 em suínos. Estas observações indicam a necessidade de
mais pesquisas para verificar em quais circunstâncias a imunoestimulação
amplifica os efeitos da infecção por PCV2. Entretanto, até o momento, é
preconizado evitar a vacinação habitual de suínos que possam estar
convalescendo de circovirose (SEGALÉS, 2005).
A diversidade e evolução do PCV2 são também fatores que podem
estar relacionadas à emergência da CS no mundo e por este motivo a
caracterização molecular do PCV2 tem sido o objeto de investigação em vários
países (ALLAN et al., 1998; FENAUX et al., 2000; SATO et al., 2000; CIACCIZANELLA et al., 2001; WANG et al., 2004; CASTRO, 2005; CHIARELLI NETO
et al., 2007; HESSE et al., 2008).
O PCV2a é considerado o mais antigo do ponto de vista evolutivo
(GRAU-ROMA et al., 2008). Alguns estudos indicam que o genótipo PCV2b
apresenta ocorrência nas infecções naturais (ALLAN et al., 2007; CHIARELLINETO et al., 2009; DUPONT et al., 2008; TAKAHAGI et al., 2009; TIMMUSK et
al., 2008; CORTEY et al., 2010). Segundo SEGALÉS (2007b), este fato pode
estar relacionado a uma maior virulência do genótipo PCV2b e pode ser
creditada em função de dois indícios: 1) os casos de aparição epizoótica na
América do Norte muito marcado pela prevalência deste; 2) um estudo
realizado
em
2007
(SEGALÉS,
2007b),
na
Europa,
que
associa
sistematicamente o genótipo b à existência de enfermidade, o que não ocorre
com o genótipo a.
16
Investigações epidemiológicas dos surtos ocorridos no final da
década de 90 na Europa e Sudeste Asiático e, em 2004-2005, nas Américas do
Norte e do Sul sugerem que PCV2a, potencialmente menos virulento, teria sido
o genótipo mais frequente durante muito tempo, representando os casos
esporádicos da enfermidade ocorridos entre os anos de 1993 a 1996. O
surgimento de um genótipo mais patogênico, presumidamente o PCV2b,
poderia ter sido o responsável pela emergência dos surtos ocorridos entre 1997
e 2006 (DUPONT et al., 2008).
Amostras dinamarquesas de tecidos suínos obtidas nos anos de
1980, 1987 e 1990 foram enquadradas no genótipo C. O PCV2c foi detectado
somente na Dinamarca e apresentou a menor patogenicidade dentre os três
genótipos conhecidos até o momento. Isto sugere que houve um aumento
gradativo da patogenicidade, desde os anos 80 até a atualidade, que segue a
sequência genotípica c, a e b (DUPONT et al., 2008).
Visando
elucidar
o
papel
da
genética
suína
na
susceptibilidade/resistência à circovirose, estudos envolvendo a avaliação dos
sinais clínicos, anatomopatológicos e moleculares das diferentes linhagens de
suínos foram desenvolvidos. Os resultados foram semelhantes entre os
autores, inferindo que há diferenças entre as linhagens frente ao PCV2, sendo
que animais da linhagem Landrace foram mais susceptíveis em desenvolver os
sinais da doença que suínos das linhagens Duroc e Large White (ROSE et al.,
2003; LÓPEZ-SORIA et al., 2004; OPRIESSNIG et al., 2009a).
Uma hipótese que poderia justificar a maior ou menor predisposição
das linhagens suínas ao PCV2 é a existência de diferentes mecanismos de
resposta imunológica ou alterações genéticas relacionadas a essas respostas.
No entanto, pouco se sabe sobre a relação do PCV2 com seu hospedeiro
quanto à ativação do sistema imune. A habilidade do vírus de se replicar e
persistir por um longo tempo no organismo indica falha na resposta imune do
indivíduo em reconhecer ou remover as partículas virais e as células infectadas
(MEERTS et al., 2006).
17
2.1.5 Sinais clínicos e aspectos patológicos
Entre o final da década de 90 até os meados de 2003, a circovirose
suína se manifestava por um significativo incremento da mortalidade e retardo
no crescimento de suínos em um número elevado de granjas em todo mundo.
Estes percentuais, hoje, são menores e em um número limitado de granjas,
não significando, entretanto, que não haja granjas com elevados índices de
mortalidade e animais refugos (SEGALÉS, 2008a).
Segundo CIACCI-ZANELLA et al. (2006), no Brasil estas novas
manifestações incluem mudanças tanto na severidade dos sinais clínicos
quanto na fase em que são observadas, sendo atualmente percebidas não só
na fase de creche, mas no período de crescimento-terminação e, até mesmo,
na maternidade.
O vírus é detectado em praticamente todas as faixas etárias, ainda
que o pico de infecção se encontre entre a 6ª e a 14ª semana de vida, sendo
pouco frequente em idades menores (SIBILA et al., 2004).
A circovirose inclui síndromes com diferentes manifestações clínicas
e lesionais, apesar de estar geralmente associada à elevada mortalidade,
atraso no crescimento, aumento no tamanho dos linfonodos, palidez corpórea,
dispneia (na maioria das vezes associada à PRRSV, vírus influenza e ao
Mycoplasma hyopneumoniae), diarreia (semelhante à apresentada pela ileíte
subaguda ou crônica), pelo opaco e arrepiado e, ocasionalmente, icterícia.
Entretanto, estes sinais clínicos podem não ser vistos em todos os animais
afetados pela CS, que na maioria das vezes se apresenta na forma inaparente
(ALLAN, 2007; BATISTA, 2009).
Além
da
apresentação
habitual
com
elevada
morbidade
e
mortalidade, com quadros claros de refugagem, há apresentações onde as
evidências clínicas não são tão nítidas (SAUCE et al., 2009). Assim, é possível
que na mesma granja haja animais com evidências de um processo
respiratório, outros com diarreia, outros com morte por úlcera gástrica e outros
cuja morte não apresenta explicação aparente (SEGALÉS, 2008a). Isto ocorre
porque, provavelmente, os mecanismos de interação com agentes ou outros
18
fatores não infecciosos são desconhecidos e, na sua maioria, dificultam o
diagnóstico (SAUCE et al., 2009).
Também é necessário destacar que a aparição do processo clínico
tende a ter um caráter individual e que os animais enfermos podem apresentar
sinais irregulares dentro de uma mesma criação, sendo comum encontrar
animais doentes e sadios em uma mesma baia. Portanto, é sugerido que exista
também uma susceptibilidade individual, provavelmente de origem genética
(SEGALÉS, 2008a).
Cabe lembrar que a circovirose suína é uma enfermidade
multifatorial e o fator genético deve ser encarado como um fator há mais na
dinâmica da infecção. No fim, a expressão clínica em uma granja afetada pela
doença será aquela que reúne o conjunto das distintas enfermidades
presentes, com um domínio de animais com atraso no crescimento e elevada
mortalidade (SEGALÉS, 2008a).
O PCV2 tem sido associado a um conjunto de outras enfermidades
além da circovirose, tais como: a síndrome da dermatite e nefropatia suína,
doenças do complexo respiratório suíno, a pneumonia necrosante proliferativa,
enteropatias, encefalopatias, distúrbios reprodutivos e tremor congênito
(ALLAN et al., 1998; LUKERT & ALLAN, 1999; HARDING et al., 1998; ROSSEL
et al., 2000; KIM et al., 2003; SEELIGER et al., 2007; MATEUSEN et al., 2007;
LEFEBVRE et al., 2008; BATISTA, 2009). Os sinais clínicos associados a
problemas
reprodutivos
devem
incluir
abortos
e/ou
natimortos
e/ou
mumificados (ALLAN, 2007).
As lesões macroscópicas mais importantes encontradas em animais
com CS são: hipertrofia de linfonodos (sendo mais frequentes nos linfonodos
mesentéricos, mediastínicos, inguinais e submandibulares), atrofia de timo, e
pulmão não colapsado que pode apresentar ou não áreas disseminadas de
hepatização vermelha. Hipotrofia e áreas descoloridas ou com pontos brancos
podem aparecer em fígados ictéricos. Pontos brancos multifocais puntiformes
ou difusos podem ser observados na superfície renal. Em animais com morte
súbita é comum a ocorrência de úlcera gastroesofágica, responsável pela
hemorragia interna que produz um quadro de palidez de pele e mucosas, mas
não se sabe se estas ocorrem por ação direta do PCV2 (Quadro 1) (SEGALÉS
19
et al., 2004; ALLAN, 2007; MORÉS et al., 2007; SEGALÉS, 2008a). Outras
lesões como poliserosite, consolidação pulmonar, colite, pneumonia intersticial
e enterite, são encontradas dependendo das infecções intercorrentes
observadas (SEGALÉS et al., 2004). No Brasil, as mais comuns são as
poliserosites e colites. Lesões de pele (manchas avermelhadas) podem ser
observadas em alguns casos (MORÉS et al., 2007). SEGALÉS (2008a) cita,
ainda, a ocorrência de atrofia da serosa com edemaciação da gordura, infartos
no baço e atrofia hepática ou hepatomegalia, com icterícia ocasional.
QUADRO 1- Lesões macroscópicas mais frequentes associadas à circovirose
suína
Achado macroscópico
Interpretação
Espinha dorsal marcada
Emagrecimento progressivo geralmente presente
nas infecções por PCV2
Linfadenopatia regional
ou generalizada
Achado característico da infecção pelo PCV2 em
animais que desenvolvem clinicamente a
circovirose suína
Pulmões não-colapsados
Sugere uma pneumonia intersticial comumente
associada a outros agentes concomitantes
Edemaciação
Gelatinização da gordura devido à mobilização da
mesma das reservas do animal com perda
progressiva de peso
Rins com pontos brancos
multifocais
Sugere nefrite intersticial. É uma lesão
habitualmente associada ao PCV2 mas pode ser
devido à outra enfermidade
Atrofia hepática/
hepatomegalia
Manifestação ocasional em animais que
desenvolvem a circovirose suína e apresentam
icterícia
Fonte: Adaptado de SEGALÉS (2008a)
A principal lesão histológica observada consiste em depleção de
linfócitos em um grau variável, com perda de folículos e associação à presença
de infiltrados histiocitários de células multinucleares gigantes nos órgãos
linfoides com distribuição multifocal a difusa (ALLAN, 2007).
Além disso, tem sido descrita a inflamação granulomatosa
disseminada em um ou mais tecidos, tais como baço, timo, intestino, nódulos
20
linfáticos e pulmão ocasionando pneumonia intersticial, hepatite, nefrite
intersticial/glomerulonefrite e pancreatite. Nas inflamações observadas nestes
órgãos, há um predomínio de macrófagos mononucleares, às vezes formando
células multinucleadas. Dependendo da fase evolutiva da doença podem ser
observados corpúsculos de inclusão basofílicos intracitoplasmáticos nos
macrófagos, principalmente nos órgãos linfoides (BATISTA, 2009).
Vale ressaltar que os sinais clínicos, os achados macro e
microscópicos apontam somente indícios mais ou menos consistentes, de que
a manifestação pode se tratar de CS. É certo que, quanto mais evidente o
quadro clínico e quanto maior o número de animais com lesões associadas de
forma direta à enfermidade, maior a possibilidade de ser a doença (ALLAN,
2007).
2.1.6 Diagnóstico
Os critérios para o diagnóstico individual da CS e aceitos
internacionalmente, são baseados em sinais clínicos e lesões típicas
associadas ao isolamento do PCV2 (ALLAN, 2007).
É
reconhecido
que
um
suíno,
como
indivíduo,
padece
especificamente de CS, quando apresenta sinais clínicos caracterizados por
atraso no crescimento e/ou alterações respiratórias / digestivas, lesões macro e
microscópicas características em órgãos linfoides (linfadenopatias e marcada
depleção linfocitária com infiltração histiocitária) e presença do DNA de PCV2,
em quantidade moderada a elevada, em lesões linfoides (SEGALÉS, 2008a).
