4-Métodos para a Amplificação de Ácidos Nucleicos

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Técnicas de Biologia Molecular
em Microbiologia Clínica
TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO
DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de amplificação de
ácidos nucleicos
PCR
 Real Time PCR
 NASBA/TMA

PCR
OPTIMIZAÇÃO DO PCR
[MgCl2]
 Th
 [dNTP]
 [primers]
 [DNA]
 [inibidores]

Variantes do PCR
RT-PCR
RT
RNA
Nested PCR
1º PCR
2º PCR
PCR
cDNA
prod. ampl.
Nested - PCR
PCR Multiplex
Variantes do PCR








RT-PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
Assymetric PCR
Degenerate PCR
Hot Start PCR
In Situ PCR
Long-PCR






PCR-ELISA
PCR-RFLP
PCR-SSCP
RAPD-PCR
REP-PCR
Touchdown PCR
Técnicas de amplificação de
ácidos nucleicos
PCR
 Real Time PCR
 NASBA/TMA

Principio de funcionamento do
Real-Time PCR
Prof.Doutor José Cabeda
Detecção dos
produtos
de PCR
Montar uma reacção
Químicas Utilizáveis
Prof.Doutor José Cabeda
SYBR-Green I
3’
5’
Excitation
SG
SG
SG
3’
5’
SG
SG
SYBR-Green I
Excitation
Emission
5’
3’
SG
SG
SG
SG
SG
3’
5’
Detcção com SybGreen
Sybr-Green Detection





Intercalates to dsDNA
Inhibits DNA amplification
so concentration is critical
Detects specific and nonspecific targets
Low starting background
with large increase in
signal
Can run a melt curve to
look at product specificity
Detecção com sondas
Quimicas utilizáveis:
sondas taqman
Sequence specific probes: Dual labeled probes
5’
3’
5’
3’
3’
5’
Excitation
Excitation
3’
R
Q
Q
5’
Quimicas utilizáveis:
molecular beacons
Molecular Beacons I
FAM
DabCyl
10mer
25mer
Molecular Beacons II
Excitation
Emission
R
Q
Molecular Beacons III
Can be used to quantitation and
mutation detection
 Need beacons for the normal and
mutation sequence
 Design is difficult due to nature of
folding structure
 Expensive when compared to FRET

Quimicas utilizáveis:
sondas FRET
TM
Hyb-Probes
Oligo 1: Fluorescein
Oligo 2: Quencher
Transfer
Excitation
Emission
Prof.Doutor José Cabeda
Quenched FRET analysis
5’ 3’




Two labeled probes, FAM at the 5’ and
BH1 on the 3’
When the probes hybridize the FAM
energy is quenched by the BH1
After the product is amplified run a melt
curve to determine genotype
Different melt points are seen for normal
and mutation
Quimicas utilizáveis:
sondas Eclipse
F
Q
MGB
F
Q
Aplicações
Quantificação
Prof.Doutor José Cabeda
End Point
versus
Real-Time
Quantificação
Aplicações
Detecção de Mutações / SNP
Prof.Doutor José Cabeda
Detecção de mutações
Aplicações
Multiplex Detection
Prof.Doutor José Cabeda
Detecção simultânea de
vários produtos
Os equipamentos
Prof.Doutor José Cabeda
LightCycler
SmartCycler
Rotorgene





The samples spin continually during
a run at 500 rpm
The samples are heated and cooled
in a low mass air oven
Tubes are illuminated as they pass
the detector
On data acquisition energy is
averaged over 20 revolutions to give
the fluorescence of each sample
Four Channels
•
•
•
•
Ch1: ex 470nm, det 510nm
Ch2: ex 530nm, det 550nm
Ch3: ex 585nm, det 610nm
Ch4: ex 625nm, det 660nm
Near Patient Testing
Laboratório de Urgência
Técnicas de amplificação de
ácidos nucleicos
PCR
 Real Time PCR
 NASBA/TMA

NASBA/
NUCLISENS
Amplification:
schematic diagram
Primer 1
Legend:
• sense RNA
• antisense RNA
• sense DNA
• antisense DNA
Reverse Transcriptase
RNase H
Primer 2
Reverse Transcriptase
T7 RNA polymerase
Primer 2
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptase
RNase H
Primer 1
Técnicas de amplificação de
Sinal

