Perfil de Resultados - Proficiência Clínica

Perfil de Resultados - Proficiência Clínica
Área: Biologia Molecular
Rodada: Ago/2015
Tema
TESTES MOLECULARES APLICADOS A LABORATÓRIOS CLÍNICOS E SERVIÇOS DE HEMOTERAPIA
Elaborador
Eduardo Wandame Gomez. Biomédico. Mestre em Diagnóstico Genético e Molecular. Responsável pela
rotina de análises em Controle de Qualidade em Hemoterapia e Coordenador técnico do Laboratório Qualitá –
Hospital Regina, Novo Hamburgo RS.
Análise das respostas e comentários dos participantes
TÉCNICAS MOLECULARES
A partir do momento em que houve um conhecimento mais aprofundado dos ácidos nucléicos, várias técnicas foram desenvolvidas
baseadas na bioquímica nuclear permitindo, dessa forma, a manipulação e análise de DNA e RNA. Considerando que o componente
genético está associado a inúmeras doenças e a possibilidade de detecção do material genético de agentes infecciosos, verifica-se o
papel relevante dessas técnicas tanto em pesquisas como na prática de laboratórios clínicos. Algumas delas são apresentadas, de
forma simplificada, a seguir:
Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
Técnica desenvolvida na década de 80, pelo pesquisador Kary Mullis, rendeu-lhe um prêmio Nobel e revolucionou a pesquisa na área
médica. É uma das ferramentas moleculares mais utilizadas em medicina laboratorial. É baseada na amplificação do fragmento alvo
em ciclos, através da atividade de uma enzima chamada DNA polimerase, possibilitando a detecção do material genético alvo em
pequenas quantidades. Para tanto, é necessária a presença de condições adequadas como co-fator magnésio e sequências
iniciadoras chamadas Primers. As etapas de um PCR podem ser descritas como extração, amplificação e leitura.
Extração: envolve a obtenção dos ácidos nucléicos da amostra a ser estudada, através de protocolos específicos de lise celular e
exposição do material genético, além de lavagens para a purificação desse material.
Amplificação: é desenhada de acordo com o processo natural de replicação do DNA, em ciclos que repetem 3 passos: desnaturação,
hibridização e extensão. Quando a sequência alvo está presente, em cada ciclo a quantidade dessas moléculas aumenta em
progressão geométrica.
Leitura: é realizada através de corrida em eletroforese.
Diversas variações de PCR foram desenvolvidas com a finalidade de aperfeiçoar a técnica. Dentre as principais, podemos destacar:
RT-PCR: a ação da enzima transcriptase reversa, antes da reação de PCR, permite obter uma fita de DNA complementar a partir do
RNA alvo, desse modo é possível a detecção de RNAs através do PCR.
PCR em Tempo Real: sinais fluorescentes são emitidos ao longo da amplificação, sendo que o monitoramento desse processo
possibilita a análise numérica da reação. Desse modo, é possível quantificar a carga viral de um determinado vírus, por exemplo.
PCR Multiplex: permite, em uma mesma reação, a detecção de sequências diferentes. Diminui custos e otimiza processos através da
pesquisa simultânea de diferentes alvos. Possui muitas aplicações, como pesquisa de painéis virais e NAT para bancos de sangue.
PCR-RFLP: une ao PCR a adição de enzimas de restrição, que "cortam" a sequência em locais específicos, gerando sequências mais
curtas para análise, em seguida ocorre à amplificação. Pode determinar a presença de mutações.
Nested-PCR: desenvolvido para melhorar a especificidade e eficiência, o segmento genômico da amostra é amplificado, primeiramente
de forma completa, e, posteriormente o produto dessa amplificação é submetido à nova amplificação restrita à sequência alvo.
Hibridização
É baseada na propriedade de desnaturação-renaturação do DNA. Consiste na interação entre uma sequência ligada a um marcador
(também chamada de sonda) e um segmento de DNA ou RNA. Como não amplifica a sequência alvo, são necessárias quantidades
maiores - comparativamente com técnicas de amplificação - para a detecção. Vários formatos de hibridização foram elaborados a fim
de resolver problemas metodológicos, como as condições que permitam o pareamento específico, o tipo de detecção e a interpretação
dos resultados. Cada método possui vantagens e desvantagens, sendo que o método de escolha é selecionado de acordo com as
condições clínicas e o diagnóstico em questão.
Microarray
É uma potente variação da hibridização que permite, através da ligação de sondas, a avaliação de um número muito grande de alvos.