Uma questão a ser levantada é o fato de alguns animais
desenvolverem a forma crônica da doença de maneira que as lesões
microscópicas nos órgãos linfoides podem ser consideradas leves ou
inexistentes, o que não permitiria o diagnóstico. Para evitar esta situação, no
diagnóstico individual de circovirose é recomendado examinar animais na fase
mais aguda ou subaguda do processo, sendo avaliado o maior número
possível de animais (ALLAN, 2007).
21
É sabido que uma granja com bons índices produtivos podem ter
casos esporádicos da enfermidade. Assim, para se estabelecer um
“diagnóstico de granja” deve-se relacionar a análise individual dos animais com
a situação epidemiológica da exploração (SEGALÉS, 2008a).
ALLAN (2007) destaca que o aumento excessivo do índice de
mortalidade e de refugos, em comparação com o nível histórico de uma granja,
permite diagnosticar um caso de rebanho. Segundo esse mesmo autor,
existem duas condições para o reconhecimento deste aumento:
1) Quando há registros de mortes de animais na propriedade, a
elevação do coeficiente pode ser reconhecida quando o número atual desta for
superior, em 1,66 x desvio padrão, à média dos níveis históricos anteriores, ou
seja, a mortalidade é a prevalência de mortes dentro de um período de tempo
específico (geralmente de três meses);
2) Quando não há registros, um aumento de mortalidade no rebanho
superior em 50% ao nível nacional ou regional é considerado indicativo de CS.
No Brasil, o índice de mortalidade média aceitável na fase de creche é de 1%
(SOBESTIANSKY, 2007).
Além de aumento significativo na mortalidade e dos sinais clínicos
compatíveis com a CS, para que se estabeleça um diagnóstico de rebanho é
necessário que seja realizado o diagnóstico individual, em pelo menos cinco
animais por rebanho. Um rebanho é considerado positivo para circovirose
quando os achados macro e microscópicos indicativos da doença e a detecção
do genoma viral estiverem presentes ao mesmo tempo em pelo menos um dos
animais necropsiados (SEGALÉS, 2008a).
É conveniente enfatizar que, animais com retardo no crescimento
não são necessariamente animais com CS, assim como um diagnóstico
negativo não descarta a possibilidade de existência da doença em uma granja.
Isto revela a importância do estabelecimento de diagnósticos diferenciais e da
avaliação da situação epidemiológica de cada propriedade. No diagnóstico
diferencial as doenças mais comumente avaliadas são a síndrome reprodutiva
e
respiratória
suína
(PRRS),
enfermidades
respiratórias
inespecíficas,
colibacilose pós-desmame, ileíte proliferativa, úlcera gástrica, disenteria suína,
22
colite
espiroquetal,
eperitrozoonose
e
intoxicações
por
desinfetantes
(SEGALÉS, 2008b).
Devido à dificuldade de isolamento do PCV2 em cultivos celulares,
uma vez que o vírus não produz efeito citopático, um grande número de
estudos para identificação do agente tem sido conduzido com métodos que
visem à detecção do DNA ou antígenos virais (ALLAN & ELLIS, 2000). Para
análise e correlação da presença do PCV2 nos tecidos e as lesões histológicas
encontradas, técnicas como a imunohistoquímica (IHQ) e a hibridização in situ
(HIS) tem sido empregadas (CHAE, 2004). Apesar de ser uma técnica bastante
sensível, a IHQ possui limitação devido à dificuldade de produção de
anticorpos monoclonais para sua realização (MCNEILLY et al., 1999).
A reação em cadeia pela polimerase (PCR) tem sido adotada para
identificar fragmentos específicos do DNA de PCV2 em amostras como
sangue, soro, secreções oronasais e oculares, fezes, urina, leite, sêmen e
tecidos fixados em formol, o que permitiu a realização de estudos
retrospectivos para PCV2 (ROSELL et al., 2000; KIM & CHAE, 2001;
FERNANDES et al., 2006). A elevada sensibilidade, a especificidade, a
facilidade de execução e a análise de grande número de amostras
simultaneamente, sendo capaz de detectar um único vírus mesmo na presença
de outros microrganismos, fazem dessa técnica uma opção atrativa para
estudos epidemiológicos e para caracterização de microrganismos causadores
de doenças. Uma das vantagens sobre outras técnicas, é que ela se constitui
como excelente ferramenta de indicação de infecção em rebanhos, o que
permite tomar as medidas necessárias para evitar a transmissão do agente e
reduzir ou eliminar a apresentação da doença (MANKERTZ et al., 2000).
2.1.7 Controle e prevenção
O comprometimento do sistema imune em animais acometidos pela
CS e a utilização de práticas inadequadas de manejo predispõem à severidade
da doença. O conhecimento destes fatos fez com que, em 2000, um programa
conhecido por “20 pontos de Madec”, ganhasse destaque. Este se refere
23
basicamente a melhorias na higiene, nas condições ambientais e para redução
de estresse aos animais. As recomendações incluem: manejo do tipo “todos
dentro, todos fora”, desinfecção, contato limitado com os animais, não misturar
lotes, isolamento ou a eutanásia de animais doentes; a manutenção da
temperatura ideal, do fluxo de ar e espaço dentro das baias e adequada
utilização de tratamentos antiparasitários e vacinação, entre outras (MADEC et
al., 2000). As medidas relatadas se mostraram efetivas à prevenção da maioria
das doenças multifatoriais e crônicas levando ao importante aprendizado de
produzir animais com boas práticas de criação, sendo esta a maior contribuição
da CS, já que as medidas passaram a ser aplicadas e consideradas após a
disseminação da doença e seus prejuízos nos plantéis em todo mundo.
No entanto, como já citado anteriormente, é sabido que a CS pode
estar presente em propriedades com bons índices zootécnicos e que possuam
boas práticas de produção devido à existência de múltiplos fatores
desencadeantes (FINTERBUSCH & MANKERTZ, 2009). Por meio de outro
estudo, Madec apontou os principais fatores de risco relacionados ao
desenvolvimento da doença. Assim, foi concluído que os leitões desmamados
com idade inferior a 21 dias, também aqueles provenientes de matrizes com
lesões decorridas de aplicação incorreta de injeções, bem naqueles em que há
presença de coinfecções são mais susceptíveis à infecção e manifestação
clínica (ROSE et al., 2007).
O controle de doenças consideradas multifatoriais, como é o caso da
CS, deve ter também um enfoque multifatorial (SEGALÉS, 2005). Além da
adoção de programas de melhoria na higiene e redução do estresse dos
animais, também são sugeridas outras estratégias que minimizem os fatores de
risco para sua ocorrência (ALLAN et al., 2007). As estratégias mais relevantes
se relacionam ao controle de enfermidades concomitantes, estimulação do
sistema imune, estado de infecção e nível de anticorpos da fêmea frente ao
PCV2 no momento do parto, nutrição, características genéticas dos animais e
vacinação (SEGALÉS, 2005; ALLAN, 2007; BATISTA, 2009).
Dentre as medidas, o controle das enfermidades concomitantes é
considerado o segundo ponto mais importante para redução do impacto da
doença. Diante da complexidade patológica existente hoje nas granjas, é
24
fundamental que ferramentas diagnósticas adequadas sejam usadas para
confirmação de qual enfermidade está ocorrendo (SEGALÉS, 2008b).
Diagnosticada a doença concomitante, o controle da mesma deve
apoiar-se em medidas efetivas, já descritas anteriormente. Nos Estados
Unidos, por exemplo, HALBUR & OPRIESSNIG (2006a; 2006b) afirmam que a
vacinação de animais em fase de terminação contra o PPV, reduziu a
severidade e a ocorrência da CS.
Como o sêmen continua a ser uma potencial fonte de transmissão
do PCV2 (MAES et al, 2008;. MADSON et al, 2007), as centrais de
inseminação artificial devem atentar para utilização de material livre desse e
outros patógenos (MAES et al., 2008).
O estado infeccioso e sorológico das fêmeas no momento do parto
são outros fatores que devem ser considerados. Acredita-se que a imunidade
materna proteja os leitões em relação ao desenvolvimento da síndrome
(RODRÍGUEZ-ARRIOJA et al., 2002; LAROCHELLE et al., 2003; SIBILA et
al.,2004). Assim, é indicado que haja redução da viremia no período periparto e
que os títulos de anticorpos contra PCV sejam incrementados nas fêmeas, o
que pode ser alcançado com o uso de vacinas frente ao PCV2 nas fêmeas ou
com uma infecção controlada em áreas de adaptação de leitoas (SEGALÉS,
2005). Neste sentido, antes da disponibilidade de vacinas comerciais, a
soroterapia foi amplamente utilizada em rebanhos europeus para controle de
PCVAD (OPRIESSNIG et al., 2008). Uma vez colhido ao abate, o sangue
proveniente de matrizes descartadas ou suínos terminados acometidos ou
recuperados de infecção pelo PCV2 era processado para separação do soro e
tratamento pelo calor e injetados intraperitonealmente em leitões ao desmame,
levando a redução de 3 a 10% nos índices de mortalidade. Todavia, as
incertezas quanto as variações no título de anticorpos ou a possibilidade de
veiculação de doenças, bem como as dificuldades de obtenção, conservação e
aplicação do soro desencorajou a utilização desta medida (BARCELLOS,
2006).
Outra alternativa ao controle da CS foi a utilização de plasma suíno
ultrafiltrado pelo método "spray dry" em rações para estes animais na fase de
creche. As publicações existentes indicam que a utilização do plasma "spray-
25
dried" (SDP) melhora os parâmetros produtivos e a saúde e bem-estar de
animais afetados com algumas doenças comuns em suíno, como a CS. O
modo de ação está relacionado à presença de imunoglobulinas, peptídeos,
fatores de crescimento e outros nutrientes com atividade biológica que levam
ao melhor consumo, crescimento e produtividade dos leitões
(COFFEY E
CROMWELL, 2001; VAN DIJK et al., 2001). PUJOLS et al. (2008)
demonstraram que rações contendo 6% de inclusão de plasma promoveram
uma maior imunização do rebanho que não apresentou sinal clínico de doença
em nenhum dos animais avaliados e não havia soroconversão para o PCV2.
Além disso, MORÉS et al. (2007) avaliando o efeito da administração de SDP
em uma granja que apresentava problemas de CS com mortalidade acima de
5% em leitões em crescimento e com presença PCV-2 demonstrada por
análise laboratorial, observaram aos 66 dias de idade dos suínos que, quando
SDP foi incluído nas dietas de desmame e crescimento, os leitões cresceram
mais rápido, atingindo 1,92 kg a mais que os controles que não receberam
plasma nas dietas. Também, foi observada redução significativa no número de
animais que apresentaram sinais clínicos de PCVAD aos 94 dias de idade.
Atualmente, a utilização de SDP na nutrição animal tem sido encarada como
uma alternativa ao uso de promotores de crescimento, uma vez que possuem
alto valor nutricional e potencial na prevenção de diversas enfermidades
(LALLÈS et al., 2009).
O efeito dos aditivos alimentares sobre o controle da doença
também foi investigado em alguns países. Dentro do consórcio europeu de
estudos para controle da PCVAD foram adicionados na dieta de modelos
experimentais, ácido linoleico e óleos essenciais. Quando comparados os
resultados com a dieta normal, houve uma redução na manifestação clínica da
doença e na excreção de partículas virais. Pesquisas realizadas a campo na
Irlanda e nos EUA corroboraram com estes resultados (ALLAN, 2007),
estimulando a realização de mais estudos na busca por terapias nutricionais
com potencial controle sobre a síndrome e outras doenças em que o sistema
imune se mostre mais acometido.
Entretanto, sem nenhuma dúvida, sob o aspecto de controle e
mesmo da etiologia, o sucesso com a vacinação frente ao PCV2 foi a maior
26
novidade em torno da doença (SEGALÉS, 2008b), alterando significativamente
o impacto do PCV2 na suinocultura em todo mundo. Inicialmente, uma vacina
autógena preparada com o vírus inativado com formaldeído 2%, proveniente de
tecido linfoide de animais com lesões de PCVAD, foi muito utilizada por alguns
veterinários clínicos. Esta ferramenta possibilitou a redução dos grandes
prejuízos causados pelas doenças associadas ao PCV2 quando o fornecimento
das vacinas comerciais ainda era limitado (OPRIESSNIG et al.,2008).