bDNA (Quantiplex)
bDNA (I)
bDNA (II)
bDNA (III)
bDNA (IV)
bDNA (V)
SDA
DNA Plymerase
Restriction enzyme
Aplicações de técnicas de
amplificação de AN ao diagnóstico
microbiológico
Prof.Doutor José Cabeda
MÉTODOS CONVENCIONAIS
NO DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO
Caracterização microscópica
Crescimento “in vitro” em meios sintéticos
Caracterização bioquímica
Demonstração imunológica da presença dos/ contacto
com microorganismos
LIMITAÇÕES DOS
MÉTODOS CONVENCIONAIS
MÉTODO
Cultural
LIMITAÇÃO
EXEMPLOS
Meios e condições de
cultura especiais
Mycoplasma spp., Legionella
spp......
Culturas celulares
Vírus, bactérias intracelulares
obrigatórias
Incapacidade de crescer
“in vitro”
Microrganismos de
crescimento lento
M. leprae, T. pallidum, HPV,
HCV....
Mycobacterium spp., fungos
LIMITAÇÕES DOS
MÉTODOS CONVENCIONAIS
MÉTODO
Serológico
LIMITAÇÃO
Sem utilidade na fase aguda 
diagnóstico retrospectivo
Problemático no hospedeiro
imunocomprometido
Reactividade cruzada
Interpretação complexa
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
• Diagnóstico etiológico em tempo
Sensibilidade
Especificidade
Rapidez
clinicamente útil
• Evitar terapias empíricas
• Administração precoce de terapia
específica
• Diminuição do tempo e custos da
hospitalização
PCR Tempo Real
ÁREAS DE APLICAÇÃO
 Diagnóstico das Doenças Infecciosas
 Detecção de Resistência aos
Antimicrobianos
UBM - HGSA
O que fazemos (Microbiologia)

Microbiologia
 Detecção/quantificação de agentes patogénicos
 Vírus
 Bactérias
 Genotipagem viral
 Detecção de resistências a drogas
 Detecção de genótipos associados a
resistência
 Epidemiologia
 Infecção nosocomial
Áreas de Intervenção (II)
Urgentes

Virologia




Detecção de agentes
Identificação de agentes
Resistências a drogas
Microbiologia





Detecção de agentes
Identificação de agentes
Resistências a drogas
Hematologia

Doenças oncológicas
 Estudo de genes quimera
 Estudo de Doença Res.Mín.
 Estudo de monoclonalidade
 Estudo de Quimerismo

Não Urgentes
Hematologia/Imunologia
 Doenças Genéticas
 Monogénicas
• Estudo de Mutações
• Estudo de haplótipos
 Multifactoriais
• Estudo de polimorfismos
(factores genéticos de risco)
Anatomia Patológica
 Biópsias
 Detecção de patogénios
 Detecção de monoclonalidade
 ThinPrep
 Detecção de HPV
Virologia
Sistema Nervoso Central Transmissíveis p/ sangue
 HIV
 HSV1/2
 HBV
 EBV
 HCV
 CMV
 VZV
Outros
 HHV-6
 HTLV-1
 Enterovirus
 HPV

Poliomavirus (JCV e BKV)
Microbiologia



Detecção de bacterias
Micobacterium tuberculosis
Leptospira spp
Pneumonias atípicas












Legionella spp.
Legionella pneumophila
Legionella genus
Micoplasma pneumoniae
Chlamydia pneumoniae
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Helicobacter pylori
Clostridium difficile (tcdA,tcdB)
Bordetella pertussis
Borrelia burgdorferi
16S rDNA
Identificação de bactérias






Micobacterium tuberculosis complex
Micobacterium avium
Micobacterium avium complex
Micobacterium kanzasii
Micobacterium intracelulare
Micobacterium Gordonae
Resistencias a drogas

Meticilina
Glicopeptídeos
Rifampicina
Isoniazida

Antiretrovirais



Escolha da tecnologia (I)
Real-Time-PCR




Mais rápido (até 1 hora)
Mais sensível
Menor risco de contaminação
Uma só tecnologia faz
 Amplificação
 Detecção
 Caracterização
PCR convencional



Mais barato
Muitos protocolos disponíveis
Mais fácil de montar para:
 Multiplex
 Nested
Escolha da tecnologia (II)
R.A.P.I.D
(Yahoo)
LightCycler
SmartCycler
SmartCycler-TD
(cepheid)
(cepheid)
7000 / 7300 / 7500 / 7900HT
(Applied Biosystems)
MX3000P
MX4000
(Stratagene)
(Stratagene)
Rotorgene
MyiQ
(pyrosequencing) (BioRad)
Opticon
Chromo 4
(MJ Research)
(MJ Research)
http://www.biocompare.com/matrix/2838/Real-Time-Thermal-Cyclers-(Thermocyclers).html
Escolha da tecnologia (III)
LightCycler




O mais rápido (cerca de 20’)
Muitos protocolos disponíveis
32 amostras/corrida
Fluorocromos limitados na versão
original
SmartCycler



