(pcv2) - fase de padronização do culti

UTILIZAÇÃO DE BACULOVÍRUS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DO
CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 (PCV2) - FASE DE PADRONIZAÇÃO DO CULTIVO
CELULAR
Autores: Keila Catarina PRIOR, Talita Carina BOGONI e Diogenes DEZEN.
Identificação autores: Bolsista PIBITI/CNPq; Coautora; Orientador IFC-Câmpus Concórdia.
Introdução
A circovirose suína é uma doença infectocontagiosa de distribuição mundial, causada
pelo circovírus suíno tipo 2. A forma mais frequente e importante de manifestação dessa
enfermidade é a Síndrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (SMDS), caracterizada
pelo emagrecimento rápido e progressivo. Atualmente a circovirose é considerada uma
doença endêmica no Brasil, pois tem apresentado um aumento gradual em número de casos
clínicos com confirmação laboratorial (MORÉS et al., 2007).
O PCV2 é considerado um dos patógenos mais importantes em suínos, causando
sérios prejuízos econômicos devido à elevada mortalidade, atraso na produção ou pela
ocorrência de infecções secundárias associadas ao vírus. O principal problema da SMDS é a
sua duração nos rebanhos, podendo persistir por vários meses se medidas de controle
apropriadas não forem adotadas. As taxas de mortalidade podem triplicar nas fases de creche
e terminação, podendo normalizar dentro de alguns meses (CIACCI-ZANELLA, 2007).
Uma alternativa importante para o controle da doença baseia-se na utilização de
vacinas, as quais estão sendo aplicadas nos rebanhos brasileiros desde 2008, sendo que até
esse momento, a prevenção era baseada única e exclusivamente na correção de fatores de
risco para a infecção (CIACCI-ZANELLA & MORÉS, 2003).
Dentre os genótipos já identificados, o PCV2a foi incialmente o mais prevalente em
suínos afetados pela SMDS até 2003, e as vacinas comerciais foram desenvolvidas baseadas
neste genótipo. No entanto o PCV2b emergiu globalmente, sendo associado a surtos mais
severos da SMDS, tornando-se o genótipo prevalente em suínos do mundo inteiro (CIACCIZANELLA et al. 2015).
Atualmente existem quatro vacinais comerciais registradas na maioria dos países,
inclusive no Brasil. No entanto, elas ainda são de alto custo e todas são construídas a partir de
amostras do vírus ocorrentes em outros países e baseadas no genótipo PCV2a (CIACCIZANELLA et al. 2015).
Portanto, o desenvolvimento e uso de vacinas com cepas autóctones poderia contribuir
na melhoria de imunidade de rebanhos locais, haja vista que podem existir diferenças
antigênicas importantes entre cepas. Neste sentido, em experimentos prévios, realizados na
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, foram produzidas três construções de
baculovírus recombinantes capazes de produzir e secretar a proteína do capsídeo (ORF2) do
PCV2, proteína esta originada de uma amostra autóctone, representativa das amostras de
PCV2b circulantes no Brasil.
Visando a continuidade do experimento, novas etapas que otimizem a produção da
proteínas recombinantes são necessárias. Uma destas etapas é o estabelecimento de um
sistema de cultivo celular, o qual foi o objetivo deste trabalho, e será descrito a seguir.
Material e Métodos
Para o cultivo celular, foram utilizadas garrafas de cultivo de 75cm² de superfície,
contendo células da linhagem Sf21, as quais são derivadas de tecido ovariano da lagarta
Spodoptera frugiperda.
O repique foi realizado seguindo as recomendações previamente descritas
(INVITROGEN, 2002) e em condições assépticas. Para garantir estas condições, o repique foi
realizado em cabine de segurança biológica, onde se realizou a desinfecção desta com luz
ultravioleta durante trinta minutos e todo material utilizado no cultivo foi submetido
anteriormente a processo de esterilização.
