• TÉCNICAS PARA DIAGNÓSTICO MOLECULAR. A busca por

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TÉCNICAS PARA DIAGNÓSTICO MOLECULAR.
A busca por alternativas rápidas e eficazes de diagnóstico são cada vez mais
necessárias, uma vez que contribuem para a erradicação de enfermidades antes que estas
provoquem sinais clínicos irreversíveis e taxas de mortalidade elevada.
Em vista disso, o diagnóstico molecular, representado pelas técnicas de PCR e
Sequenciamento, possui alta sensibilidade e especificidade, utiliza quantidade reduzida
de volume amostral, e rapidez na detecção de patógenos, constituindo uma alternativa a
ser explorada.
A PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) é uma metodologia que se baseia na
amplificação exponencial seletiva de uma região específica do DNA de um organismo.
Suas aplicações são inúmeras, desde o diagnóstico médico, mapeamento genético,
detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade, até
identificação de bactérias que causam doenças em piscicultura… De fato, a PCR
revolucionou várias áreas como a Biologia Molecular, Patologia, Farmácia, Botânica,
Medicina Forense e valeu o prêmio Nobel, em 1993, a Kary Mullis.
Um ciclo de PCR consiste em três fases: desnaturação do DNA molde (a ± 95°C),
anelamento dos primers (a ±64°C) e polimerização do DNA (a 72°C). Na 1ª etapa fazse a separação das cadeias de dupla hélice de DNA através do calor. Esta separação é
essencial para que, na 2ª fase, dois primers se liguem às sequências dos pares de bases
complementares da cadeia molde. Estes primers são desenhados e sintetizados de modo
a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA molde que se
pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicação
de DNA e, na última etapa, faz-se a sua extensão. A enzima responsável por esta
polimerização é a DNA polimerase termo-estável (Taq), tendo sido isolada a partir da
bactéria termofílica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. Para
executar este ciclo usa-se um termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e
a temperatura ao longo do ciclo. Normalmente são repetidos cerca de 30 ciclos, o que
demora apenas algumas horas.
Assim, duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo
completo de PCR logo dá-se um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos
2n vezes mais cópias do que no início (CARRAPATA, et al., 2005).
Já o sequenciamento de é uma série de métodos bioquímicos que têm como
finalidade determinar a ordem das bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina
(C) e timina (T) da molécula de DNA, seja um único gene ou o genoma completo de um
organismo.
As sequencias de DNA são "lidas" por máquinas de sequenciamento automático,
capazes de ler até 1000 nucleotídeos ou bases de uma só vez. Um algoritmo de
montagem de genoma é então utilizado para reunir todas as partes e colocá-las na ordem
original, detectando todos os locais onde existe coincidências entre pedaços distintos de
DNA. As partes coincidentes podem ser fundidas, unindo dois pedaços de DNA. O
processo é repetido até montar a sequência completa (Darnell et al., 1990).
TÉCNICAS PCR E SEQUENCIAMENTO
Após coleta bacteriana com “swab” estéril nas lesões características do peixe, o
“swab” será inserido em tubo estéril contendo meio de cultura apropriado para
multiplicação bacteriana. Após incubação em estufa bacteriológica, será feita semeadura
em meio semi-sólido adequado e incubado em temperatura ótima.
Após isolamento e purificação das colônias bacterianas, a confirmação da
identificação da espécie será feita com base na extração do DNA, PCR para
amplificação do gene 16S rDNA e sequenciamento deste produto de PCR.
1 EXTRAÇÃO DNA BACTERIANO
A metodologia utilizada será a recomendada pelo fabricante do kit Axyprep®
miniprep para DNA genômico bacteriano (AXIGEN).
2 QUANTIFICAÇÃO DO DNA
A quantificação das amostras extraídas (ng/μL) e a contaminação por proteínas
será mensurada espectrofotometricamente através do aparelho NanoDrop® (Thermo
Fisher Scientific). A concentração do DNA é estimada pela absorbância no
comprimento de onda A260, em relação a uma amostra negativa (branco). Serão
avaliadas também as relações dos comprimentos de onda A260/280 e A260/230. A
primeira estima a contaminação por proteínas e a segunda por sais; os valores esperados
nas relações para uma amostra de qualidade são 1,8-2,0 e ≥2,0, respectivamente.
3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Para a confirmação da cobertura e fidelidade dos primers 16S utilizados, as
amostras de DNA genômico serão amplificadas pela PCR. A reação consistindo de:
tampão 10X (10mM Tris-HCl, 50mM KCl); 25mM dntp; 50mM MgSO4; Platinum Taq
High Fidelity (Invitrogen); par de primers; DNA template; água ultra-pura q.s.p. 25 μl
de reação.
Os amplicons gerados serão confirmados por eletroforese em gel de agarose a
1,5%, diluído em tampão TAE 1X (Tris-acetato 40mM, EDTA 1mM; pH 8,0). A
corrida será realizada seguindo as recomendações de Sambrook et al (2001).
4 PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR
Os produtos de PCR serão purificados pelo Kit MinElute (Qiagen) de acordo
com instruções do fabricante.
5 SEQUENCIAMENTO DOS PRODUTOS DE PCR
Os produtos de PCR das amostras serão amplificados com a enzima AmpliTaq
polimerase e “BigDye Terminator” (Applied Biosystems) conforme as recomendações
do
fabricante,
utilizando
o
conjunto
de
oligonucleotídeos
iniciadores).
O
sequenciamento será realizado em aparelho ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems).
As sequências obtidas serão visualizadas e manipuladas no programa
Sequencher 5.0 (Gene Codes Corporation), no Crebio (UNESP Jaboticabal, SP). A
posição do alinhamento será guardada e as sequências visualizadas no programa Bioedit
(v.7.1.11).
A sequência no formato fasta será exportada e utilizando-se a ferramenta
BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), o fragmento será comparado com as
sequências
depositadas
no
GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/),
admitindo-se concordância de no mínimo 95% para confirmação da especificidade da
sequência.
Fernanda de Alexandre Sebastião
Bióloga, Mestre em Microbiologia Agropecuária
FCAV/UNESP