Bastante rápido (cerca de 30’)
Disponível em 25ml e 100ml:
 PCR preparatívos
 Aumento do input amostra
 Conversão de PCR
convencional facilitada
16 estações independentes
 16 programas simultânos
 Apenas 16 amostras
Infecções
víricas
do
SNC
HERPESVIRUS
ENTEROVIRUS

Sensitivity







HSV-1  200 copies/mL
HSV-2  100 copies/mL
VZV  500 copies/mL
CMV  315 copies/mL
HHV-6  1/50
EBV  1/10
Response time: 4
hours+

Sensitivity*







CoxA16  0.25 TCID50
CoxA9  0.036 TCID50
CoxB5  320 TCID50
Echo11  25 TCID50
Echo6  2000 TCID50
ENT71  56 TCID50
Response time: 4 hours
A vantagem do Nested
(Enterovírus)
TCID50/ml Lab1
Cox A9 3,9
Cox A16 0,25
Cox B5 320
320
32
32
56
ENT71
RHINO 3,2
0
Neg.
0
Neg.
+
10-2
+
10-4
+
10-5
+
10-6
+
10-7
+
10-8
+
+
-
Lab2
Lab3
Single Nested
++
++
-+/-+/--+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Single Nested
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
A vantagem do Nested
(Enterovírus)
Amostras clínicas (162 LCR)
Single RT-PCR
Nested RT-PCR
Positivas
13%
Negativas
87%
Negativas
56%
Positivas
44%
Detecção de bactérias
Leptospiras

Bacteriologia
 Leptospiras
 B.burgdorferi
 H.pylori
 M.pneumoniae
 C.pneumoniae
 L.pneumophila
 M.tuberculosis
 Bordetella Pertussis
 Clostridium difficile
B.burgdorferi
M.pneumoniae
H.pylori
M.tuberculosis
Helicobacter pylori
 Biópsias Gástricas Frescas
 Biópsias Gástricas Fixadas
Extracção de DNA:
 Homogeneização dos Tecidos
 Lise Celular
 Desnaturação Proteica
 Tampão de Lise de Tecidos
 Fast Prep
 Temperatura de 95 ºC
 Proteinase K
 Magna Pure LC
DNA Isolation Kit - Tissue
60 m
Helicobacter pylori
Detecção de H. pylori – Multiplex PCR em Tempo Real
Smart Cycler
 Urease
 -Globina (Controlo Interno)
 Ensaio “in house”
 2 Pares de Primers
(Urease / -Globina)
 Sondas TaqMan
Helicobacter pylori
Detecção de Resistência à Claritromicina – PCR em Tempo Real
Light Cycler
 Amplificação do Gene 23S rRNA
 Sondas FRET
 Análise de Melting
 Tempo de Resposta: ~ 5 H
Estirpe
Tmelting (ºC)
Wild - type
61.5
Mut (A2142C)
58.0
Mut (A2142G)
53.0
Mut (A2143G)
53.6
PNEUMONIAS ATÍPICAS
M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila

TÉCNICA: PCR em Tempo Real – SMART CYCLER
3 ENSAIOS DE PCR Efectuados individualmente para a detecção de cada
um dos microrganismos
PNEUMONIAS ATÍPICAS
M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila

TEMPO DE RESPOSTA: 3 H
VS
48 H PCR Convencional
 ESPECIFICIDADE
 SENSIBILIDADE
L. pneumophila


LIMITE DE DETECÇÃO:
L. pneumophila - 18 UFC/ml
AMOSTRAS:
LBA
LCR
Expectorações...
C. pneumoniae
M. pneumoniae
LEPTOSPIROSE (UBM-HGSA)




Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de
6 espécies patogénicas
Amostras de urina, sangue, LCR
PCR em Tempo Real (Light Cycler)
Limite de detecção: cultura = 10-12; Urina inoculada = 10-7
LEPTOSPIRA

TÉCNICA : PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER
Amplificação do gene 23S rDNA que permite num só ensaio a detecção
de 6 espécies patogénicas


TEMPO DE RESPOSTA: 3 H (Considerando o tempo dispendido no pré-tratamento das amostras de urina)
AMOSTRAS:
Urina
Sangue
LCR
Biópsias...
Bordetella pertussis

Detecção molecular de IS 481

Amostras:
 Secreções nasofarínge
 Zaragatoa nasofarínge

Armazenar a 4ºC

Volume mínimo amostra  400ml

Extracção de ácidos nucleicos

EZ 1 BioRobot – Qiagen
Bordetella pertussis

Limite de detecção

ATCC 9797D
Bordetella pertussis ATCC 9797D
Diluição
Concentração
Resultado
10-1
14ng/mL
POS
10-2
1,4ng/mL
POS
10-3
1,4x10-1ng/mL
POS
10-4
1,4x10-2ng/mL
POS
10-5
1,4x10-3ng/mL
POS
10-6
1,4x10-4ng/mL
POS
10-7
1,4x10-5ng/mL
POS
10-8
1,4x10-6ng/mL
POS
10-9
1,4x10-7ng/mL
+/-
10-10
1,4x10-8ng/mL
NEG
DNA genómico B. pertussis