Atualmente, as vacinas comerciais contra PCV2 estão entre as vacinas mais
comumente utilizadas na produção de suínos, sendo que nos Estados Unidos é
estimado que aproximadamente 98% do rebanho que chega ao abate seja
vacinado contra o vírus (DÍAZ, 2009).
Quatro vacinas comerciais contra o PCV2, produzidas com o vírus
inativado, estão disponíveis no mercado. O objetivo da vacinação contra PCV2
é a proteção do rebanho contra manifestações clinicas de PCVAD e diminuição
da excreção viral no ambiente pelas vias fecais, ou de secreção nasal, oral e
sêmen e dos efeitos da infecção subclínica. As vacinas comerciais são
baseadas no genótipo PCV2a e tem se mostrado eficientes na prevenção de
lesões e doenças associadas com PCV2a ou PCV2b. Os sítios candidatos à
produção de vacina mais eficazes são aqueles que induzem resposta imune
contra a ORF2, que tem sido identificada como o principal antígeno
imunogênico de PCV2, induzindo resposta imune humoral (NAWAGITGUL et
al., 2000).
As evidências de controle da patologia com a utilização destas se
baseiam na diminuição significativa da expressão da doença clínica, além da
melhoria dos parâmetros de produtividade. Todas revelaram ser eficazes tanto
em condições experimentais como em condições de campo, reduzindo a
incidência da CS e melhorando o ganho de peso diário e os índices de
conversão alimentar (FACHINGER et al., 2008;. HORLEN et al., 2008; PEJSAK
et al., 2009; SEGALÉS et al., 2009). Além disso, a vacinação reduz o número
de coinfecções (KIXMÖLLER et al., 2008) e a severidade das lesões em
tecidos linfoides (SEGALÉS et al., 2009). Com o uso de vacina contra PCV2
em condições experimentais, tem sido relatados: diminuição da viremia no soro
após desafio com PCV2, diminuição das lesões linfoides associadas, da
27
quantidade de antígeno viral nos tecidos, da excreção nasal e fecal e da
indução de anticorpos anti PCV2. Em condições de campo, foi observada
melhora no ganho de peso diário e conversão alimentar, diminuição das taxas
de mortalidade e gastos com medicação e aumento do número de animais
terminados e de nascidos vivos (KIXMÖLLER et al., 2008).
Com relação ao protocolo de vacinação, pesquisa recente
demonstra que a vacinação da porca e do leitão tem efeitos semelhantes em
termos de redução da carga viral em suínos em crescimento (OPRIESSNIG et
al., 2009a). A vacinação de porcas e marrãs tem por finalidade a elevação dos
títulos de anticorpos anti-PCV2 no soro e no colostro para consequente
proteção dos leitões contra o desenvolvimento da CS (JOISEL et al., 2007;
OPRIESSNIG et al., 2009a). A vacinação das fêmeas também protege os
leitões contra desafios ambientais e diminuem as excreções virais via
naso/fecal, conforme demonstrado por CIACCI-ZANELLA et al. (2008). Os
leitões são vacinados após três semanas de idade, quando há redução no título
de
anticorpos
maternos.
Isso
provoca
uma
resposta
de
anticorpos
neutralizantes e reduz ou retarda a infecção pelo PCV2 durante o desmame ou
engorda (FORT et al., 2008; OPRIESSNIG et al., 2009b).
O momento de maior eficácia para administração da vacina contra
PCV2 é um período de pelo menos três a quatro semanas antes da fase de
exposição ao vírus no ambiente da granja. Anticorpos maternais são
observados em animais com uma semana de idade e apresentam queda
gradual até alcançarem níveis mínimos ao redor das seis a sete semanas
(GRAU-ROMA et al., 2008). Assim, em granjas onde PCVAD ocorra na creche,
a vacina deve ser administrada em animais com dois a três semanas de idade
(OPRIESSNIG et al., 2008).
2.2 Torque Teno Vírus
2.2.1 Torque teno vírus em suínos
28
O torque teno vírus, segundo o Comitê Internacional de Taxonomia
de
Vírus
(ICTV),
é
classificado
na
família
Anelloviridae
e
gênero
Iotatorquevirus, é um vírus pequeno, não-envelopado, com DNA circular de fita
simples, diâmetro de 30-32nm, possui três ORFs (Figura 3) e é composto por
2.878 nucleotídeos (ITOH et al., 2000; KAMAHORA et al., 2000; OKAMOTO et
al., 2002; NIEL et al., 2005; KAKKOLA, 2008).
Primeiramente isolado em humanos em 1997 (NISHIZAWA et al.,
1997), o TTV tem sido identificado em animais de produção e de companhia
como os suínos, aves, bovinos, ovinos, cães e gatos (LEARY et al., 1999;
OKAMOTO et al., 2002), assim como em primatas e animais selvagens como
os javalis (INAMI et al., 2000, OKAMOTO & MAYUMI, 2001; MARTÍNEZ et al.,
2006). Os TTV's são considerados espécie-específicos e possuem baixa
homologia entre eles (44%) no que se refere à sequência nucleotídica. Em
suínos, dois genogrupos distintos, TTSuV1 e TTSuV2, foram detectados e, até
o presente, as informações indicam que eles não são patogênicos para esta
espécie (NIEL et al., 2005; KEKARAINEN et al., 2007).
FIGURA 3 – Representação esquemática da estrutura genômica do TTV
suíno. As setas representam as ORFs (1-3). A faixa tracejada no centro da
ORF3 indica a região de um íntron no mRNA mais curto. A área sombreada
representa a região rica em GC e o ponto preto indica a região TATA box.
Fonte: OKAMOTO et al. (2002)
29
Embora a infecção pelo TTV suíno ainda não tenha sido associada a
nenhuma doença clínica específica e a sua função em coinfecções com outros
patógenos permaneça desconhecida, uma maior frequência de infecção pelo
TTV2 foi relacionada a animais com manifestações (sistêmica, respiratória,
entérica)
atribuídas
ao
PCV2.
Problemas
reprodutivos
foram
mais
frequentemente observados em porcas infectadas pelo TTV2 e coinfectadas
por ambos os TTV's (LIWÉN et al, 2002; KEKARAINEN et al. 2006;
KEKARAINEN et al. 2007; GAGNON et al., 2007; BRASSARD et al., 2008;
ELLIS et al., 2008; TEIXEIRA, 2008; RITTERBUSCH, 2009).
Alguns estudos indicaram um possível papel do TTV em exacerbar a
patogenia causada pelo PCV2 em leitões (KEKARAINEN et al., 2006), porém
não se sabe qual a sua importância em animais adultos. Também foi relatado
que leitões gnotobióticos inoculados com TTV1 em um momento anterior à
inoculação pelo PCV2 desenvolveram a circovirose suína mais facilmente
(ELLIS et al., 2008). Estudo semelhante recentemente demonstrou a
coinfecção entre TTV e PCV2 em amostras de suínos no Brasil (CIACCIZANELLA et al., 2009b).
KRAKOWKA et al. (2008) relataram em modelos experimentais
infectados com PCV2 ou TTV ou ambos, que as coinfecções poderiam
modificar a manifestação clínica de CS. MARTIN-VALLS et al. (2008) chegou a
uma conclusão similar. Os autores encontraram o DNA de TTV amplamente
distribuído nos tecidos dos animais que sofriam de CS, mas não em tecidos de
animais saudáveis. Isso os levou a sugerir que uma infecção simultânea de
TTV e PCV2 pode resultar no desenvolvimento da CS. Em contradição, estudo
de detecção de TTV em suínos com presença de CS frente a animais controle,
não encontrou nenhuma diferença significativa entre os grupos (TAIRA et al.,
2009).
Um estudo retrospectivo realizado na Espanha indica que ambos
TTV's tem circulado desde 1985 em suínos (SEGALÉS et al., 2009). Até o
momento, foi detectada a presença de TTV1 em amostras de soro de suínos
no Brasil, Canadá, China, Coréia, Espanha, Itália, França, Tailândia, Estados
Unidos, Japão e Hungria, com prevalências entre 17% e 100% (McKEOWN et
al., 2004; BIGARRÉ et al. 2005; KEKARAINEN et al. 2006; MARTELLI et al.
30
2006; TEIXEIRA, 2008; TAKÁCS et al., 2008; TAIRA et al., 2009; CIACCIZANELLA et al., 2009b). Para TTV2, a presença do vírus no soro foi descrita
apenas no Brasil, Espanha e Japão (NIEL et al., 2005; KEKARAINEN et al.,
2006; KEKARAINEN et al., 2007; TEIXEIRA, 2008; TAIRA et al., 2009; CIACCIZANELLA et al., 2009b). No entanto, acredita-se que ambos os TTV's suínos
se encontrem distribuídos por toda população suína mundial com prevalência
variável entre 24 a 100% (MARTÍNEZ-GUINÓ et al., 2009).
Apesar de disseminado em suínos, a importância deste vírus nesta
espécie ainda não está esclarecida. Segundo SIBILA et al. (2009), a infecção
pelo TTV pode ser transmitido tanto da porca para os leitões, quanto entre
leitões e ocorre precocemente nos sistemas de produção. Ambos genogrupos
já foram detectados em frações de colostro e amostras de soro de leitões
recém nascidos, indicando a rota de transmissão vertical (MARTÍNEZ-GUINÓ
et al., 2009). Em suínos com idades variadas, a eliminação viral foi detectada
em soros, secreções nasais, fezes, sêmen e colostro.
Ainda que tenha ampla distribuição e elevada prevalência, poucos
são os conhecimentos relativos à capacidade de infecção e manifestação
clínica de enfermidades causadas direta ou indiretamente por este vírus.
Faltam técnicas laboratoriais ideais para o estudo do vírus. Semelhante ao
PCV2 e PPV, sabe-se que o TTV necessita de células em fase S para sua
replicação (ALLAN et al., 1994), mas ainda não é conhecida a população
celular na qual o TTV se replica, apesar de ser constantemente detectado em
células mononucleares do sangue periférico (OKAMURA
et al., 1999;
OKAMOTO et al., 1999) e em células hematopoiéticas da medula óssea
(KANDA et al., 1999; KIKUCHI et al., 2000). Assim, seu cultivo in vitro não é
realizado, o que poderia acelerar a obtenção de informações.
Torna-se
fundamental a continuidade de pesquisas que visem à compreensão da
biologia e especialmente das estratégias de disseminação deste agente em
populações humanas e animais, bem como seu papel na manifestação clínica
da circovirose suína e doenças associadas.
31
3. OBJETIVO
3.1 Objetivo Geral
Conhecer a dinâmica de infecção pelo PCV2 e TTV em suínos de
propriedades com sistemas intensivos de criação do Estado de Goiás.
3.2 Objetivos específicos
 Identificar granjas de suínos de criação intensiva do Estado de
Goiás, bem como animais, com casos suspeitos de enfermidade relacionada
ao PCV2 e hígidos, do mesmo plantel, para obtenção das amostras.
 Identificar a presença do circovírus suíno tipo 2 nas granjas
analisadas
 Identificar as principais manifestações clínicas associadas ao
complexo circovirose suína e doenças associadas na população estudada
 Detectar a presença do torque teno vírus 1 e 2 em suínos de
criação intensiva
 Avaliar a existência de coinfecção entre PCV2 e TTV
 Identificar entre os espécimes clínicos obtidos, aquele de eleição
para um primeiro diagnóstico de infecção pelo PCV2 num rebanho
32
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local e período de realização do experimento
A análise das amostras foi realizada no Laboratório de Virologia
Animal do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (LVA-IPTSP) da
Universidade Federal de Goiás, na cidade de Goiânia/GO, no período de março
de 2009 a dezembro de 2010.