É muito utilizado para avaliação de expressão gênica, detecção de mutações e polimorfismos.
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Questão 5: A resposta é a opção 4. O microarray é o método de hibridização descrito no enunciado. Representa um grande avanço
diagnóstico permitindo complexas análises a partir de um mesmo procedimento analítico.
Questão 6: A resposta é a opção 3. Uma das desvantagens da captura híbrida em relação ao PCR é que não há amplificação do alvo,
desse modo é necessária a presença de uma concentração maior para detecção.
Questão 7: A resposta é a opção 2. A hepatite B oculta é caracterizada pelo perfil sorológico: ausência de HBSAg, presença de antiHBC e presença de HBV-DNA. Apesar da maioria dos pacientes em fase ativa de Hepatite B apresentarem reatividade para pesquisa
de HBSAg, alguns deles desenvolvem a forma oculta. Desta forma, mesmo sem a presença de HBSAg o vírus continua circulante,
sendo detectado por pesquisa de DNA viral.
Questão 8: Esta questão foi anulada. Apesar de estudos indicarem que testes convencionais anti-HCV possuem, na média, janela
imunológica maior em relação aos outros vírus pesquisados no teste NAT, são encontradas significativas variações entre os intervalos
de tempo estimados. Paralelamente, os dados de estudos quanto à diminuição dessa janela a partir da introdução do teste NAT são
limitados. Outros fatores como individualidade de cada organismo e carga viral na qual o infectado foi exposto inicialmente impedem
um consenso quanto ao vírus detectado mais precocemente a partir teste NAT.
Questão 9: A resposta é a opção 1. O clareamento viral do HCV é caracterizado pela não detecção da partícula viral através de
técnicas moleculares, ao mesmo tempo os anticorpos anti HCV permanecem circulantes.
Questão 10: A resposta é a opção 3. A alta sensibilidade dos testes moleculares, promovida pela amplificação das partículas alvo,
permite o uso do pool a fim de reduzir custos nos testes NAT.
Questão 11: A resposta é a opção 4 As alterações fenotípicas não podem ser detectadas com o uso de PCR, geralmente essas
alterações estão associadas com o ambiente, desse modo não são encontradas nos ácidos nucléicos.
.
Referências
Bibliográficas:
• Carvalho, Cristina Valleta de; Ricci, Giannina; Affonso, Regina. Guia de Práticas em Biologia Molecular, 1a
Ed. São Caetano do Sul – SP: Yendis: 2010.
• Henry, John Bernard. Diagnósticos Clínicos e Tratamentos por Métodos Laboratoriais, 20a Ed. São Paulo:
Manole, 2008.
• Lorenz, T.C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.
J. Vis. Exp. (63), e3998, doi:10.3791/3998 (2012)
• Wendel, S.; Levi, J. E.; Almeida, P. T.; Neto, G. F. Introdução do NAT no Brazil: algumas considerações
adicionais. Rev. Bras. Hematol. Hemoter.; 31(2):112-113, 2009.
• Lajolo CP, Langhi Júnior DM, Marques Júnior JFC. ELISA negativo com NAT positivo. Uma realidade em
hemoterapia. Rev. Bras Hematol. Hemoter. 2008;30(4):330-4.
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Respostas dos Participantes
Opções (%)
Resultado(s) aceito(s)
Opção 1
Opção 2
Opção 3
Opção 4
Questão 1
7.2%
3.4%
89.4%
-
3
Questão 2
3.0%
7.7%
1.7%
87.2%
4
Questão 3
88.9%
5.5%
2.6%
3.0%
1
Questão 4
5.5%
81.3%
1.7%
11.5%
2
Questão 5
10.6%
34.5%
1.3%
53.2%
4
Questão 6
28.9%
12.8%
31.1%
26.4%
3
Questão 7
13.6%
70.2%
8.5%
5.5%
2
Questão 8
43.8%
4.3%
6.8%
43.8%
Anulada
Questão 9
63.0%
21.3%
2.1%
12.8%
1
Questão 10
15.7%
5.5%
70.6%
6.8%
3
Questão 11
6.0%
11.5%
18.7%
63.8%
4
Questão 12
85.5%
5.1%
6.0%
3.4%
1
Questão 13
4.3%
84.3%
9.4%
1.3%
2
Questão 14
1.7%
3.8%
91.9%
1.3%
3
Questão 15
86.0%
4.3%
7.2%
1.7%
1
Questionários Respondidos
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