Slide 1 - ppgbqa
Propaganda
Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Centro de Ciências Biológicas Programa de Bolsas REUNI Proteômica Florianópolis, 23 de novembro de 2010 Proteômica A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA. Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo, podendo caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares. Proteômica Proteômica é a técnica utilizada para identificar todas as proteínas expressas por um genoma em um determinado tempo/espaço com o principal objetivo de elucidar os produtos gênicos a nível protéico. Tempo Núcleo Citoplasma Membrana Espaço Proteômica Proteômica Proteômica sistemática: mapa protéico Tecidos Células Compartimentos celulares Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência Desenvolvimento Interações hospedeiros Tratamentos entre microorganismos e Áreas de pesquisa : Caracterização do câncer Área de pesquisa : Neuroproteômica – Caracterização do cérebro humano 1999 Proteoma do cérebro de camundongo 2004 Proteoma de hipocampo humano 2001 Foi proposto pela HUPO a caracterização do Proteoma humano sob condições normais e patológicas 2005 Proteoma do complexo NMDA de camundongo em resposta à fármacos 2005 Proteoma do cérebro de rato 2005 Proteoma de M.P de hipocampo de camundongo 2008 Proteoma de hipocampo de rato sob exercício 2006 Proteoma do hipocampo de camundongo Revistas Etapas metodológicas Principais etapas metodológicas Tratamento do animal Extração das proteínas Focalização isoelétrica Eletroforese em gel 2-DE Digestão in gel Espectrometria de massa Isolamento de proteinas Extração da amostra Precipitado é re-extraído Lise da célula, proteção contra proteólise e fracionamento. Tampão de lise: Lise mecânica da célula Homogenato de ptns em gelo por 20 min Centrifugação 30 min a 12000 x g a 4º C Estratégias a serem tomadas: manter a amostra na menor 25 mM Tris HCl pH 7,2 10 mM CHAPS temperatura possível e utilizar o protocolo mais simples para 0,5 M NaCl evitar perda 5% glicerol (v/v) protéica. 1 mM PMSF SN1+ SN2 Proteínas nucleares Proteínas citoplasmáticas Proteínas membranares Quantificação das proteínas com 2D Quant Kit MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS : Bradford, Biureto, Lowry e Smith ou BCA. Solução com Íon cúprico (Cu+1) Proteínas totais Cu+1 Cu+1 Cu+1 Cu+1 Cu+1 Cu+1 Agente colorimétrico 480 nm Limpeza da amostra com Clean up Kit MÉTODOS BCA: Solução precipitante 100 ug /ul de proteína Centrifugação Pellet de Proteína pura Ressuspensão das ptns em 250uL tampão de reihidratação: 7 M Uréia 2 M Tiuréia 2%(p/v) CHAPS 0.5% de IPG buffer pH 3-10 18 mM DTT Baseada na precipitação por TCA Diversas moléculas são eliminadas: -DNA, lipídeos - Sais, detergentes 0,001% azul bromofeno de Solubilização da amostra Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia Agentes Surfactantes: CHAPS Agentes redutores: DTT Hidratação do strip Tiras de strip de 13 cm imobilizado com pH 3-10 Focalicalização isoelétrica (IEF) Strips foram removidos Ajuste dos eletrodos Cerâmica IEF Total: 15500 V/h e 25 uA/strip Strips foram posicionados Ettan IPGphor 3 Paper Pads umedecidos Eletroforese em gel bidimensional (2D) 1º DTT Separação das proteínas por pI 2º Iodoacetamida Gel poliacrilamida 12,5% Cuba vertical Hoefer SE Ruby Fixação: 8% de ácido fosfórico, 50% de etanol por 1 hora Separação das ptns por massa Coloração: Coomassie Blue G-250 por 24h Proteínas separadas por pI e massa Separação de proteínas com eletroforese em gel 2D Análise simultânea de diversas proteínas . Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes. Análise das imagens no gel Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa Presença ou Ausência de spots Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais) Digestão in gel Excisão dos spots Descoloração: Tripsinização 25 mM bicarbonato de amônio e 50% acetonitrila (entre os resíduos de lisina e arginina) Peptídeos são secos à vácuo Extração de petídeos: 50% de acetonitrila e 5% trifluoroacético Estocagem a -20ºC Identificação das proteínas por Espectrometria de Massa Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos. Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas. Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações póstraducionais das proteínas. Sistema à vácuo Amostras 2DE Fonte de ionização Analisador de massa Detector Espectômetro de Massa Peptídeos são homogenizados com pequenos compostos orgânicos Estes compostos reagem com a matriz orgânica ácido -ciano-4hidroxicinâmico Peptídios são ionizados Os íons são dessorvidos Espectômetro de Massa Os íons são acelerados alcançando alta energia cinética Colisão dos íons ao detector As massas dos fragmentos são separadas e detectadas As massas digeridas dos peptídeos são comparadas com uma lista de massas teóricas de peptídeos oriundas das ORFs do banco de dados do genoma de um organismo Espectômetro de Massa Identificação de cada proteína do mapa proteômico Proteômica Array-based protein interaction detection Array-based protein interaction detection Protein microarrays Proteomicworld.com