4.2 Material e população de estudo
Para participar do estudo, foram selecionadas propriedades onde
ocorria a suspeita clínica das síndromes associadas à circovirose suína,
indicada por elevados índices de mortalidade e grande número de animais
refugos nas fases de creche e recria, indicadas por veterinários de campo e
pela Agência Goiana de Criadores de Suínos (AGS), colaboradores deste
estudo. Após a localização da granja, e autorização dos proprietários, os
materiais para análise foram coletados em seis granjas com densidade de 150
a 500 matrizes, localizadas em região com produção média de suínos no
Estado (Figura 4).
Para o cálculo do número de animais a serem eutanasiados, utilizouse uma estimativa de prevalência de 62,2% para animais em fase de creche e
de 66,75% para suínos em fase de recria/terminação (CIACCI-ZANELLA,
2005).
Utilizando
a
tabela
estatística
de
amostragem
indicada
por
SOBESTIANSKY et al. (2005), com o intervalo de confiança de 95%, foi
determinado o número mínimo de dois suínos por granja para coleta dos
tecidos. Os animais escolhidos foram submetidos à eutanásia utilizando-se
tiopentato de sódio (10mg/Kg) e cloreto de potássio 10%, aplicados por via
endovenosa, de acordo com a Resolução nº 714 de 20 de junho de 2002 do
Conselho Federal de Medicina Veterinária (CFMV, 2002). As amostras foram
obtidas de suínos alojados em sistemas intensivos de criação, com água e
33
alimento à vontade, temperatura e umidade controladas. O estudo em questão
integra outro projeto institucional aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Universidade Federal de Goiás, registrado sob o número 259/10.
Figura 4- Identificação das microrregiões de Goiás segundo a produção de
suínos. Os círculos identificam a localização das granjas.
Fonte: GOIÁS (2010).
Nas granjas foram selecionados animais com evidência de
circovirose em diferentes estágios clínicos da doença, coletando-se também,
de forma aleatória, amostras de animais hígidos dentro da mesma faixa etária.
Foram coletados soro, suabes nasal e oral, fezes e tecidos.
O número de indivíduos, bem como a fase de criação selecionadas
em cada granja ocorreu de acordo com a permissão obtida junto aos
proprietários. No entanto, a amostragem mínima pré-estabelecida de dois
animais a serem eutanasiados, foi mantida. Assim, foram colhidos soros,
suabes nasais, suabes orais e fezes de todos os 47 animais selecionados, nas
seis granjas. Em adição, dos 20 suínos eutanasiados foram colhidos
34
fragmentos de linfonodos inguinal, mediastínico e mesentérico, tonsila, pulmão,
fígado, baço, intestino e rim, totalizando 368 espécimes clínicos.
Para coleta dos espécimes clínicos, foi utilizada a metodologia
descrita por SOBESTIANSKY et al. (2005). Assim, foram obtidos com seringas,
5 mL de sangue por punção venosa da veia cava cranial, para posterior
obtenção dos soros. Os tubos foram identificados e deixados inclinados (45°),
em repouso, à temperatura ambiente, até a retração do coágulo. Após a
retirada do coágulo, os tubos foram colocados em caixas térmicas e mantidos
sob refrigeração para transporte até o LVA-IPSTP. Os suabes nasais foram
colhidos fazendo-se uma introdução profunda do suabe nos seios nasais, com
movimentos de rotação.
Para coleta dos suabes orais, a boca dos animais foi mantida aberta
com o auxílio de cachimbo e a saliva dos mesmos foi colhida com movimentos
de rotação próximo às tonsilas palatinas. Após a coleta, os suabes foram
inseridos em tubos contendo 2,0 mL de meio essencial mínimo (MEM) e
transportados sob refrigeração até o LVA-IPTSP.
As fezes foram colhidas diretamente da ampola retal, em volume
aproximado de 10g de material fecal acondicionados em sacos plásticos,
devidamente
identificados
e
transportados
sob
refrigeração
ao
local
supracitado.
Durante a necropsia, inicialmente foram verificados os aspectos
macroscópicos dos diversos órgãos na busca de possíveis alterações. Em
seguida, colheram-se os fragmentos de tecidos, com aproximadamente 10 cm,
que foram acondicionados em sacos plásticos individuais e devidamente
identificados.
As
amostras
foram
encaminhadas
ao
laboratório
sob
refrigeração. A dinâmica de coleta das amostras está representada na Figura
5. No laboratório, os soros foram estocados em freezer a -20ºC e as outras
amostras a -80ºC, até o momento da análise.
A fase de creche é representada pelos animais de três a oito
semanas, os animais de nove a 14 semanas constituem a fase de recria e
acima de 15 semanas os animais da terminação.
35
Figura 5 - Procedimento para coleta de amostras
4.3 Extração do DNA
As técnicas de extração do ácido nucléico viral (com modificações)
para os diferentes espécimes clínicos podem ser visualizadas pelos esquemas
representados na Figura 6.
Em
cada
procedimento
de
extração,
18
amostras
foram
processadas. Para verificar a presença do DNA extraído, ao final de cada
processo, foi feita uma corrida de eletroforese em gel de agarose a 2%, em
tampão TBE numa cuba horizontal sob uma corrente de 100 V. O gel foi corado
em brometo de etídeo a uma concentração final de 0,5 µg/mL (SAMBROOK et
al., 1989) e o DNA foi visualizado por meio de um transluminador ultravioleta
(UV) modelo DP-CF-011-C (VILBER LOURMAT®) e fotografado para registro
dos resultados.
36
Figura 6- Diagrama dos métodos de extração de DNA utilizados. Amostras de
soro (KIM et al., 2001), suabes (ABRÃO et al.,2005), fezes (YANG et al.,2003) e
tecidos (DEZEN, 2007a) de suínos para amplificação de ácido nucléico de PCV2.
*PBS: Tampão fosfato salino; BM: banho-maria; TE: tampão Tris-EDTA; SDS: Dodecilsulfato de
sódio; TEN: Tampão Tris-EDTA-NaCl.
37
4.4 Aplicação da técnica de PCR
4.4.1 Identificação do PCV2
Os produtos de extração foram submetidos à técnica de PCR para
detecção do PCV2, por amplificação de um segmento da ORF2 do genoma
viral, foram utilizados iniciadores (Quadro 2) descritos por KIM et al. (2001),
com sequências específicas para esta região. As sequências do gene estão
disponíveis no banco de dados do “National Center for Biotechnology
Information” (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).
QUADRO 2- Sequência e posições de nucleotídeos dos iniciadores utilizados
nas reações de PCR para identificação do PCV2
Primers
forward
reverse
Sequências
5'– CGG ATA TTG TAG TCC TGG TCG – 3'
5'– ACT GTC AAG GCT ACC ACA GTC A – 3'
Posição
1095-1115
1570–1549
Fonte: KIM et al.(2001)
Para otimizar a reação, modificações foram realizadas no protocolo
sugerido por KIM et al (2001). Assim, um primeiro ensaio foi realizado com
diferentes quantidades de DNA extraído, a saber: 1 µL, 2 µL, 3 µL e 4 µL,
sendo a quantidade de 2 μL a que se mostrou mais adequada para reação. As
reações foram realizadas com um volume final de 25 μL, sendo 2 μL de DNA
da amostra a ser testada com concentração entre 25 e 50 ng (determinada por
meio da comparação com marcador de peso molecular LAMBDA ®) e 23 μL da
mistura de reação composta por desoxirribonucleotídeos (dNTPs), tampão da
enzima, cloreto de magnésio (MgCl2), iniciadores (“Primers”) e enzima (Tac
DNA polimerase). As concentrações dos reagentes são indicadas no Quadro 3.
A reação de amplificação foi realizada em termociclador automático,
modelo MX-BCL-7 (ESCO), sob as seguintes condições: desnaturação inicial
com um ciclo a 94ºC por cinco minutos; seguida de 34 ciclos com desnaturação
da fita a 94ºC durante um minuto, anelamento a 65ºC por um minuto, extensão
38
a 72ºC por um minuto e extensão final a 72º C por 10 minutos, resultando em
um produto final amplificado de, aproximadamente, 481pb (KIM et al., 2001).
QUADRO 3- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da
mistura de reação
REAGENTES
CONCENTRAÇÃO
Tampão*
1x
dNTP’s*
0,4 mM
MgCl2*
1,2 mM
Primer Forward*
10 pmoles
Primer Reverse*
10 pmoles
Enzima**
1,0 U
*Invitrogen, Brasil; **Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen, Brasil)
Fonte: KIM et al. (2001), com modificações
Os produtos amplificados foram observados por eletroforese em gel
de agarose 2%, corados em brometo de etídio 5 μg/mL e visualizados sob luz
ultravioleta. O tamanho dos fragmentos amplificados foi determinado por
comparação com um marcador de peso molecular de 100 pares de base
(LUDWIG®).
Amostra de referência e/ou representativa para PCV2 foi gentilmente
cedida pelo Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves (CNPSA) da
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) e incluída no
estudo como controle positivo das reações. Água ultrapura estéril foi utilizada
como controle negativo.
4.4.2 Identificação do TTV1 e TTV2
Para identificação dos TTV's, os produtos de extração, provenientes
das amostras de soro, foram submetidos à técnica de PCR utilizando
iniciadores específicos (Quadro 4) descritas por SILVA et al. (2009). Estes
amplificam uma região não-codificante dentro do genoma viral, mas que é
39
responsável pela diversidade genética entre os genogrupos resultando em
produtos de 349pb e 623pb para o TTV1 e para o TTV2, respectivamente.
QUADRO 4- Sequência dos iniciadores utilizados nas reações de PCR para
identificação dos TTV's
Sequências
Iniciadores
Posição
TTV1F
5'– GGG TTC AGG AGG CTC AAT TTG G –3'
10-31
TTV1R
5'– CCC AGT CGC TAG ACA GTT CTG T–3'
358-337
TTV2F
5'– CCA CAA AGT ATT ACA GGA AAC TGC–3'
66-89
TTV2R
5'– AAC CAT TGT ATG ACC GGA GCT TT –3'
688-666
Fonte: SILVA et al. (2009)
Diferentes quantidades de DNA extraído foram testadas visando à
otimização da PCR, a saber: 1 µL, 2 µL, 3 µL, 4 µL e 5 µL, sendo as
quantidades de 2 μL e 4 μL as que se mostraram mais adequadas para as
reações de identificação do TTV2 e TTV1, respectivamente. Modificações
foram realizadas no protocolo sugerido por SILVA et al. (2009). As reações
foram realizadas com um volume final de 25 μL, sendo utilizadas as amostras
nas quais o DNA a ser testado possuía concentração entre 10 e 50 ng. As
concentrações dos reagentes e as condições de amplificação foram
determinadas segundo Silva et al. (2009), com modificações, e são
apresentadas nos Quadros 5 e 6 e na Figura 7.
QUADRO 5- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura
de reação para identificação do TTV1
REAGENTES
CONCENTRAÇÃO
Tampão*
dNTP’s*
1x
0,4 mM
MgCl2*
1,2 mM
DMSO*
6%
Primer Forward*
10 pmoles
Primer Reverse*
10 pmoles
Enzima**
1,0 U
*Invitrogen, Brasil; **Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen, Brasil)
40
QUADRO 6- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura
de reação para identificação do TTV2
REAGENTES
CONCENTRAÇÃO
Tampão*
dNTP’s*
1x
0,4 mM
MgCl2*
1,2 mM
DMSO**
8%
Primer Forward*
10 pmoles
Primer Reverse*
10 pmoles
Enzima***
1,0 U
*Invitrogen, Brasil; ** DMSO- Dimetilsulfóxido (Amresco, Biosystems); ***Taq DNA Polymerase
Recombinant (Invitrogen, Brasil)
FIGURA 7- Condições utilizadas para amplificar os fragmentos de TTV`s.
Os produtos de amplificação foram analisados por meio de
eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio 5 μg/mL e
posteriormente visualizados por meio de um transluminador, sob luz
ultravioleta. O tamanho dos fragmentos amplificados foi determinado pela
comparação com um marcador de peso molecular de 100pb (LUDWIG ®). Água
ultrapura estéril foi utilizada como controle negativo.