O repique celular foi realizado em garrafas com cerca de 80-90% de confluência da
monocamada de células. Para a análise da confluência, observou-se as a monocamada em
estereomicroscópio, sob aumento de 40x. Em seguida, realizou-se a remoção do meio de
cultivo presente nas garrafas e adicionou-se 4 mL do meio de cultivo TC-100 suplementado
com 10% de soro fetal bovino. Posteriormente realizou-se ação mecânica sobre as garrafas
para que as células se desprendessem da parede e fossem ressuspendidas no meio de cultivo.
Com o auxílio de uma pipeta fez-se a homogeneização da suspensão e realizou-se a
transferência de 2 mL dessa, para uma nova garrafa. Em seguida completou-se o volume final
de 15 mL desejado para cada garrafa com a adição de 13 mL do meio de cultivo em cada.
Posteriormente as garrafas foram incubadas a 27ºC em atmosfera ambiente, até atingirem 8090% de confluência, o que foi obtido entre o 4º e 5º dia.
Resultados e Discussão
Através do acompanhamento diário do desenvolvimento dos cultivos realizados,
observou-se que a formação de 80-90% de confluência da monocamada ocorre em média no
período de quatro a cinco dias (Figura 01). Portanto a periodicidade dos repiques deve ser
cumprida estritamente, pois a divisão celular exacerbada causa o fenômeno de inibição por
contato, caracterizado por interrupção da divisão celular por consequência do contato físico
entre duas células, devido a um excesso de densidade celular em um meio de cultivo, gerando
atrasos na multiplicação da linhagem de célula (Alves e Guimarães, 2010).
Além disso, deve-se ressaltar que o cultivo celular é um procedimento muito
suscetível a contaminações, uma vez que utiliza de meios ricos em nutrientes e a presença de
contaminantes no cultivo leva a morte celular e consequente perda do procedimento (Alves e
Guimarães, 2010).
Figura 01: Cultivo celular observado em estereomicroscópio demonstrando
aproximadamente 80% de confluência. Aumento de 40x
Considerações Finais
A multiplicação de células em laboratório é um processo que requer inúmeros
cuidados e o estabelecimento dos procedimentos demanda tempo, uma vez que falhas
resultam em morte celular e o processo deve ser retomado. Atualmente, a pesquisa encontrase em andamento e após o completo estabelecimento do cultivo celular, o próximo passo será
a infecção das células com os estoques virais, visando determinar qual dos baculovírus
recombinantes produzirá a proteína codificada pela ORF2 com maior eficiência e eficácia.
Referências
ALVES, E. A.; GUIMARÃES, A. C. R. Capítulo 5: Cultivo celular. In: MOLINARO, E.;
CAPUTO, L.; AMENDOEIRA, R. Conceitos e métodos para formação de profissionais em
laboratórios de saúde. Vol 2. Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2010. p. 215-253.
CIACCI-ZANELLA, J. R. Circoviridae. In: FLORES, E.F. (Ed.) Virologia Veterinária. Santa
Maria: UFSM, 2007. p. 363-374.
CIACCI-ZANELLA, J. R.; SCHAEFER, R.; GAVA, D. et al. Novos conhecimentos sobre a
infecção por PCV2 e a emergência de novas estirpes virais. In: IX SINSUI Simpósio
Internacional de Suinocultura. Anais… Porto Alegre: UFRGS, 2015. p. 207-220.
INVITROGEN. Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell
Culture Techniques. 2002. p. 30. Disponível em <https://tools.thermofisher.com/content/
sfs/manuals/bevtest.pdf>. Acesso em 20 de agosto de 2014.
MORÉS,
N.;
BARCELLOS,
D.;
CIACCI-ZANELLA,
J.
Circovirose
suína.
In:
SOBESTIANSKY, J., BARCELLOS, D. (Ed.) Doença dos Suínos. Goiânia: Canône
Editorial, 2007. p. 213-225.