Diluições seriadas  10-1 a 10-10
Clostridium difficile
Detecção de C. difficile de fezes - Multiplex PCR em Tempo Real
Smart Cycler
 Gene tcdA: Toxina A
 Gene tcdB: Toxina B
 2 Pares de Primers
 Sondas
 FAM: Toxina A
 TET: Toxina B
 Tempo de Resposta: ~ 3 H
 Controlo de Inibição
 Sensibilidade Analítica: 10 cópias genoma por reacção de PCR
DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS
ANTIMICROBIANOS (UBM-HGSA)
BACTÉRIA
Mycobacterium
tuberculosis
Helicobacter
pylori
RESISTÊNCIA
MUTAÇÕES
Rifampicina
rpoB 526(CACGAC)
531 (TCGTTG)
533 (CTGCCG)
Isoniazida
katG 315 (AGCACC)
315 (AGCAAC)
Claritromicina
23S rDNA
TUBERCULOSE
Identificação de isolados de cultura
Identificação directa de produtos biológicos
(em desenvolvimento)
Espécie
Tm
M. tuberculosis
63ºC
M. kansasii
59ºC
M.avium
58ºC
M.intracellulare
54ºC
M.gordonae
49ºC
16S rDNA

Gene 16S rDNA – natureza conservada no reino procariota

PCR Universal  uma reacção  amplifica vários agentes

Detecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreis
16S rDNA

Aplicações:


LCR, Sangue, produtos biológicos “estéreis”
Problemas:

Detecção de bactérias inviáveis

Risco de contaminação laboratorial

Risco de contaminação na colheita
Correlacionar resultados
positivos com a clínica
16S rDNA

Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material)

Extracção de ácidos nucleicos

Bactérias Gram -

Bactérias Gram +

Micobactérias

Lise enzimática / mecânica

Magna Pure LC, Roche


Amplificação


Total Nucleic Acid Isolation Kit
Smart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo Real
Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação)
16S rDNA



Sensibilidade analítica do método

S. aureus  160 UFC/mL

E. coli  200 UFC/mL
Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda)

Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5%

VPP: 84%; VPN: 92.7%
Resultado – POSITIVO/NEGATIVO
16S rDNA
Espécie
Origem
PCR em tempo real
E. coli
ATCC 25922
Pos
S. aureus
ATCC 25923
Pos
E. faecalis
ATCC 25212
Pos
S. pneumoniae
ATCC 6305
Pos
P. mirabilis
ATCC 12453
Pos
E. cloacae
ATCC 13047
Pos
K. pneumoniae
ATCC 13883
Pos
P. aeruginosa
ATCC 27853
Pos
H. influenzae
ATCC 49766
Pos
N. meningitidis
Isolado clínico
Pos
L. monocytogenes
Isolado clínico
Pos
S. epidermidis
Isolado clínico
Pos
S.agalactiae
Isolado clínico
Pos
M. tuberculosis
Isolado clínico
Pos
Leptospira sp
Isolado clínico
Pos
16S rDNA
Estirpes detectadas por outros autores com os mesmos primers
Acinetobacter calcoaceticus
Clostridium perfringens
Aeromonas hydrophila
Corynebacterium genitalium
Alcaligenes faecalis
Erysipelothrix rhusiophathiae
Bacteroides fragilis
Gardnerella vaginalis
Campylobacter fetus
Lactobacillus acidophilus
Campylobacter jejuni
Leuconostoc paramesenteroides
Eikenella corrodens
Micrococcus luteus
Flavobacterium meningosepticum
Mycoplasma genitalium
Legionella pneumophila
Mycoplasma hominis
Moraxella catarrhalis
Mycoplasma pneumoniae
Neisseria gonorrhoeae
Peptostreptococcus anaerobius
Providencia stuartii
Peptostreptococcus magnus
Salmonella typhimurium
Propionibacterium acnes
Serratia marcescens
Streptococcus mitis
Yersinia enterocolitica
Streptococcus sanguis
16S rDNA

Desafio:


 sensibilidade sem comprometer a especificidade

Kits de Extracção MGrade

Enzimas LowDNA
Essencial:
Resultados positivos  Identificação do produto amplificado

Distinguir contaminações de verdadeiros positivos

Correlação com clínica
 Valor Preditivo Positivo
 Sensibilidade
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