41
4.5 Análise dos resultados
Os dados foram analisados por meio de estatística descritiva
conforme citado por PEREIRA (2005). Foram utilizadas para estes fins tabelas
de distribuição de frequências e cálculos de prevalência pontual para cada
categoria analisada. Assim, para o cálculo da prevalência pontual nas
categorias manifestação clínica, fase de criação e sexo, a seguinte fórmula foi
considerada:
P= f/n (prevalência pontual)
P± 2√P(1-P)/n (limites inferior e superior do intervalo de confiança)
Para verificar uma possível associação entre a positividade para
PCV2 e cada categoria analisada foram utilizadas as medidas de risco relativo
conforme modelo apresentado no Quadro 7. Para todas estas e para a
prevalência foi considerado um intervalo de confiança de 95%, calculado como
citado anteriormente.
QUADRO 7- Matriz de cálculos das principais medidas de risco
Exposição
Positivos
Negativos
Afetados
a
b
Hígidos
c
d
Total
n
n1
Odds ratio (OR): = ad / bc
Risco Atribuível (RAP)=
a População
P (RR -1)
P (RR - 1) + 1
Segundo PEREIRA (2008), a odds ratio informa quantas vezes ou
qual a chance de um o risco ser maior em um grupo, quando comparado a
outro. O risco atribuível informa a parte da prevalência que é devida a uma
42
exposição. Assim, para comparação entre as categorias "sexo" e "fase de
criação" foi utilizada a odds ratio. O risco atribuível populacional foi usado para
comparação entre "afetados" e "hígidos" quando na infecção pelo PCV2, assim
como para avaliar uma possível associação entre manifestação clínica e a
presença do torque teno vírus.
A análise do poder diagnóstico dos espécimes clínicos utilizados se
deu por meio da análise da sensibilidade, especificidade, valores preditivos
positivo e negativo, razão de verossimilhança positiva e negativa e acurácia
dos testes, conforme descrito no Quadro 8. Não foi realizada esta análise para
tecidos, uma vez que só foram colhidos fragmentos de animais com alguma
alteração sugestiva de PCVAD.
QUADRO 8- Matriz de cálculos de correção da prevalência obtida com a
aplicação de um teste diagnóstico imperfeito
Teste "x"
Doentes
a
Positivo
(verdadeiro
positivo)
c
Negativo
Total
Sadios
`Total
b
a+b
(falso positivo)
d
(verdadeiro
negativo)
c+d
(falso negativo)
a+c
b+d
a+b+c+d
INDICADORES
Sensibilidade= a/ (a+c)
Especificidade= d/ (b+d)
Valor Preditivo positiva (VP)
=a/a+b
Valor Preditivo negativo (VN)
= d /c + d
Razão de Verossimilhança
positiva (RVP)
=a/a+c
b/ b + d
Razão de Verossimilhança
negativa (RVN)
= c/ a + c
d/ b + d
Acurácia:
a+d
a+b+c+d
43
5. RESULTADOS
5.1 Material e população de estudo
A localização geográfica das granjas envolvidas neste estudo está
representada na Figura 8.
FIGURA 8- Localização das granjas de criação intensiva de suínos do Estado de
Goiás selecionadas para coleta de amostras (marcadores azuis).
Fonte: Google Earth
44
Os animais provinham de sistemas clássicos de produção de suínos,
sítios de ciclo completo e/ou produção em dois sítios, esquematizados na
Figura 9.
Figura 9 – Sistemas clássicos de produção de suínos. (Granja 1) – Produção
em ciclo completo; (Granja 2) – Produção em dois sítios.
As granjas D e E são explorações em que há dois sítios de criação,
sendo estes: UT (unidade de terminação e recria) e UPL (unidade produtora de
leitão), respectivamente, nas quais não há mistura de lotes nas baias, porém
há coexistência de animais das mais variadas idades no mesmo galpão, sendo
possível contato animal/animal na divisória das baias. As demais criações, A,
B, C e F, atuam com tipo de produção em ciclo completo, nas quais ocorre a
mistura de lotes em uma mesma baia. Com relação às origens, com exceção
da granja D, em que há recebimento de leitões de diferentes fontes, todas as
granjas recebem animais de uma única origem, sendo que as granjas A e B
repõem os animais, em sua maioria, a partir do próprio plantel. Apenas a granja
B utiliza vacinação contra PCV2. Esses dados constituem, entre outros, os
fatores de risco para ocorrência da PCVAD, apresentados no Quadro 9.
45
QUADRO 9– Fatores de risco avaliados nas granjas de suinocultura intensiva e
associados à ocorrência de PCVAD
Granjas
A
B
C
D
E
F
Sítio
Completo
Completo
Completo
Dois
Dois
Completo
Mistura de lotes
SIM
SIM
SIM
NÃO
NÃO
SIM
Origem
1
1
1
1
1
Desmame
24d
23d
21d
28d
23d
Biosseguridade
Assistência
técnica
Controle
produção
Densidade
próxima a granja
Vazio sanitário
Média
Baixa
Baixa
2 ou mais
Recebe
c/60d
Média
Baixa
Baixa
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Baixa
Média
Baixa
Alta
Alta
Alta
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Outras espécies
Não
Sim
Sim
Sim
Vacinação
Tríplice
Tríp./mic.
Não
Tríplice
Sinais entéricos
Sim
Sim
Circo/tríp.
e mic.
Sim
Não
Sim
Não
Sim
Tríp./ Mic./
Rinite/coli
Não
Sinais nervosos
Sinais
respiratórios
Desuniformidade
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Peso desmama
7 kg
7 kg
6 kg
-
6 kg
6 kg
Cortinas
Sim
Não
Sim
Não
Não
Sim
Medicações
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Exame sêmen
Não
Não
Não
Na
Não
Não
Exame água
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Nascidos
Higienização/
limpeza
Densidade
populacional
Quarentena
Bom/fraco
Bom/fraco
Bom
-
Baixo/fraco
Baixo/fraco
Média
Boa
Média
Boa
Ruim
Ruim
Alta
Alta
Média
Média
Alta
Média
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Os dados referentes às coletas em cada granja, abordando o
número de animais com sinais clínicos e hígidos, suas respectivas idades,
fases de criação e sexo, são apresentados no Quadro 10.
46
QUADRO 10 - Número de animais selecionados por exploração, faixa etária,
fases de criação, sexo e sinais clínicos
ANIMAIS
GRANJAS
IDADE
FASE
SEXO
6 creche
6 machos
3 recria
3 fêmeas
4 creche
5 machos
4 recria
3 fêmeas
4 creche
3 machos
2 recria
3 fêmeas
PCVAD
Sem sinal
(semanas)
A
7
2
3 a 16
B
4*
4**
3 a 17
C
0
6
4 a 16
D
3
3
9 a 16
6 recria
E
4
2
4a9
6 creche
F
5
7
4 a 16
23
24
3 a 16
TOTAL:
6
3 machos
3 fêmeas
3 machos
3 fêmeas
6 creche
5 machos
6 recria
7 fêmeas
26 creche
25 machos
21 recria
22 fêmeas
(*)Animais não vacinados (**) Animais vacinados
5.2 Circovírus suíno tipo 2
5.2.1 Aspectos clínicos e das lesões macroscópicas
Os sinais clínicos observados nos animais com suspeita clínica de
CS foram: emagrecimento, dispneia, apatia, pelos arrepiados e opacos, palidez
corpórea, diarreia e sinais respiratórios e/ou entéricos. Além disso, foram
observadas manchas púrpuro-avermelhadas, em relevo, de diversos tamanhos
e formas sobre o tórax, abdômen e coxas, indicativas de SDNS (Figura 10).
47
Figura 10- Sinais clínicos identificados na seleção de animais para coleta
de amostras. A, B e C- Apatia, pelos arrepiados e emagrecimento, sinais
relativos à CS; D- Manchas avermelhadas de tamanho e forma variáveis
sugestivos de SDNS.
A frequência dos sinais clínicos observados está indicada na Tabela
2.
Apatia
e
sinais
respiratórios
foram
os
principais
sinais
clínicos.
Sintomatologia respiratória foi encontrada em todas as granjas, sendo que
tosse acompanhada de respiração abdominal e presença de secreção nasal
foram os mais característicos. Não foi encontrada icterícia. Morte súbita estava
presente em suínos da exploração A. Sinais entéricos estavam presentes em
quatro granjas, A, B, D e E. Assim, do total de animais analisados, 53% (25/47)
apresentavam alguma manifestação clínica de PCVAD.
48
TABELA 2- Frequência dos sinais clínicos observados nos suínos
selecionados em criações intensivas do Estado de Goiás no período de março
de 2009 à janeiro de 2010
Alterações
Total
Frequência (%)
Apatia
23/25
90%
Tosse
18/25
72%
Palidez e Emagrecimento
16/25
64%
Sinais entéricos
13/25
52%
Secreção nasal
10/25
40%
Alterações de pele
3/25
12%
Na Tabela 3 são demonstradas as alterações macroscópicas dos
órgãos observados durante a necropsia dos 20 animais eutanasiados e suas
respectivas frequências.
A Figura 11 representa alguns dos sinais
macroscópicos evidenciados durante a necropsia.
TABELA 3- Frequência dos sinais macroscópicos observados nos suínos
selecionados em criações intensivas do Estado de Goiás no período de março
de 2009 à janeiro de 2010
Alterações
Total
Frequência (%)
Linfadenopatia
16/20
80
Pulmões não colapsados/hepatização
15/20
75
Hiperplasia de polpa branca
11/20
55
Hipotrofia do Timo
8/20
40
Palidez renal/presença de pontos brancos
8/20
40
Aumento do padrão lobular/hepatomegalia
7/20
35
Edemaciação
6/20
30
O pulmão foi o órgão no qual foram identificadas mais alterações e
estas estavam presentes em quase todos os animais. Aderências pleurais e
pleurite, muitas vezes com presença de fibrina na cavidade, foram associadas
49
à infecções bacterianas secundárias e estavam presentes em duas granjas
(A e F).
Figura 11: Achados macroscópicos. A: Pneumonia intersticial; B:
Linfadenopatia; C: Hepatomegalia e icterícia; D: Hiperplasia da polpa branca
do baço.
5.2.2 Identificação do DNA do PCV2
50
O DNA do PCV2 foi detectado em pelo menos uma amostra clínica
de todos os animais testados neste estudo, independente destes manifestarem
alguma manifestação de PCVAD. Em 15% (7/47) dos suínos avaliados foi
encontrado material genético do PCV2 em todas as amostras coletadas, ou
seja, nos suabes nasal e oral, fezes, soros e tecidos de um mesmo animal
(Figura 12).
FIGURA 12- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de espécimes clínicos de suínos de sistemas intensivos de
criação. (PM) Peso molecular 100 pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle
positivo; (SR) Soro; (SR’) Soro1; (SN) Suabe nasal protocolo 12; (SN’) Suabe
nasal protocolo 2; (SO) Suabe oral; (FZ) Fezes; (Li) Linfonodo inguinal; (T)
Tonsila; (Ld) Linfonodo mediastínico; (Lm) Linfonodo mesentérico; (P) Pulmão;
(F) Fígado; (B) Baço; (R) Rim.
Na Tabela 4 são apresentados os dados gerais acerca da
identificação do DNA de PCV2 nas amostras segundo o espécime clínico,
fases de criação, manifestação clínica e sexo dos animais testados.
1
2
NOTA: Soros com diferentes diluições; Nos testes para avaliação do melhor protocolo de
extração do DNA viral a partir de suabes foram analisados 2 protocolos, sendo adotado o
primeiro protocolo segundo Abrão et al. (2005).
51
TABELA 4 - Distribuição dos resultados para PCV2 nos espécimes clínicos
coletados dos suínos de granjas de criação intensiva do Estado de Goiás,
segundo a fase de criação, manifestação clínica e sexo, no período de março
de 2009 à janeiro de 2010.
A amplificação do DNA viral na população estudada demonstrou
uma prevalência pontual de 70,6% ± 4,6. A prevalência nos suínos que
apresentavam alguma manifestação clínica associada a PCVAD foi de 84,8% ±
4,2. Já nos hígidos, o índice foi de 46,4% ± 5,4. De acordo com o risco
aparente populacional, nos animais em que há manifestação clínica de
PCVAD, a possibilidade de identificação viral é 63% maior que nos animais
hígidos, conforme RAP= 1,63.
Nos animais de recria a prevalência foi de 74,3% ± 5,4 enquanto na
creche se observou o índice de 67% ± 5,6. A chance de animais da recria
apresentarem o DNA do PCV2 nos espécimes clínicos analisados é maior que
os animais da creche, segundo a OR=1,42% (IC=95%, [0,92 - 2,18]), com
p>0,05.
Com relação ao sexo, o índice de 71,2 ± 5,8 e de 68,7 ± 5,2 foi
observado em fêmeas e machos, respectivamente. Se comparado com os
machos, as fêmeas apresentam maiores chances de se infectar por PCV2, haja
52
vista que a OR para machos e fêmeas foi de OR=1,12% (IC=95%, [0,72- 1,71]),
não sendo um risco significativo (p>0,05).
A identificação do DNA viral em animais com idades inferiores à 20
dias somente foi possível com o suabe nasal. Nos outros espécimes a
identificação ocorreu nas amostras provenientes de animais com idades entre
20 e 125 dias.
5.2.2.1 Identificação do DNA do PCV2 em amostras de soro
Considerando as amostras de soro, 62% (29/47) apresentaram
positividade para o PCV2 (Figura 13).
A presença do DNA viral foi identificada em 92% (23/25) dos animais
nos quais os sinais clínicos de PCVAD foram observados e em 27% (6/22) dos
hígidos, sendo significativa a maior chance de identificação viral nos animais
afetados, com OR=30,6 (IC=95%, [5,58 - 167,33]), p<0,05.
FIGURA 13- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir dos soros de suínos de sistemas intensivos de criação. (PM)
Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle positivo; (1-17)
Soros dos animais 1 a 17.
53
A porcentagem de positivos dentre os soros dos animais com
sintomatologia respiratória foi de 92% (23/25) e dentre aqueles com sinais
entéricos foi de 46% (6/13). A frequência de resultados por animal em cada
granja está representada na Tabela 5.
TABELA 5- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos
para PCV2 nos soros dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de
Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010
Resultado
Exploração
N° de animais
Positivo
(%) Negativo
(%)
TOTAL
A
9
9
100
0
-
B
8
8
100
0
-
C
6
3
50
3
50
D
6
3
50
3
50
E
6
3
50
3
50
F
12
3
25
9
75
47
29
18
38
62
Com relação à fase de criação, na creche 58% (15/26) dos soros
foram positivos e na recria 67% (14/21), havendo maiores chances de ser
identificado material genético viral no soro de animais de recria, porém sem
valor estatístico significativo de acordo com OR=0,68 (IC=95%, [0,21 - 2,22]),
p>0,05.
Quanto ao sexo, 64% (16/25) dos soros dos machos e 59% (13/22)
das fêmeas foram reagentes, revelando, assim, maior chance de detecção do
DNA viral nos soros de machos, segundo OR=1,33 (IC=95%, [0,40 - 4,30]), não
sendo este valor significativo (p>0,05).
O DNA viral foi detectado em animais com faixa etária entre 3 a 17
semanas, sendo a maior frequência de positivos na faixa entre 3-4 semanas
nas granjas em que havia manifestação clínica de PCVAD e na faixa entre 8 a
17 semanas na granja sem animais com sinais clínicos.
54
5.2.2.2 Identificação do DNA do PCV2 em amostras de suabes
A identificação do DNA viral nos suabes orais (Figura 14) ocorreu
em 51% (24/47) das amostras.
Por fase de criação revelou um maior percentual de animais
positivos na recria/terminação 57% (12/21) em comparação ao percentual de
positivos na creche 46% (12/26), não sendo um dado significativo de acordo
com a OR= 1,55 (IC=95%, [0,49 - 4,75]), p>0,05.
Os machos tiveram 48% (12/25) de positividade e as fêmeas 55%
(12/22), com OR=0,76 (IC=95%, [0,24 - 2,36]) revelando ser este um dado não
significativo (p>0,05).
O único animal hígido, que amplificou o fragmento do DNA do PCV2
no teste com suabe oral, era representante do sexo masculino e da fase de
creche. A faixa etária em que foi observada maior frequência de animais
positivos está entre 7 a 10 semanas. Em animais acima de 10 semanas de
idade, o DNA viral foi demonstrado somente naqueles que apresentavam sinais
clínicos respiratórios.
FIGURA 14- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de suabes orais dos suínos de sistemas intensivos de criação.
(PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle positivo; (131) Suabes dos animais 1 ao 31.
55
Os resultados referentes às amostras de suabes que amplificaram o
DNA do PCV2 são demonstrados na Tabela 6.
TABELA 6- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos
para PCV2 nos suabes orais e nasais dos suínos de granjas de criação
intensiva no Estado de Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010
Resultados
Granja
N° de animais
Suabe oral
Suabe nasal
+
(%)
-
(%)
+
(%)
-
(%)
A
9
7
78
2
22
9
100
0
0
B
8
1
13
7
88
8
100
0
0
C
6
2
33
4
67
6
100
0
0
D
6
3
50
3
50
6
100
0
0
E
6
4
67
2
33
6
100
0
0
F
12
7
58
5
42
12
100
0
0
TOTAL
47
24
51
23
49
47
100
0
0
A Figura 15 revela a amplificação do material genético viral em todas
as amostras de suabes nasais coletadas.
FIGURA 15- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de suabes nasais dos suínos de sistemas intensivos de
criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle
positivo; (1CG1-1CG5) Suabes dos animais 1 ao 30, suas respectivas fases e
origem.
56
5.2.2.3 Identificação do DNA do PCV2 em amostras fecais
Na Figura 16 podem ser vistos os resultados de amplificação a partir
das amostras fecais. O material genético viral foi detectado em 45% (21/47)
dos espécimes analisados.
FIGURA 16- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de amostras fecais dos suínos de sistemas intensivos de
criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle
positivo; (1-9) Amostras dos animais 1 ao 9.
O DNA viral foi identificado em 76% (19/25) dos animais nos quais
os sinais clínicos de PCVAD foram observados e em 9% (2/22) dos hígidos,
sendo significativamente maiores as chances de identificação do DNA viral nas
fezes de animais com sinais clínicos, OR=31,6 (IC=95%, [5,75 - 172,43]),
p<0,05. Dos animais que tinham sinais entéricos, 100% (13/13) foram
reagentes.
Do total de análises da creche, 38% (10/26) foram positivas. Já para
a fase de recria/terminação, a positividade foi de 52% (11/21), não sendo
significativa a maior chance de detecção em fezes de animais na fase de
recria, segundo OR=1,76 (IC=95%, [0,59 - 1,71]), p>0,05.
57
Em relação ao sexo, a frequência de amostras positivas nos machos
56% (14/25) foi superior a observada nas fêmeas 32% (7/22), não sendo este
um dado significativo segundo OR=2,72 (IC=95%, [0,36 - 3,74]), p>0,05.
Os resultados desta avaliação estão demonstrados na Tabela 7.
TABELA 7- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos
para PCV2 nas fezes dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de
Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010
Resultados
Granja
N° de
animais
Positivo
(%)
Negativo
(%)
A
9
9
100
0
-
B
8
3
38
5
62
C
6
0
-
6
100
D
6
4
67
2
33
E
6
4
67
2
33
F
12
1
8
11
92
TOTAL
47
21
45
26
55
5.2.2.4 Identificação do DNA do PCV2 em fragmentos de tecidos
Do total de fragmentos de tecidos amostrados, 77% (139/180)
amplificaram o DNA do PCV2 pela técnica de PCR (Figura 17).
FIGURA 17- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA
de PCV2 a partir de fragmentos de tecidos dos suínos de sistemas intensivos
de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle
positivo; (1) linfonodo inguinal; (2) tonsila; (3) linfonodo mediastínico; (4)
pulmão; (5) fígado; (6) baço; (7) intestino; (8) linfonodo mesentérico e (9) rim.
58
Os dados referentes a identificação do DNA do PCV2 em
fragmentos de tecidos são mostrados no Quadro 11 e na Figura 18.
QUADRO 11- Positividade para PCV2 nos fragmentos de tecidos coletados dos
suínos de granjas de criação intensiva no Estado de Goiás, no período de
março de 2009 à janeiro de 2010
(+)reação positiva (-)reação negativa
FIGURA 18- Frequência de positivos em relação ao tecido avaliado
Todos os 47 animais amplificaram DNA viral em mais de um ou em
todos os fragmentos analisados. Entre as amostras positivas, observou-se que
o pulmão foi o órgão no qual o DNA do PCV2 foi identificado com maior
frequência (100%), como demonstrado na Figura 18.
59
5.3 Validade dos testes diagnósticos
5.3.1 Soros
Na Tabela 8 estão demonstrados os dados para análise da validade
dos testes em que foram utilizados soros.
TABELA 8- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com
soros de suínos
Soros
PCVAD
Hígidos
TOTAL testes
Positivos
23
6
29
Negativos
2
16
18
TOTAL Animais
25
22
47
Em relação aos soros, a sensibilidade dos testes foi de 92%
(IC=95%, [85,7 - 98,3]), a especificidade de 73% (IC=95%, [65 - 81]), o valor
preditivo positivo de 79% (IC=95%, [72 - 86]), o valor preditivo negativo de 89%
(IC=95%, [80 - 98]), a razão de verossimilhança positiva de 3,4, a razão de
verossimilhança negativa de 0,11 e a acurácia de 82%.
De acordo com os dados, o teste com soros tem boa precisão para
diagnosticar indivíduos positivos na presença de doença, porém sua
confiabilidade, determinada pelo valor preditivo positivo e acurácia, é apenas
satisfatória. Além disso, o baixo valor de especificidade demonstra que não
houve boa precisão na detecção de negativos na ausência de doença.
5.3.2 Suabes orais
Na Tabela 9 estão demonstrados os dados para análise da validade
dos testes em que foram utilizados suabes orais.
60
TABELA 9- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com
suabes orais de suínos
Suabes orais
PCVAD
Hígidos
TOTAL testes
Positivos
17
7
24
Negativos
8
15
23
TOTAL Animais
25
22
47
Nos testes com suabes orais, a sensibilidade observada foi de 68%
(IC=95%, [54 - 82]), a especificidade de 68% (IC=95%, [54 - 82]), o valor
preditivo positivo de 71% (IC=95%, [58 - 84]), o valor preditivo negativo de 65%
(IC=95%, [51 - 79]), a razão de verossimilhança positiva de 1, a razão de
verossimilhança negativa de 0,47 e a acurácia de 68%.
De acordo com os dados, o teste com suabes orais não apresentam
boa precisão e confiabilidade em determinar verdadeiros positivos e
verdadeiros negativos.
5.3.3 Suabes nasais
Na Tabela 10 estão demonstrados os dados para análise da
validade dos testes em que foram utilizados suabes nasais.
Tabela 10- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com
suabes nasais de suínos
Suabes nasais
PCVAD
Hígidos
TOTAL testes
Positivos
17
7
24
Negativos
8
15
23
TOTAL Animais
25
22
47
61
Nos testes com suabes nasais, a sensibilidade observada foi de
100%, a especificidade de 0%, o valor preditivo positivo de 53%, o valor
preditivo negativo de 1%, a razão de verossimilhança positiva de 100, a razão
de verossimilhança negativa de 1 e a acurácia de 53%.
De acordo com os dados, o teste com suabes nasais apresentam
elevada precisão em determinar verdadeiros positivos. Entretanto, devido a
baixa especificidade, pode incitar erros quanto a resultados falso positivos.
5.3.4 Fezes
Na Tabela 11 estão demonstrados os dados para análise da
validade dos testes em que foram utilizadas amostras fecais.
TABELA 11- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com
fezes de suínos
Fezes
PCVAD
Hígidos
TOTAL testes
Positivos
19
2
21
Negativos
6
20
26
TOTAL Animais
25
22
47
.
Nos testes com amostras fecais, a sensibilidade observada foi de
76% (IC=95%, [64 - 88]), a especificidade de 91% (IC=95%, [83 - 99]), o valor
preditivo positivo de 90% (IC=95%, [82 - 98]), o valor preditivo negativo de 76%
(IC=95%, [64 - 88]), a razão de verossimilhança positiva de 8,4, a razão de
verossimilhança negativa de 0,26 e a acurácia de 83%.
De acordo com os dados, o teste com amostras fecais apresentam
elevada precisão em determinar verdadeiros negativos. Entretanto, devido a
baixa sensibilidade, pode incitar erros quanto a resultados falso negativos.
62
5.4 Identificação do TTV
Nas reações de PCR dos soros, 47% (22/47) das amostras
amplificaram fragmentos específicos para o TTV suíno. Destas, 19% (9/47)
amplificaram um produto de 349pb correspondente ao TTV1, enquanto que
32% (15/47) foram positivas para o TTV2, amplificando um produto de 671pb
(Figuras 19 e 20). Amplificaram os dois tipos virais, 13% (6/47) das amostras.
FIGURA 19- Reação de PCR para TTV1 a partir de soros de suínos de sistema
intensivo de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (1-13)
Soros dos animais 1 a 13.
FIGURA 20- Reação de PCR para TTV2 a partir de soros de suínos de sistema
intensivo de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (1-13)
Soros dos animais 1 a 13.
5.4.1 Coinfecção PCV2 e TTV
Os resultados relativos a identificação do DNA de PCV2 e TTV's são
evidenciados na Figura 21.
63
Figura 21 - Resultados referentes a identificação de coinfecção entre o
circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e o torque teno vírus (TTV1, TTV2, TTV1/TTV2).
Das amostras de soro analisadas para PCV2 e TTV, 17% (8/47)
amplificaram apenas o fragmento de DNA do PCV2. A identificação apenas do
fragmento de DNA do TTV2 ocorreu em 6% (3/47) das amostras. Em 30%
(14/47) das amostras nenhum dos DNA’s virais pesquisados foi identificado.
A coinfecção entre PCV2 x TTV foi identificada em 45% (21/47) das
amostras. Destas, 76% (16/21) foram provenientes de animais com PCVAD e
24% (5/21) de animais hígidos. Estes dados indicam que as chances de
identificar uma coinfecção em animais com manifestações clínicas associadas
à PCVAD é 90% maior que nos animais sem nenhuma manifestação, conforme
RAP=1,9 (p<0,05). Com relação ao sexo, de acordo com os dados OR= 0,58
(IC=95%, [0,33 - 1,01], p>0,05), as chances de amplificar fragmentos de DNA
de TTV é 1% maior em fêmeas.
64
PCV2 associado ao TTV1 foi amplificado em 33% (7/21) das
amostras, sendo que 71% (5/7) destas originaram-se de animais da creche que
apresentavam sinais clínicos respiratórios. Na recria, apenas uma amostra
(29% - 2/7) desta associação foi obtida de um macho que também apresentava
problemas respiratórios. Assim, houve maior amplificação nas amostras
procedentes de fêmeas 71% (5/7), em comparação aos machos 29% (2/7).
A coinfecção entre PCV2 e TTV2 foi obtida em 38% (8/21) das
amostras, sendo 25% (2/8) proveniente dos animais da fase de creche sem
sinais clínicos de PCVAD e 75% (6/8) da recria, na qual a identificação ocorreu
em dois machos com sinais clínicos e quatro fêmeas, duas com manifestações
clínicas.
Curiosamente, na granja E foi detectada apenas a associação entre
PCV2 e TTV1. Já nas granjas C e F, foi detectada somente a associação entre
PCV2 e TTV2.
A amplificação dos três tipos virais (PCV2/TTV1/TTV2) em uma
mesma amostra ocorreu em 29% (6/21) das análises, três em cada fase de
criação, sendo 83% (5/6) provenientes de animais com expressão clínica de
PCVAD e 67% (4/6) provenientes de fêmeas.
65
6. DISCUSSÃO
A circovirose suína é uma doença que acomete os plantéis suínos
em todo mundo e, devido ao impacto econômico gerado, tem sido considerada
uma das doenças mais importantes da atualidade. Este fato apresenta dois
lados distintos. O primeiro está relacionado à busca por um melhor
entendimento a respeito da doença e dos mecanismos de transmissão e
patogenia, visando alternativas para o controle e prevenção da infecção ou
mesmo da enfermidade. O segundo ponto refere-se ao diagnóstico equivocado
e muitas vezes precoce que enfermidades que cursam com emagrecimento
progressivo, o sinal clínico mais pronunciado da circovirose, podem gerar. Por
estar disseminada na população suína, a infecção dos suínos pelo PCV2 é
bastante frequente. No entanto, para se estabelecer o diagnóstico definitivo da
doença é necessário que os três pressupostos sejam preenchidos: sinais
clínicos, achados macro e microscópicos característicos e identificação do
agente nas lesões, conforme afirmado por SEGALÉS (2007).
No Estado de Goiás, a vacinação contra o agente é uma prática
comum. Apesar de alguns relatos que apontassem para a circulação do PCV2
na região desde 2001, o diagnóstico da CS ainda não foi estabelecido. A
realização deste estudo permitiu identificar a infecção pelo PCV2 nas seis
granjas avaliadas em duas microrregiões com volume médio de produção de
suínos, nas quais ainda não era realizada vacinação. A indicação desta
ferramenta é realizada quando os prejuízos com definhamento e/ou
mortalidade de animais em um plantel atinge índices elevados, uma vez que as
vacinas existentes atualmente no mercado não promovem cura ou prevenção,
mas são capazes de induzir uma redução nos sinais clínicos tais como
refugagem, pneumonias e diarreias, SDNS e falhas reprodutivas atribuídas ao
PCV2, assim como melhorarem o ganho de peso e a conversão alimentar e
reduzir a mortalidade de animais (ARAÚJO et al., 2002; FACHINGER et al.,
2008; THACKER et al., 2008).
Nos casos analisados neste estudo, os principais sinais clínicos dos
animais e as lesões macroscópicas observadas nos diversos órgãos são
semelhantes às citadas na literatura (SEGALÉS, 2004; CORREA et al., 2006).
66
Apesar de o emagrecimento progressivo, principal indicativo da doença, estar
presente na maioria dos animais, outros sinais clínicos compatíveis com a
PCVAD, como diarreia e tosse foram observados. A identificação destes sinais
reforça a ideia de que doenças entéricas e do complexo respiratório, das quais
o PCV2 faz parte, são frequentemente observadas nas explorações intensivas
de suínos em Goiás, semelhante ao que ocorre em outros locais
(CALSAMIGLIA et al., 2002; SEGALÉS et al., 2004; OPRIESSNIG et al., 2007;
CǍTANA et al., 2010).
As observações de alterações macroscópicas que,
embora também denotem a indicação de infecção por PCV2, precisam ser
associadas a um quadro microscópico característico para diagnóstico
confirmativo de CS. Ainda que a presença dos sinais e as observações
macroscópicas sejam indicativas da doença, a maioria destes é inespecífica e
podem ser relacionados a outras enfermidades. Contudo, a observação destes
achados neste estudo contribuiu para a identificação de propriedades com
casos suspeitos de PCVAD e consequentemente, para orientação na seleção
dos animais e coleta de amostras.
Sabe-se que a severidade e o tipo de manifestação clínica podem
variar consideravelmente entre os suínos, podendo alguns animais não
apresentarem quaisquer sinais característicos da doença (MADEC et al., 2008).
Nos animais avaliados, a maior detecção do agente ocorreu naqueles que
apresentavam alguma manifestação clínica quando comparados aos hígidos,
independente do espécime clínico analisado. Este fato pode estar relacionado
a uma maior excreção viral nos indivíduos afetados pela CS (GRAU-ROMA et
al., 2011). Ainda, a detecção em animais hígidos pode sugerir uma infecção na
forma subclínica, uma vez que trata-se de uma doença multifatorial que pode
ser expressa na medida em que concorrem cofatores infecciosos e não
infecciosos, além de ser dependente da resposta imune de cada indivíduo
(MADEC et al., 2008). OPRIESSNIG (2008) também descreve a ocorrência de
infecções subclínicas em plantéis e define esta como a presença de animais
sorologicamente positivos, virêmicos, mas com ausência de sinais clínicos.
Os resultados confirmam, como já foi demonstrado por outros
(KRAKOWKA et al., 2000; BOLIN et al., 2001; SHIBATA et al., 2003; SIBILA et
al., 2004, SEGALÉS et al., 2005), que o genoma do PCV2 é potencialmente
67
detectável em diferentes espécimes clínicos. A presença do vírus nos suabes
nasais e orais e fezes nesse estudo corroboram o sugerido por GRAU-ROMA
et al. (2008) que apontaram a via oronasal como, provavelmente, a principal via
de transmissão horizontal do PCV2.
A identificação do PCV2 em 100% dos suabes nasais analisados
neste estudo, pode indicar ser este o sítio de infecção e pode estar relacionado
ao fato de ter sido observada uma maior ocorrência de sinais respiratórios
associados à manifestação clínica de PCVAD. Contudo, como a detecção viral
neste espécime ocorreu de forma semelhante em animais acometidos de
doença e naqueles com uma possível infecção inaparente, este tipo de amostra
não se mostra útil para auxiliar no estabelecimento do diagnóstico de rotina da
doença. Todavia, ele pode ser utilizado para o diagnóstico de infecção no
rebanho, ou seja, quando se deseja realizar um rastreamento da doença no
grupo populacional.
Neste mesmo sentido, as amostras de soros podem ser utilizadas
com maior segurança para esta diferenciação, na medida em que os resultados
apontaram para uma maior sensibilidade destas, ou seja, para uma maior
identificação do agente em animais acometidos por doença clínica. Além disso,
de acordo com os resultados, as fezes podem ser utilizadas para confirmação
de diagnóstico de animais verdadeiramente negativos, por serem mais
específicas. Assim, em populações com baixa prevalência, o ideal seria realizar
os testes de rastreamento com suabe nasal e confirmatórios com amostras
fecais e soros, visando reduzir o número de animais falso positivos e otimizar
estratégias de controle e prevenção.
Com base nestes dados, sugere-se que o epitélio nasal possa ser o
sítio de infecção e que a doença clínica coincida com a viremia. Estes
resultados ratificam os descritos por MADSON et al (2009) e SEGALÉS et al.
(2005). Os autores afirmam que normalmente se observa que a doença clínica
associada à PCVAD é precedida de baixa titulação de anticorpos e do aumento
de vírus circulante. Além disso, quanto ao material utilizado para análise,
parece haver maior carga viral em soros de animais afetados pela CS, seguido
de suabes orais, nasais, fecais e urinários quando comparados aos mesmos
espécimes obtidos de animais hígidos.
68
Diferente do observado nesta pesquisa, que demonstrou haver uma
maior detecção do DNA do PCV2 nas fêmeas e entre estas, naquelas que
apresentavam alguma manifestação clínica, estudos de campo indicaram que
machos castrados são mais suscetíveis que as fêmeas (CORRÉGÉ, 2001;
RODRÍGUEZ-ARRIOJA et al., 2002). Os autores sugerem que ao invés de
verdadeiramente ligada ao sexo, essa diferença possa ser devido à castração.
Além disso, os mesmos autores destacam que alterações hormonais podem
influenciar numa maior predisposição dos animais à manifestação clínica da
doença. Como as alterações hormonais são mais pronunciadas no gênero
feminino, a maior ocorrência de manifestações clínicas com identificação do
agente em fêmeas neste estudo pode ser creditada a este fator. Todavia,
outras investigações se fazem necessárias para averiguar a importância
biológica destas informações.
Os coeficientes de identificação encontrados na creche e na recria
estão de acordo com os valores de obtidos por CIACCI-ZANELLA (2005) em
animais das mesmas fases em granjas da Região Sul brasileira. SEGALÉS et
al. (2005) destacam que a infecção é mais frequente em animais mais velhos
do que em suínos jovens. Este fato pode estar relacionado à dinâmica de
infecção pelo PCV2 já que quase todos os leitões apresentam elevado título de
anticorpos contra PCV2 derivados do colostro e não desenvolvem viremia até
que estes anticorpos diminuam. Aliado a diminuição dos anticorpos maternos, o
animal entra em contato com o agente presente no plantel e contrai a infecção
(LAROCHELLE et al, 2003;. GRAU-ROMA et al., 2009). Esta presença do
agente no plantel pode explicar porque alguns permanecem persistentemente
infectados e eliminando o vírus, apesar da maioria soroconverter. Aliado a isto,
está o fato de que em alguns animais há uma ineficiência da resposta imune
em limitar a replicação viral no momento anterior à soroconversão, culminando
com a presença do vírus nos órgãos linfóides e com a imunodepressão
(RODRÍGUEZ-ARRIOJA et al., 2002). Os animais persistentemente infectados,
juntamente com animais em fase de infecção aguda, podem, então, ser
responsáveis pela manutenção do agente viral no meio ambiente. Nestes
casos, a mistura de lotes no momento da desmama, fator frequentemente
identificado na suinocultura em Goiás, pode favorecer o estabelecimento da
69
infecção. Entretanto, a ocorrência ou não de manifestações clínicas associadas
ao
vírus
permite
julgar que
são
necessárias causas adicionais ou
circunstâncias particulares (fatores de risco) que acionem a replicação viral ao
ponto de suplantar o sistema imunitário (MADEC et al., 2008). Assim, além do
fator mistura de lotes já citado, e da característica imunossupressora do vírus,
situações estressantes,
como
aumento de
densidade
populacional e
coinfecções, entre outros como os demonstrados no Quadro 9, comuns na
época da desmama, propiciam uma frequência mais elevada da CS em suínos
com dois a quatro meses de idade, ou seja, final da fase de creche e início da
fase de recria, como observado neste estudo.
A identificação do genoma em todos os espécimes clínicos e em
todos os tecidos analisados está de acordo com o descrito na literatura
(CALSAMIGLIA et al., 2002; SEGALÉS et al., 2005; GRAU-ROMA et al., 2011).
Neste estudo, o pulmão foi órgão onde mais se identificou o DNA do PCV2 e
também pode ser devido ao elevado índice encontrado de sinais e alterações
macroscópicas relacionadas ao sistema respiratório.
A maioria dos autores relata um percentual mais elevado de
identificação de DNA viral em órgãos linfóides. Nesses casos, é usual observar
também a detecção do vírus no soro e/ou em secreções orais (CALSAMIGLIA
et al., 2002; SEGALÉS et al., 2005; LOPES, 2009). Contudo, em nosso estudo,
a identificação em órgãos linfoides, apesar de observada, não foi maior que a
identificada nos pulmões. Além disso, nem sempre foi caracterizada uma
relação entre identificação viral em órgãos linfoides e no soro e vice-versa. Tais
observações permitem sugerir que quando os animais estão acometidos por
enfermidades do complexo respiratório, uma maior detecção do vírus pode ser
observada nas secreções nasais e no pulmão. Esta constatação está de
acordo com o destacado por KRAKOWKA et al. (2005) de que a presença de
PCV2 nos tecidos está diretamente relacionada com as manifestações clínicas
subsequentes.
Curiosamente nas amostras fecais, a maior positividade foi
encontrada em granjas nas quais o sinal clínico de diarreia foi observado. Além
disso, as amostras negativas foram provenientes de animais de creche, sem
nenhuma evidência clínica de CS. Este fato demonstra que o PCV2 pode
70
ocorrer em animais com ou sem doença entérica e que pode ser excretado
rotineiramente com as fezes de suínos doentes e saudáveis. Assim, a
propagação fecal-oral pode ser um modo prático de transmissão deste vírus,
especialmente em animais mais velhos, o que já foi confirmado por outros
estudos (YANG et al., 2003; SEGALÉS et al., 2005). Na indústria suína, o
conhecimento sobre a introdução e os modos de propagação do vírus são
fundamentais para a prevenção e erradicação de PCV2 dos rebanhos.
A pesquisa do DNA viral de TTV e PCV2 nas amostras de soro,
coinfectando os animais, indicou que o TTV também circula entre os suínos de
criações intensivas de Goiás. Ambos os genótipos, TTV1 e TTV2, foram
identificados, com maior ocorrência do genótipo 2 em relação ao genótipo 1.
Os genótipos podem ocorrer separadamente ou coinfectando um mesmo
animal (CIACCI-ZANELLA
et al., 2009b; RITTERBUSCH, 2009), o que foi
observado também nesse estudo.
Com relação à ocorrência nas fases de criação, neste estudo houve
uma maior suscetibilidade de leitões à infecção pelo TTV1 do que os animais
de recria. Resultado semelhante foi observado por MARTELLI et al. (2006) que
também detectaram o DNA de TTV1 com frequência maior em animais jovens.
Já para o TTV2, uma maior ocorrência foi observada nos animais de recria,
diferentemente do relatado por MARTELLI et al. (2006), que encontrou uma
maior prevalência deste genótipo em javalis jovens.
Poucos são os relatos sobre uma possível ligação entre o sexo e a
suscetibilidade a infecção por TTV. Neste estudo, as fêmeas apresentaram um
maior índice de infecção do que os machos para os dois genótipos avaliados.
Num experimento com javalis, MARTINÉZ et al. (2006) demonstraram que as
fêmeas apresentam uma maior taxa de infecção por TTV2 que os machos.
Assim como na infecção pelo PCV2, este efeito pode estar mais relacionado a
fatores individuais que ao sexo em si, indicando a necessidade de maiores
investigações.
Coinfecções de PCV2 com outros agentes são apontados na
literatura como importantes fatores de desenvolvimento da circovirose
(KRAKOWKA et al., 2000, FERNANDES et al., 2006; LÓPEZ-SORIA et al.,
2008). Análises experimentais em suínos envolvendo PCV2 e outros agentes
71
virais demonstraram um aumento da carga viral de PCV2, das lesões
associadas ao vírus e da incidência da PCVAD (OPRIESSNIG et al., 2007).
Dentre os agentes que têm sido incluídos em investigações de coinfecção, o
TTV tem assumido papel de destaque, por ser ubíquo, assim como o PCV2,
(KEKARAINEN et al., 2006) e por apresentar coinfecção em um elevado
número de casos de CS (ELLIS et al., 2008; SIBILA et al., 2009).
KEKARAINEN et al. (2006) identificaram uma maior frequência de
TTV em animais infectados pelo PCV2 e acometidos pela CS em relação aos
não afetados (97% versus 78%) e o consideraram como um suposto
desencadeador de quadros clínicos de CS. Este fato pode ser observado
também neste estudo, uma vez que as chances de identificar uma coinfecção
em animais com manifestações clínicas associadas à PCVAD foi 90% maior
que nos animais sem nenhuma manifestação. Resultados semelhantes foram
descritos por GAGNON et al. (2007), ao investigar a ocorrência do TTV em
casos mais severos de CS em rebanhos norte-americanos.
Estes relatos levantam a possibilidade de um papel do TTV na
apresentação da CS. Embora uma ligação clara entre o TTV e PCV2 e as
PCVAD ainda não esteja definida, fica evidente a necessidade de mais
pesquisas que esclareçam o papel de ambos na epidemiologia e patogenia das
doenças suínas associadas. Apesar de bastante relatados em suínos, a
importância biológica destes achados ainda não está esclarecida.
Os dados aqui apresentados comprovam a coinfecção entre PCV2 e
TTV e o maior risco de animais com PCVAD apresentarem esta coinfecção e
podem apontar para uma possível participação do TTV no desenvolvimento
das enfermidades, o que não foi possível avaliar devido ao baixo universo
amostral.
Assim, sugere-se a realização de novas investigações para elucidar
questões referentes ao papel do TTV como agente isolado ou quando
relacionado a infecções pelo PCV2. Todavia, mais estudos sobre a
epidemiologia molecular e investigações sobre a real ocorrência das PCVAD,
com diagnóstico confirmativo das mesmas, devem ser realizados a fim de
elucidar pontos ainda obscuros sobre a patogenia da circovirose suína e sua
presença no Estado de Goiás e no Brasil.
72
7. CONCLUSÕES
O presente estudo permitiu concluir que:
O PCV2 circula nas granjas com sistema intensivo de criação de suínos do
Estado de Goiás, tanto em animais doentes como nos clinicamente saudáveis;
 A elevada ocorrência das manifestações clínicas relacionadas ao sistema
respiratório indica que este possa ser um dos sinais clínicos mais
frequentemente associados à PCVAD em suínos no Estado e que o PCV2 é
um agente que participa na patogenia das denominadas doenças do complexo
respiratório suíno;
O TTV circula entre os suínos de criação intensiva em Goiás;
Coinfecções entre ambos os genótipos de TTV ocorre em suínos infectados
pelo PCV2, sugerindo a possível relação entre os agentes;
A maior sensibilidade e especificidade em soros e fezes, respectivamente,
aponta que esses espécimes devem ser combinados para realização de
diagnósticos de rotina;
 Esse foi o primeiro estudo que identificou Circovírus suíno tipo 2 e Torque
teno vírus, tipos 1 e 2, em amostras de suínos de criação intensiva do Estado
de Goiás.
73
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos neste trabalho reforçam os conhecimentos
sobre epidemiologia e dinâmica de infecção por PCV2 nas explorações
intensivas de suínos no Estado de Goiás e no Brasil.
De forma a otimizar a lucratividade das explorações intensivas de
suínos, deve existir um adequado monitoramento da infecção por PCV2 por
meio de um correto diagnóstico clínico, confirmado por provas de diagnóstico
laboratorial adequadas, evitando que uma ferramenta tão importante de
controle e prevenção, como as vacinas, seja utilizada com indicações e de
maneira incorretas. O uso inadequado muitas vezes mascara o real problema
sanitário das granjas devido à presença de coinfecções recorrentes e ao
caráter imunossupressor do PCV2.
Apesar das indicações clínicas, macroscópicas e moleculares da
ocorrência de circovirose suína e doenças associadas no Estado, outras
investigações precisam ser realizadas para um diagnóstico confirmativo da
síndrome. Além disso, nenhum estudo que avaliasse a distribuição genética
das amostras, em granjas comerciais, foi conduzido em Goiás. O conhecimento
da variabilidade genotípica poderá auxiliar no desenvolvimento de métodos de
diagnósticos de rotina no Estado e na região Centro-Oeste, bem como no
direcionamento de estratégias para controle e prevenção do complexo
circovirose suína, uma vez que poderá demonstrar se há relação entre o tipo
viral circulante e a manifestação clínica observada.
Muitos autores defendem que o PCV2 isoladamente não consegue
induzir doença. Ou seja, as manifestações clínicas provocadas por este agente
necessitam de fatores desencadeantes. Esta nova realidade que representam
as doenças multifatoriais é um desafio para produtores e veterinários. Não é
possível encarar estas doenças como consequência da infecção por parte de
um agente patogênico, mas como reflexo de uma conjugação de fatores.
Assim, outras investigações não só em torno do TTV, mas de outros
microrganismos e de condições individuais dos animais, tais como influências
do sexo, idade e especialmente relacionados à imunologia do hospedeiro e do
74
agente, poderão esclarecer as dúvidas existentes sobre a circovirose suína e
abrir pressupostos para o entendimento de outras doenças multifatoriais.
75
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98
ANEXOS
ANEXO 1 - Ficha individual dos animais
Nome da granja:
Idade:
Número do animal:
Peso:
Sexo:
Fase:
Sinais clínicos:



diarreia
 sintomas respiratórios

Achados de necropsia:
inguinais
hipotrofia do timo
ausência de colabamento pulmonar
consolidação pulmonar
esplenomegalia
pontos esbranquiçados no parênquima renal
severa hipertrofia renal
difusa aderência da cápsula renal
irregularidade de superfície
úlcera gastroesofágica
lesões de pele (manchas avermelhadas)
Observações: